Summary
Здесь мы опишем, как выполнить одноклеточного микроинъекции Lucifer Yellow для визуализации сотовой связи через гэп-переходов в живых клетках, а также обеспечить некоторые полезные советы. Мы ожидаем, что эта статья поможет всем оценить степень сотовой связью за счет функциональных щелевых контактов. Все, что описано здесь, может быть, в принципе, адаптированы к другим флуоресцентных красителей с молекулярной массой менее 1000 дальтон.
Introduction
Щелевые соединения являются межклеточные каналы , которые позволяют междуэтажной среди соседних ячеек 1. Эта связь соединяет два или более соседних ячеек, где каждый из них вносит свой вклад с коннексон или hemichannel, чтобы сформировать межклеточный канал. В клетках млекопитающих коннексон образован шестью коннексинами, мономеров с четырьмя трансмембранными доменами и С и N терминала в цитоплазме 2. Щелевые контакты не только позволяют поток ионов, вторичных мессенджеров и малых метаболитов, а также способствуют многие формы сотовой связи во многих физиологических процессах, таких как синаптической передачи, сердечных сокращений, роста и дифференцировки 3, 4, 5, 6 клеток, 7, 8. Кроме того щелевые соединения были связаны смногие заболевания , включая рак 9, 10, 11 , мышечной атрофии, некоторых генетических заболеваний и демиелинизирующих заболеваний 12.
Этот тип межклеточного перекрестных помех может быть оценена несколькими способами 13, 14, 15, 16. В этой статье мы покажем, как выполнить одноклеточного микроинъекции Lucifer Yellow для визуализации сотовой связи через гэп-переходов в живых клетках. Мы обсудим, как подготовить клетки и микропипетки, использование микроманипулятора и инъекцию Люцифера желтого красителя в вилочковой эпителиальной клеточной линии. Как правило, эта экспериментальная процедура может быть проанализирована с помощью среднего связанных клеток к клетке, нагруженной красителем. Кроме того, этот способ может быть использован с другими флуоресцентными красителями, с молекулярной массой ниже зазораперекрестки отсечение, который составляет примерно 1000 Дальтон.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Получение клеток
- Поддерживать культуру вилочковой эпителиальной клеточной линии (IT76M1) или клетки должны быть испытаны в инкубаторе (37 ° C / 5% CO 2).
- Вымойте клеток с PBS 1x (повторить этот пункт 3x).
- Добавить трипсина в клетки в течение 5 мин.
- Добавить среду (в два раза от объема добавленного трипсина в пункте 1.3) с добавлением 10% FBS (эмбриональной бычьей сыворотки) в клетки с помощью трипсина и центрифугу (800 мкг в течение 5 мин).
- Граф клеток в гемоцитометра.
- Регулировка плотности клеток в зависимости от типа клеток, клетки должны быть в тесном контакте друг с другом, чтобы разрешить соединение. Примечание: В нашем случае мы использовали 3 × 10 5 клеток на 35 мм чашку Петри.
2. Подготовка Микропипетки
- Потяните микропипетки, как указано из стеклянного капилляра микропипетки (диаметром 1,5 мм) до конечной 0,2 мкм в диаметре, с тем, чтобы достичь конечного сопротивления приблизительно 30 МОме "> 17, 18.
Примечание: В качестве альтернативы, инъекционные пипетки можно приобрести. Сопротивление зависит от размера ячейки, например более высокое сопротивление микроэлектрода было бы необходимо для ацинарных клетках поджелудочной железы, например (100-150 МОм) 19. Общей проблемой, которая может возникнуть является осаждение Lucifer желтый раствор, который затем может затруднять микропипетки и может потребовать предварительной фильтрации или центрифугирования. Перед инъекцией, микропипетки следует анализировать под микроскопом , чтобы обнаружить , если имеется препятствие или любой тип разрушения 13. Микропипетки может быть проверена путем введения LY с наконечником микропипетки внутри солевого раствора.
3. Тестирование Микропипетки
- Готовят раствор желтого цвета Lucifer (5%) в 150 ммоль / л LĪČI и загружают микропипетки с помощью шприца или путем засыпки (положить в нее LY раствор).
- Поместите микротрубкиТТЕ над 35-мм чашки Петри с клетками IT76M1 на рабочей станции микроинъекции и погрузить кончик стеклянной микропипетки в клеточную среду. Фокус на микропипетки и выполнить тест на красителе, протекающий путем применения пульс.
4. Одноклеточный Lucifer Yellow Микроинъекция
- Фокус микроскопа прямо над слоем клеток с использованием высокой MAGNI фи катион (40X), затем медленно опустите пипетки к клеткам с помощью микроманипулятора.
