Elektrophysiologische Aufnehmen von Published: February 26, 2014 doi: 10.3791/51355

DOI

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Rebecca Delventhal¹, Aidan Kiely¹, John R. Carlson¹

¹MCDB, Yale University

Summary

Dieses Protokoll beschreibt extrazellulären Aufnahme der Aktionspotentialantworten durch labellar Geschmack Neuronen in Drosophila gefeuert.

Abstract

Die periphere Geschmack Reaktion der Insekten können kraftvoll mit elektrophysiologischen Methoden untersucht werden. Die hier beschriebene Methode ermöglicht es dem Forscher, Geschmacks Antworten direkt und quantitativ zu messen, was die sensorischen Input, dass die Insektennervensystem erhält von Geschmack Reize in seiner Umgebung. Dieses Protokoll beschreibt alle wichtigen Schritte bei der Durchführung dieser Technik. Die kritischen Schritte in die Montage eines Elektrophysiologie-rig, wie die Auswahl der notwendigen Ausrüstung und eine geeignete Umgebung für die Aufnahme, abgegrenzt werden. Wir beschreiben auch, wie man für die Aufnahme durch entsprechende Referenz-und Aufzeichnungselektroden vorzubereiten und Geschmacksstoff-Lösungen. Wir beschreiben im Detail die für die Herstellung des Insekten durch Einsetzen einer Glasreferenzelektrode in die Fliege um den Rüssel zu immobilisieren verwendete Methode. Wir zeigen Spuren der elektrischen Impulse durch Geschmack Neuronen in Reaktion auf eine Zucker-und eine bittere Verbindung gefeuert. Aspekte des Protokolls sind Technically Herausforderung und wir auch eine umfangreiche Beschreibung von einigen gemeinsamen technischen Herausforderungen, die auftreten können, wie der Mangel an Signal-oder übermäßiges Rauschen in das System, und mögliche Lösungen. Die Technik stößt an ihre Grenzen, wie zum Beispiel die Unfähigkeit, zeitlich komplexe Reize liefern, beachten Hintergrund Brennen unmittelbar vor der Auslieferung Stimulus oder verwenden wasserunlösliche Verbindungen bequem Geschmack. Trotz dieser Einschränkungen ist diese Technik (einschließlich geringfügige Änderungen im Protokoll Bezug genommen) ein Standard, breit akzeptiertes Verfahren für die Aufzeichnung von Drosophila neuronalen Antworten auf Verbindungen zu probieren.

Introduction

Der Geschmackssinn kann ein Insekt eine breite Palette von lösliche Chemikalien zu erkennen und spielt eine wichtige Rolle bei der Akzeptanz einer nahrhaften Substanz oder die Ablehnung eines schädlichen oder giftigen ein. Geschmack ist auch gedacht, um eine Rolle bei der Partnerwahl spielen, durch den Nachweis von Pheromonen ^1-5. Diese wichtige und vielfältige Funktionen haben das Insekt Geschmack System ein überzeugendes Ziel von Ermittlungen, wie sensorische Systeme übersetzen Umweltreize in relevante Verhaltens Ausgänge gemacht.

Die Primäreinheit der Drosophila melanogaster Geschmack System ist der Geschmack Haar oder Sensillum. Moleküle geben Sie die Sensillum über eine Poren an seiner Spitze ^2,6. Sensillen auf der Lippe, der Beine, der Flügel-Marge und des Rachens ⁶ gefunden. Auf der Lippe, wird die Anzahl und Lage der Sensillen stereotyp. Es gibt drei Klassen von morphologischen Sensillen je nach Länge: die Länge (L), Mittelstufe (I) und kurze (S ) Sensillen ^7,8. Jeder Sensillum enthält entweder zwei (I-Typ) oder vier (L-und S-Typ) Geschmacksrezeptorzellen (KNS) ^9. Verschiedene KNS reagieren auf verschiedene Kategorien von Geschmack Reize: bitter, Zucker, Salz und Osmolarität ^7,10 und Express unterschiedliche Untergruppen von Geschmacksrezeptoren ^8,11-13. Nur I und S-Typ-Sensillen enthalten Bitter-responsive KNS ^8,10. Die KNS Projekt auf die Unterschlundganglion Ganglion (SOG) und deren Aktivierung durch Geschmacksmoleküle auf den höheren zentralen Nervensystems für die Decodierung weitergeleitet, was zu einer Verhaltensreaktion ^6. Die relativ kleine Zahl von Neuronen und die Zugänglichkeit für Molekular-und Verhaltensanalyse machen den Geschmack Drosophila-System ein hervorragendes Modell für die Untersuchung von Geschmacks-Systeme im Allgemeinen. Die relative Leichtigkeit, mit der das System über genetische Mutation oder der GAL4-UAS Expressionssystem manipuliert werden, dient auch als ein wertvolles Werkzeug ^14,15.

