Summary
表面へのビリオンの付着は、超解像蛍光イメージングまたは原子間力顕微鏡(AFM)による単一のビリオンイメージングの要件です。ここでは、AFMおよび超解像蛍光イメージングでの使用に適したガラス表面へのビリオンの制御接着のためのサンプル調製方法を示す。
Abstract
ガラス表面へのビリオンの固定化は、単一のビリオンイメージングにおいて重要なステップです。ここでは、単一分子イメージングアッセイから、ガラス表面に特異性を持つ単一のビリオンの接着を可能にする技術を紹介します。この調製物は、PLL-g-PEGとPLL-g-PEG-ビオチンの混合物でガラスの表面をグラフトし、アビジンの層を追加し、最終的にビオチン化されたウイルス特異的抗体の付着を通じてビリオンアンカーを作成することに基づいています。この手法は、原子間力顕微鏡(AFM)や超解像蛍光イメージングなど、さまざまな実験に応用してきました。このサンプル調製方法は、表面へのビリオンの制御接着をもたらす。
Introduction
電荷ベースの非特異的相互作用は、原子間力顕微鏡1,2におけるビリオンの接着に日常的に使用される。これらの技術は、非常に硬いキャプシド3-6で非エンベロープビリオンに使用すると特にうまく機能します。これらの技術はサンプルを固定化するのに非常に有効であるが、それらは表面にタンパク質の非特異的結合を防ぐものではない。非特異的結合は、AFMと様々な抗体を用いてサンプルのインキュベーションを必要とする超解像蛍光技術を用いてビリオンを画像化しようとすると問題を引き起こす可能性がある。ここでは、ビリオンの特定の固定化のためのサンプル調製方法を概説する。
ポリ(エチレングリコール)(PEG)は、ポリ(L-リジン)(PLL)に移植され、ガラス表面に吸着し、ガラス7とのタンパク質の静電相互作用のための重要なブロックを提供する。ガラス表面上の単一分子の固定化を必要とする単分子アッセイは、この性質を利用して、これを用いて、PEGベースの固定化技術8~10を作成した。この調製物はまた、クラトリンケージをガラス表面11に固定化するとともに、コントロールセル接着のための均質なフィブロネクチンコーティングを作成するためにも使用された。
単一分子イメージング方法からガラス表面へのPLL-g-PEG吸着に基づくサンプル調製方法を採用し、静脈性口内炎ウイルス(VSV)の単一ウイルスのイメージングに適用しました。これらの単一のビリオンは、原子間力顕微鏡(AFM)を用いて画像化した。同様の実験もコントロールとして機能化されたビーズに対して行った。また、超解像蛍光顕微鏡法によってビリオンを画像化し、Alexa 647で標識されたVSV-G抗体を用いて、単一のビリオンのエンベロープの画像を作成した。高解像度蛍光イメージングは、単一分子の局在化を利用して、画像13〜15を作成する。fPALMバイ平面イメージングは、光軸15,16に沿って平面および50nm解像度の20nmを有する単一分子の局在化を可能にする。この2平面技術は、本研究に存在する超解像度蛍光画像を画像化するために使用された。同様の結果を持つ代替技術は、STORM13,17,18です。
この論文で概説した手順によってガラスに固定されたVSVのAFMおよび超分解能蛍光像の両方が、最小非特異的相互作用19を有するガラスへのビリオンの特異的結合を示した。ここでは、AFMおよび超解像度蛍光イメージング実験用のサンプル調製プロトコルを紹介します。簡単に言うと:きれいなガラスカバーリップはPLL-g-PEGおよびPLL-g-PEG-ビオチンの混合物を吸着することによって機能する。この薄膜は、コーティングされた表面に15〜25%の機能化ビオチンを提供するように設計される典型的な。カバーリップはさらに四量体アビジンでインキュベートされる。ビオチン化されたウイルス抗体は、ビリオンのユニークな結合部位を作成するために使用されます。抗体の結合は2つの方法で行うことができる。
最初の方法はAFMのために最適化されていますが、超解像蛍光イメージングには適しています。この方法では、アビジン被覆表面は、ウイルス接着の前にビオチン化抗体で処理される。固定化されたビリオンは、エンベロープを覆い、ビリオンの超解像蛍光イメージングを可能にするために、Alexa 647標識抗体で処理されます。
2番目の方法は、アビジン処理面にウイルスを付着させる前に、ビオチン化抗体およびAlexa 647標識抗体を用いてウイルスを溶液中で攻撃することです。この方法は、ウイルスエンベロープの回復が重要である超解像蛍光イメージング実験に最適化されています。この方法は、ウイルス表面に均一な抗体被覆を可能にする利点を有する。ビオチン化抗体は、ウイルスエンベロープの外側に高濃度の蛍光標識を維持しながら、アビジン処理面に対するウイルスの十分な吸着を可能にする比率でAlexa 647標識ウイルス抗体と混合することができる。これらのAlexa 647標識ウイルス抗体はビオチン化されておらず、その過剰はバックグラウンドノイズを低減するために洗い流され得る。
