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Biology

एकल वीरीय परमाणु बल माइक्रोस्कोपी और सुपर-रेजोल्यूशन फ्लोरेसेंस इमेजिंग के लिए नमूना तैयारी

Published: January 2, 2014 doi: 10.3791/51366
Automatic Translation
1,2, 1,2
1Department of Physics & Astronomy, University of Utah, 2Center for Cell and Genome, University of Utah

Summary

एक सतह के लिए virions के लगाव सुपर संकल्प फ्लोरेसेंस इमेजिंग या परमाणु बल माइक्रोस्कोपी (AFM) द्वारा एकल वीर्य इमेजिंग के लिए एक आवश्यकता है । यहां हम एएफएम और सुपर-रेजोल्यूशन फ्लोरेसेंस इमेजिंग में उपयोग के लिए उपयुक्त कांच की सतहों के लिए विरियंस के नियंत्रित आसंजन के लिए एक नमूना तैयारी विधि प्रदर्शित करते हैं।

Abstract

कांच की सतहों के लिए विषुव का स्थिरीकरण एकल वीर्य इमेजिंग में एक महत्वपूर्ण कदम है। यहां हम एकल अणु इमेजिंग परख से अपनाई गई एक तकनीक प्रस्तुत करते हैं जो विशिष्टता के साथ कांच की सतहों के लिए एकल विरनों के आसंजन की अनुमति देता है। यह तैयारी पीएलएल-जी-खूंटी और पीएलएल-जी-खूंटी-बायोटिन के मिश्रण के साथ ग्लास की सतह को ग्राफ्टिंग करने पर आधारित है, जो एविडिन की एक परत जोड़ती है, और अंत में बायोटिनाइलेटेड वायरस विशिष्ट एंटीबॉडी के लगाव के माध्यम से विरीन एंकर बनाती है। हमने इस तकनीक को परमाणु बल माइक्रोस्कोपी (एएफएम) और सुपर-रेजोल्यूशन फ्लोरेसेंस इमेजिंग सहित कई प्रयोगों में लागू किया है। इस नमूना तैयारी विधि के परिणामस्वरूप सतह पर विरनों का नियंत्रण आसंजन होता है।

Introduction

आवेश आधारित गैर - विशिष्ट बातचीत नियमित रूप से परमाणु बल माइक्रोस्कोपी1,2में विषाणुओं के आसंजन के लिए उपयोग की जाती है। ये तकनीकें विशेष रूप से अच्छी तरह से काम करती हैं जब बहुत कठोर कैप्सिड3-6के साथ नॉनएनवेलोप्ड विरियंस पर उपयोग किया जाता है। यद्यपि ये तकनीकें नमूने को स्थिर करने में बहुत प्रभावी हैं, लेकिन वे सतह पर प्रोटीन के गैर-विशिष्ट बाध्यकारी को नहीं रोकते हैं। गैर-विशिष्ट बाध्यकारी एएफएम और सुपर-रिज़ॉल्यूशन फ्लोरेसेंस तकनीकों के साथ विरशन छवि का प्रयास करते समय एक समस्या पैदा कर सकता है जिसके लिए विभिन्न एंटीबॉडी के साथ नमूने के ऊष्मायनों की आवश्यकता होती है। यहां हम वीरन्धों के विशिष्ट स्थिरीकरण के लिए एक नमूना तैयारी विधि की रूपरेखा तैयार करते हैं।

पॉली (एथिलीन ग्लाइकोल) (खूंटी) पॉली (एल-लिसाइन) (पीएलएल) और कांच की सतह पर सोखने के लिए ग्राफ्ट ग्लास7के साथ प्रोटीन के इलेक्ट्रोस्टैटिक इंटरैक्शन के लिए एक महत्वपूर्ण ब्लॉक प्रदान करता है। एकल अणु परख जो कांच की सतहों पर एकल अणुओं के स्थिरीकरण की आवश्यकता है इस संपत्ति का लाभ ले लिया है और यह एक विशिष्ट खूंटी आधारित एकल अणु स्थिरीकरण तकनीक8-10बनाने के लिए इस्तेमाल किया । इस तैयारी का उपयोग कांच की सतह11 पर क्लैथ्रिन पिंजरों को स्थिर करने के साथ - साथ नियंत्रण कोशिका आसंजन 12के लिए समरूप फाइब्रोनेक्टिन कोटिंग बनाने के लिए भी किया गया था ।

हमने एकल अणु इमेजिंग पद्धतियों से कांच की सतहों के लिए पीएलएल-जी-खूंटी सोखने के आधार पर नमूना तैयारी विधि अपनाई है और इसे वेसिकुलर स्टोमेटाइटिस वायरस (वीएसवी) के एकल विषाणुओं पर लागू किया है। इन एकल विषाणुओं को परमाणु बल माइक्रोस्कोपी (एएफएम) का उपयोग करके चित्रित किया गया था। इसी तरह के प्रयोग भी एक नियंत्रण के रूप में कार्यात्मक मोतियों पर किए गए थे। उग्रता को सुपर-रिज़ॉल्यूशन फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी द्वारा भी इमेज किया गया था, जो एलेक्सा 647 के साथ लेबल किए गए वीएसवी-जी एंटीबॉडी थे, जिनका उपयोग एकल विरनों के लिफाफे की छवि बनाने के लिए किया गया था। उच्च संकल्प फ्लोरोसेंट इमेजिंग13-15छवि बनाने के लिए एकल अणुओं के स्थानीयकरण का उपयोग करता है। fPALM द्वि-planar इमेजिंग विमान में 20 एनएम और ऑप्टिकल एक्सिस15,16 साथ 50एनएम संकल्प के साथ एकल अणुओं के स्थानीयकरण की अनुमति देता है . इस द्वि-प्लानर तकनीक का उपयोग इस अध्ययन में मौजूद सुपर-रेजोल्यूशन फ्लोरोसेंट छवियों को छवि देने के लिए किया गया था। एक वैकल्पिक तकनीक जिसके समान परिणाम होते हैं, वह हैस्टॉर्म 13,17,18.

