En Vivo De dos fotones microscopía de terminaciones nerviosas individuales en la piel

Summary

Se presenta el protocolo para la formación de imágenes longitudinal dinámico y lesión selectiva por láser de las terminaciones nerviosas en ratones transgénicos reportero.

Abstract

Las terminaciones nerviosas en la piel están implicadas en procesos fisiológicos tales como la detección de ^1, así como en procesos patológicos tales como dolor neuropático ^2. Su posicionamiento de cerca a la superficie facilita imágenes microscópicas de las terminaciones nerviosas de la piel en la que viven los animales intactos. Usando microscopía multifotónica, es posible obtener imágenes finas superar el problema de la fuerte dispersión de la luz del tejido de la piel. Reportero ratones transgénicos que expresan EYFP bajo el control del promotor Thy-1 en las neuronas (incluyendo neuronas sensoriales periferia) son muy adecuados para los estudios longitudinales de las terminaciones nerviosas individuales durante períodos prolongados de tiempo hasta varios meses o incluso largo de la vida. Además, usando el mismo láser de femtosegundo como para la formación de imágenes, es posible producir lesiones altamente selectivos de fibras nerviosas para los estudios de la reestructuración de la fibra nerviosa. A continuación, presentamos un protocolo sencillo y fiable para multifotón longitudinal de imágenes in vivo ymicrocirugía láser basado en las terminaciones nerviosas de la piel de ratones.

Introduction

Terminaciones nerviosas cutáneas experimentan cambios dinámicos en diferentes estados fisiopatológicos. Las fibras nerviosas pueden pasar por el proceso de degeneración y regeneración o reestructuración en el curso de estas enfermedades como la neuropatía periférica ² o Morton neuroma ^3. Después de una lesión traumática, una parte importante de la dinámica de terminaciones nerviosas en la piel es la reinervación de la zona dañada. Sin embargo, el enfoque común para la investigación de las terminaciones nerviosas es ex vivo seccionamiento histológico que carece de información en tiempo real sobre los procesos en curso ^4. El uso de marcadores fluorescentes codificadas genéticamente, es posible realizar un seguimiento de las terminaciones nerviosas en la piel de animales vivos, obteniendo así información rica y significativamente más pertinente sobre los cambios estructurales. La investigación de las terminaciones nerviosas cutáneas es posible utilizando microscopía de fluorescencia convencional, sin embargo, la luz fuerte dispersión de la tejido de la piel socava fuertemente en la calidadde los datos adquiridos ^5. Microscopía multifotónica permite la adquisición de imágenes de alta resolución en los tejidos debido a la fuerte dispersión de la suma no lineal de la energía de los fotones de luz de excitación resultantes en la emisión de fluorescencia sólo desde el punto focal del objetivo. Este efecto conduce a un fuerte incremento en la profundidad de penetración y la mejora de la relación señal-ruido para la medición en los tejidos de la piel ^6. Utilizando el mismo láser como para formación de imágenes, es posible producir la disección selectiva de las fibras nerviosas ^7. En el siguiente protocolo se muestra el método de formación de imágenes longitudinal de las terminaciones nerviosas cutáneas in vivo en ratones transgénicos reportero combinado con lesión selectiva por láser utilizando el sistema de microscopio multifotónica disponible comercialmente.

Protocol

Los procedimientos que implican sujetos animales han sido aprobados por la Junta Nacional Experimental Animal, Finlandia.

1. Preparación Animal for Imaging

1. Anestesiar a un ratón mediante inyección intraperitional (IP) de ketamina (0,08 mg por peso corporal) y xilazina (0,01 mg por peso corporal). Compruebe la anestesia con la parte trasera reflejo del pellizco del dedo del pie.
2. Sumergir los ojos de animales en gotas para los ojos (Viscotears) para proteger los ojos de la deshidratación.
3. Ponga el mouse sobre una almohadilla eléctrica (Supertech) a 37 ° C para evitar la hipotermia.
4. Limpiar la almohadilla de la pata designado para formación de imágenes con etanol al 70%.
5. Añadir una gota de agua sobre la piel de la almohadilla de la pata de inmersión para el acoplamiento entre la piel y la cubierta de vidrio.
6. Coloque el material de embalaje de plástico debajo de la pata trasera que se coloca debajo de un anillo de metal con clase de cobertura.
7. Ajustar el grosor del material de embalaje de plástico para aplanar la piel.
8. Ponga una gota de agua sobre la cubierta glass para la inmersión entre cubreobjetos y el objetivo.

