In Vivo microscopie à deux photons de terminaisons nerveuses dans la peau simples

Summary

Le protocole pour l'imagerie dynamique longitudinale et lésion laser sélectif de terminaisons nerveuses chez des souris transgéniques reporter est présente.

Abstract

Les terminaisons nerveuses de la peau sont impliqués dans des processus physiologiques tels que la détection ^d'une aussi dans des processus pathologiques tels que la douleur neuropathique ^2. Leur positionnement proche de la surface facilite l'imagerie microscopique de terminaisons nerveuses de la peau chez l'animal intact vivant. En utilisant la microscopie multiphotonique, il est possible d'obtenir des images fines à surmonter le problème de la forte dispersion de la lumière du tissu cutané. Reporter souris transgéniques qui expriment EYFP sous le contrôle de Thy-1 promoteur dans les neurones (y compris la périphérie des neurones sensoriels) sont bien adaptés pour les études longitudinales de chaque terminaisons nerveuses sur des périodes de temps prolongées jusqu'à plusieurs mois, voire toute une vie. En outre, en utilisant le même laser femtoseconde comme pour l'imagerie, il est possible de produire des lésions hautement sélectifs des fibres nerveuses pour les études de la restructuration de fibres nerveuses. Ici, nous présentons un protocole simple et fiable pour multiphotonique longitudinale en imagerie in vivo etmicrochirurgie au laser sur la souris terminaisons nerveuses de la peau.

Introduction

Terminaisons nerveuses cutanées subissent des changements dynamiques sous différents états physiopathologiques. Les fibres nerveuses peuvent passer par le processus de dégénérescence et de régénération ou de restructuration dans le cadre de maladies telles que la neuropathie périphérique ² ou Morton neurinome ^3. Après un traumatisme, une partie importante de terminaisons nerveuses dynamique dans la peau est réinnervation de la zone endommagée. Cependant, l'approche commune pour enquêter sur les terminaisons nerveuses est ex vivo histologique sectionnement qui manque d'informations en temps réel sur les processus en cours ^4. En utilisant des marqueurs fluorescents génétiquement codés, il est possible de suivre les terminaisons nerveuses de la peau d'animaux vivants, obtenant ainsi une information riche et beaucoup plus pertinentes sur les changements structurels. L'étude des terminaisons nerveuses cutanées est possible en utilisant la microscopie à fluorescence classique, cependant, la forte dispersion de la lumière du tissu cutané compromet fortement la qualitédes données acquises ^5. La microscopie multiphotonique permet l'acquisition d'images à haute résolution dans les tissus fortement de diffusion en raison de la somme non-linéaire de l'énergie des photons de lumière d'excitation résultant des émissions de fluorescence seulement du point focal de l'objectif. Cet effet conduit à une forte augmentation de la profondeur de pénétration et une amélioration de rapport signal sur bruit de la mesure, dans les tissus de la peau ^6. En utilisant le même laser pour l'imagerie, il est possible de produire dissection sélective des fibres nerveuses ^7. Dans le protocole suivant, nous montrons le procédé d'imagerie longitudinal de terminaisons nerveuses cutanées in vivo dans des souris transgéniques reporter associé à une lésion sélective au laser disponible dans le commerce en utilisant le système de microscope multiphotonique.

Protocol

Procédures portant sur des sujets animaux ont été approuvés par le Conseil d'expérimentation animale nationale, de la Finlande.

1 Préparation des animaux pour l'imagerie

1. Anesthésier une souris par intraperitional (IP) injection de kétamine (0,08 mg par poids corporel) et de xylazine (0,01 mg par kg de poids corporel). Vérifiez l'anesthésie avec l'arrière réflexe orteil de pincement.
2. Plongez les yeux de l'animal en collyre (Viscotears) pour protéger les yeux de la déshydratation.
3. Mettez la souris sur un coussin chauffant (Supertech) à 37 ° C pour éviter l'hypothermie.
4. Nettoyer le coussinet plantaire désigné pour l'imagerie avec 70% d'éthanol.
5. Ajouter une goutte d'eau sur la peau du coussinet plantaire pour le couplage d'immersion entre la peau et le verre de couverture.
6. Placer un matériau d'emballage en matière plastique sous la patte arrière qui est positionné sous une bague métallique de la classe de couverture.
7. Ajuster l'épaisseur de la matière d'emballage en plastique pour aplatir la peau.
8. Mettre une goutte d'eau sur les glas de couvertures pour une immersion entre le verre et le couvercle de l'objectif.