- Прокол клетки-мишени, когда кончик достаточно близко, чтобы коснуться клеточной мембраны, и нанесите небольшое гиперполяризационные импульс, чтобы ввести LY в клетку. Приложенное напряжение будет зависеть от суммарного заряда красителя, который будет введен. В качестве альтернативы, некоторые другие красители, могут быть использованы с этой техникой, как показано в таблице 1.
Примечание: В принципе любой гидрофильным красителем с MW менее 1KDa можно было бы использовать. Тем не менее, скорость передачи может варьироваться в зависимости от веса и гидрофильности. Кроме того, Unspecific перенос красителя, используемого должны быть оценены. - Захват изображений клеток 3 мин после инъекции красителя или сделать небольшой ролик со временем покадровой микроскопии (30 кадров в секунду).
ПРИМЕЧАНИЕ: Аналогичный подход можно увидеть в Хитоми и др (2015) 20. Для того, чтобы избежать общения с помощью межклеточных мостиков (неполным митоза), со-инъекции родамина декстрана (от 2 до 10 кДа), которая не проходит через щелевые контакты , но проходит через межклеточные мосты и некоторые виды нанотрубок рекомендуется , как показано на рисунке 2 ,
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Тимуса эпителиальные клетки линии IT-76MI были использованы для оценки сцепления красителя щелевых контактов , как эти клетки были описаны , чтобы выразить функциональные щелевые соединения , образованные коннексина 43 21. На рисунке 1 показана инъекцию Lucifer Yellow при нанесении в одной ячейке ниже кончика пипетки. Через несколько минут, соединенные клетки становятся флуоресцентный (звездочками) указывает на диффузию флуоресцентного красителя через щелевые контакты. Число клеток и времени, чтобы стал флуоресцентный непосредственно связана со степенью сотовой связи между этими клетками. На рисунке 2 показана инъекция LY в эпителиальных клетках тимуса и вставки (вставка d) показывают , совместное введение LY и родамина декстрана (10 кДа). Как и ожидалось, Л.Я. переходит в соседнюю ячейку, хотя родамина декстран не из-за его высокой молекулярной массой. Кроме того, наличие ГДж блокатора (вставка F), октанол, BLOтрахнуться прохождение красителя к окружающим клеткам. В качестве альтернативы, можно оценить степень сцепления конкретной ячейки или влияние препарата на функцию ГДж. На фиг.3А показана инъекцию LY в ТЕС клеток с или без дексаметазона. Затем 100 клеток вводили, в присутствии дексаметазона и процентом 1 или 2-х ячеек, сообщающихся была одинаковой по отношению к контролю без препарата. Однако число 3 или 4 клеток, сообщающихся была выше по сравнению с контролем. Через пять или 6 клеток и 7 или 8 клеток с ГДж связи в присутствии дексаметазона не наблюдалось в контроле, тем самым указывая, что дексаметазон увеличивает степень сцепления в TEC клетках.
Рисунок 1: Люцифер Желтый раствор для инъекций в клетках IT-76MI. (А) микропипетки близко к клеточной мембране. (В (С) Импульсное испытание был сгенерирован , чтобы проверить , является ли электрод фактически инжекции красителя. (D) пипетка коснулась клеточную мембрану и загружали с Люцифером желтый краситель. (Е) Клетка заряженный позволил красителю проходить через щелевые контакты , по меньшей мере , пять соседних ячеек (показано стрелками), X20. F) Цифровой зум было сделано, чтобы обеспечить лучшую визуализацию. Звездочки указывают на клетки, которые были обвинены в контрастный фазовой микроскопии (рис 1А). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2: Люцифер Желтый раствор для инъекций в эпителиальных клетках тимуса (TEC). Фазовый контраст и флуоресцентной микроскопии. (A В) человеческого тимуса эпителиальные клетки. (C и D) Тимусная медсестра Cell, (E и F) клеточная линия Мышь тимуса эпителиальные, соответственно. Вставка в (D) показывает ту же ячейку (стрелка) после инъекции родамина-декстрана 10 кДа (не проницаемой через щелевые контакты). Вставки в (Е) и (F) показывают отсутствие переноса красителя в TEC линии предварительно обрабатывают октанола 1 мм (щелевых блокатора) в течение 10 мин. Во всех панелях Звездочки отмечают вводили клетки. (AF) X 200. Воспроизведено из Алвес и др. , 1995 5. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3: щелевых communicatioN увеличилась на дексаметазона у крысы линии эпителиальных клеток. ТЕС обрабатывали 1 мкМ дексаметазон, и степень сцепления оценивали с помощью анализа переноса желтый краситель Lucifer. (A) Микроскопия поля (фазового контраста и флуоресценции, соответственно, в левой и правой панелях) , изображающие впрыскивается клетку и те , которые были связаны , когда LY впрыскивали (увеличение 320X). Во всех панелях Звездочки отмечают вводили клетки. (В) Гистограммы , показывающий структуру сочетания управления и дексаметазон обработанных клеток. Анализ включает в себя 100 микроинъекций на группу. Воспроизводится из Алвес и др., 2000 23. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
| КРАСКА | МВт | Возбуждение / эмиссия |
| гидроксикумарин карбоновой кислоты | 206 | 386/488 |
| кальцеин синий | 321 | 360/449 |
| 4 ', 6-диамидино-2-фенилиндол дигидрохлорид | 279 | 358/461 |
| карбоксифлуоресцеин | 376 | 492/517 |
| этидия йодида (бромид) | 314 | 518/605 |
| Люцифер Желтый CH | 443 | 428/536 |
| 488 Alexa Fluor | 570,5 | 495/519 |
| кальцеин | 622 | 494/517 |
| пропидий йодид | 414 | 535/617 |
Таблица 1: Красители в настоящее время используется для микроинъекций экспериментов. Здесь, в,некоторые использовали красители с молекулярной массой и длины волны возбуждения / испускания.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Для того чтобы проверить наличие функциональной межклеточного щелевых контактов, использование изотопных индикаторов, которые мембрана непроницаема, хотя проницаемой межклеточные каналы необходимы 16. Флуоресцеин, первый флуоресцентный краситель для наблюдения от клетки к клетке соединительной 22, проницаема между не соединительных мембран 3 и поэтому был замещен Lucifer желтый краситель 15. В настоящее время, чтобы найти лучший выбор среди множества различных типов флуоресцентных индикаторов зависит от объема и условий эксперимента. Процедура загрузки клеток с флуоресцентными красителями позволяет оценивать морфологии, функции отдельных клеток и кинетическую скорость передачи между клетками. Кроме того, микроинъекции краситель позволяет более глубокое понимание физиологической роли щелевых контактов между клетками 21, 23, так как степень Cellular связи связана с количеством соединенных ячеек.
Несколько ключевых факторов имеют решающее значение для успешного получения данных микроинъекции. Нормальная клетка гомеостаз и целостность должна поддерживаться, таким образом, короткое время впрыска (<1 сек) красителя и технической экспертизы с микроинъекции необходимо. Ключевыми факторами в получении более высокое разрешение захваченных изображений , имеющих охлаждаемый ПЗС - камеры, флуоресцентные фильтры на месте и использование высокой цели НС 14. Кроме того, некоторые советы могут быть полезны, как: 1) чашки для культивирования клеток с сетками рекомендуется визуализировать конкретную впрыскивается ячейку, которая также со стеклянным дном блюда должны быть использованы для применения в микроскопии высокого разрешения; 2) рекомендуется сделать 10-20 дергают иглы перед началом микроинъекции; 3) в зависимости от сопротивления наконечника электрода может быть очень полезным, загрузка микропипетки с красителем с помощью капиллярности, коснувшись кончиком пипетки в раствор красителя; 4) нет необходимости загружать все тело пипетки, несколько микролитров, чтобы заполнить кончик и от 2 до 3 мм выше наконечник достаточно; 5) начать эксперимент с менее увеличенному линзы и попытаться увидеть тень пипетку стен. После этого переместите пипетку, как можно ближе, и, прежде чем прикасаться клетки, переход к более высокой цели увеличения, например, 40х или более; 6) Некоторые группы используют пневматическую microinjector. Пневматический инъекции не является лучшим выбором, так как он не является точным и может вводить неизвестные объемы; с пульсом протокол может быть стандартизирован, чтобы впрыснуть известный объем красителя. Кроме того, рекомендуется, чтобы впрыснуть в вышеприведенном цитозоль из-за глубины мембраны; инъекции в указанной выше ядра мембраны может повредить его и влиять на клеточную физиологию. Наконец, клетки, которые не слишком плоские являются более предпочтительным, чем плоские.
