Summary
Fastsättning av virioner på en yta är ett krav för en virion imaging av Super-upplösning fluorescens imaging eller atomkraftmikroskopi (AFM). Här demonstrerar vi en provberedningsmetod för kontrollerad vidhäftning av virioner till glasytor som är lämpliga för användning i AFM och superupplösning fluorescensavbildning.
Abstract
Immobilisering av virioner till glasytor är ett kritiskt steg i en virion imaging. Här presenterar vi en teknik som antagits från enstaka molekyltomografianalyser som möjliggör vidhäftning av enstaka virioner till glasytor med specificitet. Denna beredning är baserad på ympning av glasets yta med en blandning av PLL-g-PEG och PLL-g-PEG-Biotin, tillsats av ett lager av avidin och slutligen skapa virion ankare genom fastsättning av biotinylerade virus specifika antikroppar. Vi har tillämpat denna teknik över en rad experiment inklusive atomkraftmikroskopi (AFM) och superupplösning fluorescens imaging. Denna provberedningsmetod resulterar i en kontroll vidhäftning av virions till ytan.
Introduction
Laddningsbaserade ospecificerade interaktioner används rutinmässigt för vidhäftning av virioner i atomkraftmikroskopi1,2. Dessa tekniker fungerar särskilt bra när de används på icke-avvecklade virioner med mycket styva kapsyler3-6. Även om dessa tekniker är mycket effektiva för att immobilisera provet, förhindrar de inte ospecificerad bindning av proteiner till ytan. Den ospecificerade bindningen kan skapa ett problem när man försöker avbilda virioner med AFM- och superupplösningsfluorescenstekniker som kräver inkubationer av provet med olika antikroppar. Här beskriver vi en provberedningsmetod för specifik immobilisering av virioner.
Poly(etylenglykol) (PEG) ympat till poly (L-lysin) (PLL) och adsorberat på en glasyta ger ett betydande block för elektrostatiska interaktioner av proteiner med glas7. Enstaka molekylanalyser som kräver immobilisering av enstaka molekyler på glasytor har utnyttjat denna egenskap och använt den för att skapa en specifik PEG-baserad enmolekyl immobiliseringsteknik8-10. Denna beredning användes också för att immobilisera clathrin burar på glasytan11 samt skapa en homogen fibronectin beläggning för kontrollcell vidhäftning 12.
Vi har antagit provberedningsmetoden baserat på PLL-g-PEG adsorption till glasytor från enmolekylsavbildningsmetoder och tillämpat den på avbildning av enstaka virioner av vesikulärt stomatitvirus (VSV). Dessa enstaka virioner avbildades med hjälp av atomkraftmikroskopi (AFM). Liknande experiment utfördes också på funktionella pärlor som en kontroll. Virionerna var också avbildade av superupplösning fluorescensmikroskopi var en VSV-G antikropp märkt med Alexa 647 användes för att skapa en bild av kuvertet av enstaka virions. Högupplöst fluorescerande avbildning använder lokalisering av enstaka molekyler för att skapa en bild13-15. fPALM bi-planar imaging möjliggör lokalisering av enstaka molekyler med 20 nm i plan och 50 nm upplösning längs den optiska axeln15,16. Denna bi-planar teknik användes för att avbilda super-resolution fluorescerande bilder som finns i denna studie. En alternativ teknik som har liknande resultat är STORM13,17,18.
Både AFM och superupplösning fluorescerande bilder av VSV förankrade på glaset genom de förfaranden som beskrivs i detta dokument, visade specifik bindning av virions till glaset med minsta ospecificerade interaktioner19. Här presenterar vi provberedningsprotokollen för AFM och superupplösnings fluorescerande bildexperiment. I korthet: Rena glaslock fungerar genom att adsorbera en blandning av PLL-g-PEG och PLL-g-PEG-biotin. Det är typiskt för denna tunna film att konstrueras för att ge mellan 15-25% funktionell biotin på en belagd yta. Täcklipsen inkuberas ytterligare med tetramerisk avidin. En biotinylerad virusantikropp används sedan för att skapa ett unikt bindningsställe för virionerna. Bindning av antikroppen kan göras på två sätt.