Protocol
1. 化学の準備
- PLL-g-PEG-ビオチンおよびアビジンの調製および貯蔵:
- 1.0 mg/mlの濃度でメーカーの指示に従ってPBSバッファーにポリマーPLL-g-PEG-ビオチンを溶解します。
- カバースリップサイズ( 表1参照)に従ってアリコートを使用し、-80°Cで1年間保存します。
- アビジン/ニュートラアビジンの調製と保管
- 1.0 mg/mlの濃度でメーカーの指示に従ってPBSバッファーにラベルなしアビジン/ニュートラアビジンを溶解します。
- カバースリップサイズ( 表1参照)に従ってアリコートを使用し、-20°Cで最大3年間保存します。
- ウイルスサンプル調製:このアッセイの前に実験ニーズとラボプロトコルに従ってウイルスサンプルを調製します。方法 5A の場合はステップ 1.3.1、メソッド 5B には 1.3.2 を使用します。
- ステージ2の前に方法5Aのウイルスサンプルを準備する。調製したウイルスサンプルを調製後1〜2日以内に使用するか、またはカバースリップサイズに従ってアリコート( 表1参照)、液体窒素でフラッシュフリーズし、-80°Cで最大1年間保存します。解凍したら、すぐに使用してください。
- 1.3.1と同様の方法5Bのウイルスサンプルを準備します。5Bの前にウイルスのアリコートを解凍し、抗体と混合する前に24時間以下で4°Cで保存します。
- 実験に適したビオチン化抗体を調製する。
2. 化学処理の準備のためのカバースリップクリーニング
- カバーリップを縦方向に保持する適切なサイズのテフロンカバースリップラックに置き、濾過されたエチルアルコール(190プルーフ)で満たされたビーカーに浸します。
- フィルター処理されたエチルアルコール(190プルーフ)でカバーリップを30分間超音波処理します。
- アルコールからカバーリップを取り除き、超純水で広範囲にカバーリップをすすい取ります。
- 洗い込んだカバーリップを別のクリーンテフロンラックに入れ、ビーカーを1 M NaOHで満たします。
- 1 M NaOH のカバーリップを 30 分間超音波処理します。
- NaOHからカバーリップを取り出し、超純水で広範囲にすすいます。
- すすったカバースリップを窒素の流れで乾かして、清潔で乾燥したテフロンラックに入れます。
- カバースリップを検査して、カバースリップに残っている可視フィルムまたは粒子がないか検査します。可視材料が残っている場合、カバースリップは適切に洗浄されておらず、すすいでください。適切にクリーニングされない場合は、手順 2.1 から 2.7 を繰り返します。
- 2分間酸素プラズマでカバーリップを清掃します。この手順はオプションですが、推奨されます。
3. PLL-g-PEG薄膜層の形成
- 窒素流(または任意の酸素プラズマ)で乾燥した直後に、1つのカバースリップを無菌ペトリ皿に水平に置きます。カバースリップの中央にピペットを適量解凍したPBSバッファリングPLL-g-PEG-ビオチン( 表1参照)。
- サンドイッチ法で流体の上に別のクリーニングカバースリップを置きます。この方法は、2つのカバーリップを持つことから成り、現在の化学層によってのみ分離された互いに向き合って、化学的に処理された「活性面」を彼らの化学フィルムをインキュベートする。2 つのカバーリップ間のボリュームが完全に流体で満たされているが、カバーリップの間から流体が漏れないように十分な流体があることを確認します (表 1を参照)。「アクティブな面」は、サンドイッチ構成の流体と接触しているカバースリップ面を指定します。
- ペトリ皿の蓋をカバースリップサンドイッチの上に置き、RTで45〜60分間インキュベートします。
- ペトリ皿の蓋を取り除き、ピンセットでサンドイッチを拾います。余分な液体をつままないように注意してください。親指と人差し指を使ってサンドイッチを軽くつまみ、カバーリップを互いに対して水平に水平にスライドさせ、アクティブな面に触れることなく2つのカバーリップを互いに分離します。
- 25mlの超純水を2~4倍の超純水にピペットで入れ、窒素流でカバーリップを乾燥させて、両方の活性面を超純水でリンスします。どのカバースリップ面がアクティブになっているかを確認してください。
- カバーリップをすぐに利用するか、無塵の低湿度環境に置かれた滅菌ペトリ皿にアクティブな顔を持つO / Nを保存します。
4. アビジン結合強化
- 無菌ペトリ皿にアクティブフェイスを持つPLL-g-PEG処理カバースリップを置きます。
- ピペットは、アクティブな顔の中央に緩衝液中の解凍されたアビジン(ステップ1.2で調製)の適切な量を。
- サンドイッチ法で流体の上に別のカバースリップ(アクティブな顔を下向きに)置きます。カバーリップのアクティブな面に注意してください。インキュベーション中にアクティブな面が流体と接触することが重要です(ステップ3.2を参照)。