इस पेपर में उल्लिखित प्रक्रियाओं द्वारा ग्लास में लंगर डाले गए वीएसवी की एएफएम और सुपर-रेजोल्यूशन फ्लोरोसेंट छवियों दोनों ने न्यूनतम गैर-विशिष्ट बातचीत19के साथ ग्लास में वीरन्य के विशिष्ट बाध्यकारी दिखाए। यहां हम एएफएम और सुपर-रेजोल्यूशन फ्लोरोसेंट इमेजिंग प्रयोगों के लिए नमूना तैयारी प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। संक्षेप में: साफ ग्लास कवर्लिप को पीएलएल-जी-खूंटी और पीएलएल-जी-खूंटी-बायोटिन के मिश्रण को सोखकर कार्यात्मक किया जाता है। इस पतली फिल्म को लेपित सतह पर 15-25% कार्यात्मक बायोटिन के बीच प्रदान करने के लिए इंजीनियर किया जाना विशिष्ट है। कवरस्लिप को टेट्रामेरिक एविडिन के साथ आगे बढ़ाया जाता है। इसके बाद एक बायोटिनाइलेटेड वायरल एंटीबॉडी का उपयोग विरशन के लिए एक अद्वितीय बाध्यकारी साइट बनाने के लिए किया जाता है। एंटीबॉडी का बाइंडिंग दो तरह से किया जा सकता है।

पहली विधि AFM के लिए अनुकूलित है, लेकिन यह सुपर संकल्प फ्लोरेसेंस इमेजिंग के लिए उपयुक्त रहता है । इस विधि में एविडिन लेपित सतह वायरल आसंजन से पहले बायोटिनाइलेटेड एंटीबॉडी के साथ इलाज किया जाता है। स्थिर उग्रता को लिफाफे को कवर करने और स्पीरियंस के सुपर-रिज़ॉल्यूशन फ्लोरेसेंस इमेजिंग की अनुमति देने के लिए एलेक्सा 647 लेबल एंटीबॉडी के साथ इलाज किया जाता है।

दूसरी विधि एविडिन उपचारित सतह पर वायरस का पालन करने से पहले बायोटिनाइलेटेड एंटीबॉडी और एलेक्सा 647 लेबल एंटीबॉडी के साथ समाधान में वायरस पर हमला करना है; इस विधि को सुपर-रिज़ॉल्यूशन फ्लोरेसेंस इमेजिंग प्रयोगों के लिए अनुकूलित किया गया है जिसमें वायरल लिफाफे की वसूली महत्वपूर्ण है। इस विधि में वायरल सतह पर एक समान एंटीबॉडी कोटिंग की अनुमति देने का लाभ है। बायोटिनेलेटेड एंटीबॉडी को एलेक्सा 647 लेबल वाले वायरल एंटीबॉडी के साथ अनुपात में मिलाया जा सकता है जो वायरल लिफाफे के बाहरी हिस्से पर फ्लोरोसेंट लेबल की उच्च एकाग्रता बनाए रखते हुए एविडिन उपचारित सतह पर वायरस के पर्याप्त अवशोषण की अनुमति देता है। ये एलेक्सा 647 लेबल वायरल एंटीबॉडी बायोटिनाइलेटेड नहीं हैं और पृष्ठभूमि शोर को कम करने के लिए उनकी अतिरिक्त को धोया जा सकता है।

Protocol

1. रसायन विज्ञान की तैयारी

  1. पीएलएल-जी-खूंटी-बायोटिन और एविडिन की तैयारी और भंडारण:
    1. 1.0 मिलीग्राम/मिलीलीटर की एकाग्रता पर निर्माता के निर्देशों के अनुसार पीबीएस बफर में बहुलक पीएलएल-जी-खूंटी-बायोटिन को भंग करें।
    2. कवरलिप आकार के अनुसार अलीकोट (टेबल 1देखें) और एक वर्ष तक -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  2. Avidin/NeutrAvidin की तैयारी और भंडारण
    1. 1.0 मिलीग्राम/मिलीलीटर की एकाग्रता पर निर्माता के निर्देशों के अनुसार पीबीएस बफर में अवेलेबल एविडिन/न्यूट्राविडिन को भंग करें।
    2. कवरलिप आकार के अनुसार अलीकोट (टेबल 1देखें) और 3 साल तक -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  3. वायरस नमूना तैयारी: इस परख से पहले प्रयोगात्मक जरूरत और प्रयोगशाला प्रोटोकॉल के अनुसार वायरस के नमूने तैयार करें। विधि 5A के लिए चरण 1.3.1 का उपयोग करें, या विधि 5B के लिए 1.3.2।
    1. चरण 2 के अग्रिम में विधि 5A के लिए वायरस के नमूने तैयार करें। तैयारी के 1-2 दिनों के भीतर तैयार वायरल नमूनों का उपयोग करें, या कवर स्लिप आकार के अनुसार एलिकोट (टेबल 1देखें) फिर तरल नाइट्रोजन में फ्लैश फ्रीज करें और एक वर्ष तक -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। गल जाने पर तुरंत इस्तेमाल करें।
    2. 1.3.1 के समान विधि 5B के लिए वायरस के नमूने तैयार करें। 5B के अग्रिम में वायरस के गल aliquots और एंटीबॉडी के साथ मिश्रण करने से पहले 24 घंटे से अधिक नहीं 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर ।
  4. प्रयोग के लिए उपयुक्त बायोटिनेलेटेड एंटीबॉडी तैयार करें।