NHALT "> Da diese Sensillen ragen aus der Oberfläche der Lippe, machen sie hervorragende Ziele für die Elektrophysiologie. Das Brennen der KNS kann mit extrazellulären Aufnahme überwacht werden. Historisch gesehen, die Seitenwand-Aufzeichnungsverfahren, das eine Glaselektrode in die eingelegte verwendet Sensillum neuronale Aktivität aufzuzeichnen, ²⁶ verwendet. Jedoch ist dieses Verfahren technisch schwierig zu führen, und es ist schwierig, lange von jedem Präparat aufzunehmen. Die Spitze-Aufzeichnungsverfahren, das die Reaktion der Neuronen mit einer Elektrode Maßnahmen, gleichzeitig liefert ein Geschmacksträger ist, da die Methode der Wahl ^9,16 zu werden. Es wurde verwendet, um den Geschmack System von Drosophila melanogaster ^8,10,17,18 sowie eine Reihe von anderen Insektenarten ^19-23 zu untersuchen. Es hat wurde durch die Entwicklung der tastePROBE Verstärker, der eine der wichtigsten Nachteile der Spitze-Aufzeichnungsverfahren durch Kompensation erleichtert wandDie große Potentialdifferenz zwischen der Bezugselektrode und der Insekten Sensillum, so dass die GRN Aktionspotentiale ohne übermäßige Verstärkung oder Filterung ²⁴ aufgezeichnet werden. Eine weitere wichtige Entwicklung war die Verwendung von Citrat als tricholine der Aufnahme Elektrolyt ^25. TCC unterdrückt Antworten von der Osmolarität empfindlichen GRN und nicht stimulieren die salzempfindlichen GRN, so dass Reaktionen, die durch bittere Geschmacksstoffe und Zucker erzeugt viel einfacher zu analysieren ^25.

Hier beschreiben wir, wie Spitze Aufnahme von Drosophila labellar Sensillen ist derzeit in der Carlson Labor durchgeführt. Dieses Protokoll wird erklären, wie man einen geeigneten Elektrophysiologie rig, wie die Fliege vorzubereiten, und wie man Geschmack Aufnahmen durchführen zu etablieren. Auch bei der Verwendung dieses Wir präsentieren einige durch die Aufnahme von Teilmengen von Drosophila Sensillen, sowie einige häufig auftretende Probleme und mögliche Lösungen, die auftreten können, erhalten repräsentative DatenTechnik.

Protocol

Das folgende Protokoll erfüllt alle Richtlinien der Tierpflege von der Yale University.

1. Reagenzien und Vorbereitung der Ausrüstung

1. Aufnahmegeräte-Setup (Abbildung 1A).
   1. Wählen Sie einen Raum für Rig-Setup, das frei von großen Schwankungen der Temperatur und Luftfeuchtigkeit und auch aus Quellen von elektrischen und mechanischen Geräusche, wie Kühlschränke und Zentrifugen getrennt ist.
      
