Summary
Wir beschreiben hier, wie Sie eine Einzelzellmikroinjektion von Lucifer Yellow auszuführen einige nützliche Tipps zur Visualisierung zellulärer Kommunikation über Gap-Junctions in lebenden Zellen und liefern. Wir gehen davon aus, dass dieses Papier allen helfen wird, den Grad der zellulären Kopplung aufgrund funktioneller gap junctions zu bewerten. Alles, was hier beschrieben könnte im Prinzip angepasst anderen Fluoreszenzfarbstoffen mit einem Molekulargewicht unter 1000 Dalton.
Introduction
Gap Junctions sind interzelluläre Kanäle, die die gegenseitige Verbindung zwischen benachbarten Zellen 1 zu ermöglichen. Diese Kommunikation verbindet zwei oder mehr benachbarten Zellen, wo jeder trägt mit einem Connexin oder hemichannel den interzellulären Kanal zu bilden. In Säugerzellen wird das Connexon sechs Connexine, Monomere mit vier transmembranen Domänen und einer C- und N - terminalen im Zytoplasma 2 gebildet. Gap Junctions erlauben nicht nur den Fluss von Ionen, sekundäre Botenstoffe und kleine Stoffwechselprodukte , sondern auch für viele Formen der zellulären Kommunikation in vielen physiologischen Prozessen, wie der synaptischen Übertragung, Herzkontraktion, Zellwachstum beitragen und Differenzierung 3, 4, 5, 6, 7, 8. Zusätzlich Gap Junctions wurden mit den zugehörigenviele Krankheiten , darunter Krebs 9, 10, Muskelatrophie 11, einige genetische Krankheiten und demyelinisierenden Erkrankungen 12.
Diese Art von interzellularen Übersprechens kann durch mehrere Methoden , 13, 14, 15, 16 ausgewertet werden. zur Visualisierung zellulärer Kommunikation über Gap-Junctions in lebenden Zellen in diesem Beitrag zeigen wir, wie ein Single-Cell-Mikroinjektion von Lucifer Yellow auszuführen. Wir diskutieren, wie die Zellen vorzubereiten und die Mikropipette, die Verwendung des Mikromanipulators und die Injektion von Lucifer Yellow-Farbstoff in einer Thymus-Epithel-Zelllinie. Normalerweise ist diese experimentelle Verfahren konnte durch den Durchschnitt der verbundenen Zellen zu der Zelle mit Farbstoff beladen analysiert werden. Darüber hinaus könnte dieses Verfahren mit anderen Fluoreszenzfarbstoffen mit einem Molekulargewicht unterhalb des Spaltes verwendet werdenKreuzungen Cut-off, die etwa 1000 Dalton ist.
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Protocol
1. Herstellung von Zellen
- Pflegen einer Kultur eines Thymus - Epithel - Zelllinie (IT76M1) oder einer Zelle in einem Inkubator (37 ° C / 5% CO 2) getestet werden.
- Waschen Sie die Zellen mit PBS 1x (wiederholen Sie diesen Artikel 3x).
- Hinzufügen Trypsin zu den Zellen für 5 min.
- Hinzufügen Medium (zweimal des Volumens von Trypsin hinzugefügt in Punkt 1.3) mit 10% FBS (fötales Rinderserum) auf die Zellen mit Trypsin und zentrifugiert (800 × g für 5 min).
- Zählen Sie die Zellen in einem Hämozytometer.
- Stellen Sie die Dichte der Zellen entsprechend dem Zelltyp, wie die Zellen in engem Kontakt miteinander sein müssen Kopplung zu ermöglichen. Hinweis: In unserem Fall haben wir 3 x 10 5 Zellen pro 35 mm Petrischale.
2. Vorbereitung Mikropipette
- Ziehen Sie den Mikropipette als aus einer Glaskapillare Mikro spezifiziert (1,5 mm Durchmesser) auf einen endgültigen Durchmesser von 0,2 & mgr; m, um eine endgültige Widerstand von etwa 30 M & Omega; zu erreichenf "> 17, 18.