2. métal fixateur Anneau Préparation

1. Pour la stabilisation de la peau utiliser le fixateur de métal. Nous utilisons de conception communautaire protégé fixateur deux ailes avec un anneau métallique (avec la permission de Neurotar Ltd, Finlande). Remplir la seringue avec de la colle, mettre la petite goutte de colle à travers l'aiguille sur le ring et écartez doucement la colle pour une couverture uniforme de la surface de l'anneau. Il est essentiel de mettre la quantité minimale de colle qui est nécessaire seulement pour une couverture uniforme, parce quantité excessive de colle peut réduire le champ de la vue et d'entraver l'imagerie ultérieure.
   NOTE: En variante, la combinaison d'une barre de métal (par-dessous) et lame de verre de microscope standard (comme une couverture) peut être utilisé pour aplatir la peau et pour assurer un couplage optique correct de l'ensemble ^14. Deux trombones pourraient être utilisés pour fixer la patte entre le verre et la surface de la barre métallique (Figure 4
2. Couvrir le ring avec lamelle de microscope (5 mm de diamètre, la microscopie électronique à la science).
3. Visser la bague fixateur à la barre de métal rigide qui est montaged sur la platine du microscope motorisé.

3. procédure d'imagerie

1. En cas d'utilisation de la souris Thy1-YFP-H, choisissez la partie bleue de la lampe spectres de fluorescence pour visualiser les fibres nerveuses. Trouver le nerf d'intérêt en mode épifluorescence et se concentrer sur elle.
2. Notez les coordonnées d'un point pour l'imagerie longitudinale. Utilisez un tampon carpien comme un point de référence. Pendant les séances d'imagerie suivants, détecter d'abord la plaquette carpien et ensuite trouver les mêmes fibres nerveuses de gros en amont et en revenir en utilisant les coordonnées enregistrées. Il est indispensable de positionner le coussinet de la patte dans la même direction perpendiculaire à la barre métallique afin de maintenir le même système de référence.
3. Activez le mode à deux photons. Pour les souris Thy1-YFP-H, il convient d'utiliser la longueur d'onde de 950 nm du rayonnement laserà visualiser les fibres nerveuses.
4. Sélectionner les longueurs d'onde de laser et d'émission des canaux (450 à 480 nm pour la seconde détection harmonique de production, de 520 à 550 nm pour l'imagerie des nerfs YFP-marquées et de 580 à 630 nm pour la détection de la YFP fluorescence et l'autofluorescence des cheveux), démarrer avec puissance laser faible (3-5%) pour prévenir le photovieillissement et de blanchiment. La tension typique sur les tubes photo-multiplicateurs est de 600 à 700 V pour ce type d'imagerie.
5. Réglez la résolution souhaitée (512 x 512 ou 640 x 640 pour les événements des mesures rapides, 800 x 800 ou 1024 x 1024 pour l'imagerie morphologique), étape axiale (1-3 pm), l'épaisseur de l'échantillon et les intervalles de temps (1-10 min). Le temps d'exposition est de l'ordre de 1 ms par un pixel.
6. Tout d'abord marquer les limites supérieure et inférieure du volume d'imagerie dans le logiciel.
7. Acquérir la pile d'images de référence pour la référence avant la lésion. En cas de besoin, il est possible d'enregistrer la ligne de base au cours de plusieurs minutes.
8. Après l'imagerie propre le tampon avec un tissu et de mettre la souris dans une boîte de récupération à 36 ° C jusqu'à ce qu'il soit complètement réveillé.
   REMARQUE: En général, la durée d'une session d'imagerie combinée avec lésion induite par laser (voir ci-dessous) ne dépasse pas 1 heure. Nous vous recommandons de vérifier que l'animal est profondément anesthésié toutes les 10-15 minutes; cela ne devrait pas interférer avec elle-même, mais l'imagerie doit être considérée, alors que la procédure expérimentale est prévue. La durée de l'effet d'une dose unique de kétamine / de xylazyne est d'environ 30 à 40 minutes, donc nous vous recommandons d'appliquer davantage de ¼ à ½ dose après 25-30 min.
   REMARQUE: Il doit être considéré comme bien quand l'expérimentation prévoit que la fréquence des séances d'imagerie pour un animal ne doit pas dépasser 1 séance pour 2 jours pour éviter les effets négatifs de reanesthésie concurrentiel.

