Encellede Mikroinjeksjon for Cell Communication analyse

Summary

Vi beskriver her hvordan du utfører en encellet mikroinjeksjon av Lucifer Yellow å visualisere mobil kommunikasjon via gap-kryss i levende celler, og gi noen nyttige tips. Vi forventer at denne artikkelen vil hjelpe alle til å vurdere graden av cellulær kobling grunn av funksjonelle gap veikryss. Alt som er beskrevet her kan være i prinsippet tilpasses andre fluorescerende fargestoffer med molekylvekt under 1000 Dalton.

Introduction

Gap veikryss er inter kanaler som gjør at inter blant nabocellene ^1. Denne kommunikasjonen forbinder to eller flere tilstøtende celler, hvor hver av dem bidrar med en connexon eller hemichannel for å danne det intercellulære kanalen. I pattedyrceller, er connexon dannet av seks connexins, monomerer med fire transmembrane domener og et C-terminal og N i cytoplasmaet ^2. Gap junctions ikke bare tillate strøm av ioner, andre budbringere og små metabolitter, men også bidra til mange former for mobil kommunikasjon i mange fysiologiske prosesser, slik som synaptisk transmisjon, hjerte sammentrekning, cellevekst og differensiering ^{3, 4, 5, 6, 7, 8.} I tillegg gap junctions har vært forbundet medmange sykdommer, inkludert kreft ^{9, 10,} muskelatrofi ^11, noen genetiske sykdommer og demyeliniserende sykdommer ^12.

Denne type av intercellulære krysstale kan evalueres ved flere metoder ^{for 13, 14, 15, 16.} I denne artikkelen viser vi hvordan du utfører en encellet mikroinjeksjon av Lucifer Yellow å visualisere mobil kommunikasjon via gap-kryss i levende celler. Vi diskuterer hvordan å fremstille celler og mikropipette, bruken av mikromanipluatoren og injeksjon av Lucifer gult fargestoff i en tymisk epitel cellelinje. Vanligvis kan dette eksperimentelle fremgangsmåte analyseres ved gjennomsnittet av celler som er koblet til cellen lastet med fargestoff. I tillegg kan denne fremgangsmåte brukes sammen med andre fluorescerende fargestoffer med molekylvekt under gapetveikryss cut-off som er omtrent 1000 dalton.

Protocol

1. Utarbeidelse av celler

1. Opprettholde en kultur av en tymisk epitel cellelinje (IT76M1) eller celle som skal testes i en inkubator (37 ° C / _5% CO2).
2. Vask cellene med PBS 1x (gjenta dette elementet 3x).
3. Legg Trypsin til cellene i 5 min.
4. Legg medium (to ganger av volumet av trypsin tilsettes i punkt 1.3) med 10% FBS (føtalt bovint serum) til cellene med trypsin og sentrifuge (800 xg i 5 min).
5. Telle celler i et hemocytometer.
6. Justere tettheten til celler i henhold til den celletype som cellene har til å være i nær kontakt med hverandre for å tillate kobling. Merk: I vårt tilfelle brukte vi 3 x 10 ⁵ celler per 35 mm petriskål.

2. Mikropipette Forberedelse

1. Trekk mikropipette som angis fra et glasskapillar mikropipette (1,5 mm diameter) til en endelig 0,2 pm diameter, slik som for å oppnå en endelig motstand på ca. 30 Megohmf "> ^{17, 18.}
   MERK: Alternativt kan injeksjons pipetter kjøpes. Motstanden er avhengig av cellestørrelse, for eksempel en høyere motstand mikroelektrode vil være nødvendig for pancreatic akinærceller, for eksempel (100-150 Megohm) ^19. Et vanlig problem som kan oppstå er utfellingen av Lucifer gult oppløsning som deretter kan hindre mikropipette og kan kreve forutgående filtrering eller sentrifugering. Før injeksjon bør mikropipette analyseres under mikroskopet for å oppdage om det er en hindring eller hvilken som helst type avbrudd ^13. Mikropipette kan testes ved å injisere LY med mikropipette spissen inne i en saltoppløsning.

3. Teste Mikropipette

1. Klargjør Lucifer Yellow løsning (5%) i 150 mmol / L LiCl og laste mikropipette med en sprøyte eller ved tilbakefylling (putter inn i den LY Solution).
2. Plasser micropipeTTE over 35 mm petriskål med IT76M1 celler på mikroinjeksjon arbeidsstasjonen og senke spissen av glasset mikropipette inn i cellen medium. Fokus på mikropipette og utføre et fargestoff som strømmer test ved anvendelse av en puls.

