Summary
We beschrijven hier hoe je een eencellige micro-injectie van Lucifer Yellow uit te voeren om cellulaire communicatie via gap-junctions te visualiseren in levende cellen, en een aantal nuttige tips. We verwachten dat dit artikel iedereen zal helpen om de mate van cellulaire koppeling te evalueren door functionele gap junctions. Alles hier beschreven kan zijn, in principe, aangepast aan andere fluorescente kleurstoffen met een molecuulgewicht onder 1000 Dalton.
Introduction
Gap junctions zijn intercellulaire kanalen die de onderlinge communicatie mogelijk maken tussen naburige cellen 1. Deze mededeling verbindt twee of meer naburige cellen, waarbij elk bijdraagt met een connexon of hemikanaal aan de intercellulaire kanaal te vormen. In zoogdiercellen is de connexon gevormd door zes connexines, monomeren met vier transmembraandomeinen en een C- en N-terminale binnen het cytoplasma 2. Gap junctions niet alleen mogelijk de stroom van ionen, second messengers en kleine metabolieten, maar ook bij vele vormen van cellulaire communicatie in vele fysiologische processen, zoals synaptische transmissie, hart contractie, celgroei en differentiatie 3, 4, 5, 6, 7, 8. Daarnaast zijn gap junctions geassocieerd metveel ziekten waaronder kanker 9, 10, 11 spieratrofie, sommige genetische ziekten en demyelineringsziekten 12.
Dit type intercellulaire overspraak kan worden geëvalueerd door verscheidene werkwijzen 13, 14, 15, 16. In dit artikel laten we zien hoe een eencellige micro-injectie van Lucifer Yellow uit te voeren om cellulaire communicatie via gap-junctions te visualiseren in levende cellen. We bespreken hoe de cellen en de micropipet, het gebruik van de micromanipulator en de injectie van Lucifer Yellow kleurstof in een thymus epitheelcellijn bereiden. Meestal kan deze experimentele procedure wordt geanalyseerd door de gemiddelde geschakelde cellen met de cel geladen met kleurstof. Bovendien kan deze methode worden gebruikt met andere fluorescente kleurstoffen met een molecuulgewicht onder de spleetknooppunten cut-off die ongeveer 1.000 dalton.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bereiding van Cellen
- Handhaaf een kweek van een thymus epitheelcellijn (IT76M1) of te testen cel in een incubator (37 ° C / 5% CO 2).
- Was de cellen met PBS 1x (herhaal dit item 3x).
- Trypsine toevoegen aan de cellen gedurende 5 min.
- voeg medium (tweemaal de hoeveelheid trypsine toegevoegd punt 1,3) met 10% FBS (foetaal runderserum) aan de cellen met trypsine en gecentrifugeerd (800 xg gedurende 5 minuten).
- Tel de cellen in een hemocytometer.
- Pas de dichtheid van cellen volgens het celtype als de cellen in nauw contact met elkaar te koppelen toelaten. Opmerking: In ons geval gebruikten we 3 x 10 5 cellen per 35 mm petrischaal.
2. Micropipet Voorbereiding
- Trek de micropipet zoals opgegeven in een glazen micropipet capillair (1,5 mm diameter) tot een uiteindelijke diameter 0,2 urn teneinde een uiteindelijke weerstand van ongeveer 30 MQ verwezenlijkenf "> 17, 18.
LET OP: U kunt de injectie pipetten worden gekocht. De weerstand is afhankelijk van de celgrootte, bijvoorbeeld een hogere weerstand micro-elektrode zou noodzakelijk acinaire cellen, bijvoorbeeld (100-150 MQ) 19. Een gemeenschappelijk probleem dat kan optreden is het neerslaan van Lucifer Yellow oplossing die vervolgens kan belemmeren de micropipet en kan vóór filtratie of centrifugeren vereisen. Vóór injectie dient de micropipet onder de microscoop worden geanalyseerd om te detecteren of er een obstructie of een soort storing 13. De micropipet kan worden getest door het injecteren LY met de micropipet tip in een zoutoplossing.
3. Het testen van de Micropipet
- Bereid de Lucifer Yellow oplossing (5%) in 150 mmol / L LiCI en laadt de micropipet met een injectiespuit of vulmateriaal (gestoken LY Solution).
- Plaats de micropipette via 35 mm petrischaal met IT76M1 cellen op de micro-injectie werkstation en dompel het uiteinde van de glazen micropipet in het celmedium. Focus op de micropipet en het uitvoeren van een kleurstof stroomt-test door het toepassen van een puls.
4. Single-cell Lucifer Yellow Microinjection
- Focus de microscoop recht boven de cellaag behulp van een hoge magni fi catie (40X), daarna langzaam de pipet om de cellen met behulp van de micromanipulator.