2. रासायनिक उपचार की तैयारी में कवरस्लिप सफाई

  1. एक उचित आकार के टेफ्लॉन कवरलिप रैक में कवरस्लिप रखें जो उन्हें ऊर्ध्वाधर अभिविन्यास में रखता है और उन्हें फ़िल्टर (0.2 माइक्रोन) एथिल अल्कोहल (1 9 0 प्रूफ) से भरे बीकर में जलमग्न कर देता है।
  2. 30 मिनट के लिए फ़िल्टर एथिल अल्कोहल (1 9 0 प्रूफ) में कवरस्लिप को सोनिकेट करें।
  3. शराब से कवरस्लिप निकालें और अल्ट्रापुरे पानी के साथ बड़े पैमाने पर कवर्लिप कुल्ला।
  4. एक अलग साफ टेफ्लॉन रैक और 1 एम नाओएच से भरे बीकर में कुल्ला कवरस्लिप रखें।
  5. 30 मिनट के लिए 1 एम नाओह में कवरस्लिप को सोनिकेट करें।
  6. नाओएच से कवरस्लिप निकालें और उन्हें अल्ट्रापुरे पानी से बड़े पैमाने पर कुल्लाएं।
  7. नाइट्रोजन स्ट्रीम के साथ कुल्ला कवर्लिप्स को सुखाएं, और उन्हें एक साफ, सूखे टेफ्लॉन रैक में रखें।
  8. किसी भी दृश्यमान फिल्म या कणों के लिए कवरस्लिप का निरीक्षण करें जो कवरस्लिप पर रहते हैं। यदि कोई दृश्यमान सामग्री बनी हुई है, तो कवरलिप को ठीक से साफ और धोया नहीं गया है। यदि ठीक से साफ नहीं दोहराने कदम 2.1-2.7।
  9. कवरस्लिप को ऑक्सीजन-प्लाज्मा से 2 मिनट तक साफ करें। यह कदम वैकल्पिक है लेकिन अनुशंसित है।

3. पीएलएल-जी-खूंटी पतली फिल्म परत का गठन

  1. नाइट्रोजन स्ट्रीम (या वैकल्पिक ऑक्सीजन-प्लाज्मा) में सूखने के तुरंत बाद, एक बाँझ पेट्री डिश में क्षैतिज रूप से एक कवरलिप रखें। कवरलिप के केंद्र में पिपेट गल पीबीएस बफर पीएलएल-जी-खूंटी-बायोटिन (तालिका 1देखें) की एक उचित राशि।
  2. सैंडविच विधि में तरल पदार्थ के ऊपर एक और साफ कवरलिप रखें। ध्यान दें कि इस विधि में दो कवरस्लिप होते हैं, जो उनके रासायनिक रूप से इलाज किए गए "सक्रिय चेहरों" को एक दूसरे की ओर उन्मुख करके अपनी रासायनिक फिल्मों को इनक्यूबेट करते हैं, केवल वर्तमान रासायनिक परत से अलग होते हैं। सुनिश्चित करें कि पर्याप्त तरल पदार्थ है जैसे कि दो कवरस्लिप के बीच की मात्रा पूरी तरह से तरल पदार्थ से भरी हुई है, लेकिन कोई भी तरल पदार्थ कवरस्लिप के बीच से लीक नहीं होता है (तालिका 1देखें)। "सक्रिय चेहरा" अब से कवरलिप चेहरे जो सैंडविच विन्यास में तरल पदार्थ के संपर्क में रहा है नामित ।
  3. कवरस्लिप सैंडविच के ऊपर पेट्री डिश का ढक्कन रखें और आरटी में 45-60 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें ।
  4. पेट्री डिश का ढक्कन हटाएं और चिमटी की एक जोड़ी के साथ सैंडविच उठाएं। अतिरिक्त तरल पदार्थ को चुटकी न देने के लिए सावधान रहें। सैंडविच को हल्के से चुटकी लेने के लिए अंगूठे और इंडेक्स फिंगर का उपयोग करें और एक-दूसरे के संबंध में क्षैतिज रूप से विपरीत दिशाओं में कवरस्लिप को स्लाइड करें, फिर सक्रिय चेहरों को छुए बिना दो कवरस्लिप को एक दूसरे से अलग करें।
  5. सक्रिय चेहरे 2-4x पर 25 मिलीलीटर अल्ट्रापुरे पानी को पाइप करके अल्ट्रापुरे पानी के साथ दोनों सक्रिय चेहरों को कुल्लाएं, और फिर एक नाइट्रोजन धारा के साथ कवरस्लिप सूखी। ध्यान दें कि कौन से कवरलिप चेहरे सक्रिय हैं।
  6. तुरंत कवरस्लिप का उपयोग करें, या एक धूल मुक्त कम आर्द्रता वातावरण में रखा एक बाँझ पेट्री पकवान में सक्रिय चेहरे के साथ O/N स्टोर करें ।

4. एविडिन बाइंडिंग एन्हांसमेंट

  1. एक बाँझ पेट्री डिश में सक्रिय चेहरे के साथ एक PLL-जी-खूंटी इलाज कवरस्लिप रखें ।
  2. पाइपेट सक्रिय चेहरे के बीच पर बफर (चरण 1.2 में तैयार) में गल गई एविडिन की उचित मात्रा।
  3. सैंडविच विधि में तरल पदार्थ के ऊपर एक और कवरलिप (सक्रिय चेहरा नीचे) रखें। कवर्लिप्स के सक्रिय चेहरे पर ध्यान दें। यह महत्वपूर्ण है कि सक्रिय चेहरे इनक्यूबेशन के दौरान तरल पदार्थ के संपर्क में रहें (चरण 3.2 देखें)।
  4. कवरस्लिप सैंडविच के ऊपर पेट्री डिश का ढक्कन रखें और आरटी में 25-30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें ।
  5. पेट्री डिश ढक्कन निकालें और चरण 3.4 में वर्णित दो कवरस्लिप को अलग करें, जिससे सक्रिय चेहरों का ट्रैक रखना और न छूना सुनिश्चित हो।
  6. सक्रिय चेहरे 2-4x पर 25 मिलीलीटर अल्ट्रापुरे पानी को पाइप करके अल्ट्रापुरे पानी के साथ दोनों सक्रिय चेहरों को कुल्लाएं और फिर एक नाइट्रोजन धारा के साथ कवरस्लिप सूखी। कवर्लिप्स के सक्रिय चेहरे पर ध्यान दें। अगले चरण के लिए तुरंत उपयोग करें।