Den första metoden är optimerad för AFM men den är fortfarande lämplig för superupplösning fluorescensavbildning. I denna metod behandlas den avidinbelagda ytan med biotinylerad antikropp före viral vidhäftning. De immobiliserade virionerna behandlas med Alexa 647 märkt antikropp för att täcka kuvertet och tillåta superupplösning fluorescensavbildning av virions.
Den andra metoden är att attackera viruset i lösning med den biotinylerade antikroppen och Alexa 647 märkt antikropp innan virusen fastnar på den avidinbehandlade ytan; denna metod är optimerad för superupplösta fluorescensavbildningsexperiment där återhämtning av viruskuvertet är viktigt. Denna metod har fördelen att tillåta enhetlig antikroppsbeläggning på virusytan. Den biotinylerade antikroppen kan blandas med Alexa 647 märkta virusantikroppar i förhållanden som möjliggör tillräcklig adsorption av viruset till den avidinbehandlade ytan samtidigt som en hög koncentration av fluorescerande etikett bibehålls på utsidan av virushöljet. Dessa Alexa 647 märkta virusantikroppar är inte biotinylerade och deras överskott kan sköljas bort för att minska bakgrundsljudet.
Protocol
1. Kemi förberedelse
- Beredning och lagring av PLL-g-PEG-Biotin och avidin:
- Lös upp polymeren PLL-g-PEG-biotin i PBS-bufferten enligt tillverkarens anvisningar vid en koncentration av 1,0 mg/ml.
- Alikvot enligt täckglasstorlek (se tabell 1)och förvaras vid -80 °C i upp till ett år.
- Förberedelse och lagring av Avidin/NeutrAvidin
- Lös upp den omärkta Avidin/NeutrAvidin i PBS-bufferten enligt tillverkarens anvisningar vid en koncentration av 1,0 mg/ml.
- Alikvot enligt täckglasstorlek (se tabell 1)och förvaras vid -20 °C i upp till 3 år.
- Beredning av virusprov: Förbered virusprover enligt experimentellt behov och labbprotokoll före denna analys. Använd steg 1.3.1 för metod 5A, eller 1.3.2 för metod 5B.
- Förbered virusprover för metod 5A före steg 2. Använd beredda virusprover inom 1-2 dagar efter beredningen, eller alikvot enligt täckspillstorlek (se tabell 1)och blinka sedan frys i flytande kväve och förvara vid -80 °C i upp till ett år. När den tinas, använd omedelbart.
- Förbered virusprover för metod 5B som liknar 1.3.1. Tina upp alikvoter av virus före 5B och förvara vid 4 °C högst 24 timmar före blandning med antikroppar.
- Förbered lämpliga biotinylerade antikroppar för experimentet.
2. Coverlip Rengöring som förberedelse för kemisk behandling
- Placera täcken i ett teflonkåpor i lämplig storlek som håller dem i vertikal orientering och nedsänk dem i en bägare fylld med filtrerad (0,2 μm) etylalkohol (190-bevis).
- Sonicate täcklipsen i den filtrerade etylalkoholen (190 bevis) i 30 min.
- Ta bort täcken från alkohol och skölj täcken i stor utsträckning med ultrapure vatten.
- Placera sköljda täcken i ett separat rent Teflon-rack och bägare fyllt med 1 M NaOH.
- Sonicate täckena i 1 M NaOH i 30 min.
- Ta bort täcken från NaOH och skölj dem kraftigt med ultrapurevatten.
- Torka de sköljda täckena med en kväveström och placera dem i ett rent, torrt Teflon-rack.
- Inspektera täckglasen för synliga film eller partiklar som finns kvar på täcket. Om något synligt material finns kvar har täcket inte rengjorts och sköljts ordentligt. Om de inte rengörs korrekt upprepas steg 2.1-2.7.
- Rengör täckglasen med syreplasma i 2 minuter. Det här steget är valfritt men rekommenderas.
3. Bildandet av PLL-g-PEG tunnfilmsskikt
- Omedelbart efter torkning i kväveströmmen (eller den valfria syreplasman), placera ett lock horisontellt i en steril Petri-skål. Rör i mitten av täckglaset en lämplig mängd tinad PBS-buffrad PLL-g-PEG-biotin (se tabell 1).