      Fig. 1 ist. (A) Übersicht über die Aufnahme rig-Setup. Stereomikroskop (a) auf Anti-Vibrationsplattform (b). Referenzelektrodenhalter (c) auf der Plattform gegenüber der heads (d) montiert über Mikromanipulatoren montiert. Ein Auslass Kunststoffrohr (e) liefern befeuchteten an der Fliege Vorbereitung gerichteten Luftstrom wird auch auf T montierter-Plattform. Die heads ist mit dem Verstärker (F), die mit dem digitalen Akquisitionssystem (DAS) (g), die mit einem PC (h) verbunden ist, verbunden ist. (B) Konfiguration der Elektroden-und Auslaufrohr:. Referenzelektrode auf der linken Seite, der Aufnahme-Elektrode auf der rechten Seite, und Luftstrom Austrittsrohr beim Fliegen Vorbereitung gerichtet Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.
   2. Berg-Stereomikroskop zum Zentrum der Anti-Vibrationstisch oder Plattform.
   3. Befestigen Mikromanipulatoren für die Referenzelektrode / Insekten Herstellung und heads / Aufzeichnungselektrode auf der linken und rechten Seite des Mikroskops, jeweils mit magnetischen steht.
   4. Rähmchenauslass Kunststoffrohr in einem dritten Mikromanipulator auf der Rückseite des Mikroskops ausgerichtet, daß die Öffnung des Rohres in Richtung Lage des Fliegen prep hingewiesen (siehe Fig. 1B).
   5. Mit flexiblen Kunststoffschlauch, antach Steckdose Kunststoffrohr mit einem Vakuumkolben teilweise mit Wasser gefüllt. Verbinden eine kleine Aquariumpumpe auf Luftblase durch das Wasser in den Kolben gegeben, wodurch eine befeuchtete Luftstrom durch den Auslaß in Richtung des Kunststoffrohrs Fliege.
   6. Berg Faseroptik-Lichtquelle aus dem Vibrationstisch, Ausrichten der Ausgänge durch die Reflexion von Licht über ein Stück weißes Papier-Karte direkt unterhalb der Vorbereitung beleuchten die Vorbereitung. Stellen Sie sicher, dass die Lichtquelle nicht auf dem Tisch liegen. Hinweis: der Nutzen spiegelt die Lichtquelle auf einer Papierscheibe ist zweifach: Sie verbessert den Kontrast, so dass Sensillen leichter zu visualisieren, und es verhindert Erwärmung der Vorbereitung, die von direktem Licht führen würde.
   7. Stecken tastePROBE Verstärker in den digitalen Erfassungssystem (DAS) und der DAS in einem Personal Computer, laut Hersteller-Handbuch. Stecken Fußpedal Auslöser und vereinbaren Sie unter Arbeitsbereich. Hinweis: Galvanisch getrennte Steckdosen für den Verstärker und DAS sind sehr wünschenswertLage.
   8. Elektrisch Masse Mikroskop, Mikromanipulatoren und Lichtquelle durch Verbinden von Metallkomponenten Tabelle mit Krokodilklemmen und Längen von isolierten elektrischen Draht und Isolierband. Elektrisch Masse Metall-Plattform durch den Anschluss an Baugrund oder DAS, die durch Netzstecker geerdet ist.
   9. Installieren Sie geeignete Erfassungssoftware für den DAS der Wahl auf dem PC. Hinweis: Stellen Sie sicher, dass die digitale Erfassung Treiber mit dem Betriebssystem auf dem PC kompatibel sind.
   10. Konfigurieren Sie die Software-Amplifikation (10-100x), Signalfilterung, und Abtastrate (mindestens 10 KHz) (in der Regel ein Bessel-Bandpassfilter von 100 Hz-3, 000 Hz). Hinweis: Signalamplituden von Geschmacks-Neuronen sind in der Regel im Bereich von 0,5 bis 2 mV, so dass die Anzeigeskala ist auf ihre Visualisierung zu erleichtern. Hinweis: Die 100-Hz-Filter hilft, fremde elektrische Störungen auszuschließen, aber die Form der Spikes verändert und können erweiterte Spitze Sortier mor machene Herausforderung. Alternativ kann ein 1-Hz-Filter verwendet werden.
   11. Optional kann ein Faraday-Käfig rund um die ganze Vibrationstisch gesetzt werden. Allerdings sind kleine Platten aus Aluminiumfolie in der Regel ausreichend, um keinen Lärm von der äußeren Umgebung oder Prüfer erzeugt reduzieren.
2. Glaselektrodenvorbereitung
   
   Abbildung 2. Referenz-und Aufzeichnungselektroden. Fotografie unter Vergrößerung der Glas Kapillaren in Referenzelektrode gezogen, mit (A) und ohne (B) Spitze gebrochen und Aufzeichnungselektrode (C). Weiße Balken stellt 2 mm. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.
   1. Ziehen Sie den ReferenzElektrode aus einer Glaskapillare mit einer Pipette Abzieher Instrument. Hinweis: Die genauen Einstellungen der Pipette Abzieher-Programm wird von Gerät zu Gerät variieren. Versuchen Sie, eine sehr lange allmähliche Verjüngung zu erzielen. Die Porengröße an der Spitze ist nicht entscheidend, da die Spitze werden vor Flugvorbereitung (2A und 2B) gebrochen werden, aber stellen Sie sicher, dass der Durchmesser des konischen Länge der Elektrode ist weder zu dünn, was nicht für eine ausreichende erlauben Immobilisierung der Lippe, noch zu groß ist, die die Geschmacksnervenzellen schädigen oder zerstören die Speicheldrüsen können.
   2. Ziehen Aufzeichnungselektrode aus einer Kapillare aus Borosilikatglas mit Filament mit einer Pipette Abzieher Instrument. Versuchen, eine Verjüngung, die flacher ist als die der Referenzelektrode ist, und einem Porendurchmesser von etwa 10-15 um (2C) ²⁸ zu erreichen.
3. Geschmacksstoff-Lösungen Vorbereitung
   1. Verwenden Sie Beadle-Ephrussi Ringer Lösungtion (B & E) als Referenzelektrode Elektrolyten. Zu einem Liter B & E zu machen, lösen sich 7,5 g NaCl, 0,35 g KCl und 0,279 g CaCl ₂ ∙ 2H ₂ O in einem Liter Reinstwasser. Bewahren kleineren Aliquots bei -20 ° C.
   2. Verwenden 30 mM tricholine Citratlösung (TCC) als Aufzeichnungselektrode und Elektrolytlösungsmittel für Geschmacksstoff-Lösungen ^25, wenn bitteren oder Zucker GRN Antworten gemessen werden. Alternativ kann 1-3 mM Kaliumchloridlösung verwendet werden, wenn Reaktionen des Wasserzelle zu messen sind.
   3. Um Geschmacksstoff-Lösungen machen, wiegen entsprechende Menge an Geschmacksstoff in Pulverform und in den TCC, um eine anfängliche Konzentration Lager zu machen. Verwenden Sie diese serielle Verdünnungen von diesem Anfangsbestand machen, um die gewünschte Konzentration zum Testen zu erhalten. Hinweis: Wenn tastants nicht leicht in Wasser auflösen, ein anderes Lösungsmittel, wie Ethanol, können verwendet werden, um Anfangsbestand Konzentration zu machen. Eine entsprechende Kontrolllösung von TCC und Lösungsmittel ohne GeschmacksträgerIn diesem Fall verwendet werden.
   4. Shop Aliquots langfristig bei -20 ° C Speicherung eines Werk Aliquot einer Geschmacksstoff-Lösung bei 4 ° C für die Aufzeichnung für die Verwendung bis zu einer Woche, abhängig von der chemischen Eigenschaften der Geschmacksstoff.

