Summary
Vi beskriver här hur man utför en enda cell mikroinjektion av Lucifer Yellow att visualisera cellulära kommunikation via gap-junctions i levande celler, och ger några användbara tips. Vi förväntar oss att detta dokument kommer att hjälpa alla att utvärdera graden av cellulär koppling på grund av funktionella gap-junctions. Allt som beskrivs här kan vara i princip anpassas till andra fluorescerande färgämnen med molekylvikt under 1000 Dalton.
Introduction
Gap korsningar är inter kanaler som tillåter förbindelse bland angränsande celler 1. Detta meddelande förbinder två eller flera angränsande celler, där var och en bidrar med en connexon eller hemichannel att bilda inter kanal. I däggdjursceller, är connexon bildas av sex connexiner, monomerer med fyra transmembrandomäner och en C och N-terminala inom cytoplasman 2. Gap junctions inte bara tillåta flödet av joner, sekundära budbärare och små metaboliter, utan också bidra till många former av cellulär kommunikation i många fysiologiska processer, såsom synaptisk överföring, hjärtsammandragning, celltillväxt och differentiering 3, 4, 5, 6, 7, 8. Dessutom kanalförbindelser har associerats medmånga sjukdomar, bland annat cancer 9, 10, muskelatrofi 11, vissa genetiska sjukdomar och demyeliniserande sjukdomar 12.
Denna typ av intercellulär överhörning kan utvärderas genom flera metoder 13, 14, 15, 16. I detta dokument visar vi hur man utför en enkelcellmikroinjektion av Lucifer Yellow att visualisera cellulära kommunikation via gap-junctions i levande celler. Vi diskuterar hur man förbereder cellerna och mikropipett, användningen av mikromanipulator och injektion av Lucifer gult färgämne i en tymus epitelceller linje. Vanligtvis, kan detta försöksförfarande analyseras med genomsnittet av anslutna celler till cellen laddad med färgämne. Dessutom kan denna metod användas med andra fluorescerande färgämnen med molekylvikt under gapetkorsningar cut-off som är ca 1000 dalton.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Framställning av celler
- Upprätthålla en kultur av en tymisk epitelcellinje (IT76M1) eller cell, som skall testas i en inkubator (37 ° C / 5% CO2).
- Tvätta cellerna med PBS 1x (upprepa denna punkt 3x).
- Lägg Trypsin till cellerna under 5 min.
- Lägg medium (två gånger av den mängd trypsin tillsätts i punkt 1.3) med 10% FBS (fetalt bovint serum) till cellerna med trypsin och centrifug (800 x g under 5 min).
- Räkna cellerna i en hemocytometer.
- Justera densiteten av celler i enlighet med celltyp som cellerna måste vara i nära kontakt med varandra för att medge koppling. Obs: I vårt fall har vi använt 3 x 10 5 celler per 35 mm petriskål.
2. Mikropipett Framställning
- Dra mikropipett som anges från en glaskapillär mikropipett (1,5 mm i diameter) till en slutlig 0,2 | j, m med en diameter så att man uppnår en slutlig resistans av ungefär 30 Mohmf "> 17, 18.
OBS: Alternativt kan injektionspipetter köpas. Motståndet beror på cellstorleken, exempelvis en högre resistans mikroelektrod skulle vara nödvändigt för pankreatiska acinar-celler, exempelvis (100-150 Mohm) 19. Ett vanligt problem som kan uppstå är utfällningen av Lucifer Yellow-lösning som därefter kan hindra mikropipett och kan kräva föregående filtrering eller centrifugering. Före injektion ska mikropipett analyseras under mikroskop för att upptäcka om det finns ett hinder eller någon typ av störningar 13. Mikropipett kan testas genom att injicera LY med mikropipett spets inuti en saltlösning.
3. Testa Mikropipett
- Förbered Lucifer Gul lösning (5%) i 150 mmol / L LiCl och ladda mikropipett med hjälp av en spruta eller genom återfyllning (lagt ned på det LY Solution).
- Placera micropipette över 35 mm petriskål med IT76M1 cellerna på mikroinjektion arbetsstation och dränka spetsen på glasmikropipett in i cellmediet. Fokus på mikropipett och utföra ett färgämne strömmar prov genom att applicera en puls.
4. Single-cell Lucifer Yellow mikroinjektion
- Fokusera mikroskop precis ovanför cellskiktet med hjälp av en hög magni fi kation (40X), sedan långsamt sänka pipetten till cellerna med hjälp av mikromanipulator.