2. metal Fixator Preparación Anillo

1. Para la estabilización de la piel utilizar el fijador de metal. Utilizamos protegido Diseño Comunidad fijador de dos hojas con un anillo de metal (cortesía de Neurotar Ltd, Finlandia). Llene la jeringa con superglue, poner la pequeña gota de pegamento a través de la aguja en el anillo y extender suavemente el pegamento para la cobertura uniforme de la superficie del anillo. Es fundamental poner la mínima cantidad de pegamento que se necesita sólo para una cobertura uniforme, debido a la cantidad excesiva de pegamento puede reducir el campo de la visión y obstruir la imagen posterior.
   NOTA: Como alternativa, la combinación de una barra de metal (de debajo) y portaobjetos de vidrio de microscopio estándar (como una tapa) podría ser utilizado para aplanar la piel y para asegurar el acoplamiento óptico adecuado del conjunto ^14. Dos clips de papel podrían ser utilizados para fijar la pata entre el vidrio y la superficie de la barra de metal (figura 4
2. Cubra el anillo con tapa deslizante microscopio (5 mm de diámetro, Microscopía Electrónica de Ciencias).
3. Tornillo en el fijador de anillo de la barra de metal rígido que se montaged en la platina del microscopio motorizado.

3. Procedimiento Imaging

1. En caso de utilizar los ratones Thy1-YFP-H, elija la parte azul del espectro de fluorescencia de la lámpara para visualizar las fibras nerviosas. Encuentra el nervio de interés en el modo de epifluorescencia y se centran en ella.
2. Anote las coordenadas de un lugar para la imagen longitudinal. Use una almohadilla carpiano como punto de referencia. Durante las siguientes sesiones de formación de imágenes, detectar primero la almohadilla del carpo y luego encontrar las mismas fibras nerviosas grandes aguas arriba y vuelva usando las coordenadas guardadas. Es esencial para posicionar la almohadilla de la pata en la misma dirección perpendicular a la barra de metal para mantener el mismo sistema de referencia.
3. Activar el modo de dos fotones. Para los ratones Thy1-YFP-H, es adecuado utilizar la longitud de onda de 950 nm de radiación láserpara visualizar las fibras nerviosas.
4. Seleccionar la longitud de onda de emisión láser y canales (450 a 480 nm para la detección de segunda generación armónica, 520-550 nm para la obtención de imágenes de los nervios etiquetados-YFP y 580-630 nm para la detección de fluorescencia y YFP autofluorescencia del cabello), comenzar con láser de baja potencia (3-5%) para prevenir el fotodaño y blanqueo. La tensión típica en los tubos fotomultiplicadores es 600-700 V para este tipo de formación de imágenes.
5. Ajuste la resolución deseada (512 x 512 o 640 x 640 para mediciones de procesos rápidos, 800 x 800 o 1024 x 1024 para imágenes morfológicas), paso axial (1-3 micras), el espesor de la muestra y los intervalos de tiempo (1-10 min). El tiempo de exposición es en el orden de 1 ms por un píxel.
6. Primero marcar los límites superior e inferior del volumen de formación de imágenes en el software.
7. Adquirir la pila de imágenes de referencia para la referencia antes de la lesión. Cuando sea necesario, es posible grabar la línea de base durante varios minutos.
8. Después de la formación de imágenes limpia la almohadilla con un pañuelo de papel y poner el ratón en una caja de recuperación a 36 ° C hasta que esté completamente despierto.
   NOTA: Por lo general, la duración de una sesión de imágenes combinadas con lesión inducida por láser (ver más abajo) no sea superior a 1 hora. Se recomienda verificar que el animal está profundamente anestesiado cada 10-15 minutos; esto no debería interferir con la formación de imágenes en sí, sino que debe ser considerado, mientras que está previsto procedimiento experimental. La duración del efecto de una dosis única de ketamina / xylazyne es de alrededor de 30 a 40 min, por lo tanto se recomienda aplicar adicional de ¼ a ½ dosis después de 25-30 min.
   NOTA: Se debe considerar también cuando la experimentación es la planificación que la frecuencia de las sesiones de formación de imágenes de un animal individual no debe exceder de 1 sesión por 2 días para evitar los efectos adversos de la reanestesia competitiva.

