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Summary
동적 길이 이미징 및 기자 형질 전환 생쥐의 신경 종말의 선택적 레이저 병변에 대한 프로토콜은 제공됩니다.
Abstract
피부, 신경과 같은 신경 병증 성 통증은이 같은 일을 센싱뿐만 아니라 병리 생리적 과정의 프로세스에 관여된다. 그들의 근접에 표면의 위치는 그대로 동물을 생활에서 피부 신경 말단의 미세한 영상을 용이하게한다. 다 광자 현미경을 사용하면, 피부 조직의 강한 광 산란 문제를 극복 미세 영상을 얻을 수있다. (주변 감각 신경 포함) 뉴런 네-1 프로모터의 조절하에 EYFP을 표현 기자 형질 전환 마우스는 최대 몇 개월 또는 평생 오랜 기간 동안 개별 신경 종말의 종 연구에 적합하다. 또한, 촬상 용으로 동일한 펨토초 레이저를 이용하여, 이는 신경 섬유의 재구성 연구에 신경 섬유의 매우 선택적 병변을 제조 할 수있다. 여기서, 우리는 생체 내에서 촬상 종 다 광자위한 간단하고 신뢰성있는 프로토콜을 제시마우스 피부의 신경 말단에 레이저 기반 미세.
Introduction
피부 신경 말단 다른 병태 생리 학적 상태에 따라 동적 인 변화를 겪는다. 신경 섬유는 말초 신경 병증이 모톤 신경종 또는 3과 같은 질병의 과정에서 변성 및 재생 또는 재구성의 프로세스를 수행 할 수있다. 외상 후 피부의 신경 말단 역학의 중요한 부분은 손상된 영역의 reinnervation이다. 그러나, 신경 종말의 조사를위한 일반적인 방법은 진행중인 프로세스 4에 실시간 정보를 결여 생체의 조직 학적 절편이다. 유 전적으로 인코딩 된 형광 마커를 사용하여, 따라서 구조적 변화에 훨씬 더 풍부하고 관련 정보를 획득하는, 살아있는 동물의 피부에있는 신경 말단을 추적 할 수있다. 피부 신경 종말의 조사는 종래의 형광 현미경이 있지만, 피부 조직의 강한 광산란 강하게 품질을 저해하여 가능하다데이터 5를 인수했다. 다 광자 현미경에 의한 유일한 목적의 초점으로부터의 형광 발광을 초래 여기 광의 광자의 에너지의 비 - 선형 합에 강하게 산란 조직의 고해상도의 영상을 획득하는 것을 허용한다. 이 효과는 피부 조직 (6)에서의 측정 결과에 대한 강력한 침투 깊이의 증가와 신호 대 잡음 비의 향상을 이끈다. 이미징을위한 동일한 레이저를 사용하면, 신경 섬유 (7)의 선택적인 박리를 제조 할 수있다. 다음의 프로토콜에서는 선택적 레이저 병변 시판 다 광자 현미경 시스템을 사용하여 결합 된 리포터 유전자 변형 마우스에서 생체 내 피부 신경 종말의 길이의 촬상 방법을 보여준다.
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Protocol
동물 과목을 포함하는 절차는 국립 동물 실험위원회, 핀란드에 의해 승인되었습니다.
이미징을위한 1 동물 준비
- intraperitional 케타민 (IP) 주입 (체중 당 0.08 mg)의과 자일 라진 (체중 당 0.01 ㎎)을하여 마우스를 마취. 후면 발가락 핀치 반사와 마취를 확인합니다.
- 눈 탈수으로부터 눈을 보호하기 위해 (Viscotears를) 삭제에 동물의 눈을 담근다.
- 저체온증을 방지하기 위해 37 ° C에서 가열 패드 (SUPERTECH)에 마우스를 넣습니다.
- 70 % 에탄올로 영상에 대해 지정된 발 패드를 청소합니다.
- 피부와 커버 글라스 사이에 침지 커플 링 풋 패드의 피부에 물 방울을 추가한다.
- 커버 클래스와 금속 링 아래 위치되는 뒷발 하에서 플라스틱 포장재를 넣어.
- 피부를 평탄화 플라스틱 포장 재료의 두께를 조정한다.
- 커버 GLAS에 물 방울을 넣어커버 유리와 대물 사이 침지들.