4. Single-celle Lucifer Yellow Mikroinjeksjon

1. Fokus mikroskopet rett over cellelaget ved hjelp av en høy Magni fi kasjon (40X), deretter sakte senke pipetten til cellene ved hjelp av micromanipulator.
2. Punkter målcellen når spissen er nær nok til å berøre cellemembranen, og påfør en liten Hyperpolarizing puls å innføre LY inn i cellen. Den påtrykte spenning vil avhenge av den netto ladning av fargestoff som skal injiseres. Alternativt kan noen andre fargestoffer som brukes i denne teknikk som vist i tabell 1.
   Merk: I prinsippet enhver hydrofil fargestoff med MW mindre enn 1KDa kunne brukes. Imidlertid kan hastigheten for overføring variere i henhold til vekt og hydrofilitet. I tillegg unspecific overføring av det fargestoff som brukes, må vurderes.
3. Capture cellebilder tre minutter etter fargestoff injeksjon eller lage en liten film med tiden lapse mikroskopi (30 fps).
   MERK: En lignende tilnærming kan sees i Hitomi et al (2015) ^20. For å unngå kommunikasjon av intercellulære broer (ufullstendig mitose), en ko-injeksjon av rhodamin dekstran (fra 2 til 10 kDa), som ikke passerer gjennom gap veikryss men passerer gjennom intercellulære broer og visse typer nanotubules anbefales som vist i figur 2 .

Representative Results

Tymisk epitel cellelinje IT-76MI ble brukt for å evaluere fargestoff kopling av gap junctions som disse cellene ble beskrevet til å uttrykke funksjonelle gap junctions dannet ved connexin 43 ^21. Figur 1 viser injeksjon av Lucifer gult når de påføres i en celle under spissen av pipetten. Etter noen få minutter, som er koblet celler blir fluorescerende (stjerne) som indikerer diffusjon av det fluorescerende fargestoff gjennom gap veikryss. Antall celler og tid til å ble fluorescerende er direkte knyttet til graden av cellulær kommunikasjon mellom disse cellene. Figur 2 viser injeksjon av LY på tymiske epitel-celler og innsatsene (innsats d) viser den ko-injeksjon av LY og Rhodamine Dextran (10 kDa). Som forventet LY føres til en nabocelle, selv om den rhodamin Dextran ikke på grunn av sin høye molekylvekt. I tillegg er tilstedeværelsen av en GJ blokker (innsats f), oktanol, blocked passasje av fargestoff til de omgivende celler. Alternativt kan man vurdere graden av kobling av en bestemt celle eller virkningen av et medikament på funksjonen av GJ. Figur 3A viser injeksjon av LY i TEC-celler med eller uten deksametason. Deretter ble 100 celler ble injisert, i nærvær av deksametason og prosentandelen av 1 eller 2 celler kommuniserer var lik i forhold til kontrollen uten medikamentet. Imidlertid er antallet av 3 eller 4 celler kommuniserende var høyere sammenlignet med kontroll. Fem eller 6 celler og 7 eller 8 celler med GJ kommunikasjon i nærvær av deksametason ble ikke observert i kontrollgruppen, noe som indikerer at deksametason økte graden av koplingen i TEC-celler.

Figur 1: Lucifer Yellow injeksjon i IT-76MI celler. (A) mikropipette nær til cellemembranen. (B (C) En testpuls ble generert for å verifisere hvorvidt elektroden faktisk injisering av fargestoff. (D) Pipetten rørt i cellemembranen, og det ble fylt med Lucifer gult fargestoff. (E) Cellen belastet tillot farge å passere gjennom gap veikryss til minst fem naboceller (indikert ved pilene), X20. F) En digital zoom ble gjort for å tillate bedre visualisering. Stjernene påpeke cellene som ble belastet i kontrast fase mikroskopi (figur 1A). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2: Lucifer gult injeksjon på tymiske epitel-celler (TEC). Fasekontrast og fluorescens mikroskopi. (En B) Menneskelig Thymus- epitelceller. (C og D) Thymus- Nurse Cell, (E og F) En mus tymiske epitel cellelinje, henholdsvis. Innsatsen i (D) viser den samme celle (pil) etter en injeksjon med rhodamin-dekstran 10 kDa (ikke permeabelt gjennom gap veikryss). Innsatsene i (E) og (F) viser fravær av farvestoffoverføring i den TEC linje forbehandlet med oktanol 1 mM (et gap junction blokker) i 10 min. I alle paneler stjernene markere de injiserte celler. (AF) X 200. Gjengitt fra Alves et al. 1995 ^5. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3: Gap junction telekommunikasjonsn økte med deksametason i en rotte epitelcellelinje. TEC ble behandlet med 1 uM deksametason, og koplingsgraden ble evaluert av Lucifer gult fargestoff overføring assay. (A) Mikros felt (fasekontrast og fluorescens, henholdsvis på venstre og høyre panel) som viser den injiserte cellen og de som ble koblet da LY ble injisert (forstørrelse 320X). I alle paneler stjernene markere de injiserte celler. (B) histogrammer som viser mønsteret for kobling av kontroll og deksametason-behandlede celler. Analysen består av 100 microinjections per gruppe. Gjengitt fra Alves et al., 2000 ^23. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

