在皮肤中的单神经末梢体内双光子显微镜

Summary

该协议的动态纵向成像和神经末梢记者在转基因小鼠中的选择性激光损伤呈现。

Abstract

在皮肤神经末梢参与生理过程，如感测¹以及在病理过程，如神经性疼痛^2。他们贴近地表的定位有利于皮肤神经末梢的生活完整的动物显微成像。使用多光子显微术，它能够获得精细图像克服的皮肤组织的强烈的光散射问题。表达的THY-1启动子在神经元（包括周感觉神经元）的控制下EYFP记者转基因小鼠是适合于个别的神经末梢在延长的时间周期的纵向研究长达数月甚至终生。此外，使用相同的飞秒激光作为用于成像，所以能够产生神经纤维的高选择性病变的神经纤维重组的研究。在这里，我们提出了一个简单而可靠的协议进行纵向多光子活体成像和基于激光显微对小鼠皮肤的神经末梢。

Introduction

皮肤的神经末梢发生在不同的病理生理状态的动态变化。神经纤维可以通过变性和再生或重组过程中这种疾病的过程中如周围神经病变²莫顿神经瘤^3。跌打损伤后，神经末梢动态皮肤的一个重要组成部分是受损区域的神经再支配。然而，对于神经末梢调查的通常的方法是在体外组织学切片，缺乏对正在进行的流程⁴的实时信息。用遗传编码的荧光标记物，所以能够掌握其神经末梢活体动物的皮肤，从而获得关于结构变化丰富和显著更多相关信息。皮神经末梢的调查能够使用常规荧光显微镜，然而，皮肤组织的强烈的光散射强烈破坏了质量数据的获取^5。多光子显微镜能够取得在强烈散射组织中的高清晰度图像，由于只从物镜的焦点导致荧光发射的激发光的光子能量的非线性总和。这个效果导致了强劲增长的穿透深度和改善信号对噪声比的测量在皮肤组织^6。使用相同的激光作为成像，所以能够产生神经纤维⁷的选择性清扫。在下面的协议，我们将展示在体内的皮肤神经末梢纵向成像的记者转基因小鼠结合使用市售的多光子显微镜系统选择性激光损伤的方法。

Protocol

涉及动物主题手续已批准的全国动物实验局，芬兰。

1，动物准备成像

1. 由intraperitional（IP）注射氯胺酮（每体重0.08毫克）和甲苯噻嗪（每体重0.01毫克），麻醉鼠标。检查与后脚趾捏反射麻醉。
2. 沉浸动物的眼睛滴眼液（，涉及的），以保护眼睛免受脱水。
3. 把鼠标放在一个加热垫（仕霸）在37℃，以防止体温过低。
4. 清洁指定用于成像，用70％乙醇的足垫。
5. 添加一滴水在脚下垫皮和玻璃盖之间的耦合浸泡的皮肤。
6. 把塑料包装材料在被定位在一个金属环与盖类的后肢。
7. 调整塑料包装材料的厚度，以弄平皮肤。
8. 把一滴水封面上的GLASS表示玻璃盖和物镜之间的浸没。

2，金属环固定器的制备

1. 对于皮肤的稳定利用该金属固定器。我们使用社区设计保护两翼固定器与金属环（礼貌Neurotar有限公司，芬兰）。填充注射器强力胶，把小滴强力胶，通过针环上，轻轻地传播胶水环表面均匀覆盖。关键是要放的是只需要为均匀的覆盖胶的最小量，因为胶水过多量可以减少视图的字段和阻碍后续的成像。
   注：在金属条（从下方）和标准显微镜玻片上（作为盖）的可替换的组合可以被用来压平的皮肤，并确保在组件¹⁴的适当的光学耦合。两个纸夹可用于固定玻璃和金属条表面之间的爪（ 图4
2. 覆盖环显微镜盖玻片（直径5 mm，电子显微镜学）。
3. 拧上环固定器是拼接而成的电动显微镜阶段的刚性金属条。