2. Drosophila Vorbereitung

Abbildung 3. Vorbereitung von Flug für die Aufnahme. (A) Insertion Position der Referenzelektrode in der dorsalen Thorax Fliege. Der weiße Pfeil zeigt die Referenzelektrode. (B) Zwischenposition der Referenzelektrode: über Hals und Kopf fortgeschritten, Rüssel noch nicht verlängert. (C, D) mit Referenzelektrode in der Endposition mit Spitze des Elektrode innerhalb Lippe und Rüssel Flyvoll ausgefahren. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.

1. Sammeln Sie neu geschlüpften Fliegen für die Aufnahme von gepflegten fly Kulturen, unter Temperatur-und Luftfeuchtigkeits-kontrollierten Bedingungen aufgewachsen, und sie altern 5-10 Tage in frischem Kulturflaschen vor der Aufnahme.
2. Chill-Mikroskop Platte auf Eis für 15-30 min vor der Zubereitung Fliege.
3. Backfill Glasbezugselektrode mit B & E-Lösung mit einer langen, dünnen Nadel aus Kunststoff von 0,5 mm Durchmesser, wie z. B. eine Rücken Nadel und 1-ml-Spritze und klopfen Sie leicht keine Blasen. Brechen kleine Menge von Spitze mit einer Pinzette aus und verwenden Sie Kapillarwirkung mit einem Gewebe ziehen alle verbleibenden Luftblasen, die Beobachtung unter Binokular.
4. Slide B & E-gefüllte Referenzelektrode auf Draht Bezugselektrodenhalter, kümmert sich nicht um Luftblasen einzuführen.
5. Saugen Sie fliegen in ein P200 Pipettenspitze, unter Verwendung von Flugsauger gebautvon Schlauch-, Mesh-und Pipettenspitze; ^29. Platz im Eiskübel und Chill für 30-60 sek.
6. Entfernen Mikroskop Platte von Eis, wischen Sie Feuchtigkeit und Position unter Mikroskop. Klopfen Sie fliegen aus der Pipettenspitze auf Mikroskop Platte.
   Hinweis: die Fliege sollte ausreichend immobilisiert, leicht zu manipulieren.
7. Bei niedriger Vergrößerung, entfernen Sie vorsichtig die Vorderbeine mit einer Pinzette, während die Thorax stabil mit der anderen Zange halten. Positionieren Sie die Fliege auf seiner Bauchseite, Rückenseite nach oben ein. Hinweis: Achten Sie stets auf berühren Sie nicht die Lippe mit der Zange zu jeder Zeit während des Herstellungsverfahrens gegen mechanische Beschädigungen zu minimieren.
8. Während mit einer Pinzette hält die Fliege im Ort, legen Sie die Referenzelektrode an der Mittellinie der hinteren dorsalen Thorax. Eine vorgeschlagene Eintrittswinkel beträgt etwa fünfundvierzig Grad in der Richtung des Kopfes (3A).
9. Sichern Sie die Referenz electrodE Halter mit Modelliermasse, so dass die Fliege unter dem Mikroskop bei hoher Vergrößerung sichtbar ist. Manöver und Winkel der Glaselektrode durch den Hals und Kopf, indem die Fliege auf den Referenzelektrodenhalter mit zwei Pinzetten. Hinweis: Arbeiten Sie schnell, aber gleichmäßig, es ist einfacher, diesen Schritt, während die Fliege ist immer noch von der Kälte (3B) immobilisiert.
10. Sanft erweitern die Rüssel mit einer Pinzette, während Sie die Fliege weiter unten auf der Glasreferenzelektrode, bis die Spitze der Elektrode im Inneren der Lippe und der Rüssel ausgefahren (3C und 3D). Hinweis: Achten Sie darauf, jeden Teil der Rüssel Gewebe durchbohren oder zu dehnen den Rand der Lippe mit der Referenzelektrode, da dies die Fliege beschädigen und / oder schmecken Neuronen und Einfluss auf die Aufnahmequalität.

3. Aufnahme von Labellar Sensillen

Abbildung 4. Aufnahme von Fliege. (A) Lippe der Flugvorbereitung auf links mit Aufnahme-Elektrode für den Kontakt mit rechts, unter hoher Vergrößerung ausgerichtet ist. (B) Aufnahme-Elektrode und Einzel Sensillum auf Lippe in Kontakt, unter hoher Vergrößerung. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.