- Placera ett annat rengjort täckglas ovanpå vätskan i en smörgåsmetod. Observera att denna metod består i att två täckglas inkuberar sina kemiska filmer genom att orientera sina kemiskt behandlade "aktiva ansikten" mot varandra, åtskilda endast av det nuvarande kemiska skiktet. Se till att det finns tillräckligt med vätska så att volymen mellan de två täckena är helt fylld med vätska, men att ingen vätska läcker ut mellan täckglasen (se tabell 1). Det "aktiva ansiktet" betecknar hädanefter täckskyddsytor som har varit i kontakt med vätskan i sandwichkonfigurationen.
- Placera locket på Petri-skålen över täcksmörgåsen och inkubera på RT i 45-60 min.
- Ta bort locket på Petri-skålen och plocka upp smörgåsen med ett par pincett. Var försiktig så att du inte nyper ut överflödig vätska. Använd tummen och pekfingret för att nypa smörgåsen lätt och skjut täckena i motsatta riktningar horisontellt med avseende på varandra och separera sedan de två täckena från varandra utan att röra de aktiva ytorna.
- Skölj båda aktiva ansikten med ultrapurevatten genom att pipettera 25 ml ultrapurevatten över den aktiva ytan 2-4x och torka sedan täckena med en kväveström. Var noga med att notera vilka täckskyddsytor som är aktiva.
- Använd täckglasen omedelbart, eller förvara O/N med det aktiva ansiktet uppåt i en steril Petri-skål placerad i en dammfri miljö med låg luftfuktighet.
4. Förbättring av avidinbindning
- Placera ett PLL-g-PEG-behandlat täckglas med aktivt ansikte uppåt i en steril Petri-skål.
- Pipett en lämplig mängd tinat avidin i buffert (beredd i steg 1.2) på mitten av det aktiva ansiktet.
- Placera ett annat täckglas (aktivt med ansiktet nedåt) ovanpå vätskan i sandwichmetoden. Notera täckglasens aktiva ansikte. Det är viktigt att de aktiva ytorna kommer i kontakt med vätskan under inkubationen (se steg 3.2).
- Placera locket på Petri-skålen över täcksmörgåsen och inkubera på RT i 25-30 min.
- Ta bort petriskålens lock och separera de två täckena enligt beskrivningen i steg 3.4, se till att hålla reda på och inte röra de aktiva ytorna.
- Skölj båda aktiva ansikten med ultrapurevatten genom att pipettera 25 ml ultrapurevatten över den aktiva ytan 2-4x och torka sedan täckena med en kväveström. Notera täckglasens aktiva ansikte. Använd omedelbart för nästa steg.
VIKTIGT: Det finns två olika metoder för att slutföra provberedningen beroende på vilken typ av analys experimentet medför. Experimenteraren bör fortsätta med steg 5A där viruset är förankrat i glaset innan ytterligare antikroppsbehandling som krävs för superupplösningsavbildning tillsätts. 5B beskriver en alternativ metod för att märka viruset i lösning innan det förankras i glaset. De representativa uppgifterna i detta manuskript utarbetas med hjälp av 5A. En lämplig metod bör väljas enligt experimentell analystyp.
5A. Aktiv ansiktsantikropp tjuder
- Omedelbart efter torkning med en kväveström i steg 4.6, placera en avidinbehandlad coverlip aktiv med ansiktet uppåt i en steril Petri-skål.
- Pipett en lämplig mängd tinad biotinylerad antikropp i buffert på mitten av det aktiva ansiktet (se tabell 1).
- Placera ett annat täckglas (aktivt med ansiktet nedåt) ovanpå vätskan i en sandwichmetod. Observera täckglasens aktiva ansikte, det är viktigt att de aktiva ytorna är i kontakt med vätskan för inkubation (se steg 3.2).Note the active face of the coverlips, it is important the active faces are in contact with the fluid for inkubation (se steg 3.2.).
- Placera locket på Petri-skålen över täcksmörgåsen och inkubera på RT i 45-60 min.
- Ta bort petriskålens lock och separera de två täckena enligt beskrivningen i steg 3.4, se till att hålla reda på och inte röra de aktiva ytorna.