महत्वपूर्ण नोट: प्रयोग पर जोर देता है के प्रकार के आधार पर नमूना तैयारी को पूरा करने के लिए दो अलग तरीके हैं । प्रयोगकर्ता को स्टेज 5A के साथ आगे बढ़ना चाहिए जिसमें वायरस को सुपर-रेजोल्यूशन इमेजिंग के लिए आवश्यक किसी भी अतिरिक्त एंटीबॉडी उपचार से पहले ग्लास में लंगर डाला जाता है। 5B इसे ग्लास में एंकरिंग करने से पहले वायरस को समाधान में लेबल करने की एक वैकल्पिक विधि का वर्णन करता है। इस पांडुलिपि में प्रतिनिधि डेटा 5A का उपयोग करके तैयार किया जाता है। प्रयोगात्मक परख प्रकार के अनुसार एक उपयुक्त विधि का चयन किया जाना चाहिए।

5A. सक्रिय चेहरा एंटीबॉडी टीथर

  1. चरण 4.6 में नाइट्रोजन धारा के साथ सूखने के तुरंत बाद, एक बाँझ पेट्री डिश में एक एविडिन उपचारित कवरस्लिप सक्रिय चेहरा रखें।
  2. पाइपेट सक्रिय चेहरे के बीच पर बफर में गल बायोटिनाइलेटेड एंटीबॉडी की एक उचित मात्रा (तालिका 1देखें)।
  3. सैंडविच विधि में तरल पदार्थ के ऊपर एक और कवरस्लिप (सक्रिय चेहरा नीचे) रखें। कवर्लिप्स के सक्रिय चेहरे पर ध्यान दें, यह महत्वपूर्ण है कि सक्रिय चेहरे इनक्यूबेशन के लिए तरल पदार्थ के संपर्क में हैं (चरण 3.2 देखें)।
  4. कवरस्लिप सैंडविच के ऊपर पेट्री डिश का ढक्कन रखें और आरटी में 45-60 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें ।
  5. पेट्री डिश ढक्कन निकालें और चरण 3.4 में वर्णित दो कवरस्लिप को अलग करें, जिससे सक्रिय चेहरों का ट्रैक रखना और न छूना सुनिश्चित हो।
  6. सक्रिय चेहरे 2-4x पर पीबीएस के 25 मिलीलीटर पाइपिंग द्वारा पीबीएस के साथ दोनों सक्रिय चेहरों कुल्ला, सूखी नहीं है और तुरंत उपयोग करते हैं । ट्रैक रखना सुनिश्चित करें कि कौन से कवरलिप चेहरे सक्रिय हैं।
  7. एक बाँझ पेट्री डिश में एक एंटीबॉडी इलाज कवरस्लिप सक्रिय चेहरे रखें, और सक्रिय चेहरे के बीच पर बफर में गल वायरस की एक उचित मात्रा में पिपेट करें।
  8. सैंडविच विधि में तरल पदार्थ के ऊपर एक और कवरस्लिप (सक्रिय चेहरा नीचे) रखें। सक्रिय चेहरे पर ध्यान दें, क्योंकि यह महत्वपूर्ण है कि सक्रिय चेहरे इनक्यूबेशन के लिए तरल पदार्थ के संपर्क में हैं (चरण 3.2 देखें)।
  9. कवरस्लिप सैंडविच के ऊपर पेट्री डिश का ढक्कन रखें और आरटी में 45-60 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें ।
  10. पेट्री डिश ढक्कन निकालें और चरण 3.4 में वर्णित दो कवरस्लिप को अलग करें, जिससे सक्रिय चेहरों का ट्रैक रखना और न छूना सुनिश्चित हो।
  11. सक्रिय चेहरे 2-4x पर पीबीएस के 25 मिलीलीटर पाइपिंग द्वारा पीबीएस के साथ दोनों सक्रिय चेहरों कुल्ला। कवरस्लिप को सूखा न करें, इसके बजाय उन्हें एक टेफ्लॉन रैक में रखें और पीबीएस से भरे बीकर को तुरंत रखें। ट्रैक रखना सुनिश्चित करें कि कौन से कवरलिप चेहरे सक्रिय हैं।
  12. तैयार नमूनों का तुरंत उपयोग करें या अखंडता के महत्वपूर्ण नुकसान के बिना तीन दिनों तक 4 डिग्री सेल्सियस पर एक उपयुक्त बफर में स्टोर करें।