1. Immer erden Sie sich vor dem Berühren einer Ausrüstung während der Aufnahme-Prozess Berühren der Metalloberfläche des Anti-Vibrationstisch oder Plattform! Hinweis: Es ist extrem wichtig, nicht um eine statische Ladung auf die heads liefern, wie dass die Schaltung beschädigen.
2. Sichere Bezugselektrodenhalter zu Mikromanipulator auf Lufttisch von recordin montiertg rig. Position ein Lappen der Lippe in der Mikroskopfeld, unter hoher Vergrößerung (in der Regel mindestens 140X), und im Einklang mit befeuchteten Luftstrom.
3. Schalten Sie befeuchteten Luftstrom, Computer, DAS und Verstärker. Offene Erfassungssoftware.
4. Spülen und füllen Glas Aufzeichnungselektrode mit der gewünschten Geschmacksträger.
   1. Spülen Glas Aufzeichnungselektrode mit hochreinem Wasser unter Verwendung einer Spritze und Kunststoffrohr ^28, um kleine Mengen von Wasser durch das Rohr mindestens zehnmal ziehen.
   2. Spülen Aufzeichnungselektrode mit Geschmacksstoff mindestens fünfmal. Füllen Aufzeichnungselektrode etwa ein Drittel bis zur Hälfte voll mit Geschmacksträger und von Schlauch zu entfernen. Wenn es Luftblasen, tippen zu lösen oder einfach nachfüllen Elektrode.
   3. Schieben Elektrode auf Silberdraht des heads schnell und reibungslos, so dass keine Luftblasen einzuführen.
5. Stimulieren Einzel Sensillum mit Geschmacksstoff gefüllten Aufzeichnungselektrode.
   1. Verwenden Sie die micromaniputor, um die Aufnahme-Elektrode mit Sensillum von Interesse ausgerichtet zu bringen.
   2. Drücken Sie Fußpedal, um Erfassungsmodus des Verstärkers auslösen.
   3. Schieben Sie den Aufnahme-Elektrode mit der Feindrehknopf der Mikromanipulator vorsichtig, bis sie Kontakt mit Spitze des Sensillum und die Aufnahme beginnt.
   4. Entfernen Elektrode nach 1-2 sek.
   5. Wiederholen Sie Schritt 3.5 mit anderen Sensillen, wenn gewünscht. Hinweis: Warten Sie mindestens 1 min zwischen Präsentationen auf den gleichen Sensillum. Wenn die Aufzeichnung mit einer einzigen Geschmacksstoff über einen längeren Zeitraum kann die Geschmacksstoff-Lösung und trocknet die Lösung in der Spitze kann stärker konzentriert werden. Dies kann durch leichtes Kontakt mit der Spitze der Glaselektrode mit glatten Papier, eine kleine Menge von Flüssigkeit durch Kapillarwirkung entfernen behoben werden.
6. Um Antworten auf die anderen Geschmacksträger aufnehmen, spülen und Lastaufnahmeelektrode mit neuen Geschmacksträger und wiederholen Sie Schritt 3.4. Hinweis: Gründlich Spülen der Elektrode zwischen tastants ist absolutely entscheidend, um eine Kreuzkontamination zu vermeiden.
7. Speichern Sie Dateien regelmäßig mit identifizierende Informationen wie Datum, Genotyp und Geschmacksstoffe. Hinweis: Es ist wichtig, eine schriftliche Aufzeichnung der Geschmacksträger und Sensillum Identität der Präsentation während der Aufnahme-Session für die Datenanalyse zu halten.

Representative Results

Fig. 5A zeigt die Antwort eines L Sensillum zu einem Zucker, Saccharose. Das gleiche Sensillum nicht zu einem bitteren Verbindung reagieren, Berberin. 5B zeigt, dass ein I-Typ Sensillum, die einen bitteren responsive Neuron enthält, zeigt größere Amplitude Spitzen in Reaktion auf Berberin und kleinere Amplitudenspitzen in Reaktion auf Saccharose. L Sensillen einen minimalen Hintergrund Reaktion auf die Lösungsmittelkontrolle, TCC anzuzeigen, während ich Sensillen praktisch keine Reaktion auf die TCC (Abbildung 5) anzuzeigen. Für weitere Informationen über Salz-und Wasser Antworten labellar KNS Sie bitte Hiroi ¹⁰ verweisen.

Abbildung 5. Repräsentative Spuren von Drosophila labellar Antworten Wildtyp (A) L sensillu m Reaktion auf 100 mM Saccharose (SUK), 1 mM Berberin (BER) und 30 mM TCC. (B) Ich sensillar Reaktion auf SUC, BER und TCC. Die Pfeilspitze zeigt die Kontakt Artefakt, das zu Beginn jeder Aufnahme auf. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.

Abbildung 6. Vertreter suboptimal elektrophysiologischen Ergebnissen. (A) völlige Fehlen von Signal (B) 50/60 Hz "Rauschen" (C) stochastische Rauschen (D) mechanosensorischen Neuron Brennen allein (E) bitter GRN (offene Dreiecke) und mechanosensorischen Neuron ( gefüllte Dreiecke), die beide Brand./ Www.jove.com/files/ftp_upload/51355/51355fig6highres.jpg "target =" _blank "> Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.