HINWEIS: Alternativ-Spritzen Pipetten erworben werden kann. Der Widerstand hängt von der Zellgröße, beispielsweise eine höhere Resistenz Mikroelektrode würde Azinuszellen des Pankreas erforderlich sein, beispielsweise (100-150 M & OHgr;) 19. Ein häufiges Problem ist die Fällung von Lucifer Yellow Lösung kommen könnte, die dann die Mikro behindern können und kann vor der Filtration oder Zentrifugation erfordern. Vor der Injektion sollte die Mikropipette unter dem Mikroskop untersucht werden , um festzustellen , ob es ein Hindernis ist , oder jede Art von Störungen 13. Die Mikropipette kann durch die Injektion von LY mit der Mikropipettenspitze in einer Salzlösung getestet werden.
3. Prüfung der Mikropipette
- Bereiten Sie die Lucifer Yellow-Lösung (5%) in 150 mmol / L LiCl und laden Sie die Mikropipette mit einer Spritze oder durch Verfüllung (put in sie LY Solution).
- Legen Sie die Micropipette über die 35 mm-Petrischale mit den IT76M1 Zellen auf dem Mikroinjektions Workstation und tauchen die Spitze des Glas-Mikropipette in das Zellmedium. Konzentrieren Sie sich auf der Mikropipette und führen Sie einen Farbstoff fließt Test durch das Aufbringen eines Impulses.
4. Single-Zelle Lucifer Yellow Mikroinjektions
- Konzentrieren Sie das Mikroskop direkt über der Zellschicht eine hohe Magni fi kation (40X) verwenden, dann senken Sie langsam die Pipette auf die Zellen, die die Mikromanipulator mit.
- Stechen Sie die Zielzelle, wenn die Spitze nahe genug ist, um die Zellmembran zu berühren, und geben Sie eine kleine hyperpolarisierender Impuls die LY in die Zelle einzuführen. Die angelegte Spannung wird auf die Nettoladung des Farbstoffs abhängen injiziert werden. Alternativ könnten einige andere Farbstoffe mit dieser Technik verwendet werden, wie in Tabelle 1 gezeigt.
Hinweis: Im Prinzip jedes hydrophile Farbstoff mit MW von weniger als 1 kDa verwendet werden könnten. Jedoch könnte die Übertragungsrate ändern sich je nach dem Gewicht und der Hydrophilie. Zusätzlich unspecific Übertragung des Farbstoffs verwendet wird, muss untersucht werden. - Erfassen Zellbildern 3 Minuten nach Farbstoffinjektion oder machen einen kleinen Film mit Zeitraffer-Mikroskopie (30 fps).
HINWEIS: Ein ähnlicher Ansatz in Hitomi et al (2015) 20 zu sehen. Um die Kommunikation durch Interzellularbrücken (incomplete Mitose), eine Co-Injektion von Rhodamin - Dextran (2 bis 10 KDa) zu vermeiden, die nicht durch gap junctions hindurchgeht , sondern durchläuft Interzellularbrücken und bestimmte Arten von Nanoröhrchen empfohlen wird , wie in Figur 2 gezeigt .
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Representative Results
Thymic epithelialen Zelllinie IT-76MI wurden verwendet Farbstoff Kopplung von gap junctions zu bewerten , da diese Zellen funktionelle Gap Junctions von 43 21 Connexin gebildet auszudrücken beschrieben wurden. Abbildung 1 zeigt die Injektion von Lucifer Yellow, wenn in der einen Zelle unterhalb der Spitze der Pipette aufgetragen. Nach einigen Minuten werden verbundenen Zellen fluoreszierend (Sternchen), die Diffusion des Fluoreszenzfarbstoffs durch die gap junctions anzeigt. Die Anzahl der Zellen und der Zeit fluoreszierend wurde direkt mit dem Grad der zellulären Kommunikation zwischen diesen Zellen assoziiert. Abbildung 2 zeigt die Injektion von LY in Thymus - Epithelzellen und die Einsätze (insert d) zeigen die Co-Injektion von LY und Rhodamin Dextran (10 kDa). Wie erwartet geht die LY zu einer benachbarten Zelle, obwohl die Rhodamine Dextran aufgrund seines hohen Molekulargewichts nicht. Darüber hinaus ist die Anwesenheit eines GJ blocker (insert f), Octanol, blocked den Durchgang des Farbstoffs an den umgebenden Zellen. Alternativ kann man den Grad der Kopplung einer bestimmten Zelle oder der Wirkung eines Arzneistoffs auf die Funktion von GJ bewerten. 3A zeigt die Injektion von LY in TEC-Zellen mit oder ohne Dexamethason. Dann wurden 100-Zellen injiziert, in Gegenwart von Dexamethason und dem Prozentsatz von 1 oder 2 Zellen kommuniziere war ähnlich in Bezug auf die Kontrolle ohne den Wirkstoff. Jedoch ist die Zahl von 3 oder 4 Zellen kommuniziere höher war im Vergleich zur Kontrolle. Fünf oder 6-Zellen und 7 oder 8 Zellen mit GJ Kommunikation in Gegenwart von Dexamethason nicht in der Kontrolle beobachtet, was darauf hinweist, dass Dexamethason den Kopplungsgrad in TEC-Zellen erhöht.