4. laser des lésions

1. Après l'acquisition de l'image pile de référence, utiliser le protocole de blanchiment de faire une micro lésion.
2. Augmenter la puissance du laser de 100%.
3. Augmenter le temps d'exposition à 100-1.000 ms par région d'intérêt (100-1,000x plus que dans le cas de l'imagerie standard).
4. Délimiter la zone de la lésion.
5. Faire la lésion par la mise en marche du blanchiment.
6. Revenez à la mode d'imagerie régulier et continuer avec des enregistrements time-lapse.

5. traitement et analyse des données

1. Procéder à unmixing utilisant Déconvolution spectrale plugin dans ImageJ ⁸ (Joachim Walter, http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/spectral-unmixing.html ).
2. Ouvrez la pile d'images et de diviser les canaux.
3. Trouvez la zone de libre des nerfs ou des cheveux pour les mesures de fond. Mettez une région ointérêt de f dans ce domaine.
4. Décrire avec soin la partie des cheveux où elle se distingue nettement des nerfs.
5. Exposer le nerf dans la partie de l'image où elle est séparée de la chevelure.
6. Enregistrer unmixing matrice.
7. Appliquer matrice de unmixing mesurée pour l'ensemble de la pile.
8. Enregistrez les nouveaux piles d'images traitées au format * .tif.

Representative Results

Selon la méthode décrite, il est possible de suivre la même fibre après la lésion et à l'étude de la dégradation des terminaisons nerveuses endommagées (figure 1). Acquisition de la pile à l'épaisseur de 120 à 150 um est généralement approprié pour l'imagerie répétitive pendant plusieurs jours afin de maintenir l'ensemble de fibres dans le champ de vision.

La lésion peut généralement être réalisée de façon concise lorsque le matériau d'emballage en matière plastique est ajusté à aplatir la peau, de sorte que les couches de collagène apparaissent avec une intensité uniforme sur l'image (figure 2). Les terminaisons nerveuses dessus de la couche de collagène sont les plus appropriés pour produire la lésion précis.

Dans le cas où la peau n'est pas aplatie, l'image peut se produire à s'estomper (Figure 3). L'intensité de cette situation peut encore être adaptée à des investigations morphologiques des fibres nerveuses, mais la procédure de lésion laser serait être entravée.

Figure 1 Durée piste de l'effet de la lésion de laser sur la fibre nerveuse présentés sous forme d'images maximal de projection. Les images supérieures correspond à la fibre avant et directement après la lésion, le panneau inférieur montre la même fibre, après 30 minutes et 10 jours (à gauche et à panneaux de droite, de manière correspondante). Il existe des structures exprimant YFP de nature non neuronales qui apparaissent 10 jours après la lésion. Ces structures sont susceptibles d'être des kératinocytes qui sont connues pour exprimer le gène de manière transitoire dans des conditions Thy1 traumatiques. La fluorescence YFP des fibres nerveuses est indiqué en jaune. Une flèche indique la zone de la lésion. Barre d'échelle de 30 um.

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Figure 2: image maximale de projection pour les terminaisons nerveuses dans la zone aplatie de la peau. L'fluorescence YFP des fibres nerveuses est représenté en jaune, la génération de second harmonique du collagène est représentée en bleu. Barre d'échelle de 50 um.

Figure 3 Les terminaisons nerveuses dans la zone courbe de la peau obtenu à la z-projection maximale de multiples sections optiques. L'fluorescence YFP de fibres nerveuses et l'autofluorescence des cheveux est représenté en jaune, la génération de seconde harmonique du collagène est montré en bleu. Barre d'échelle de 50 um.

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Figure 4 La procédure de fixation de la patte à l'aide de la lame de verre de microscope comme un couvercle. La lame est fixée à la barre métallique à l'aide des clips de papier standard.

Discussion

Dans ce protocole vidéo, nous démontrons le procédé de formation d'image longitudinal à deux photons non-invasive de terminaisons nerveuses individuelles.