2 금속 고정 장치 반지 준비
- 피부의 안정화 금속 고정 장치를 이용한다. 우리는 금속 링 (Neurotar (주), 핀란드의 제공) 커뮤니티 디자인 보호 두 날개 고정 장치를 사용합니다. , superglue과 주사기를 채우기 링에 바늘을 통해 superglue의 작은 방울을 넣어 조심스럽게 링 표면의 균일 한 커버리지 접착제를 확산. 접착제의 양이 과대 시야를 감소시키고 후속 이미징을 방해 할 수 있기 때문에, 단지 균일 따르면에 필요한 접착제의 최소량을 넣어 중요하다.
NOTE : (아래에서)과 금속 바아 (커버)을 표준 현미경 유리 슬라이드의 선택적 조합은 피부를 평평하게하고 적절한 어셈블리 (14)의 광 결합을 보장하기 위해 사용될 수있다. 두 종이 클립 유리 및 금속 바아 표면 사이의 발을 고정하는 데 사용될 수있다 (도 4 - 현미경 커버 슬라이드 (5mm 직경, 전자 현미경 과학)와 함께 반지를 커버.
- 전동 현미경 무대에 montaged되는 단단한 금속 막대에 링 고정 장치에 나사.
3 이미징 절차
- thy1-YFP-H 마우스를 이용하는 경우, 신경 섬유를 시각화하는 형광 램프 스펙트럼의 청색 부분을 선택한다. 표면 형광 모드에 대한 관심의 신경을 찾아 초점을 맞 춥니 다.
- 길이 이미징을위한 장소의 좌표를 기록합니다. 기준점으로 손목 패드를 사용한다. 다음 촬상 세션 중에 제 손목 패드를 감지하고 동일한 상류 큰 신경 섬유를 찾아 저장된 좌표를 사용 돌아가서. 그것은 참조 동일한 시스템을 유지하는 금속 바아에 직교하는 동일 방향으로 다리 패드를 배치하는 것이 필수적이다.
- 두 광자 모드를 켭니다. thy1-YFP-H 마우스의 경우, 레이저 방사의 950 nm 파장을 사용하는 것이 적합신경 섬유를 시각화합니다.
- (450부터 520에서 YFP 표지 된 신경의 촬상 550 ㎚에 대한 580에서 YFP 형광 및 모발의 자기 형광의 검출을 위해 630 ㎚에 제 고조파 발생 검출을위한 480 nm의, 행) 선택 레이저 파장 및 배출 채널, 시작 표백 광 손상을 방지하기 위해 낮은 레이저 파워 (~ 5 %). 광전자 증 배관 튜브의 전형적인 전압은 이미징 이런 종류의 600-700 V이다.
- (1-10 원하는 해상도 (512 X 512 또는 빨리 이벤트 측정 640 × 640, × 800 또는 형태학 이미징 1024 1024 X 800), 축 방향의 공정 (1-3 μM), 시료의 두께와 시간 간격을 설정할 분). 노출 시간은 하나의 화소 당 1 밀리 초 정도이다.
- 먼저 소프트웨어 촬상 공간의 상부 및 하부 경계를 표시한다.
- 병변 전에 참조 용 참조 화상 스택을 획득. 필요하면, 수 분 동안 기준을 기록 할 수있다.
- 티슈로 패드를 깨끗한 영상과 완전히 깨어 때까지 36 ° C에서 복구 상자에 마우스를 넣어 후.
참고 : 일반적으로, 레이저 유도 병변과 함께 한 영상 세션의 지속 시간 (아래 참조) 1 시간을 초과하지 않는다. 우리는 동물이 깊이마다 10 ~ 15 분 마취되어 있는지 확인하는 것이 좋습니다; 이 자체 이미징을 방해하지 않아야하지만, 실험 절차가 계획되는 동안 고려되어야한다. 단일 케타민 / xylazyne 투여의 효과의 지속 시간은 따라서 우리가 25 ~ 30 분 후 복용량을 1/2 ¼ 추가로 적용하는 것이 좋습니다, 40 분에 30이다.
NOTE : 실험은 각각의 동물에 대한 촬상 세션 주파수 재사용의 악영향을 방지하기 위해 하나의 세션 당 2 일을 초과하지 않도록 계획 될 때뿐만 아니라 고려되어야petitive 마취.
(4) 레이저 병변
- 참조 화상 스택을 획득 한 후, 마이크로 병변을 만드는 표백 프로토콜을 사용한다.
- 100 %로 레이저 파워를 높입니다.