Abbildung 1: Lucifer Yellow Injektion in IT-76MI Zellen. (A) Die Mikro nahe der Zellmembran. (B (C) ein Testimpuls erzeugt wurde , um zu überprüfen , ob die Elektrode tatsächlich wird der Farbstoff injiziert wird . (D) Die Pipette berührt die Zellmembran und es wurde mit Lucifer Yellow Farbstoff berechnet. (E) Die geladene Zelle erlaubt den Farbstoff mindestens fünf Nachbarzellen durch gap junctions zu passieren (durch die Pfeile angedeutet), X20. F) Es wurde ein digitaler Zoom getan bessere Visualisierung ermöglichen. Sternchen zeigen die Zellen aus, die in der Kontrastphasenmikroskopie (Abbildung 1A) berechnet wurden. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: Lucifer Yellow Injektion in Thymusepithelzellen (TEC). Phasenkontrast und Fluoreszenzmikroskopie. (A B) Menschliche Thymusepithel Zelle. (C und D) Thymic Krankenschwester Cell, (E und F) Eine Maus Thymusepithel Zelllinie sind. Der Einsatz in (D) zeigt die gleiche Zelle (Pfeil) nach einer Injektion von Rhodamin-Dextran 10 kDa (nicht permeable durch gap junctions). Die Einsätze in (E) und (F) zeigen das Fehlen von Farbstoffübertragung in der TEC Linie vorbehandelt mit Octanol 1 mM (a gap junction - Blocker) für 10 min. In allen Platten markieren Sternchen die injizierten Zellen. (AF) X 200. Übernommen von Alves et al. 1995 5. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3: Gap Junction communication von Dexamethason in einer Ratte epithelialen Zelllinie erhöht. TEC wurden mit 1 & mgr; M Dexamethason behandelt und Kopplungsgrad wurde durch die Lucifer Yellow Farbstoffübertragung Test bewertet. (A) Mikroskopie Felder (Phasenkontrast und Fluoreszenz, die jeweils in der linken und rechten Platten) , welches die Zelle injiziert und die , die gekoppelt wurden , wenn LY injiziert wurde (Vergrßerung 320X). In allen Platten markieren Sternchen die injizierten Zellen. (B) Histogramme zeigt das Muster der Kopplung der Kontrolle und Dexamethason behandelten Zellen. Die Analyse besteht aus 100 Mikroinjektionen pro Gruppe. Übernommen aus Alves et al., 2000 23. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
| FARBSTOFF | MW | Anregungs- / Emissions |
| Hydroxycumarin Carbonsäure | 206 | 386/488 |
| Calcein blau | 321 | 360/449 |
| 4 ', 6-Diamidino-2-Phenylindol-Dihydrochlorid | 279 | 358/461 |
| Carboxyfluorescein | 376 | 492/517 |
| Ethidium- Iodid (Bromid) | 314 | 518/605 |
| Lucifer Yellow CH | 443 | 428/536 |
| Alexa Fluor 488 | 570,5 | 495/519 |
| Calcein | 622 | 494/517 |
| Propidiumiodid | 414 | 535/617 |
Tabelle 1: Die Farbstoffe derzeit für Mikroinjektionsexperimente verwendet. Hier in,einige verwendeten Farbstoffe mit dem Molekulargewicht und der Anregungs- / Emissionswellenlänge.