- Punktera målcellen när spetsen är tillräckligt nära för att röra cellmembranet, och applicera en liten hyperpolariserande puls för att introducera LY in i cellen. Den pålagda spänningen beror på nettoladdningen för färgämnet som skall injiceras. Alternativt kan vissa andra färgämnen användas med denna teknik såsom visas i tabell 1.
Obs: I princip alla hydrofila färgämnet med MW mindre än 1 kDa skulle kunna användas. Kunde dock överföringshastigheten variera beroende på vikt och hydrofilicitet. Dessutom unspecific överföring av färgämne som används måste utvärderas. - Fånga cellbilder tre minuter efter färg injektion eller göra en liten film med time lapse mikroskopi (30 fps).
OBS: Ett liknande tillvägagångssätt kan ses i Hitomi et al (2015) 20. För att undvika att kommunikation genom intercellulära broar (ofullständig mitos), en co-injektion av rodamin dextran (från 2 till 10 kDa), som inte passerar genom kanalförbindelser utan passerar genom intercellulära broar och vissa typer av nanotubules rekommenderas såsom visas i fig 2 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tymus epitelcellinje IT-76MI användes för att utvärdera färg koppling genom gap junctions som dessa celler beskrevs för att uttrycka funktionella gap-junctions bildats genom connexin 43 21. Figur 1 visar injektions av Lucifer Yellow när den tillämpas i en cell nedanför spetsen på pipetten. Efter några minuter, kopplade celler blir fluorescerande (asterisker) som anger spridningen av det fluorescerande färgämnet genom kanalförbindelser. Antalet celler och tid till blev fluorescerande är direkt förknippad med graden av cellulär kommunikation mellan dessa celler. Figur 2 visar injektion av LY i tymiska epitelceller och skären (infoga d) visar samtidig injektion av LY och Rhodamine Dextran (10 kDa). Som väntat LY passerar till en angränsande cell, även om Rhodamine Dextran gör inte på grund av dess höga molekylvikt. Dessutom, närvaron av en GJ blockerare (infoga f), oktanol, blocked passagen av färgämnet till de omgivande cellerna. Alternativt kan man utvärdera graden av koppling av en specifik cell eller effekten av ett läkemedel på funktionen av GJ. Figur 3A visar injektion av LY i TEC-celler med eller utan dexametason. Varefter 100 celler injicerades, i närvaro av dexametason och den procentuella andelen av 1 eller 2-celler som kommunicerar var liknande i förhållande till kontrollen utan läkemedlet. antalet 3 eller 4-celler som kommunicerar var dock högre jämfört med kontroll. Fem eller 6 celler och 7 eller 8 celler med GJ kommunikation i närvaro av dexametason observerades inte i kontrollen, vilket tyder på att dexametason ökade graden av koppling i TEC-celler.
Figur 1: Lucifer Yellow injektion i IT-76MI celler. (A) Den mikropipett nära cellmembranet. (B (C) En testpuls genererades för att kontrollera om elektroden faktiskt injicera färgämnet. (D) Pipetten rörde cellmembranet och det fylldes med Lucifer Gul färg. (E) Cellen sats tillåts färgen att passera genom kanalförbindelser till åtminstone fem grannceller (visas med pilarna), X20. F) En digital zoom gjordes för att möjliggöra bättre visualisering. Asterisker påpekar de celler som satsades i kontrast fas mikroskopi (Figur 1A). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Lucifer Yellow injektion tymiska epitelceller (TEC). Faskontrast och fluorescens-mikroskopi. (A B) Human Thymic Epitelcellsproliferation. (C och D) Thymic Nurse Cell, (E och F) A Mouse Thymic epitelcellinje, respektive. Insatsen i (D) visar samma cell (pil) efter en injektion av Rhodamine-dextran 10 kDa (inte genomträngliga genom gap junctions). Insatserna i (E) och (F) visar avsaknad av färgöverföring i TEC linjen förbehandlats med oktanol 1 mM (ett gap junction-blockerare) under 10 min. I alla paneler asterisker markerar de injicerade cellerna. (AF) X 200. Återgiven från Alves m.fl.. , 1995 5. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Gap Junction Communication ökade med dexametason i en rått epitelceller linje. TEC behandlades med 1 | iM dexametason, och kopplingsgraden utvärderades genom Lucifer Yellow färgöverföringsanalys. (A) Mikroskopi fält (fas kontrast och fluorescens, respektive, i den vänstra och högra paneler) som visar den injicerade cellen och de som kopplades när LY injicerades (förstoring 320X). I alla paneler asterisker markerar de injicerade cellerna. (B) Histogram som visar mönstret för koppling av kontroll och dexametasonbehandlade celler. Analysen består av 100 microinjections per grupp. Reproduceras från Alves et al., 2000 23. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| FÄRGA | MW | Excitation / emission |
| hydroxikumarin karboxylsyra | 206 | 386/488 |
| kalcein blå | 321 | 360/449 |