    महत्वपूर्ण नोट: यदि नमूनों का उपयोग एएफएम परख में किया जाना है, तो तैयारी पूरी हो गई है और उनका उपयोग तुरंत किया जा सकता है या जिसे चरण 5A.20 - 5A.21 में वर्णित किया गया है। यदि नमूनों का उपयोग सुपर-रेजोल्यूशन फ्लोरेसेंस इमेजिंग परख में किया जाना है, तो कदम 5A.12 - 5A.19 में वर्णित एंटीबॉडी लेबलिंग पर आगे बढ़ें।
  13. दोनों वायरस का इलाज कवरस्लिप सक्रिय चेहरा एक बाँझ पेट्री डिश में रखें और पर्याप्त प्रोटीन को कवरस्लिप पर बफर अवरुद्ध करने के लिए पर्याप्त तरल पदार्थ की मात्रा मनका को कवर्सलिप के केंद्रीय ९५% को कवर कवर करने के लिए कवरस्लिप से किसी भी अवरुद्ध बफर बहने के बिना (आम तौर पर १००-२०० μl.) 60-90 मिनट के लिए आरटी में इनक्यूबेट ।
  14. पेट्री डिश से एक समय में कवरस्लिप को हटाकर ब्लॉकिंग बफर को ध्यान से हटा दें और कवरस्लिप के तरल पदार्थ को बेकार बीकर में डाल दें। कवरस्लिप को न छोड़ने के लिए सावधान रहें।
  15. सक्रिय चेहरे 2-4x पर पीबीएस के 25 मिलीलीटर पाइपिंग द्वारा पीबीएस के साथ दोनों सक्रिय चेहरों कुल्ला, सूखी नहीं है और तुरंत उपयोग करते हैं । ट्रैक रखना सुनिश्चित करें कि कौन से कवरलिप चेहरे सक्रिय हैं।
  16. एक बाँझ पेट्री डिश में एक एकल अवरुद्ध बफर इलाज कवरस्लिप सक्रिय चेहरे को रखें, और सक्रिय चेहरे के बीच पर बफर में वायरल एंटीबॉडी लेबल फ्लोरोसेंटली लेबल की एक उचित मात्रा में पिपेट करें।
  17. सैंडविच विधि में तरल पदार्थ के शीर्ष पर एक और कवरलिप (सक्रिय चेहरा नीचे) रखें। ध्यान दें कि कौन सा चेहरा सक्रिय है, यह महत्वपूर्ण है कि सक्रिय चेहरे इनक्यूबेशन के लिए तरल पदार्थ के संपर्क में हैं (चरण 3.2 देखें)।
  18. कवरस्लिप सैंडविच के ऊपर पेट्री डिश का ढक्कन रखें और आरटी में 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें ।
  19. पेट्री डिश ढक्कन निकालें और चरण 3.4 में वर्णित दो कवरस्लिप को अलग करें, जिससे सक्रिय चेहरों का ट्रैक रखना और न छूना सुनिश्चित हो।
  20. सक्रिय चेहरे 2-4x पर पीबीएस के 25 मिलीलीटर पाइपिंग द्वारा पीबीएस के साथ दोनों सक्रिय चेहरों कुल्ला, सूखी नहीं है और तुरंत उपयोग करते हैं । ट्रैक रखना सुनिश्चित करें कि कौन से कवरलिप चेहरे सक्रिय हैं।
  21. कवरस्लिप को सूखा न करें, इसके बजाय उन्हें पीबीएस से भरे बीकर के भीतर टेफ्लॉन रैक में रखें। ट्रैक रखना सुनिश्चित करें कि कौन से कवरलिप चेहरे सक्रिय हैं।
  22. तैयार नमूनों का तुरंत उपयोग करें या अखंडता के महत्वपूर्ण नुकसान के बिना तीन दिनों तक 4 डिग्री सेल्सियस पर एक उपयुक्त बफर में स्टोर करें।

5B। समाधान एंटीबॉडी हमले में

यह विधि सुपर-रेजोल्यूशन फ्लोरोसेंट इमेजिंग के लिए लेबलिंग रणनीति की एक वैकल्पिक वृद्धि है। इन सॉल्यूशन अटैक को लागू करके, वायरल सतह पर बेहतर एंटीबॉडी कोटिंग हासिल की जा सकती है।

  1. प्रयोगों की जरूरत के अनुसार अनुपात में एंटीबॉडी समाधान मिलाएं। उदाहरण 1:01 मिलीग्राम/मिलीलीटर बायोटिनाइलेटेड एंटीबॉडी का अनुपात ०.०१ मिलीग्राम/मिलीलीटर फ्लोरोसेंटली लेबल एंटीबॉडी एक अच्छा बाध्यकारी आत्मीयता देगा और सुपर-रेजोल्यूशन इमेजिंग परख में अच्छे लिफाफे की वसूली के लिए अनुमति देगा ।
  2. एंटीबॉडी और वायरस समाधान के बराबर भाग क्रमशः (5B.1) और (1.3) में तैयार मिलाएं। अलीकोट में कई बार ऊपर और नीचे पाइपिंग करके धीरे-धीरे मिलाएं। इस परिणामी समाधान को 4 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे तक की आवश्यकता तक संग्रहीत किया जा सकता है।
  3. चरण 4.6 के पूरा होने पर, एक बाँझ पेट्री डिश में सक्रिय चेहरे के साथ एक एविडिन इलाज कवरलिप रखें।
  4. सक्रिय चेहरे के बीच पर एंटीबॉडी समाधान (चरण 5B.2 में तैयार) के साथ वायरस की उचित मात्रा में पिपेट करें।
  5. सैंडविच विधि में तरल पदार्थ के ऊपर एक और कवरस्लिप (सक्रिय चेहरा नीचे) रखें। सक्रिय चेहरे पर ध्यान दें, क्योंकि यह महत्वपूर्ण है कि सक्रिय चेहरे इनक्यूबेशन के लिए तरल पदार्थ के संपर्क में हैं (चरण 3.2 देखें)।
  6. कवरस्लिप सैंडविच के ऊपर पेट्री डिश का ढक्कन रखें और आरटी में 45-60 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें ।
  7. पेट्री डिश ढक्कन निकालें और चरण 3.4 में वर्णित दो कवरस्लिप को अलग करें, जिससे सक्रिय चेहरों का ट्रैक रखना और न छूना सुनिश्चित हो।
  8. सक्रिय चेहरे 2-4x पर पीबीएस के 25 मिलीलीटर पाइपिंग द्वारा पीबीएस के साथ दोनों सक्रिय चेहरों कुल्ला। कवरस्लिप को सूखा न करें, इसके बजाय उन्हें एक टेफ्लॉन रैक में रखें और पीबीएस से भरे बीकर को तुरंत रखें। ट्रैक रखना सुनिश्चित करें कि कौन से कवरलिप चेहरे सक्रिय हैं।
  9. तैयार नमूनों का तुरंत उपयोग करें या अखंडता के महत्वपूर्ण नुकसान के बिना तीन दिनों तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