Таким образом, этот метод эффективен для изучения межклеточной коммуникации по щелевых контактов, но нуждаютсяs опыт / опыт и хороший материал и оборудование для получения данных высокого качества. Мы надеемся, что эта статья и видео поможет новичкам понять и выполнить эту технику.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lucifer yellow | Sigma | L0259 | |
| Lithium Chloride | Sigma | L4408 | |
| PBS tablets | Sigma | P4417 | |
| RPMI | Sigma | R4130 | |
| Bovine fetal serum | Cultilab | ||
| Trypsin | Sigma | T4799 | |
| vibration-insulated table | Newport | VH3036W-OPT | A vibration-insulated table is needed to protect the experiments from vibration and avoid cell damage |
| Micromanipulator | Narishige | MMO-203 | This equipment allows precision adjustments of the micropipette, which is needed for cell micro injection. |
| Current Generator | Digitimer | DS2 | To produce the dye flow through the micropipette, a current below one nano ampere was given using a current generator with an electrode inside the micropipette or an amplifier which has a capacitance compensation circuit (old electrometer) or current injection functions of new patch clamp amplifiers, and the ground wire submersed in the plate dish. Alternatively, the dye can be injected by a pneumatic microinjector, following the factory recommendations. |
References
- Bennett, M. V., et al. Gap junctions: new tools, new answers, new questions. Neuron. 6 (3), 305-320 (1991).
- Orellana, J. A., Martinez, A. D., Retamal, M. A. Gap junction channels and hemichannels in the CNS: Regulation by signaling molecules. Neuropharmacology. , (2013).
- Peracchia, C. Structural correlates of gap junction permeation. Int Rev Cytol. 66, 81-146 (1980).
- Loewenstein, W. R. Junctional intercellular communication and the control of growth. Biochim Biophys Acta. 560 (1), 1-65 (1979).
- Alves, L. A., et al. Functional gap junctions in thymic epithelial cells are formed by connexin 43. Eur.J Immunol. 25 (2), 431-437 (1995).
- Alves, L. A., et al. Are there functional gap junctions or junctional hemichannels in macrophages? Blood. 88 (1), 328-334 (1996).
- Fonseca, P. C., et al. Characterization of connexin 30.3 and 43 in thymocytes. Immunology letters. 94 (1-2), 65-75 (2004).
- Nihei, O. K., et al. Modulatory effects of cAMP and PKC activation on gap junctional intercellular communication among thymic epithelial cells. BMC Cell Biol. 11, 3 (2010).
- Czyz, J., Szpak, K., Madeja, Z. The role of connexins in prostate cancer promotion and progression. Nat Rev Urol. 9 (5), 274-282 (2012).
- El-Saghir, J. A., El-Habre, E. T., El-Sabban, M. E., Talhouk, R. S. Connexins: a junctional crossroad to breast cancer. Int J Dev Biol. 55 (7-9), 773-780 (2011).
- Cea, L. A., et al. Connexin- and pannexin-based channels in normal skeletal muscles and their possible role in muscle atrophy. J Membr Biol. 245 (8), 423-436 (2012).
- Cotrina, M. L., Nedergaard, M. Brain connexins in demyelinating diseases: therapeutic potential of glial targets. Brain Res. 1487, 61-68 (2012).
- Park, H. an-A., R, S., Khanna, S. avita, Sen, C. handan K. Current Technologies in Single-Cell Microinjection and Application to Study Signal Transduction. Methods in Redox Signaling. , Chapter 10 (2010).
- Abbaci, M., Barberi-Heyob, M., Blondel, W., Guillemin, F., Didelon, J. Advantages and limitations of commonly used methods to assay the molecular permeability of gap junctional intercellular communication. Biotechniques. 45 (1), 33-52 (2008).
- Stewart, W. W. Functional connections between cells as revealed by dye-coupling with a highly fluorescent naphthalimide tracer. Cell. 14 (3), 741-759 (1978).
- Meda, P. Probing the function of connexin channels in primary tissues. Methods. 20 (2), 232-244 (2000).
- Klaunig, J. E., Shi, Y. Assessment of gap junctional intercellular communication. Curr Protoc Toxicol. , Chapter 2 Unit2 17 (2009).
- Hanani, M. Lucifer yellow - an angel rather than the devil. J Cell Mol Med. 16 (1), 22-31 (2012).
- Orci, L., Biochemistry, C. Blockage of Cell-to-Cell Communication within Pancreatic Acini Is Associated with Increased Basal Release of Amylase Materials and Methods Preparation of Acini. Cell. 103 (August), 475-483 (1986).
- Hitomi, M., et al. Differential connexin function enhances self-renewal in glioblastoma. Cell Rep. 11 (7), 1031-1042 (2015).
- Nihei, O. K., Campos de Carvalho,, C, A., Spray, D. C., Savino, W., Alves, L. A. A novel form of cellular communication among thymic epithelial cells: intercellular calcium wave propagation. Am J Physiol Cell Physiol. 285 (5), C1304-C1313 (2003).
- Kanno, Y., Loewenstein, W. R.
- Alves, L. A., Nihei, O. K., Fonseca, P. C., Carvalho, A. C., Savino, W. Gap junction modulation by extracellular signaling molecules: the thymus model. Braz J Med Biol Res. 33 (4), 457-465 (2000).