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Discussion
Um die Anwesenheit von funktionellen interzellularen gap junction, die Verwendung von Tracern , um zu überprüfen, die Membran undurchlässig sind, obwohl durchlässig durch interzelluläre Kanäle 16 erforderlich sind. Fluorescein, der erste Fluoreszenzfarbstoff von Zelle zu Zelle Kupplung 22, durchlässig ist 3 zwischen nicht junctional Membranen zu beobachten und ist daher durch Lucifer Yellow Farbstoff 15 ersetzt wurde. Derzeit finden die beste Wahl unter den vielen verschiedenen Arten von fluoreszierendem Tracer auf den Umfang und die Bedingungen des Experiments abhängt. Das Verfahren der Zell Beladung mit Fluoreszenzfarbstoffen ermöglicht die Bewertung der Morphologie, Funktion einzelner Zellen und die kinetische Geschwindigkeit der Übertragung zwischen den Zellen. Weiterhin ermöglicht Farbstoff Mikroinjektions ein besseres Verständnis der physiologischen Rolle von gap junctions zwischen den Zellen 21, 23, da der Grad der czellulären Kommunikation wird mit der Anzahl von gekoppelten Zellen bezogen.
Mehrere wichtige Faktoren sind von entscheidender Bedeutung für die Mikrodaten erfolgreich zu erhalten. Normale Zelle Homöostase und Integrität muss beibehalten werden, so dass eine kurze Einspritzzeit (<1 s) von Farbstoff und technisches Know-how mit Mikroinjektions benötigt. Wesentliche Faktoren eine bessere Auflösung der aufgenommenen Bilder in immer 14 mit einer gekühlten CCD - Kamera, die Fluoreszenzfilter vorhanden und die Verwendung eines hohen NA - Objektiv ist mit. Auch könnte ein paar Tipps, die als: 1) Zellkulturschalen mit Gitter empfohlen werden, eine bestimmte Zelle injiziert, um sichtbar zu machen, auch Glasbodenschalen sollten für die hochauflösende Mikroskopie-Anwendungen verwendet werden; 2) Es wird empfohlen, 10-20 gezogen Nadeln zu machen vor dem Start Mikroinjektionen; 3) abhängig von dem Widerstand der Elektrodenspitze kann sehr hilfreich sein, die Mikropipette mit der Farbstoffbeladung Kapillarität Verwendung durch die Pipettenspitze in die Farbstofflösung Berührung; 4) Es ist nicht notwendig, den gesamten Körper der Pipette zu laden, ein paar Mikroliter der Spitze und 2 bis 3 mm zu füllen oberhalb der Spitze ist ausreichend; 5) starten Sie das Experiment mit einer weniger vergrößert Linse und versuchen, den Schatten der Pipette Wände zu sehen. Danach die Pipette so nah wie möglich zu bewegen und vor der Zelle zu berühren, verschieben sich auf den höheren vergrößerndes Objektiv, wie 40x oder größer ist; 6) Einige Gruppen verwenden, um eine pneumatische Mikroinjektors. Pneumatische Injektion ist nicht die beste Wahl, da es nicht genau ist, und unbekannte Mengen injizieren kann; mit einem Impuls könnte das Protokoll ein bekanntes Volumen an Farbstoff zu injizieren, werden vereinheitlicht. Zusätzlich wird empfohlen, wegen der Tiefe in die Membran über dem Cytosol zu injizieren; Injektion in die Membran über dem Kern könnte es verletzen und Zellphysiologie beeinflussen. Schließlich Zellen, die nicht zu flach sind, sind bevorzugt über maue.
Zusammenfassend ist dieses Verfahren wirksam interzelluläre Kommunikation durch Gap Junctions zu studieren, sondern NotwendigkeitKompetenz / Erfahrung und gutes Material und Ausrüstung qualitativ hochwertige Daten zu erhalten. Wir hoffen, dass Sie diesen Artikel und Video-Hilfe Anfänger, diese Technik zu verstehen und auszuführen.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lucifer yellow | Sigma | L0259 | |
| Lithium Chloride | Sigma | L4408 | |
| PBS tablets | Sigma | P4417 | |
| RPMI | Sigma | R4130 | |
| Bovine fetal serum | Cultilab | ||
| Trypsin | Sigma | T4799 | |
| vibration-insulated table | Newport | VH3036W-OPT | A vibration-insulated table is needed to protect the experiments from vibration and avoid cell damage |
| Micromanipulator | Narishige | MMO-203 | This equipment allows precision adjustments of the micropipette, which is needed for cell micro injection. |
| Current Generator | Digitimer | DS2 | To produce the dye flow through the micropipette, a current below one nano ampere was given using a current generator with an electrode inside the micropipette or an amplifier which has a capacitance compensation circuit (old electrometer) or current injection functions of new patch clamp amplifiers, and the ground wire submersed in the plate dish. Alternatively, the dye can be injected by a pneumatic microinjector, following the factory recommendations. |
References
- Bennett, M. V., et al. Gap junctions: new tools, new answers, new questions. Neuron. 6 (3), 305-320 (1991).