6. परमाणु बल माइक्रोस्कोपी सामग्री संपत्ति माप

  1. एएफएम लेजर चालू करें और एएफएम सॉफ्टवेयर खोलें। उद्घाटन संवाद से वांछित परख के लिए उपयुक्त स्कैनिंग मोड का चयन करें। सभी आवश्यक खिड़कियां डिफ़ॉल्ट रूप से खुलनी चाहिए; वांछित खिड़कियां खोलने के लिए अपने उपयोगकर्ता के मैनुअल से परामर्श नहीं करते हैं।
  2. वांछित माप के लिए उपयुक्त कैंटिलीवर का चयन करें और निर्माता दिशानिर्देशों के अनुसार इसे कैंटिलीवर आवास में डालें। विभिन्न प्रकार की स्थितियां और प्रयोग प्रकार हैं जिनके लिए विभिन्न प्रकार के कैंटिलीवर हैं। प्रयोगकर्ता को अपनी जरूरत के हिसाब से कैंटिलीवर्स पर रिसर्च करनी चाहिए।
  3. निर्माता के दिशा निर्देशों के अनुसार एएफएम हेड में कैंटिलीवर आवास डालें।
  4. यदि नमूने का उपयोग गीली परिस्थितियों में किया जाना है, तो संग्रहण बफर से नमूना निकालें और 6.7 चरण में आगे बढ़ें।
  5. यदि नमूने का उपयोग परिवेश (शुष्क) स्थितियों के तहत किया जाना है, तो नमूने को इसके भंडारण बफर से हटा दें और अल्ट्रापुरे पानी के बीकर में डुबकी लगाकर संक्षेप में कुल्ला करें। नोट: यह नमूने पर एक पतली जलयोजन परत छोड़ देगा जो कम वसंत स्थिर होने वाले कैंटिलीवर्स के साथ केशिका आकर्षण को प्रेरित कर सकता है।
  6. यदि नमूने का उपयोग परिवेश (शुष्क) स्थितियों में किया जाना है, तो धीरे-धीरे नमूना नाइट्रोजन धारा के साथ सुखाएं।
  7. धीरे-धीरे एक धूल मुक्त फिल्टर पेपर के साथ कवरस्लिप के पीछे की ओर सूखें, जिससे नमूने के सक्रिय चेहरे को छूना सुनिश्चित हो।
  8. नमूना को उपयुक्त एएफएम नमूना धारक में रखें, फिर नमूना एएफएम चरण पर रखें।
  9. यदि नमूने को गीली परिस्थितियों में इमेज किया जाना है, तो नमूने के केंद्र (~ 10 माइक्रोन) पर बफर की एक छोटी राशि को पिपेट करें।
  10. नमूने के ऊपर एएफएम सिर रखें।
  11. यदि नमूना गीला है, तो सुनिश्चित करें कि कैंटिलीवर और एएफएम टिप सतह परत में प्रवेश करते हैं, और कैंटिलीवर और कैंटिलीवर आवास के बीच कोई बुलबुले नहीं हैं।
  12. इष्टतम संकेत प्राप्त करने के लिए निर्माता सिफारिशों के अनुसार कैंटिलीवर के साथ एएफएम लेजर को संरेखित करें।
  13. कैंटिलीवर सुनाई देती आवृत्ति को मापें और प्रयोग प्रकार के अनुसार स्कैन आवृत्ति निर्धारित करें।
  14. एएफएम टिप को सतह पर कम करें और सिग्नल सेटिंग्स को अनुकूलित करें।
  15. अपने चुनने के मोड में एक 20 माइक्रोन वर्ग AFM स्कैन प्रदर्शन करते हैं। प्रतिनिधि डेटा उत्पन्न करने में टैपिंग (एसी) मोड का उपयोग किया गया था। अनुमानित ऊंचाई से वायरस उम्मीदवारों की पहचान करें, जिसे आमतौर पर कांच की सतह पर तेज स्पाइक्स के रूप में देखा जा सकता है।
  16. एक वायरस उम्मीदवार का चयन करें और इसके ऊपर स्कैन सिर केंद्र।
  17. अपने टोपोलॉजी और अभिविन्यास प्राप्त करने के लिए चयनित वायरस के बारे में 250 एनएम स्क्वायर स्कैन (या उपयुक्त सुपर-रिज़ॉल्यूशन स्कैन) करें।
  18. सामग्री संपत्ति माप के लिए वायरस पर एक बिंदु का चयन करें(उदाहरण के लिए एक युवा के मॉड्यूलस माप के लिए गोलाकार वायरस का केंद्र) और निर्माता के निर्देशों के अनुसार माप करते हैं।

7. सुपर-रेजोल्यूशन इमेजिंग विधि

  1. सुपर-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग सॉफ्टवेयर खोलें और निर्माता के दिशानिर्देशों के अनुसार सॉफ्टवेयर को कैलिब्रेट करें।
  2. फ्लोरोसेंट मोतियों का उपयोग करने वाले निर्माता के निर्देशों के अनुसार सुपर-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग उपकरण को कैलिब्रेट करें।
  3. 1 एम विदेश मंत्रालय के 50 माइक्रोन और 10x ग्लॉक्सी के 100 माइक्रोन को स्टॉक बफर के 850 माइक्रोन के संयोजन से इमेजिंग से ठीक पहले स्टॉक से नमूना इमेजिंग बफर को इकट्ठा करें। प्रयोग की अवधि के लिए बर्फ पर इमेजिंग बफर रखें।
  4. इसके स्टोरेज बफर से सैंपल के साथ तैयार कवरस्लिप निकालें और इसे अल्ट्रापुरे पानी की बीकर में डुबोकर 5x कुल्ला लें ।
  5. धूल मुक्त फिल्टर पेपर का उपयोग करते हुए अट्रैक्टिव कवरलिप फेस को सुखा लें। सक्रिय चेहरे को छूना सुनिश्चित करें।
  6. एक इमेजिंग सिस्टम नमूना धारक में डालें और नमूना धारक के लिए इमेजिंग बफर के 250 माइक्रोन जोड़ें। लगातार परिणाम बनाए रखने के लिए हर 2 घंटे में नमूने पर इमेजिंग बफर का आदान-प्रदान करना उचित है।
  7. कमरे के वातावरण के साथ वायुमंडलीय बातचीत को कम करने के लिए नमूना धारक को पैराफिल्म के साथ कवर करें।
  8. इमेजिंग के लिए इमेजिंग उपकरण में नमूना धारक रखें।
  9. निर्माता के निर्देशों का उपयोग करते हुए नमूना को ध्यान में लाएं।
  10. छवि सुपर संकल्प तकनीक के अनुसार नमूना कार्यरत किया जा रहा है । फोटो-स्विचेबल फ्लोरोफोरस के एक साथ सक्रियणों को कम करते हुए सिग्नल को अनुकूलित करने के लिए इमेजिंग शर्तों को समायोजित करना सुनिश्चित करें।