3，影像学检查

1. 在使用THY1-YFP-H的小鼠中选择的荧光灯的光谱的蓝色部分的可视化的神经纤维。查找在萤光模式感兴趣的神经和聚焦。
2. 写下纵向成像的点的坐标。使用腕垫作为参考点。在接下来的成像会议，第一次检测的腕垫，然后找到同样的上游的大神经纤维，回去使用保存的坐标。至关重要的是定位在同一方向上的脚垫垂直于金属棒保持的基准相同的系统。
3. 打开的双光子模式。为THY1-YFP-H老鼠，它适合于使用激光辐射的950纳米波长的可视化的神经纤维。
4. 选择激光波长和发射信道（从450至480纳米的二次谐波生成的检测，从520到550nm的YFP标记的神经成像和从580到630纳米的检测YFP的荧光和头发的自发荧光的），开始低激光功率（3-5％），以防止光损伤和漂白。在光电倍增管的典型电压为600-700 V对于这种成像。
5. 设置所需的分辨率（512×512或640×640为快速事件的测量，800×800或1024×1024的形态学成像），轴向步骤（1-3微米），将样品的厚度和时间间隔（1-10分）。曝光时间是在每1个像素的1毫秒的顺序。
6. 第一标记中的软件的成像体积的上边界和下边界。
7. 获取参考图像堆栈病变前的基准。当需要时，可以在几分钟的时间来记录的基线。
8. 后成像清洁用纸巾垫，把鼠标在恢复中，在36°C，直到它完全清醒。
   注意：通常情况下，一个成像会话结合激光诱导损伤的持续时间（见下文）不超过1小时。我们建议您确认该动物是深度麻醉每次10-15分钟;这不应该随着影像本身的干扰，但同时，实验步骤，计划应予以考虑。单氯胺酮/ xylazyne剂量效果的持续时间大约是30到40分钟，因此我们建议申请额外四分之一后25-30分钟½剂量。
   注意：它应该被认为是很好的时候试验计划的成像会话的单个动物的频率不应该超过1次每2天，避免了重新不利影响petitive麻醉。

4，激光损伤

1. 获取参考图像堆栈后，用漂白协议，使微小病变。
2. 增加激光功率为100％。
3. 增加曝光时间，以每感兴趣（100-1,000x超过了标准的情况下成像）区域100-1,000毫秒。
4. 概述了病变区域。
5. 通过在漂白切换使病变。
6. 切换回普通拍摄模式，并继续延时录像。

5，数据处理和分析

1. 使用混合光谱中的插件ImageJ的⁸混溶继续（约阿希姆·沃尔特http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/spectral-unmixing.html ）。
2. 打开图像堆栈和分裂的通道。
3. 发现游离的神经或头发的背景测量的面积。把一个区域Ø˚F的兴趣在这一领域。
4. 小心地勾划出发，其中它是由神经清晰可辨的一部分。
5. 封装在所述图像的一部分，它是独立于头发的神经。
6. 保存解混矩阵。
7. 整个堆栈应用实测解混矩阵。
8. 保存为*。TIF格式，新的图像处理堆栈。

Representative Results

使用所描述的技术也能够掌握其损伤后在同一光纤，并研究了受损的神经末梢（ 图1）的降解。采集的堆栈120-150微米的厚度通常是正确的重复成像期间数天，以保持在整个纤维中的视场。

病灶通常可以简明地产生时的塑料包装材料被调整到弄平皮肤，使胶原蛋白层出现在图像上均匀的强度（ 图2）。神经末梢的胶原层之上是，以产生精确的病变最合适的。

如果皮肤不平坦的，可能会出现图像模糊（ 图3）。在这种情况下，强度仍然可以是适合于在神经纤维的形态学研究，但会在激光损伤过程受到阻碍。

的激光损伤的神经纤维表现为最大的投影图像的效果如图1时间轨道，上部图片显示纤维和病变后直接，下图显示，30分钟后和10天（左和同一纤维前右侧面板，相应的）。有非神经性的出现损伤后10天有YFP的表达结构。这些结构很可能是已知能表达大鼠Thy1基因瞬时创伤的条件下的角质形成细胞。神经纤维的YFP的荧光显示为黄色。箭头标记病灶的区域。比例尺为30μm。