- Skölj båda aktiva ytorna med PBS genom att pipettera 25 ml PBS över det aktiva ansiktet 2-4x, torka inte och använd omedelbart. Var noga med att hålla reda på vilka täckskyddsytor som är aktiva.
- Placera en antikroppsbehandlad coverlip aktiv med ansiktet uppåt i en steril Petri-skål och pipett en lämplig mängd tinat virus i buffert på mitten av det aktiva ansiktet.
- Placera ett annat täckglas (aktivt med ansiktet nedåt) ovanpå vätskan i en sandwichmetod. Observera det aktiva ansiktet, eftersom det är viktigt att de aktiva ytorna är i kontakt med vätskan för inkubation (se steg 3.2.).
- Placera locket på Petri-skålen över täcksmörgåsen och inkubera på RT i 45-60 min.
- Ta bort petriskålens lock och separera de två täckena enligt beskrivningen i steg 3.4, se till att hålla reda på och inte röra de aktiva ytorna.
- Skölj båda aktiva ytorna med PBS genom att pipettera 25 ml PBS över det aktiva ansiktet 2-4x. Torka inte täckena, placera dem istället i ett Teflon-rack och bägare fylld med PBS omedelbart. Var noga med att hålla reda på vilka täckskyddsytor som är aktiva.
- Använd de beredda proverna omedelbart eller förvara i en lämplig buffert vid 4 °C i upp till tre dagar utan betydande förlust av integritet.
Viktig ANMÄRKNING: Om proverna ska användas i en AFM-analys är preparatet klart och de kan användas omedelbart eller lagras enligt beskrivningen i steg 5A.20 - 5A.21. Om prover ska användas i en fluorescensavbildningsanalys med superupplösning, fortsätt till den antikroppsmärkning som beskrivs i steg 5A.12 - 5A.19. - Placera båda virusbehandlade täcken aktiva med ansiktet uppåt i en steril Petri-skål och pipet tillräckligt med proteinblockeringsbuffert på täckglasen för att vara tillräckligt med vätskevolym för att täcka den centrala 95% av täckglaset utan att flöda någon blockerande buffert från täckglaset (vanligtvis 100 - 200 μl.) Inkubera på RT i 60-90 min.
- Ta försiktigt bort blockeringsbufferten genom att ta bort täckena en i taget från Petri-skålen och häll vätskan från täckglaset i en spillbägare. Var försiktig så att du inte tappar täcket.
- Skölj båda aktiva ytorna med PBS genom att pipettera 25 ml PBS över det aktiva ansiktet 2-4x, torka inte och använd omedelbart. Var noga med att hålla reda på vilka täckskyddsytor som är aktiva.
- Placera en enda blockerande buffertbehandlad coverlip aktiv med ansiktet uppåt i en steril Petri-skål och pipetten en lämplig mängd fluorescerande märkt virusantikropp i buffert på mitten av det aktiva ansiktet.
- Placera ett annat täckglas (aktivt med ansiktet nedåt) ovanpå vätskan i en sandwichmetod. Observera vilket ansikte som är aktivt, det är viktigt att de aktiva ytorna är i kontakt med vätskan för inkubation (se steg 3.2).
- Placera locket på Petri-skålen över täcksmörgåsen och inkubera på RT i 30 minuter.
- Ta bort petriskålens lock och separera de två täckena enligt beskrivningen i steg 3.4, se till att hålla reda på och inte röra de aktiva ytorna.
- Skölj båda aktiva ytorna med PBS genom att pipettera 25 ml PBS över det aktiva ansiktet 2-4x, torka inte och använd omedelbart. Var noga med att hålla reda på vilka täckskyddsytor som är aktiva.
- Torka inte täckena, placera dem istället i ett Teflon-rack i en bägare fylld med PBS. Var noga med att hålla reda på vilka täckskyddsytor som är aktiva.
- Använd de beredda proverna omedelbart eller förvara i en lämplig buffert vid 4 °C i upp till tre dagar utan betydande förlust av integritet.
5B. I lösningsantikroppsattack
Den här metoden är en valfri förbättring av märkningsstrategin för den fluorescerande avbildningen med superupplösning. Genom att applicera inlösningsattacken kan bättre antikroppsbeläggning på virusytan uppnås.