4. Laser lesión

1. Después de la adquisición de la imagen de referencia de pila, utilice el protocolo de blanqueo para hacer una lesión micro.
2. Aumentar la potencia del láser al 100%.
3. Aumentar el tiempo de exposición a 100-1.000 ms por región de interés (100-1,000x más que en el caso de las imágenes estándar).
4. Esquema de la zona de la lesión.
5. Hacer la lesión por el cambio en el blanqueo.
6. Vuelva al modo de imagen normal y continuar con las grabaciones time-lapse.

5. Procesamiento y Análisis de Datos

1. Proceda con desmezcla espectral usando desmezcla plugin en ImageJ ⁸ (Joachim Walter, http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/spectral-unmixing.html ).
2. Abra la pila de imágenes y dividir los canales.
3. Encuentra el área libre de los nervios o de pelo para las mediciones de fondo. Ponga una región of interés en esa área.
4. Esquema cuidadosamente la parte del cabello donde se distingue claramente de los nervios.
5. Esquema del nervio en la parte de la imagen donde es separado del cabello.
6. Ahorra desmezcla matriz.
7. Aplicar matriz desmezcla medido para toda la pila.
8. Guarde los nuevos pilas de imágenes procesadas en formato * .tif.

Representative Results

Usando la técnica descrita es posible un seguimiento de la misma fibra después de la lesión y para estudiar la degradación de las terminaciones nerviosas dañadas (Figura 1). Adquisición de la pila con el espesor de 120-150 micras es generalmente adecuado para la formación de imágenes repetitivo durante varios días con el fin de mantener a toda la fibra en el campo de visión.

La lesión típicamente se puede producir de forma concisa cuando el material de los envases de plástico se ajusta para aplanar la piel, por lo que las capas de colágeno aparecen con una intensidad uniforme en la imagen (Figura 2). Las terminaciones nerviosas por encima de la capa de colágeno son los más adecuados para producir la lesión precisa.

En caso de que la piel no se aplana, la imagen puede ocurrir a difuminarse (Figura 3). La intensidad en esta situación todavía puede ser adecuado para investigaciones morfológicas de las fibras nerviosas pero el procedimiento lesión láser haría ser obstaculizado.

Figura pista 1. tiempo del efecto de la lesión láser en la fibra nerviosa presentado como imágenes de proyección máxima. Las imágenes superiores muestran la fibra antes y directamente después de la lesión, el panel inferior muestra la misma fibra después de 30 min y 10 días (izquierda y paneles de la derecha, respectivamente). Hay algunas estructuras que expresan YFP de la naturaleza no neuronal que aparecen 10 días después de la lesión. Estas estructuras son probablemente los queratinocitos que se sabe que expresan el gen Thy1 transitoriamente en condiciones traumáticas. La fluorescencia YFP de fibras nerviosas se muestra en amarillo. Una flecha marca la región de la lesión. La barra de escala 30 micras.

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Figura 2. imagen de proyección máxima de las terminaciones nerviosas en la zona de piel aplanada. La fluorescencia YFP de fibras nerviosas se muestra en amarillo, la segunda generación de armónicos del colágeno se muestra en azul. La barra de escala 50 m.

Figura 3. Las terminaciones nerviosas en la zona curvada de la piel obtenida como z-proyección máxima para múltiples secciones ópticas. La fluorescencia YFP de las fibras nerviosas y autofluorescencia del cabello se muestra en amarillo, se muestra la generación de segundo armónico del colágeno en azul. La barra de escala 50 m.

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Figura 4. El procedimiento de fijación de la pata usando el portaobjetos de vidrio de microscopio como una cubierta. La corredera está unido a la barra de metal utilizando clips de papel estándar.

Discussion

En este protocolo de vídeo se demuestra el método para longitudinal dos fotones de imágenes no invasiva de las terminaciones nerviosas individuales.