    महत्वपूर्ण नोट: इमेजिंग की स्थिति नमूना निर्भर है और प्रयोगात्मक जरूरत के अनुसार बदलती हैं । एलेक्सा 647 का उपयोग करने वाला एक विशिष्ट प्रयोग इमेजिंग बफर में उनकी अंधेरी स्थिति में कुशलतापूर्वक आरंभ किया गया है, फिर 405 एनएम यूवी प्रकाश के अनुप्रयोग के माध्यम से फोटो-सक्रिय किया जा सकता है। छवियों को एक घनी लेबल नमूने के भीतर एलेक्सा 647 अणुओं के एक विरल सबसेट रोमांचक द्वारा प्राप्त किया जाता है और प्रत्येक फ्लोरोफोर को मुख्य रूप से एकत्र फोटॉनों की संख्या द्वारा सीमित सटीकता के साथ स्थानीयकृत किया जाता है। इस प्रक्रिया को सॉफ्टवेयर द्वारा बार-बार दोहराया जाता है जब तक कि अधिग्रहण चक्रों की वांछित संख्या नहीं हुई है। प्रयोगकर्ता के पास यह सेटिंग होना चाहिए जो नमूने में प्रत्येक फ्लोरोफोर के साथ फोटो-ब्लीच किया गया है।
  11. जब इमेजिंग पूरी हो जाती है, तो निर्माता के निर्देशों के अनुसार इमेजिंग उपकरण बंद करें। सॉफ्टवेयर डेटा विश्लेषण के लिए खुला छोड़ दिया जा सकता है।
  12. डेटा विश्लेषण प्रयोग पर भारी निर्भर है; हालांकि, सभी मामलों में वायरस की पहचान उनकी पूरी चौड़ाई से आधी अधिकतम है, जो ज्ञात वायरस आयामों की तुलना में है, फ्लोरोसेंट लेबल के अतिरिक्त आकार को ध्यान में रखना सुनिश्चित करता है।
  13. बेहतर विज़ुअलाइज़ेशन के लिए, आइसोस्यूरफेस रेंडरिंग विकल्प या वॉल्यूमेट्रिक रेंडरिंग विकल्प का उपयोग करके नमूनों को देखें, जिनमें से दोनों आमतौर पर सुपर-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग सॉफ्टवेयर में पाए जाते हैं।

Representative Results

एएफएम का उपयोग करके एकल उग्र इमेजिंग:

ऊपर उल्लिखित नमूना तैयारी प्रोटोकॉल का उपयोग कांच की सतह पर जंगली प्रकार के विरियन को एंकरिंग में किया गया था। वीएसवी विरन्स लंबाई में 180 एनएम और व्यास में 80 एनएम की लंबाई में गोली के आकार के होते हैं। चूंकि विभिन्न प्रकार के विरान हैं जिनके लिए इस तकनीक को लागू किया जा सकता है, इस अवधारणा को यहां बायोटिनाइलेटेड 36 एनएम मोतियों पर भी प्रदर्शित किया जाता है। परिणामस्वरूप एएफएम प्रयोग चित्र 1में दिखाए गए हैं । यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि वीएसवी विरियंस में नॉनएनवेलोप्ड वायरस (जीपीए) की तुलना में कम युवा मोडुलस (100 एमपीए) है। एक कड़ी कैंटिलीवर के साथ परिवेश की स्थितियों में टैपिंग मोड के तहत एकल विरेशन वीएसवी की विशेष छवियां प्राप्त की गई थीं। इसका उद्देश्य वायरस को इस बात के लिए विकृत करना रहा है कि वायरस के भीतर अतिरिक्त प्रोटीन घनत्व एएफएम छवि के भीतर टक्कर के रूप में दिखाई देता है। इस विधि का उपयोग वायरस गुहा19के भीतर अतिरिक्त प्रोटीन घनत्व का पता लगाने के लिए किया जाता है ।

सिंगल विरेशन सुपर रेजोल्यूशन इमेजिंग:

एलेक्सा 647 लेबल VSV-G एंटीबॉडी विधि 5A का उपयोग कर सुपर संकल्प प्रयोगों के लिए व्यक्तिगत VSV virions के लिफाफे कोट करने के लिए इस्तेमाल किया गया। टेदरिंग घनत्व और कम अविशिष्ट बाध्यकारी को प्रदर्शित करने के लिए, नमूना का एक बड़ा स्कैन चित्र 2 एमें दिखाया गया है। एक प्रतिनिधि वीर पर वायरल लिफाफे की वसूली चित्रा 2B (ब्लू isosurface) में दिखाया गया है ।

Figure 1

चित्रा 1. कार्यात्मक पेग सतह पर मोतियों और वीएसवी की एएफएम इमेजिंग। 36 एनएम बायोटिनाइलेटेड मोतियों(ए, बी)और एक वीएसवी विरयन(सी)का एएफएम स्कैन एक बायोटिनेलेटेड वीएसवीजी एंटीबॉडी के साथ सतह पर लंगर डाले। एएफएम एसी एयर स्थलाकृति स्कैन मोड में किया गया। टिप त्रिज्या <25 एनएम है और माप बल मॉड्यूलेशन और प्रकाश दोहन के तहत किया गया। टिप में 15 किलोहर्ट्ज की अनिश्चितता के साथ 3 एन/एम और गूंजती आवृत्ति 75 किलोहर्ट्ज का बल स्थिर था। जबकि मोतियों ने एएफएम स्कैन के दौरान अपनी ऊंचाई को बनाए रखा, वीएसवी विरयन में काफी छोटे युवा के मॉड्यूलस होते हैं और ऊंचाई में काफी विकृत होते हैं। इस छवि में उग्र विशेष रूप से टैपिंग मोड में एक कठोर कैंटिलीवर के साथ चित्रित किया गया था जिसने एक छोटे से जाइल कन्वोल्वस (वायरस के टिप बनाम कुंद अंत को निर्धारित करने के लिए उपयोग किया जाता है) और वायरस के टिप और कुंद अंत के बीच ऊंचाई अंतर का उपयोग वायरस19के कुंद अंत में अतिरिक्त प्रोटीन घनत्व का पता लगाने के लिए किया जाता है।