FARGE	MW	Eksitasjon / utslipp
hydroxycoumarin karboksylsyre	206	386/488
calcein blå	321	360/449
4 ', 6-diamidino-2-fenylindol-dihydroklorid	279	358/461
carboxyfluorescein	376	492/517
ethidium jodid (bromide)	314	518/605
Lucifer Yellow CH	443	428/536
Alexa Fluor 488	570,5	495/519
calcein	622	494/517
propidiumjodid	414	535/617

Tabell 1: Fargestoffer tiden anvendes for mikroinjeksjon eksperimenter. Her i,brukte man fargestoffer med molekylvekt og eksitasjons / emisjonsbølgelengden til.

Discussion

For å verifisere tilstedeværelse av funksjonelle intercellulær gap junction, bruk av tracere, som er ugjennomtrengelig membran, selv om det permeable av intercellulære kanalene er nødvendig ^16. Fluorescein, den første fluorescerende fargestoff for å observere celle-til-celle-kopling ^22, er permeabel mellom ikke synaptiske membraner ³ og har derfor blitt erstattet av Lucifer gult fargestoff ^15. Tiden, for å finne det beste valget blant de mange forskjellige typer fluorescerende tracere avhenger av omfang og vilkår for forsøket. Fremgangsmåten i cellen blir lastet med fluorescerende fargestoffer muliggjør evaluering av morfologi, funksjon av enkeltceller, og den kinetiske hastighet for transport celler. Videre gir fargestoff mikroinjeksjon en bedre forståelse av den fysiologiske rollen til gap junctions mellom cellene ^{21, 23,} ettersom graden av cellular kommunikasjon er beslektet med antall koblede celler.

Flere viktige faktorer er avgjørende for å lykkes med å skaffe mikroinjeksjon data. Normal celle homeostase og integritet må opprettholdes, og dermed en kort injeksjon tid (<1 s) av fargestoff og teknisk ekspertise med mikroinjeksjon er nødvendig. Viktige faktorer i å få en bedre oppløsning av de fangede bilder er å ha et avkjølt CCD-kamera, fluorescens filtrene på plass, og anvendelse av en høy NA objektiv ^14. Også, kan noen tips være nyttig som: 1) cellekultur retter med nett er anbefalt å visualisere en bestemt injisert celle, også glassbunn retter bør brukes for høy oppløsning mikros programmer; 2) det anbefales å gjøre 10-20 trukket nåler før du starter microinjections; 3) avhengig av motstanden i elektrodespissen kan være svært nyttig, lasting mikropipette med fargestoff hjelp capillarity ved å berøre pipettespissen inn i fargeløsning; 4) det er ikke nødvendig å laste hele kroppen av pipetten, noen få mikroliter å fylle spissen og 2 til 3 mm over tuppen er tilstrekkelig; 5) starter eksperimentet med en mindre forstørret linse og prøve å se skyggen av pipetten vegger. Etterpå bevege pipetten så nært som mulig og før berøring cellen, skifte til høyere forstørrelse objektiv, for eksempel 40x eller mer; 6) Noen grupper bruker en pneumatisk microinjector. Pneumatisk injeksjon er ikke det beste valget siden det ikke er presis og kunne injisere ukjente volumer; med en puls protokollen kan være standardisert for å injisere et kjent volum av fargestoff. I tillegg anbefales det å injisere inn i membranen ovenfor cytosol på grunn av dybden; injeksjon i membranen over kjernen kunne skade den og påvirker cellefysiologi. Til slutt, celler som ikke er altfor flat er å foretrekke fremfor flate seg.

Oppsummert er denne metoden effektiv for å studere inter kommunikasjon ved gap veikryss, men behovetkompetanse / erfaring og god materiell og utstyr for å innhente data av høy kvalitet. Vi håper at denne artikkelen og video hjelpe nybegynnere å forstå og utføre denne teknikken.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lucifer yellow	Sigma	L0259
Lithium Chloride	Sigma	L4408
PBS tablets	Sigma	P4417
RPMI	Sigma	R4130
Bovine fetal serum	Cultilab
Trypsin	Sigma	T4799
vibration-insulated table	Newport	VH3036W-OPT	A vibration-insulated table is needed to protect the experiments from vibration and avoid cell damage
Micromanipulator	Narishige	MMO-203	This equipment allows precision adjustments of the micropipette, which is needed for cell micro injection.
Current Generator	Digitimer	DS2	To produce the dye flow through the micropipette, a current below one nano ampere was given using a current generator with an electrode inside the micropipette or an amplifier which has a capacitance compensation circuit (old electrometer) or current injection functions of new patch clamp amplifiers, and the ground wire submersed in the plate dish. Alternatively, the dye can be injected by a pneumatic microinjector, following the factory recommendations.