La dinámica de la inervación de la piel se ve afectada en enfermedades tales como la psoriasis y la neuropatía periférica ^2, y en lesiones traumáticas ^9. Dos fotones de imágenes permite el análisis detallado de las estructuras de fibras nerviosas en la matriz de colágeno. El uso de ratones transgénicos reportero ayuda a evitar los problemas relativos a la tinción de las fibras nerviosas. Cepa Thy1-YFP-H parece ser suficientemente robusto para el análisis de datos morfológicos ¹⁰ mientras que los ratones Thy1-mitoCFP pueden proporcionar una oportunidad de estudios funcionales de la dinámica mitocondrial en las fibras nerviosas ^11. La línea YFP-16 / ICR se puede utilizar para la observación de los cuerpos de Meissner ^12. El enfoque alternativo puede ser la inyección viral en ganglio de la raíz dorsal para el seguimiento selectiva de poblaciones neuronales específicas13.

Vale la pena notar que la producción de la lesión selectiva dentro de la matriz de colágeno está fuertemente impedida en comparación con las capas superiores de la piel. Es por ello que a veces los tiempos de exposición para la disección de las fibras nerviosas pueden diferir tanto como diez veces mientras que la intensidad de la fluorescencia para la formación de imágenes difiere en el rango de 10-20%. Para mantener una buena calidad de la imagen el acoplamiento constante inmersión tiene que ser mantenido.

La resolución de la imagen por lo general depende de la velocidad deseable de adquisición. Tiempo típico para la producción de una pila marcos- 30 de la resolución 800 x 800 píxeles es de 1 min, por lo que se puede reducir la resolución o el espesor de la zona de captación de imagen para detectar cambios rápidos o aumentar la resolución de multa estudios características morfológicas.

La fijación de la almohadilla de la pata debe ser suficiente para no permitir que la deriva de la imagen apretado, pero al mismo tiempo no debe afectar a la circulación de la sangre en tél la piel. Para la optimización del procedimiento, las inyecciones de los vasos sanguíneos trazadores (por ejemplo, TexasRed etiquetados 70 kDa dextrano) son posibles, que permite una para ajustar la presión del material de embalaje de plástico a través de la vigilancia de la circulación sanguínea. Los artefactos de movimiento en la preparación descrita en este protocolo son poco probable porque el animal se anestesió profundamente, la propia pata está firmemente unido al conjunto de fijación, y porque los latidos del corazón y el movimiento de respiración no se transmiten directamente a la pata. Sin embargo, los movimientos leves son posibles, especialmente si se realiza imágenes de gran aumento. En este caso se puede recomendar el uso de plugins ImageJ diseñadas para compensar los artefactos de movimiento.

La formación de imágenes repetitiva de la misma zona se puede lograr mediante el uso de puntos de referencia tales como la almohadilla carpiano ^14, o en caso de inyección de algunas sustancias en la almohadilla de la pata el lugar de la inyección puede servir como un punto de referencia ^6. La otra posibilidad es el tatuaje de la piel.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Round cover glass	Electron Microscopy Science	72296-05	5 mm diameter #1.5 thickness
Eye drops Viscotears	Novartis		2 mg/g
Superglue Loctite 401	Henkel	135429
Ketaminol	Intervet		Ketamine 50 mg/ml, working solution 10 mg/ml (use it 80 µg per gram of animal weight)
Rompun	Bayer Healthcare		Xylazine 20 mg/ml, working solution 1.25 mg/ml (use it 10 µg per gram of animal weight)
Ethanol 70%
Distilled water or Milli-Q water
Syringes 1 ml	BD	300013
30 G 1/2" needles	BD	304000
Plastic packaging material			Could be purchased from general hardware store
FV-1000MPE microscope	Olympus	FV-1000MPE	Microscope with motorized stage and rigid metal bar for fixation
25X XLPlan objective	Olympus	XLPLN 25XWMP	Water immersion objective optimized for multiphoton imaging
Mai-Tai DeepSee laser (2 W)	SpectraPhysics
Heating pad	Supertech	TMP-5b	Heating pad with a temperature controller
Metal ring fixator	Neurotar Ltd.
ImageJ	NIH		Open source software for image processing and analysis, http://rsbweb.nih.gov/ij/
Thy1-YFPH mice strain	JaxLab	003782