- 이자 (100-1,000x 표준 이미징 가지 경우에 비해 이상)의 지역 당 100 ~ 1000 밀리 초에 노출 시간을 늘립니다.
- 병변의 영역을 설명합니다.
- 표백에 전환하여 병변을 확인합니다.
- 으로 보통의 영상 모드로 전환하고 시간 경과 녹화를 계속합니다.
(5) 데이터 처리 및 분석
- ImageJ에 8 스펙트럼 Unmixing 플러그인을 사용하여 unmixing와 (요아킴 월터 진행 http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/spectral-unmixing.html을 ).
- 이미지 스택을 열고 채널을 분할합니다.
- 배경 측정을위한 신경 또는 머리카락이없는 지역을 찾아보십시오. 지역 O를 넣어그 지역에서 F 관심.
- 신중하게 신경 분명히 구별 될 모발의 부분 윤곽.
- 이 머리 별개 이미지 부분에서 신경 개요.
- 행렬을 unmixing 저장합니다.
- 전체 스택에 대한 측정 unmixing 행렬을 적용합니다.
- *의이 .tif 형식의 새로운 이미지 처리 스택을 저장합니다.
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Representative Results
그것이 가능 기재된 기술을 사용하여 병변 후 동일한 광섬유를 추적하고 손상된 신경 종말 (도 1)의 분해를 연구. 120-150 μm의 두께의 적층 체의 취득은 시야에 전체의 섬유를 유지하기 위해 수 일 동안 반복 이미징 대개 적절하다.
플라스틱 포장재가 피부를 평평하게 조정되면 병변은 일반적으로 간결하게 제조 될 수 있으므로, 콜라겐 층에 균일 한 강도의 화상 (도 2)로 나타난다. 콜라겐 층 위에 신경 종말이 정확한 병변을 생산하기에 가장 적합하다.
피부가 평평하지 않는 경우, 이미지가 흐려질 수 (그림 3)을 발생할 수 있습니다. 이러한 상황에서의 강도는 여전히 형태학 신경 섬유의 조사하지만 레이저 병변 절차하고자 적합 할 수있다 방해.
직접 병변 후, 상기 하부 패널은 30 분 10 일간 (왼쪽 후 동일한 광섬유를 도시 전에 최대 투사 화상으로 제시 신경 섬유에 레이저 병변 효과도 1 시간 곡. 상부 이미지 섬유 보여 오른쪽 패널 대응). 십일 병변 후 나타나는 비 신경 세포의 자연의 일부 YFP 표현하는 구조가있다. 이러한 구조는 외상성 조건 하에서 일시적 Thy1 유전자를 발현하는 것으로 알려져있다 라티노 될 가능성이있다. 신경 섬유의 YFP 형광 노란색으로 표시됩니다. 화살표는 병변의 영역을 표시합니다. 스케일 바 30 μm의.
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평탄화 된 피부 영역에서 신경 종말위한도 2의 최대 투영 이미지. 신경 섬유 YFP 형광 노랑에 도시되어 콜라겐 번째 고조파 발생 청색으로 도시되어있다. 스케일 바 50 μm의.
도 3 다중 광 섹션에 대한 최대 Z-투영 얻어지는 피부의 곡선 영역의 신경 종말. 신경 섬유와 모발의 자기 형광의 YFP 형광이 노랑에 도시되어 콜라겐 차 고조파 발생을 나타낸다 파란색. 스케일 바 50 μm의.
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커버로서 현미경 유리 슬라이드를 사용하여 발을 고정 절차 4도. 슬라이드 표준 종이 클립을 사용하여 금속 바아에 부착된다.
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Discussion
이 동영상 프로토콜에서는 단일 신경 말단의 비 침습적 종 이광자 촬상 방법을 보여준다.
피부 신경 밀도의 역학 건선 및 말초 신경 병증이, 등의 질환과 외상 구에 영향을받습니다. 두 광자 이미징은 콜라겐 매트릭스에있는 신경 섬유 구조의 상세한 분석을 할 수 있습니다. 리포터 유전자 변형 마우스의 사용은 신경 섬유의 염색에 관한 문제를 방지하는 데 도움이. Thy1-mitoCFP 생쥐는 신경 섬유 (11)의 기능적인 미토콘드리아 동력학 연구의 기회를 제공하는 반면 Thy1-YFP-H 균주는 형태 학적 데이터 분석 (10)에 대한 충분히 강력한 것으로 보인다. YFP-16 / ICR 라인 마이스너 체 (12)의 관찰에 사용될 수있다. 대안적인 접근은 특정 신경 개체군 선택적 추적 후근 신경절에 바이러스 감염 일 수있다13.