- Blanda antikroppslösningar i förhållanden enligt experimentbehov. Exempel 1:4-förhållande på 0, 01 mg/ml biotinylerad antikropp till 0, 01 mg/ml fluorescerande märkt antikropp ger en god bindningstillhörighet och möjliggör god höljesåtervinning i en superupplöst bildanalys.
- Blanda lika stora delar av antikropps- respektive viruslösningarna i (5B.1) respektive (1.3). Blanda försiktigt genom att pipetting upp och ner några gånger i alikvoten. Denna resulterande lösning kan förvaras tills den behövs i upp till 24 timmar vid 4 °C.
- Efter avslutad steg 4.6, placera en avidinbehandlad täcklip med aktivt ansikte upp i en steril Petri-maträtt.
- Pipett en lämplig mängd virus med antikroppslösning (beredd i steg 5B.2) på mitten av det aktiva ansiktet.
- Placera ett annat täckglas (aktivt med ansiktet nedåt) ovanpå vätskan i en sandwichmetod. Observera det aktiva ansiktet, eftersom det är viktigt att de aktiva ytorna kommer i kontakt med vätskan för inkubation (se steg 3.2).
- Placera locket på Petri-skålen över täcksmörgåsen och inkubera på RT i 45-60 min.
- Ta bort petriskålens lock och separera de två täckena enligt beskrivningen i steg 3.4, se till att hålla reda på och inte röra de aktiva ytorna.
- Skölj båda aktiva ytorna med PBS genom att pipettera 25 ml PBS över det aktiva ansiktet 2-4x. Torka inte täckena, placera dem istället i ett Teflon-rack och bägare fylld med PBS omedelbart. Var noga med att hålla reda på vilka täckskyddsytor som är aktiva.
- Använd beredda prover omedelbart eller förvara vid 4 °C i upp till tre dagar utan betydande förlust av integritet.
6. Atomic Force mikroskopimaterial egenskapsmätning
- Slå på AFM-lasrarna och öppna AFM-programvaran. Välj lämpligt skanningsläge för önskad analys i öppningsdialogrutan. Alla nödvändiga fönster bör öppnas som standard. om du inte konsulterar bruksanvisningen för att öppna önskade fönster.
- Välj en cantilever som är lämplig för önskad mätning och sätt in den i cantileverhuset enligt tillverkarens riktlinjer. Det finns ett brett utbud av villkor och experimenttyper för vilka det finns en mängd olika cantilevers. Experimenteraren bör forska i cantilevers efter deras behov.
- Sätt in kantileverhuset i AFM-huvudet enligt tillverkarens riktlinjer.
- Om provet ska användas under våta förhållanden, ta bort provet från lagringsbufferten och fortsätt till steg 6.7.
- Om provet ska användas under omgivande (torra) förhållanden, ta bort provet från dess lagringsbuffert och skölj det kort genom att doppa i en bägare ultrapurevatten. Obs: Detta kommer att lämna ett tunt vätskeskikt på provet som kan inducera kapillär attraktion med cantilevers som har en låg fjäderkonstant.
- Om provet ska användas under omgivande (torra) förhållanden, torka försiktigt provet med en kväveström.
- Torka försiktigt på baksidan av täcket med ett dammfritt filterpapper och se till att inte röra provets aktiva ansikte.
- Placera provet i lämplig hållare för afm-prov och placera sedan provet på AFM-scenen.
- Om provet ska avbildas under våta förhållanden ska pipetten en liten mängd buffert på provets mitt (~10 μl).
- Placera AFM-huvudet över provet.
- Om provet är vått, se till att cantilever- och AFM-spetsen tränger in i ytskiktet och att det inte finns några bubblor mellan cantilever- och cantileverhuset.
- Rikta in AFM-lasern mot kantilevern i enlighet med tillverkarens rekommendationer för att få den optimala signalen.
- Mät cantilever resonansfrekvensen och ställ in skanningsfrekvensen enligt experimenttyp.
- Sänk AFM-spetsen till ytan och optimera signalinställningarna.
- Utför en 20 μm kvadratisk AFM-skanning i det läge du väljer. Tryck (AC) användes för att generera representativa data. Identifiera viruskandidater med ungefärlig höjd, vilket vanligtvis kan ses som skarpa spikar på glasytan.