Figure 2
चित्रा 2। पेग कार्यात्मक सतह पर वीएसवी विरियंस की फ्लोरेसेंस आधारित इमेजिंग। ए)विस्तृत क्षेत्र फ्लोरेसेंस में इमेज्ड बायोटिनेलेटेड एंटी वीएसवीजी एंटीबॉडी का उपयोग करके पेग सतह पर पुनः संयोजन वीएसवी पौरस। B)उच्च संकल्प फ्लोरेसेंस एक बायोटिनाइलेटेड एंटी वीएसवीजी एंटीबॉडी के माध्यम से पेग सतह से जुड़े वीएसवी के लिफाफे का पुनर्निर्माण और एलेक्सा 647 लेबल एंटी-वीएसवीजी एंटीबॉडी (विधि 5A इन छवियों को बनाने के लिए इस्तेमाल किया गया था) के साथ सजाया गया था। नीली सतह एक 2D आइसोसुरफेस प्रक्षेपण है। बाएं गोली के आकार के वायरस का एक मॉडल दिखाता है । 

कवरलिप आकार सुपरिवर्तनीय
40 मिमी 65 माइक्रोन
35 मिमी 50 माइक्रोन
30 मिमी 36 माइक्रोन
25 मिमी 25 माइक्रोन
20 मिमी 16 माइक्रोन

तालिका 1. कवरस्लिप आकार के अनुसार द्रव एलिकोट्स।

Discussion

एएफएम और हाई-रेजोल्यूशन फ्लोरेसेंस इमेजिंग के साथ सिंगल विरियमेंट इमेजिंग का उपयोग क्रायोम टोमोग्राफी के लिए वैकल्पिक पद्धति के रूप में किया जा सकता है। इन पद्धतियों में से हर एक की अपनी विशिष्ट शक्तियां हैं । उदाहरण के लिए एएफएम को WT विरियंस पर किया जा सकता है जिसमें नमूने या आंतरिक वायरल प्रोटीन को टैग करने की कोई आवश्यकता नहीं है। वायरल संरचनाओं का स्थान वीरन के लोचदार गुणों में उनके योगदान से विघटित है।

नव विकसित वायरल रिवर्स जेनेटिक दृष्टिकोणों के संयोजन में एकल विरेशन सुपर-रेजोल्यूशन इमेजिंग कम कॉपी नंबर वायरल प्रोटीन20को स्थानीय बनाने के लिए एक शक्तिशाली तकनीक बन जाती है। फ्लोरोसेंट प्रोटीन के लिए जुड़े प्रोटीन के साथ अपने प्रोटीन के प्रतिस्थापन के साथ recombinant वायरस बनाया जा सकता है और इन रिवर्स आनुवंशिक दृष्टिकोण का उपयोग कर शुद्ध । हालांकि सुपर संकल्प इमेजिंग आनुवंशिक टैगिंग के कारण भाग में विशिष्टता है, यह उत्परिवर्ती वायरस के उपयोग की आवश्यकता है ।

एएफएम और सुपर-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग मानार्थ तरीके हैं जो बहुत ही समान नमूना तैयारी का उपयोग करते हैं। इस पत्र में उल्लिखित तरीके, जो पहले एकल अणु इमेजिंग परखते हुए अपनाए जाते हैं, वीरों के टोपोलॉजी पर थोड़ा प्रभाव के साथ एकल विरनों को एंकरिंग की अनुमति देते हैं।

Disclosures

लेखकों को इस कागज में कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की है ।

Acknowledgments

हम मूल एकल अणु तैयारी प्रोटोकॉल के लिए डॉ जब तक Böcking शुक्रिया अदा करते हैं । इस कार्य को एनएसएफ ग्रांट ने दिया समर्थन 1121972

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glass coverslips (fPALM) Electron Microscopy Services 72225-01 25 mm Coverslips
PLL(20)-g[3.5]-PEG(2)/PEG(3.4)-Biotin (20%)  SuSoS - Stock: 0.5 mg/ml in PBS
NeutrAvidin biotin-binding protein Invitrogen A2666 Stock: 0.25 mg/ml in PBS
Alexa Fluor 647 goat anti-rabbit IgG (H+L)  Invitrogen A21245 1:200 in 0.2 M KPO4, 0.15 M NaCl, 10% Glycol, pH 7.2 buffer
α-VSV-G  Invitrogen ab34774 1:200 in 0.2 M KPO4, 0.15 M NaCl, 10% Glycol, pH 7.2 buffer
Gluox Sigma G2133-250KU Glucose oxidase type seven from Aspergillius 
Catalase Sigma C40-100mg Catalase from Bovine liver 
MEA Sigma 30070-10G Cysteamine (MEA
Stock Buffer 50 mM Tris-HCl (pH 8.0) + 10 mM NaCl + 10% glucose
NTE 10 mM Tris pH 7.4, 100 mM NaCl, 66 mM EDTA
Slide-A-Lyzer, mini dialysis unit Thermo Scientific 10,000 MW
Microscope Cover Glass: 35 CIRCLE #1 Fisherbrand 35 CIRCLE #1

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References

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एकल वीरीय परमाणु बल माइक्रोस्कोपी और सुपर-रेजोल्यूशन फ्लोरेसेंस इमेजिंग के लिए नमूना तैयारी
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Hodges, J. A., Saffarian, S. Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging. J. Vis. Exp. (83), e51366, doi:10.3791/51366 (2014).

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