이는 콜라겐 매트릭스 내에 선택적 병변의 생산이 강하게 피부의 상위층에 비해 방해한다는 차리지 가치가있다. 촬상 용의 형광 강도가 10 ~ 20 %의 범위에서 상이하면서 신경 섬유의 해부 용 때때로 노광 시간만큼 열배 다를 수있는 이유이다. 상수 침지 결합이 유지되어야하는 이미지의 좋은 품질을 유지한다.
이미지의 해상도는 일반적으로 인수의 바람직한 속도에 따라 달라집니다. 한 빨리 변경 또는 미세 형태 학적 기능 연구에 대한 해상도를 높일 수있는 해상도 또는 이미지로 만들어진 영역의 두께를 줄일 수 있도록 해상도 800 × 800 픽셀 (30) frames- 스택의 생산을위한 일반적인 시간은 1 분입니다.
발바닥의 고정 된 이미지의 편차를 허용하지 않도록 충분한 타이트해야하지만, 동시에 그것은 t에서의 혈액 순환에 영향을 미치지 않아야그는 피부. 절차의 최적화를 위해, 혈관 트레이서의 주사는 혈액 흐름을 모니터링 통해 플라스틱 포장재 압력을 조정하는 일을 허용 가능하다 (예를 들어, 70 kDa의 TexasRed 개는 덱스 트란). 심장 박동 및 호흡 운동에 직접 발에 전달되지 않기 때문에 동물을 깊게 마취 때문에이 프로토콜에 기재된 제조에서 모션 아티팩트가 어렵다, 그 자체가 발을 단단하게 고정 조립체에 부착하고있다. 그러나, 미세한 움직임 고배율 촬상 행한다 특히 가능하다. 이 경우 우리는 모션 아티팩트를 보상하기위한 ImageJ에 플러그인을 사용하는 것이 좋습니다 수 있습니다.
동일 면적의 반복적 인 촬영은 손목 패드 (14)로서, 또는 주입의 스폿이 랜드 마크 (6)로 사용될 수 발바닥의 일부 물질 주입의 경우에는 이러한 기준점을 이용함으로써 달성 될 수있다. 다른 가능성은 피부의 문신이다.
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Disclosures
저자는 그들이 더 경쟁 금전적 이해 관계가 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
저자는 재정 지원에 대한 기술 지원, CIMO 재단과 FGSN에 대한 Neurotar (주)에게 감사의 말씀을 전합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Round cover glass | Electron Microscopy Science | 72296-05 | 5 mm diameter #1.5 thickness |
| Eye drops Viscotears | Novartis | 2 mg/g | |
| Superglue Loctite 401 | Henkel | 135429 | |
| Ketaminol | Intervet | Ketamine 50 mg/ml, working solution 10 mg/ml (use it 80 µg per gram of animal weight) | |
| Rompun | Bayer Healthcare | Xylazine 20 mg/ml, working solution 1.25 mg/ml (use it 10 µg per gram of animal weight) | |
| Ethanol 70% | |||
| Distilled water or Milli-Q water | |||
| Syringes 1 ml | BD | 300013 | |
| 30 G 1/2" needles | BD | 304000 | |
| Plastic packaging material | Could be purchased from general hardware store | ||
| FV-1000MPE microscope | Olympus | FV-1000MPE | Microscope with motorized stage and rigid metal bar for fixation |
| 25X XLPlan objective | Olympus | XLPLN 25XWMP | Water immersion objective optimized for multiphoton imaging |
| Mai-Tai DeepSee laser (2 W) | SpectraPhysics | ||
| Heating pad | Supertech | TMP-5b | Heating pad with a temperature controller |
| Metal ring fixator | Neurotar Ltd. | ||
| ImageJ | NIH | Open source software for image processing and analysis, http://rsbweb.nih.gov/ij/ | |
| Thy1-YFPH mice strain | JaxLab | 003782 |
References
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신경 과학 문제 90 광자 현미경 신경 종말 병변 네-1 프로모터,Erratum
Formal Correction: Erratum: In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin
Posted by JoVE Editors on 09/01/2014.
Citeable Link.
A correction was made to In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin.
Leonard Khiroug was removed as an author.