- Välj en viruskandidat och centrera skanningshuvudet ovanför det.
- Utför en 250 nm kvadratisk skanning (eller lämplig superupplösningsskanning) om det valda viruset för att få dess topologi och orientering.
- Välj en punkt på viruset för materialegenskapsmätningen(t.ex. mitten av ett sfäriskt virus för en Youngs modulmätning) och utför mätningen enligt tillverkarens anvisningar.
7. Bildmetod för superupplösning
- Öppna bildprogramvaran för superupplösning och kalibrera programvaran enligt tillverkarens riktlinjer.
- Kalibrera avbildningsutrustningen med superupplösning i enlighet med tillverkarens anvisningar med hjälp av fluorescerande pärlor.
- Montera provavbildningsbufferten från lagren strax före avbildning genom att kombinera 50 μl 1 M MEA och 100 μl 10x Gloxy till 850 μl stambuffert. Håll bildbufferten på is under hela experimentet.
- Ta bort ett förberett täckglas med prov från dess lagringsbuffert och skölj det 5x genom att doppa det i en bägare ultrapurevatten.
- Torka den icke-aktiva täckplattans ansikte med hjälp av ett dammfritt filterpapper. Se till att inte röra det aktiva ansiktet.
- Sätt in i en bildsystemprovhållare och tillsätt 250 μl bildbuffert till provhållaren. Det är rimligt att byta bildbufferten på provet varannan timme för att upprätthålla konsekventa resultat.
- Täck provhållaren med parafilm för att minska atmosfärisk interaktion med rumsmiljön.
- Placera provhållaren i bildåtergivningsutrustningen för avbildning.
- Sätt provet i fokus med hjälp av tillverkarens anvisningar.
- Avbilda provet enligt superupplösningstekniken som används. Var noga med att justera bildförhållandena för att optimera signalen samtidigt som du minskar samtidiga aktiveringar av fotoomkopplingsbara fluorforer.
VIKTIGT: Bildframställningsförhållandena är provberoende och varierar beroende på experimentellt behov. Ett typiskt experiment som använder Alexa 647 effektivt initierat till sitt mörka tillstånd i bildbufferten kan sedan fotoaktiveras genom tillämpning av 405 nm UV-ljus. Bilder erhålls genom att spännande en gles delmängd av Alexa 647 molekyler inom ett tätt märkt prov och lokalisera varje fluorfor med en precision begränsad främst av antalet insamlade fotoner. Denna procedur itereras upprepade gånger av programvaran tills ett önskat antal förvärvscykler har inträffat. Experimenteraren bör ha denna inställning korrelera med varje fluorfor i provet som har fotoblekts. - När avbildningen är klar stänger du av bildutrustningen enligt tillverkarens anvisningar. Programvaran kan lämnas öppen för dataanalys.
- Dataanalys är starkt beroende av experiment; Identifiera dock i alla fall virus med full bredd på halv maximum, vilket jämförs med de kända virusdimensionerna, och se till att ta hänsyn till den extra storleken på fluorescerande etiketter.
- För bättre visualisering, visa exempel genom att använda antingen Isosurface-renderingsalternativet eller det volymetriska renderingsalternativet, som båda vanligtvis finns i superupplösningsavbildningsprogram.
Representative Results
En virion imaging med AFM:
Provberedningsprotokollet som beskrivs ovan användes vid förankring av vilda typvirioner till glasytan. VSV-virioner är kulformade 180 nm långa och 80 nm i diameter. Eftersom det finns en mängd olika virioner för vilka denna teknik kan tillämpas, visas konceptet också här på biotinylerade 36 nm pärlor också. De resulterande AFM-experimenten visas i figur 1. Det är viktigt att notera att VSV-virions har en lägre Youngs modulus (100 MPa) jämfört med de icke-utstänkta virusen (GPa). De särskilda bilderna av single virion VSV erhölls under gängningsläge i omgivningsförhållanden med en styv cantilever. Syftet har varit att deformera viruset till den grad att den extra proteintätheten i viruset blir synlig som en bula inom AFM-bilden. Denna metod används för att upptäcka den extra proteintätheten i virushålan19.