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为在平坦的皮肤区域神经末梢图2最大的投影图像。神经纤维的YFP的荧光显示为黄色，在二次谐波生成的胶原蛋白显示为蓝色。比例尺为50μm。

图3中所获得的最大z轴投影为多个的光学部分的皮肤的弯曲区域中的神经末梢。神经纤维和毛发的自体荧光的YFP的荧光显示为黄色，在二次谐波生成的胶原的示蓝色。比例尺为50μm。

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图4：采用显微镜载玻片为掩护的爪子固定的程序。滑动连接到使用标准的回形针的金属条。

Discussion

在这个视频协议，我们证明了该方法的单神经末梢的非侵入性的纵向双光子成像。

皮肤神经支配的动力学在这些疾病如牛皮癣和外周神经病变^2，并且在创伤性损伤⁹受到影响。双光子成像允许神经纤维结构中的胶原基质的详细分析。利用转基因小鼠的报道中，有助于避免与神经纤维的染色的问题。 THY1-YFP-H菌株似乎是形态学数据分析¹⁰足够坚固，而大鼠Thy1-mitoCFP小鼠可提供在神经纤维¹¹线粒体动力学的功能性研究的机会。在YFP-16 / ICR线可用于观察迈斯纳机构^12。的另一种方法可以是病毒注射到脊髓背根神经节的特定神经元群体的选择跟踪13。

但值得注意的是生产的胶原蛋白基质中选择性病变的强烈受阻相比于皮肤的上层。这就是为什么有时候曝光时间为神经纤维的夹层可以不同高达十倍，而荧光用于成像的强度不同，在10-20％的范围内。以保持恒定浸没耦合必须保持图象的质量好。

图像的分辨率通常依赖于收购所需的速度。典型的生产时间30 frames-栈，分辨率800×800像素的是1分钟，这样可以降低分辨率或成像区域的厚度检测的快速变化或增加罚款形态特征的研究解决。

足垫的固定应紧够不使图像的漂移，但同时它不应该影响血液循环的叔他的皮肤。对于该过程的优化，血管示踪剂注射剂（ 例如 ，TexasRed标记的70kDa的葡聚糖）是可能的，从而允许一个通过监测血流来调节塑料包装材料的压力。在该协议中所描述的制备的运动伪影是不可能的，因为该动物深度麻醉，爪本身被牢固地附连到固定组件，并且因为心跳和呼吸运动不直接传递到爪子。然而，轻微的运动是可能的特别是如果进行高倍率成像。在这种情况下，我们可以建议您使用设计的，以补偿运动伪影的ImageJ插件。

相同区域的重复成像可以通过使用这样的参考点作为腕垫^14，或在注射情况下，在足垫注射点可以作为一个划时代⁶某些物质来实现。另一种可能是皮肤的纹身。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Round cover glass	Electron Microscopy Science	72296-05	5 mm diameter #1.5 thickness
Eye drops Viscotears	Novartis		2 mg/g
Superglue Loctite 401	Henkel	135429
Ketaminol	Intervet		Ketamine 50 mg/ml, working solution 10 mg/ml (use it 80 µg per gram of animal weight)
Rompun	Bayer Healthcare		Xylazine 20 mg/ml, working solution 1.25 mg/ml (use it 10 µg per gram of animal weight)
Ethanol 70%
Distilled water or Milli-Q water
Syringes 1 ml	BD	300013
30 G 1/2" needles	BD	304000
Plastic packaging material			Could be purchased from general hardware store
FV-1000MPE microscope	Olympus	FV-1000MPE	Microscope with motorized stage and rigid metal bar for fixation
25X XLPlan objective	Olympus	XLPLN 25XWMP	Water immersion objective optimized for multiphoton imaging
Mai-Tai DeepSee laser (2 W)	SpectraPhysics
Heating pad	Supertech	TMP-5b	Heating pad with a temperature controller
Metal ring fixator	Neurotar Ltd.
ImageJ	NIH		Open source software for image processing and analysis, http://rsbweb.nih.gov/ij/
Thy1-YFPH mice strain	JaxLab	003782