- Doorboord doelcel wanneer de punt dicht genoeg bij de celmembraan raken, en breng een kleine hyperpolarizing puls naar de LY introduceren in de cel. De aangelegde spanning is afhankelijk van de netto lading van de kleurstof te injecteren. Alternatief kunnen andere kleurstoffen worden gebruikt met deze techniek zoals getoond in tabel 1.
Opmerking: In principe kan elk hydrofiel kleurstof met MW lager dan 1 kDa kunnen worden gebruikt. De overdrachtssnelheid kan variëren afhankelijk van het gewicht en hydrofiliciteit. Bovendien, unspecific overdracht van de gebruikte kleurstof worden geëvalueerd. - Leg cel beelden 3 minuten na kleurstof injectie of een kleine film met time lapse microscopie (30 fps).
LET OP: Een soortgelijke benadering kan worden gezien in Hitomi et al (2015) 20. Om de communicatie van intercellulaire bruggen (incomplete mitose), een co-injectie van rhodamine dextran (2-10 kDa), die niet via gap junctions heen gaan maar gaat door intercellulaire bruggen en bepaalde nanotubules aanbevolen voorkomen zoals weergegeven in figuur 2 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Thymus epitheel cellijn IT-76MI werden gebruikt om kleurstof koppeling te evalueren door gap junctions als deze cellen werden beschreven functionele gap junctions gevormd door connexine 43 21 uit te drukken. Figuur 1 toont de injectie van Lucifer Yellow wanneer toegepast in een cel onder de punt van de pipet. Na enkele minuten, verbonden cellen fluorescentie (sterretjes) die de diffusie van de fluorescerende kleurstof via gap junctions. Het aantal cellen en de tijd tot fluoresceren is rechtstreeks verbonden met de mate van cellulaire communicatie tussen deze cellen. Figuur 2 toont de injectie van LY thymus epitheelcellen en de inserts (insert d) tonen de co-injectie van LY en Rhodamine dextran (10 kDa). Zoals verwacht LY geeft een naburige cel, hoewel de Rhodamine dextran niet vanwege het hoge molecuulgewicht. Bovendien is de aanwezigheid van een GJ blokker (insert f), octanol, blocked de passage van de kleurstof naar de omringende cellen. Als alternatief kan men de mate van koppeling van een specifieke cel of het effect van een geneesmiddel op de functie van GJ evalueren. Figuur 3A toont de injectie van LY TEC cellen met of zonder dexamethason. Vervolgens werden 100 cellen geïnjecteerd in aanwezigheid van dexamethason en het percentage 1 of 2 cellen communiceren was vergelijkbaar met betrekking tot de controle zonder het middel. Maar het aantal 3 of 4 cellen communiceren was hoger in vergelijking met controle. Vijf of cellen 6 en 7 of 8 cellen met GJ communicatie in aanwezigheid van dexamethason werd niet waargenomen in de controle, hetgeen erop wijst dat dexamethason verhoogde de mate van koppeling TEC cellen.
Figuur 1: Lucifer Yellow injectie in IT-76MI cellen. (A) De micropipet nabij de celmembraan. (B (C) een testpuls werd gegenereerd om te controleren of de elektrode eigenlijk de kleurstof injecteren. (D) De pipet raakte de celmembraan en het was geladen met Lucifer Yellow kleurstof. (E) De cel gebracht kon de kleurstof doorgangsgat junctions te passen ten minste vijf naburige cellen (aangegeven door de pijlen), X20. F) Een digitale zoom werd gedaan om een betere visualisatie mogelijk te maken. Sterretjes wijzen op de cellen die in de fase contrast microscopie (Figuur 1A) werden gebracht. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Lucifer Yellow injectie in de thymus epitheelcellen (TEC). Fase contrast en fluorescentie microscopie. (A B), Human thymus epitheliale cel. (C en D) thymus Nurse Cell, (E en F) Een muis thymus Epitheliale cellijn, respectievelijk. De insert in (D) toont dezelfde cel (pijl) na een injectie van rhodamine-dextran 10 kDa (niet permeabel doorgangsgat junctions). Afdekkingen uit (E) en (F) tonen de afwezigheid van kleurstofoverdracht in het TEC lijn voorbehandeld met 1 mM octanol (a gap junction blocker) gedurende 10 min. In alle panelen sterretjes markeren de geïnjecteerde cellen. (AF) X 200. Overgenomen van Alves et al. , 1995 5. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Gap junction communication verhoogd met dexamethason in een rat epitheliale cellijn. TEC werden behandeld met 1 uM dexamethason en koppeling graad werd geëvalueerd door Lucifer Yellow kleurstofoverdracht assay. (A) Microscopie gebieden (fase contrast en fluorescentie in respectievelijk de linker en rechter panelen) die de geïnjecteerde cel en die werden gekoppeld als LY werd geïnjecteerd (vergroting 320X). In alle panelen sterretjes markeren de geïnjecteerde cellen. (B) Histogrammen tonen het patroon van koppeling van controle en dexamethason behandelde cellen. De analyse bestaat uit 100 micro-injecties per groep. Gereproduceerd van Alves et al., 2000 23. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| DYE | MW | Excitatie / Emission |
| hydroxycumarine carbonzuur | 206 | 386/488 |
| calceïne blauw | 321 | 360/449 |
| 4 ', 6-diamidino-2-fenylindool dihydrochloride | 279 | 358/461 |
| carboxyfluoresceïne | 376 | 492/517 |
| ethidium jodide (bromide) | 314 | 518/605 |
| Lucifer Yellow CH | 443 | 428/536 |
| Alexa Fluor 488 | 570,5 | 495/519 |
| calceïne | 622 | 494/517 |
| propidiumjodide | 414 | 535/617 |
Tabel 1: Kleurstoffen momenteel gebruikt voor micro-injectie experimenten. Hier in,sommige gebruikte kleurstoffen met moleculaire gewicht en de golflengte excitatie / emissie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Om de aanwezigheid van functionele intercellulaire gap junction, het gebruik van tracers die ondoorlaatbaar membraan zijn te verifiëren, maar permeabel door intercellulaire kanalen 16 vereist. Fluoresceïne, de eerste fluorescerende kleurstof te observeren cel-cel koppeling 22, permeabel tussen niet junctional 3 membranen en is derhalve vervangen door Lucifer Yellow 15 kleurstof. Op dit moment, op zoek naar de beste keuze uit de vele verschillende types van fluorescerende tracers hangt af van de omvang en de voorwaarden van het experiment. De werkwijze van celbelading met fluorescente kleurstoffen die toelaat om de morfologie, de functie van afzonderlijke cellen en de kinetische overdrachtssnelheid tussen cellen. Bovendien kleurstof micro-injectie kan een beter inzicht in de fysiologische rol van gap junctions tussen cellen 21, 23, omdat de mate van cellular communicatie is gerelateerd aan het aantal gekoppelde cellen.
Een aantal belangrijke factoren zijn cruciaal voor het succesvol verkrijgen van micro-injectie van gegevens. Normale cel homeostase en integriteit moet worden gehandhaafd, waardoor een korte injectie tijd (<1 s) van de kleurstof en technische expertise met micro-injectie nodig is. Belangrijke factoren bij het verkrijgen van een betere resolutie van de opgenomen beelden is een gekoelde CCD camera, de fluorescentie filters op zijn plaats en het gebruik van een hoge NA doel 14. Tevens kunnen sommige tips nuttig zijn als: 1) celcultuurschalen van roosters aanbeveling een bepaalde geïnjecteerde cel ook glazen bodem gerechten worden gebruikt voor high-resolution microscopy toepassingen visualiseren; 2) is het raadzaam om 10-20 trok naalden te maken voordat u begint met micro-injecties; 3) afhankelijk van de weerstand van de elektrode kan zeer nuttig zijn, het laden van de micropipet met de kleurstof via capillariteit door op de pipetpunt in de kleurstofoplossing; 4) is het niet nodig om het gehele lichaam van de pipet, een paar microliter laden de punt- en 2-3 mm boven het vullen tip is voldoende; 5) start het experiment met een minder vergroot lens en proberen om de schaduw van de pipet muren te zien. Daarna bewegen de pipet zo dicht mogelijk voor de cel raakt, verschuiven naar de hogere objectiefvergroting, zoals 40x of meer; 6) Sommige groepen maken gebruik van een pneumatische microinjector. Pneumatische injectie is niet de beste keuze omdat het niet nauwkeurig en onbekende hoeveelheden kunnen inspuiten; met een puls het protocol kan worden gestandaardiseerd tot een bekende hoeveelheid kleurstof injecteren. Bovendien wordt aanbevolen om te injecteren in het membraan boven het cytosol door de diepte; injectie in het membraan boven de kern zou kunnen verwonden en invloed celfysiologie. Tot slot, cellen die niet zijn te plat zijn voorkeur boven plat degenen.