Bild av en virion superupplösning:
Alexa 647 märkta VSV-G antikroppar användes för att täcka kuvertet av enskilda VSV virions för superupplösning experiment med metod 5A. För att påvisa den tjudrande densiteten och den låga ospecificerade bindningen visas en stor skanning av provet i figur 2A. Återvinningen av virushöljet på en representativ virion visas i figur 2B (blå isosurface).
Figur 1. AFM-avbildning av pärlor och VSV på den funktionaliserade PEGG-ytan. AFM-skanning av 36 nm biotinylerade pärlor(A, B)och en VSV-virion (C) förankrad på ytan med en biotinylerad VSVG-antikropp. AFM gjordes i AC luft topografi skanning läge. Spetsradien är <25 nm och mätningar utfördes under kraftmodulering och lätt gängning. Spetsen hade en kraftkonstant på 3 N/m och resonansfrekvens 75 kHz med osäkerhet på 15 kHz. Medan pärlorna behöll sin höjd under AFM-skanningen, har VSV-virion en betydligt mindre ung modulus och är signifikant deformerad i höjd. I den här bilden avbildades virion specifikt med en styv cantilever i gängningsläge som producerade en liten xy-faltning (används för att bestämma virusets spets vs trubbiga ände) och höjdskillnaden mellan virusets spets och trubbiga ände används för att upptäcka extra proteintäthet i den trubbiga änden av viruset19.
Figur 2. Fluorescensbaserad avbildning av VSV-virioner på PEGG-den funktionaliserade ytan. A) rekombinant VSV-virioner immobiliserade på PEGG-ytan med hjälp av en biotinylerad anti VSVG-antikropp som avbildas i bred fältfluorescens. B) Högupplöst fluorescensrekonstruktion av kuvertet av VSV fäst vid PEGG-ytan genom en biotinylerad anti VSVG-antikropp och dekorerad med Alexa 647 märkta anti-VSVG-antikroppar (metod 5A användes för att skapa dessa bilder). Den blå ytan är en 2D isosurface projektion. Vänster visar en modell av det kulformade viruset.
| Omslagslipstorlek | vätska |
| 40 mm | 65 μl |
| 35 mm | 50 μl |
| 30 mm | 36 μl |
| 25 mm | 25 μl |
| 20 mm | 16 μl |
Tabell 1. Flytande alikvoter enligt täcklipstorlek.
Discussion
Enkel virion imaging med AFM och Högupplöst fluorescens imaging kan användas som en alternativ metodik till CryoEM tomografi. Var och en av dessa metoder har sina specifika styrkor. Till exempel kan AFM göras på WT-virioner utan krav på märkning av provet eller de inre virusproteinerna. Placeringen av virusstrukturer är decentraliserad från deras bidrag till virions elastiska egenskaper.
Single virion super-resolution imaging i kombination med de nyutvecklade virala omvända genetiska metoder blir en kraftfull teknik för att lokalisera lågt kopieringsnummer viralaproteiner 20. Rekombinanta virus med ersättning av deras proteiner med proteiner som smälts till fluorescerande proteiner kan tillverkas och renas med hjälp av dessa omvända genetiska metoder. Även om superupplösningsavbildning delvis har specificitet på grund av den genetiska märkningen, kräver den användning av mutantvirusen.
AFM och superupplösningsavbildning är gratis metoder som använder mycket liknande provpreparat. De metoder som beskrivs i detta dokument, som antas bilda tidigare enstaka molekylavbildningsanalyser, möjliggör förankring av enstaka virioner med små effekter på virions topologi.
Disclosures
Författarna har inga konkurrerande ekonomiska intressen i detta dokument.