| 4 ', 6-diamidino-2-fenylindol-dihydroklorid | 279 | 358/461 |
| karboxifluorescein | 376 | 492/517 |
| ethidium jodid (bromid) | 314 | 518/605 |
| Lucifer Yellow CH | 443 | 428/536 |
| Alexa Fluor 488 | 570,5 | 495/519 |
| kalcein | 622 | 494/517 |
| propidiumjodid | 414 | 535/617 |
Tabell 1: Färgämnen för närvarande används för mikroinjektionsexperiment. Här i,Några används färgämnen med molekylvikt och våglängden excitation / emission.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
För att kontrollera förekomsten av funktionella inter gap junction, användning av spårämnen, som är membran ogenomträngligt, men genomträngligt genom inter kanaler krävs 16. Fluorescein, den första fluorescerande färg för att observera cell-till-cell-koppling 22, är permeabel mellan icke junctionala membran 3 och har därför ersatts med Lucifer Yellow färgämne 15. För närvarande, för att hitta det bästa valet bland de många olika typer av fluorescerande spårämnen beror på omfattningen och villkoren för experimentet. Proceduren i cellbelastning med fluorescerande färgämnen medger utvärdering av morfologi, funktion av enstaka celler och den kinetiska hastigheten för överföring mellan celler. Dessutom tillåter färgämne mikroinjektion en bättre förståelse av den fysiologiska rollen för kanalförbindelser mellan celler 21, 23, eftersom graden av cellular kommunikation förbinds med det antal av kopplade celler.
Flera viktiga faktorer är avgörande för att framgångsrikt erhålla mikroinjektion uppgifter. Normal cell homeostas och integritet måste upprätthållas, alltså en kort insprutningstiden (<1 s) av färgämne och teknisk expertis med mikroinjektion behövs. Nyckelfaktorer i att få en bättre upplösning av de tagna bilderna är att ha en kyld CCD-kamera, fluorescensfilter på plats och användning av en hög målsättning NA 14. Dessutom kan några tips vara användbara som: 1) cellodlingsskålar med galler rekommenderas att visualisera en viss injicerade cell, också glasbottnade rätter bör användas för högupplösta mikroskopi applikationer; 2) är det rekommenderat att göra 10-20 drog nålar innan microinjections; 3) beroende på resistansen hos elektrodspetsen kan vara till stor hjälp, lastning mikropipett med färgämnet med användning av kapillaritet genom att trycka på pipettspetsen i färgämneslösningen; 4) det är inte nödvändigt att läsa in hela kroppen av pipetten, några mikroliter för att fylla spetsen och 2 till 3 mm ovanför spetsen är tillräcklig; 5) starta experimentet med en mindre förstorad lins och försöka se skuggan av pipetten väggarna. Efteråt flytta pipetten så nära som möjligt och innan du rör cellen, flyttas till högre förstoring mål, såsom 40x eller större; 6) Vissa grupper använder en pneumatisk microinjector. Pneumatisk injektion är inte det bästa valet, eftersom det är inte exakt och kan injicera okända volymer; med en puls protokollet skulle kunna standardiseras för att injicera en känd volym av färgämne. Dessutom är det rekommenderat att injicera in i membranet ovanför cytosolen på grund av djupet; injektion i membranet ovanför kärnan kan skada den och påverka cellfysiologi. Slutligen celler som inte är alltför platt är att föredra över plana sådana.
Sammanfattningsvis är effektiv denna metod för att studera intercellulär kommunikation genom kanalforbindelser men behöverexpertis / erfarenhet och bra material och utrustning för att erhålla data av hög kvalitet. Vi hoppas att den här artikeln och video hjälpa nybörjare att förstå och utföra denna teknik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lucifer yellow | Sigma | L0259 | |
| Lithium Chloride | Sigma | L4408 | |
| PBS tablets | Sigma | P4417 | |
| RPMI | Sigma | R4130 | |
| Bovine fetal serum | Cultilab | ||
| Trypsin | Sigma | T4799 | |
| vibration-insulated table | Newport | VH3036W-OPT | A vibration-insulated table is needed to protect the experiments from vibration and avoid cell damage |
| Micromanipulator | Narishige | MMO-203 | This equipment allows precision adjustments of the micropipette, which is needed for cell micro injection. |
| Current Generator | Digitimer | DS2 | To produce the dye flow through the micropipette, a current below one nano ampere was given using a current generator with an electrode inside the micropipette or an amplifier which has a capacitance compensation circuit (old electrometer) or current injection functions of new patch clamp amplifiers, and the ground wire submersed in the plate dish. Alternatively, the dye can be injected by a pneumatic microinjector, following the factory recommendations. |
References
- Bennett, M. V., et al. Gap junctions: new tools, new answers, new questions. Neuron. 6 (3), 305-320 (1991).