Discussion

Labellar sensilla unterscheiden sich in der Leichtigkeit der Aufnahme aufgrund von Unterschieden in der Morphologie und Anatomie Organisation. Manchmal ist ein Sensillum auf keine Geschmacksstoffe reagieren, auch eine, die dafür bekannt ist, eine positive Antwort zu entlocken. Die Häufigkeit, mit der dies geschieht, hängt von der Aktivität Sensillum. L Sensillen sind durchweg ansprechend und sind relativ einfach, aufgrund ihrer Länge zugreifen. Im Allgemeinen sind die S Sensillen konsequent reagiert, aber ihre kurze Länge und Position auf der Lippe einen guten Kontakt Herausforderung. I sensilla kann leichter erreicht werden, abhängig von dem Winkel der Herstellung, aber häufiger sind sie unempfänglich. An jedem beliebigen Flugvorbereitung, kann ein größerer Anteil der Sensillen ich nicht mehr reagiert als L oder S Sensillen sein. Genetischer Hintergrund kann die Konsistenz der Antworten Geschmack als auch zu beeinflussen. Zum Beispiel können einige transgenen Fliegen weniger konsequent Antworten als Wildtyp angezeigt, vermutlich weil die Transgene auf die geNeral Gesundheit der Fliege. Wir haben beobachtet, dass w ^- mutierten Fliegen sind besonders schwierig, von der Sie aufnehmen.

Eine gemeinsame technische Problem ist ein Mangel an Signal, dh keine Spitzen beobachtet werden (Abbildung 6A). Erstens, manchmal eine bestimmte Sensillum nicht mehr reagiert, während andere von der gleichen Klasse auf der gleichen Flug kann reagieren. Zweitens kann es eine Luftblase in der Aufzeichnungselektrode und der Referenzelektrode sein. Wenn der Aufzeichnungselektrode vermutet wird, kann dies einfach durch Entfernen und Wiederauffüllen des Glaselektrode, leichtes Klopfen und Inspektion unter Vergrßerung zu gewährleisten, keine Blasen vorhanden sind, befestigt werden. Wenn die Referenzelektrode steht im Verdacht, eine Luftblase enthalten, Erneuerung der Vorbereitung mit einer neuen Fliege ist der einfachste Weg, um dieses Problem zu beheben. Drittens, manchmal die Drähte tragen das elektrische Signal kann nicht richtig angeschlossen werden. Viertens, gelegentlich das Spannungssignal empfangen kann höher oder niedriger sein alsder Bereich der Verstärker messen kann. Wenn Sie die tastePROBE Verstärker, um zu sehen, wenn entweder der Clip nach oben oder nach unten Clip-Anzeige leuchtet auf. Wenn der Clip up-Anzeige leuchtet auf, die oft aus-und Nachfüllen der Glas-Referenzelektrode, während die Betreuung auf nicht mehr als zur Hälfte füllen und Wischen Sie die Außenseite, um die Feuchtigkeit zu entfernen, wird das Problem zu lösen. Feuchtigkeit auf der Außenseite der Glaselektrode kann eine elektrische Verbindung zwischen dem Metallgehäuse der Elektrode und dem Draht herzustellen, Senden des Signals außerhalb des Bereichs des Verstärkers. Wenn das fehlschlägt, um das Problem oder den Clip unten Kontrollleuchte lösen sich auf, sollten Vorschläge in den folgenden Absatz zur Bekämpfung von elektrischen Störungen im System. Fünfte, manchmal eine Fliege kann bei der Zubereitung sterben oder anderweitig nicht mehr reagiert trotz des Präparats gesundes Aussehen. Wachstumsbedingungen, wie Feuchtigkeit, Temperatur, Alter, Lebensmittelqualität, und Mikroflora, sowie einer weniger gesunden genetischen Hintergrund könnte zu einer höheren beitragenAnteil der "nicht mehr reagiert" Fliegen. Schließlich, selten, ein Gerät nicht funktionsfähig sein kann. Wenn das Signal nicht konsequent erreicht und alle anderen Möglichkeiten ausgeschöpft sind, kann es notwendig sein, die Funktionalität der einzelnen Geräte zu untersuchen: heads, Verstärker und digitalisieren. Der einfachste Weg, dies zu tun ist, um ein Gerät mit einem anderen aus einer Anlage, die bekannt ist funktionsfähig zu ersetzen. Wenn nur ein Rigg in einem Labor vorhanden ist, kann ein Signalgenerator verwendet werden, um die Funktionalität der elektronischen Bauteile zu testen.