Acknowledgments
Vi tackar dr Till Böcking för det ursprungliga beredningsprotokollet för en molekyl. Detta arbete stöddes av NSF-bidrag 1121972(SS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass coverslips (fPALM) | Electron Microscopy Services | 72225-01 | 25 mm Coverslips |
| PLL(20)-g[3.5]-PEG(2)/PEG(3.4)-Biotin (20%) | SuSoS | - | Stock: 0.5 mg/ml in PBS |
| NeutrAvidin biotin-binding protein | Invitrogen | A2666 | Stock: 0.25 mg/ml in PBS |
| Alexa Fluor 647 goat anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | A21245 | 1:200 in 0.2 M KPO4, 0.15 M NaCl, 10% Glycol, pH 7.2 buffer |
| α-VSV-G | Invitrogen | ab34774 | 1:200 in 0.2 M KPO4, 0.15 M NaCl, 10% Glycol, pH 7.2 buffer |
| Gluox | Sigma | G2133-250KU | Glucose oxidase type seven from Aspergillius |
| Catalase | Sigma | C40-100mg | Catalase from Bovine liver |
| MEA | Sigma | 30070-10G | Cysteamine (MEA |
| Stock Buffer | 50 mM Tris-HCl (pH 8.0) + 10 mM NaCl + 10% glucose | ||
| NTE | 10 mM Tris pH 7.4, 100 mM NaCl, 66 mM EDTA | ||
| Slide-A-Lyzer, mini dialysis unit | Thermo Scientific | 10,000 MW | |
| Microscope Cover Glass: 35 CIRCLE #1 | Fisherbrand | 35 CIRCLE #1 |
References
- Pang, H. -B., et al. Virion stiffness regulates immature HIV-1 entry. Retrovirology. 10, 4 (2013).
- Kol, N., et al. A Stiffness Switch in Human Immunodeficiency Virus. Biophys. J. 92, 1777-1783 (2007).
- Ortega-Esteban, A., et al. Minimizing tip–sample forces in jumping mode atomic force microscopy in liquid. Ultramicroscopy. 114, 56-61 (2012).
- Ortega-Esteban, A., et al. Monitoring dynamics of human adenovirus disassembly induced by mechanical fatigue. Sci. Rep. 3, (2013).
- Hernando-Pérez, M., et al. Physical Virology: Direct Measurement of Phage. phi29 Stiffness Provides Evidence of Internal Pressure (Small 15/2012). Small. 8, 2365-2365 (2012).
- Carrasco, C., et al. DNA-mediated anisotropic mechanical reinforcement of a virus. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 13706-13711 (2006).
- Sofia, S. J., Premnath, V. V., Merrill, E. W. Poly(ethylene oxide) Grafted to Silicon Surfaces: Grafting Density and Protein Adsorption. Macromolecules. 31, 5059-5070 (1998).
- Visnapuu, M. -L., Duzdevich, D., Greene, E. C. The importance of surfaces in single-molecule bioscience. Mol. Biosyst. 4, 394-403 (2008).
- Elenko, M. P., Szostak, J. W., Van Oijen, A. M. Single-molecule binding experiments on long time scales. Rev. Sci. Instrum. 81, (2010).
- van Oijen, A. M., et al. Single-Molecule Kinetics of λ Exonuclease Reveal Base Dependence and Dynamic Disorder. Science. 301, 1235-1238 (2003).
- Böcking, T., Aguet, F., Harrison, S. C., Kirchhausen, T. Single-molecule analysis of a molecular disassemblase reveals the mechanism of Hsc70-driven clathrin uncoating. Nat. Struct. Mol. Biol. 18, 295-301 (2011).
- Cocucci, E., Aguet, F., Boulant, S., Kirchhausen, T. The First Five Seconds in the Life of a Clathrin-Coated Pit. Cell. 150, 495-507 (2012).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. W. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy. 3, 793-795 (2006).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313, 1642-1645 (2006).
- Hess, S. T., Girirajan, T. P. K., Mason, M. D. Ultra-High Resolution Imaging by Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy. Biophys. J. 91, 4258-4272 (2006).
- Juette, M. F., et al. Three-dimensional sub-100 nm resolution fluorescence microscopy of thick samples. Nat. Methods. 5, 527-529 (2008).
- Xu, K., Zhong, G., Zhuang, X. Actin, Spectrin, and Associated Proteins Form a Periodic Cytoskeletal Structure in Axons. Science. 339, 452-456 (2013).
- Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-Dimensional Super-Resolution Imaging by Stochastic Optical Reconstruction Microscopy. Science. 319, 810-813 (2008).
- Hodges, J., et al. Asymmetric packaging of polymerases within vesicular stomatitis virus. Biochemical and Biophysical Research Communications. 440, 271-276 (2013).
- Lawson, N. D., Stillman, E. A., Whitt, M. A., Rose, J. K. Recombinant vesicular stomatitis viruses from DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 4477-4481 (1995).