- Orellana, J. A., Martinez, A. D., Retamal, M. A. Gap junction channels and hemichannels in the CNS: Regulation by signaling molecules. Neuropharmacology. , (2013).
- Peracchia, C. Structural correlates of gap junction permeation. Int Rev Cytol. 66, 81-146 (1980).
- Loewenstein, W. R. Junctional intercellular communication and the control of growth. Biochim Biophys Acta. 560 (1), 1-65 (1979).
- Alves, L. A., et al. Functional gap junctions in thymic epithelial cells are formed by connexin 43. Eur.J Immunol. 25 (2), 431-437 (1995).
- Alves, L. A., et al. Are there functional gap junctions or junctional hemichannels in macrophages? Blood. 88 (1), 328-334 (1996).
- Fonseca, P. C., et al. Characterization of connexin 30.3 and 43 in thymocytes. Immunology letters. 94 (1-2), 65-75 (2004).
- Nihei, O. K., et al. Modulatory effects of cAMP and PKC activation on gap junctional intercellular communication among thymic epithelial cells. BMC Cell Biol. 11, 3 (2010).
- Czyz, J., Szpak, K., Madeja, Z. The role of connexins in prostate cancer promotion and progression. Nat Rev Urol. 9 (5), 274-282 (2012).
- El-Saghir, J. A., El-Habre, E. T., El-Sabban, M. E., Talhouk, R. S. Connexins: a junctional crossroad to breast cancer. Int J Dev Biol. 55 (7-9), 773-780 (2011).
- Cea, L. A., et al. Connexin- and pannexin-based channels in normal skeletal muscles and their possible role in muscle atrophy. J Membr Biol. 245 (8), 423-436 (2012).
- Cotrina, M. L., Nedergaard, M. Brain connexins in demyelinating diseases: therapeutic potential of glial targets. Brain Res. 1487, 61-68 (2012).
- Park, H. an-A., R, S., Khanna, S. avita, Sen, C. handan K. Current Technologies in Single-Cell Microinjection and Application to Study Signal Transduction. Methods in Redox Signaling. , Chapter 10 (2010).
- Abbaci, M., Barberi-Heyob, M., Blondel, W., Guillemin, F., Didelon, J. Advantages and limitations of commonly used methods to assay the molecular permeability of gap junctional intercellular communication. Biotechniques. 45 (1), 33-52 (2008).
- Stewart, W. W. Functional connections between cells as revealed by dye-coupling with a highly fluorescent naphthalimide tracer. Cell. 14 (3), 741-759 (1978).
- Meda, P. Probing the function of connexin channels in primary tissues. Methods. 20 (2), 232-244 (2000).
- Klaunig, J. E., Shi, Y. Assessment of gap junctional intercellular communication. Curr Protoc Toxicol. , Chapter 2 Unit2 17 (2009).
- Hanani, M. Lucifer yellow - an angel rather than the devil. J Cell Mol Med. 16 (1), 22-31 (2012).
- Orci, L., Biochemistry, C. Blockage of Cell-to-Cell Communication within Pancreatic Acini Is Associated with Increased Basal Release of Amylase Materials and Methods Preparation of Acini. Cell. 103 (August), 475-483 (1986).
- Hitomi, M., et al. Differential connexin function enhances self-renewal in glioblastoma. Cell Rep. 11 (7), 1031-1042 (2015).
- Nihei, O. K., Campos de Carvalho,, C, A., Spray, D. C., Savino, W., Alves, L. A. A novel form of cellular communication among thymic epithelial cells: intercellular calcium wave propagation. Am J Physiol Cell Physiol. 285 (5), C1304-C1313 (2003).
- Kanno, Y., Loewenstein, W. R.
- Alves, L. A., Nihei, O. K., Fonseca, P. C., Carvalho, A. C., Savino, W. Gap junction modulation by extracellular signaling molecules: the thymus model. Braz J Med Biol Res. 33 (4), 457-465 (2000).