Eine weitere gemeinsame technische Problem ist, dass der "Lärm", die eine beobachtete Signal, das nicht angezeigt wird, um neuronale Aktionspotentiale in Reaktion auf eine Geschmacksreizes (6B-E) vertreten, ist gefeuert. Erstens kann das Signal von 50/60 Hz-Rauschen von Aufzeichnungsgeräten oder anderen Geräten in der Nähe (Fig. 6B) führen. Mit keine Fliege an der Referenzelektrode, Direktly verbinden die Aufnahme-und Referenzelektroden durch einen Rückgang von Ringer-Lösung und geben Sie den Passthrough-Modus des Verstärkers durch Drücken auf die Taste. Wenn Rauschen auf der beobachtbaren Signalreich, bedeutet dies wahrscheinlich, dass das Rauschen außerhalb des Flugvorbereitung. Stellen Sie sicher, dass alle rig Geräte ordnungsgemäß geerdet sind und dass Alufolie Schilde vorhanden sind. Ziehen Sie probe Geräten in der Nähe zu sehen, ob das Rauschen beseitigt oder zusätzliche Komponenten zu schützen. Zweitens kann die stochastische Störungen auftreten (Abbildung 6C). In diesem Fall sind die Schritte für 50/60 Hz-Rauschens noch beschrieben durchgeführt werden. Darüber hinaus versuchen Ausstecken oder Austausch verschiedener Komponenten des Kontrollgeräts, insbesondere die heads und / oder Verstärker. Wenn kein Rauschen beobachtet wird, wenn die Elektroden direkt miteinander verbunden sind, ist die Strahlungsquellen, die Fliege Zubereitung. Es ist in der Regel am einfachsten, bereiten eine neue Fliege für die Aufnahme, wobei darauf zu Schäden an der Fliege zu minimieren. Dritte Aktivierungsder mechanosensorischen Neuron in der Sensillum enthalten sein (6D und 6E) beobachtet werden. Die mechanosensorischen Neuron kann aktiviert werden, wenn die Sensillum abgelenkt oder nach dem Aufbringen der Aufzeichnungselektrode gebogen ist, oder während des Kontakts gestoßen werden. Die Spikes sind, unterscheiden sich von chemosensorischen Spitzen durch ihre unregelmäßige Muster, die in der Regel wird mit der mechanischen Störung, nicht die Anwendung eines Geschmacksreizes koordiniert. Mechanosensorischen Brennen kann durch Ausrichten der Aufzeichnungselektrode mit Sensillum und sanft fort nur so weit, wie es notwendig ist, den Kontakt mit der Spitze des Sensillum machen, minimiert werden. Viertens kann stochastischen spike "Platzen" beobachtet werden, dies scheint ähnlich neuronale Aktivität, aber eine hohe Frequenz und Amplitude in Reaktion auf einen Reiz koordiniert. Diese Regel ergibt sich aus der Flugvorbereitung selbst, nicht aus dem Gerät, und kann aufgrund einer Nerven durch die Referenzelektrode gestört werden. </ P>

Eine dritte gemeinsame technische Problem ist, dass die Vorbereitung ist mobil, wodurch die Lippe zu bewegen, die Verbindung mit einem Sensillum schwierig macht. Erstens kann die Fliegen Zubereitung instabil. Überprüfen Sie, dass die Referenzelektrode richtig positioniert ist, und gegebenenfalls neu einstellen. Zweitens kann die Referenzelektrode zu dünn an der Spitze sein, den Rüssel und Lippe unbeweglich zu halten. Versuchen Sie, den Abbruch einer längeren Höhe der Spitze vor der Herstellung der Fliege. Wenn das nicht ausreicht, stellen die Pipettenzieher Einstellungen nach Bedarf, um die Form der Referenzelektrode zu ändern, so dass die Verjüngung allmählicher und der Durchmesser ist leicht erhöht. Drittens kann die Fliegen ungewöhnlich aktiv sein. Remake die Vorbereitung mit einem neuen Fliege.

Für allgemeine Informationen und Elektrophysiologie mehr Anleitung zur Fehlerbehebung, um Axon Guide ³⁰ verweisen.

Es gibt wenige Beschränkungen für die Spitze-Aufzeichnungsverfahren in dieser Publika umrissenion. Eine Einschränkung ist, dass der Geschmacksstoff muss wasserlöslich sein, wie sie in der Aufzeichnungselektrode mit dem Elektrolyten geliefert. Dies erhöht die Schwierigkeit der Aufnahme mit Kohlenwasserstoffverbindungen, obwohl die Verwendung eines Lösungsmittels wie DMSO wurde eine Aufzeichnung mit Pheromonen ⁴ möglich gemacht. Alternative Ansätze zu einer geschärften Wolframelektrode zu verwenden, um die Aufnahmen aus der Steckdose Basis des Sensillum durchzuführen, oder verwenden Sie eine Glaselektrode, um Aufnahmen von der Seitenwand des Sensillum durchzuführen, in denen sowohl die Geschmacksträger ist unabhängig von der Aufzeichnungselektrode geliefert ^26,27. Jedoch sind diese Techniken schwierig und Seitenwandaufnahmen sind schädlich für die Geschmacksorgan. Eine weitere Einschränkung ist die Menge an Zeit erforderlich, um das Geschmacksstoff-Lösung (Protocol Schritt 3.3), was den Durchsatz verringert auszutauschen, und begrenzt die Verwendung von komplizierten Stimulus Paradigmen oft in olfaktorischen Aufnahmen ersichtlich. Gustatorischen Rezeptorzellen zeigen eine gewisse VariabilitätAmplitude ist, dass abhängig von Spikefrequenz. Diese Funktion kann Beurteilung der neuronalen Identität komplizieren und erweiterte Spitze Sortierung schwieriger ^25,31-33. Darüber hinaus aufgrund der Natur der Spitze-Aufzeichnungsverfahren kann man nicht die basale Brenn unmittelbar vor der Abgabe eines Reiz aufzunehmen, wie sie üblicherweise in olfaktorischen Aufnahmen gemacht. Trotz dieser Nachteile hat die Spitze-Aufzeichnungsverfahren erfolgreich verwendet worden, um viele der Prinzipien der Geschmack Kodierung in Drosophila und anderen Arten ^{8,10,17,19,21-23} aufzuklären.