Kortom, deze werkwijze effectief is om intercellulaire communicatie te bestuderen door gap junctions maar behoeftes kennis / ervaring en goed materiaal en apparatuur om gegevens van hoge kwaliteit te verkrijgen. We hopen dat dit artikel en video hulp beginners te begrijpen en uit te voeren deze techniek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lucifer yellow | Sigma | L0259 | |
| Lithium Chloride | Sigma | L4408 | |
| PBS tablets | Sigma | P4417 | |
| RPMI | Sigma | R4130 | |
| Bovine fetal serum | Cultilab | ||
| Trypsin | Sigma | T4799 | |
| vibration-insulated table | Newport | VH3036W-OPT | A vibration-insulated table is needed to protect the experiments from vibration and avoid cell damage |
| Micromanipulator | Narishige | MMO-203 | This equipment allows precision adjustments of the micropipette, which is needed for cell micro injection. |
| Current Generator | Digitimer | DS2 | To produce the dye flow through the micropipette, a current below one nano ampere was given using a current generator with an electrode inside the micropipette or an amplifier which has a capacitance compensation circuit (old electrometer) or current injection functions of new patch clamp amplifiers, and the ground wire submersed in the plate dish. Alternatively, the dye can be injected by a pneumatic microinjector, following the factory recommendations. |
References
- Bennett, M. V., et al. Gap junctions: new tools, new answers, new questions. Neuron. 6 (3), 305-320 (1991).
- Orellana, J. A., Martinez, A. D., Retamal, M. A. Gap junction channels and hemichannels in the CNS: Regulation by signaling molecules. Neuropharmacology. , (2013).
- Peracchia, C. Structural correlates of gap junction permeation. Int Rev Cytol. 66, 81-146 (1980).
- Loewenstein, W. R. Junctional intercellular communication and the control of growth. Biochim Biophys Acta. 560 (1), 1-65 (1979).
- Alves, L. A., et al. Functional gap junctions in thymic epithelial cells are formed by connexin 43. Eur.J Immunol. 25 (2), 431-437 (1995).
- Alves, L. A., et al. Are there functional gap junctions or junctional hemichannels in macrophages? Blood. 88 (1), 328-334 (1996).
- Fonseca, P. C., et al. Characterization of connexin 30.3 and 43 in thymocytes. Immunology letters. 94 (1-2), 65-75 (2004).
- Nihei, O. K., et al. Modulatory effects of cAMP and PKC activation on gap junctional intercellular communication among thymic epithelial cells. BMC Cell Biol. 11, 3 (2010).
- Czyz, J., Szpak, K., Madeja, Z. The role of connexins in prostate cancer promotion and progression. Nat Rev Urol. 9 (5), 274-282 (2012).
- El-Saghir, J. A., El-Habre, E. T., El-Sabban, M. E., Talhouk, R. S. Connexins: a junctional crossroad to breast cancer. Int J Dev Biol. 55 (7-9), 773-780 (2011).
- Cea, L. A., et al. Connexin- and pannexin-based channels in normal skeletal muscles and their possible role in muscle atrophy. J Membr Biol. 245 (8), 423-436 (2012).
- Cotrina, M. L., Nedergaard, M. Brain connexins in demyelinating diseases: therapeutic potential of glial targets. Brain Res. 1487, 61-68 (2012).
- Park, H. an-A., R, S., Khanna, S. avita, Sen, C. handan K. Current Technologies in Single-Cell Microinjection and Application to Study Signal Transduction. Methods in Redox Signaling. , Chapter 10 (2010).
- Abbaci, M., Barberi-Heyob, M., Blondel, W., Guillemin, F., Didelon, J. Advantages and limitations of commonly used methods to assay the molecular permeability of gap junctional intercellular communication. Biotechniques. 45 (1), 33-52 (2008).
- Stewart, W. W. Functional connections between cells as revealed by dye-coupling with a highly fluorescent naphthalimide tracer. Cell. 14 (3), 741-759 (1978).
- Meda, P. Probing the function of connexin channels in primary tissues. Methods. 20 (2), 232-244 (2000).
- Klaunig, J. E., Shi, Y. Assessment of gap junctional intercellular communication. Curr Protoc Toxicol. , Chapter 2 Unit2 17 (2009).
- Hanani, M. Lucifer yellow - an angel rather than the devil. J Cell Mol Med. 16 (1), 22-31 (2012).
- Orci, L., Biochemistry, C. Blockage of Cell-to-Cell Communication within Pancreatic Acini Is Associated with Increased Basal Release of Amylase Materials and Methods Preparation of Acini. Cell. 103 (August), 475-483 (1986).
- Hitomi, M., et al. Differential connexin function enhances self-renewal in glioblastoma. Cell Rep. 11 (7), 1031-1042 (2015).
- Nihei, O. K., Campos de Carvalho,, C, A., Spray, D. C., Savino, W., Alves, L. A. A novel form of cellular communication among thymic epithelial cells: intercellular calcium wave propagation. Am J Physiol Cell Physiol. 285 (5), C1304-C1313 (2003).
- Kanno, Y., Loewenstein, W. R.
- Alves, L. A., Nihei, O. K., Fonseca, P. C., Carvalho, A. C., Savino, W. Gap junction modulation by extracellular signaling molecules: the thymus model. Braz J Med Biol Res. 33 (4), 457-465 (2000).