- Orellana, J. A., Martinez, A. D., Retamal, M. A. Gap junction channels and hemichannels in the CNS: Regulation by signaling molecules. Neuropharmacology. , (2013).
- Peracchia, C. Structural correlates of gap junction permeation. Int Rev Cytol. 66, 81-146 (1980).
- Loewenstein, W. R. Junctional intercellular communication and the control of growth. Biochim Biophys Acta. 560 (1), 1-65 (1979).
- Alves, L. A., et al. Functional gap junctions in thymic epithelial cells are formed by connexin 43. Eur.J Immunol. 25 (2), 431-437 (1995).
- Alves, L. A., et al. Are there functional gap junctions or junctional hemichannels in macrophages? Blood. 88 (1), 328-334 (1996).
- Fonseca, P. C., et al. Characterization of connexin 30.3 and 43 in thymocytes. Immunology letters. 94 (1-2), 65-75 (2004).
- Nihei, O. K., et al. Modulatory effects of cAMP and PKC activation on gap junctional intercellular communication among thymic epithelial cells. BMC Cell Biol. 11, 3 (2010).
- Czyz, J., Szpak, K., Madeja, Z. The role of connexins in prostate cancer promotion and progression. Nat Rev Urol. 9 (5), 274-282 (2012).
- El-Saghir, J. A., El-Habre, E. T., El-Sabban, M. E., Talhouk, R. S. Connexins: a junctional crossroad to breast cancer. Int J Dev Biol. 55 (7-9), 773-780 (2011).
- Cea, L. A., et al. Connexin- and pannexin-based channels in normal skeletal muscles and their possible role in muscle atrophy. J Membr Biol. 245 (8), 423-436 (2012).
- Cotrina, M. L., Nedergaard, M. Brain connexins in demyelinating diseases: therapeutic potential of glial targets. Brain Res. 1487, 61-68 (2012).
- Park, H. an-A., R, S., Khanna, S. avita, Sen, C. handan K. Current Technologies in Single-Cell Microinjection and Application to Study Signal Transduction. Methods in Redox Signaling. , Chapter 10 (2010).
- Abbaci, M., Barberi-Heyob, M., Blondel, W., Guillemin, F., Didelon, J. Advantages and limitations of commonly used methods to assay the molecular permeability of gap junctional intercellular communication. Biotechniques. 45 (1), 33-52 (2008).
- Stewart, W. W. Functional connections between cells as revealed by dye-coupling with a highly fluorescent naphthalimide tracer. Cell. 14 (3), 741-759 (1978).
- Meda, P. Probing the function of connexin channels in primary tissues. Methods. 20 (2), 232-244 (2000).
- Klaunig, J. E., Shi, Y. Assessment of gap junctional intercellular communication. Curr Protoc Toxicol. , Chapter 2 Unit2 17 (2009).
- Hanani, M. Lucifer yellow - an angel rather than the devil. J Cell Mol Med. 16 (1), 22-31 (2012).
- Orci, L., Biochemistry, C. Blockage of Cell-to-Cell Communication within Pancreatic Acini Is Associated with Increased Basal Release of Amylase Materials and Methods Preparation of Acini. Cell. 103 (August), 475-483 (1986).
- Hitomi, M., et al. Differential connexin function enhances self-renewal in glioblastoma. Cell Rep. 11 (7), 1031-1042 (2015).
- Nihei, O. K., Campos de Carvalho,, C, A., Spray, D. C., Savino, W., Alves, L. A. A novel form of cellular communication among thymic epithelial cells: intercellular calcium wave propagation. Am J Physiol Cell Physiol. 285 (5), C1304-C1313 (2003).
- Kanno, Y., Loewenstein, W. R.
- Alves, L. A., Nihei, O. K., Fonseca, P. C., Carvalho, A. C., Savino, W. Gap junction modulation by extracellular signaling molecules: the thymus model. Braz J Med Biol Res. 33 (4), 457-465 (2000).