Die Fliege Präparationstechnik hier skizziert ist nur ein möglicher Ansatz. Bei diesem Herstellungsverfahren wird der Rüssel in einer ausgefahrenen Position, um den Kontakt der Aufzeichnungselektrode mit Sensillum Interesse zu erleichtern befestigt, und die Referenzelektrode in das Tier eingeführt. Andere Herstellungsverfahren umfassen das Anbringen des Tieres zu einem Knetklumpens und die Verwendung dünner Streifen vonBand um den Rüssel ³⁴ zu fixieren. Ja, solange die grundlegenden Parameter der Gewebestabilisierung und Referenzelektrode Platzierung erfüllt sind, Sensillen an anderen Standorten oder von verschiedenen Arten aus in der gleichen Weise aufgezeichnet werden. So kann beispielsweise Bein Sensillen von durch die Festsetzung der Körper einer Fliege zu einem Sylgard-beschichtete Objektträger mit feinen Insektenstifte, Spreizen Sie die Beine über den Rand des Glases leicht ³⁵ aufgezeichnet werden. Es möglich ist, pharmakologische Wirkstoffe über die Aufzeichnungselektrode mit dem sensilla liefern, die Signaltransduktion in der Geschmacksrezeptorzellen zu untersuchen. Es ist einfach eine Aufgabe des Experimentierens zu bestimmen, welche Vorgehensweise für das gewünschte Ergebnis am besten funktioniert.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Stereo Zoom Microscope	Olympus	SZX12 DFPLFL1.6x PF eyepieces: WHN10x-H/22	capable of ~150X magnification with long working distance table mount stand
Antivibration Table	Kinetic Systems	BenchMate2210
Micromanipulators	Narishige	NMN-21
Magnetic stands	ENCO	Model #625-0930
Reference Electrode Holder	Harvard Apparatus	ESP/W-F10N	Can be mounted on 5 ml serological pipette for extended range
Silver Wire	World Precision Instruments	AGW1510	0.3-0.5 mm diameter
Retort Stand			generic
Outlet Plastic Tube			generic, 1 cm diameter
Flexible Plastic Tubing	Nalgene	8000-0060	VI grade 1/4 in internal diameter
500 ml Conical Flask			generic, with side arm
Aquarium Pump	Aquatic Gardens	Airpump 2000
Fiber Optic Light Source	Dolan-Jenner Industries	Fiber-Lite 2100
White Card/Paper	Whatman	1001-110
Digital Acquisition System	Syntech	IDAC-4	Alternative: National Instruments NI-6251
Headstage	Syntech	DTP-1	Tasteprobe
Tasteprobe Amplifier	Syntech	DTP-1	Tasteprobe
Alligator Clips	Grainger	1XWN7	Any brand is fine
Insulated Electrical Wire			Generic
Gold Connector Pins	World Precision Instruments	5482
Personal Computer	Dell	Vostro	Check for compatibility with digital acquisition system and software
Acquisition Software	Syntech	Autospike	Autospike works with IDAC-4; alternatively, use LabView with NI-6251
Aluminum Foil and/or Faraday Cage			Electromagnetic noise shielding
Borosilicate Glass Capillaries	World Precision Instruments	1B100F-4
Pipette Puller	Sutter Instrument Company	Model P-87 Flaming/Brown Micropipette Puller
Beadle and Ephrussi Ringer Solution			See recipe in protocol section
Tricholine citrate, 65%	Sigma	T0252-100G
Stereomicroscope	Olympus	VMZ 1x-4x	Capable of 10-40X magnification
Ice Bucket			Generic
p200 Pipette Tips			Generic
Spinal Needle	Terumo	SN*2590
1 ml Syringe	Beckton-Dickenson	301025
Fly Aspirator			Assembled from P1000 pipette tips, flexible plastic tubing, and mesh
Modeling Clay			Generic
Forceps	Fine Science Tools By Dumont	11252-00	#5SF (super-fine tips)
10 ml Syringe	Beckton-Dickinson	301029
Plastic Tubing	Tygon	R-3603