La dynamique de l'innervation de la peau est affectée dans des maladies telles que le psoriasis et la neuropathie périphérique ^2, et dans les lésions traumatiques ^9. L'imagerie à deux photons permet une analyse détaillée des structures de fibres nerveuses dans la matrice de collagène. L'utilisation de souris transgéniques rapporteurs permet d'éviter les problèmes liés à la coloration des fibres nerveuses. Thy1-YFP-H souche semble être suffisamment robuste pour l'analyse des données morphologiques ¹⁰ tandis que les souris Thy1-mitoCFP peuvent être l'occasion de l'étude fonctionnelle de la dynamique des mitochondries dans les fibres nerveuses ^11. La ligne 16-YFP / ICR peut être utilisé pour l'observation d'organes Meissner ^12. L'approche alternative peut être l'injection du virus dans les ganglions de la racine dorsale pour le suivi sélectif des populations neuronales spécifiques13.

Il convient de noter que la production d'une lésion sélective à l'intérieur de la matrice de collagène est fortement entravée par rapport aux couches supérieures de la peau. C'est pourquoi parfois des temps d'exposition pour la dissection des fibres nerveuses peuvent varier autant que dix fois tandis que l'intensité de la fluorescence pour la formation d'image diffère de la gamme de 10 à 20%. Pour maintenir une bonne qualité de l'image de l'accouplement d'immersion constante doit être maintenue.

La résolution de l'image dépend généralement de la vitesse souhaitable d'acquisition. Temps typique pour la production d'une pile Cadres- 30 de la résolution 800 x 800 pixels est de 1 min, on peut donc diminuer la résolution ou l'épaisseur de la zone imagée pour détecter les changements rapides ou augmenter la résolution de fines études Caractéristiques morphologiques.

La fixation de la patte doit être suffisante pour ne pas permettre à la dérive de l'image serré, mais en même temps il ne devrait pas affecter la circulation du sang dans le til la peau. Pour l'optimisation de la procédure, les injections de vaisseaux sanguins traceurs (par exemple, TexasRed étiquetés dextran 70 kDa) sont possibles, permettant de régler la pression de matériaux d'emballage en plastique par la surveillance de la circulation sanguine. artefacts de mouvement dans la préparation décrite dans ce protocole est peu probable parce que l'animal est profondément anesthésié, la patte elle-même est fermement attaché à l'ensemble de fixation, et parce que le rythme cardiaque et la respiration de mouvement ne sont pas directement transmises à la patte. Toutefois, de légers mouvements sont possibles, surtout si l'imagerie à fort grossissement est réalisée. Dans ce cas, nous pouvons recommander l'utilisation des plugins ImageJ destinées à compenser les artefacts de mouvement.

L'imagerie répétitive de la même zone peut être réalisée par l'utilisation de ces points de référence comme tampon carpien ^14, ou en cas d'injection de certaines substances dans le coussinet plantaire de la place de l'injection peut servir de point de repère ^6. L'autre possibilité est le tatouage de la peau.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Round cover glass	Electron Microscopy Science	72296-05	5 mm diameter #1.5 thickness
Eye drops Viscotears	Novartis		2 mg/g
Superglue Loctite 401	Henkel	135429
Ketaminol	Intervet		Ketamine 50 mg/ml, working solution 10 mg/ml (use it 80 µg per gram of animal weight)
Rompun	Bayer Healthcare		Xylazine 20 mg/ml, working solution 1.25 mg/ml (use it 10 µg per gram of animal weight)
Ethanol 70%
Distilled water or Milli-Q water
Syringes 1 ml	BD	300013
30 G 1/2" needles	BD	304000
Plastic packaging material			Could be purchased from general hardware store
FV-1000MPE microscope	Olympus	FV-1000MPE	Microscope with motorized stage and rigid metal bar for fixation
25X XLPlan objective	Olympus	XLPLN 25XWMP	Water immersion objective optimized for multiphoton imaging
Mai-Tai DeepSee laser (2 W)	SpectraPhysics
Heating pad	Supertech	TMP-5b	Heating pad with a temperature controller
Metal ring fixator	Neurotar Ltd.
ImageJ	NIH		Open source software for image processing and analysis, http://rsbweb.nih.gov/ij/
Thy1-YFPH mice strain	JaxLab	003782