- ペトリ皿の蓋をカバースリップサンドイッチの上に置き、RTで25〜30分間インキュベートします。
- 手順 3.4 で説明したように、ペトリ皿のふたを取り外し、2 つのカバーリップを分離して、アクティブな面を追跡し、触れないようにします。
- 25mlの超純水を2~4倍の超純水にピペットして、両方の活性面を超純水でリンスし、窒素流でカバーリップを乾燥させます。カバーリップのアクティブな面に注意してください。次のステージにすぐに使用します。
重要な注意:実験に伴うアッセイの種類に応じて、サンプル調製を完了するための2つの異なる方法があります。実験者は、超解像イメージングに必要な追加の抗体治療が追加される前に、ウイルスがガラスに固定されたステージ5Aに進む必要があります。5Bは、ウイルスをガラスに固定する前に溶液中で標識する別の方法を説明する。本原稿の代表データは5Aを用いて作成される。実験アッセイタイプに応じて適切な方法を選択する必要があります。
5A. アクティブフェイス抗体テザー
- ステージ4.6で窒素気流で乾燥した直後に、無菌ペトリ皿にアビジン処理カバースリップアクティブフェイスを置きます。
- ピペットは、活性面の中央に緩衝液中の解凍されたビオチン化抗体の適切な量を( 表1参照)。
- サンドイッチ法で流体の上に別のカバースリップ(アクティブな顔を下向きに)配置します。カバースリップのアクティブな面に注意して、アクティブな面がインキュベーションのために流体と接触することが重要である(ステップ3.2を参照)。
- ペトリ皿の蓋をカバースリップサンドイッチの上に置き、RTで45〜60分間インキュベートします。
- 手順 3.4 で説明したように、ペトリ皿のふたを取り外し、2 つのカバーリップを分離して、アクティブな面を追跡し、触れないようにします。
- 25mlのPBSをアクティブな顔の上に25mlのピペットでPBSで両方の活性面をすすい、乾かしてすぐに使用しないでください。どのカバースリップ面がアクティブかを追跡してください。
- 抗体処理されたカバースリップ活性フェイスを滅菌ペトリ皿に上げ、適量の解凍ウイルスを緩衝液中のピペットを活性面の真ん中に置く。
- サンドイッチ法で流体の上に別のカバースリップ(アクティブな顔を下向きに)配置します。アクティブな面がインキュベーションのために流体と接触することが重要であるため、アクティブな面に注意してください(ステップ3.2を参照)。
- ペトリ皿の蓋をカバースリップサンドイッチの上に置き、RTで45〜60分間インキュベートします。
- 手順 3.4 で説明したように、ペトリ皿のふたを取り外し、2 つのカバーリップを分離して、アクティブな面を追跡し、触れないようにします。
- アクティブな顔を2-4x上に25mlのPBSをピペット処理して、両方のアクティブな顔をPBSでリンスします。カバーリップを乾燥させず、代わりにテフロンラックに入れ、すぐにPBSで満たされたビーカーを入れてください。どのカバースリップ面がアクティブかを追跡してください。
- 準備したサンプルをすぐに利用するか、4°Cの適切なバッファーに最大3日間保存し、完全性を大幅に失うことなくお使いください。
重要な注意:サンプルがAFMアッセイで使用される場合、調製は完了し、すぐに利用するか、ステップ5A.20- 5A.21に記載されているように保存することができます。サンプルが超解像蛍光イメージングアッセイで利用される場合は、ステップ5A.12~5A.19に記載の抗体標識に進む。 - 両方のウイルス処理されたカバーリップアクティブフェイスを無菌ペトリ皿に置き、カバースリップに十分なタンパク質遮断バッファーをピレットして、カバースリップからブロッキングバッファを流さずにカバースリップの中央95%をカバーするのに十分な流体量をカバーするのに十分な液体量を送ります(通常は100〜200 μl)。RTで60〜90分間インキュベートします。
- ペトリ皿からカバーリップを1つずつ取り出し、カバースリップから液体を廃棄物ビーカーに注ぐことで、ブロッキングバッファを慎重に取り除きます。カバースリップを落とさないように注意してください。
- 25mlのPBSをアクティブな顔の上に25mlのピペットでPBSで両方の活性面をすすい、乾かしてすぐに使用しないでください。どのカバースリップ面がアクティブかを追跡してください。
- 滅菌ペトリ皿にカバースリップ活性フェイスを処理した単一のブロッキングバッファーを置き、ピペットを適量の蛍光標識されたウイルス抗体を緩衝液中の活性面の真ん中に置く。
- サンドイッチ法で流体の上に別のカバースリップ(アクティブな顔を下向き)を置きます。どの面がアクティブであるかに注意してください、アクティブな面がインキュベーションのために流体と接触していること(ステップ3.2を参照)ことが重要です。
- ペトリ皿の蓋をカバースリップサンドイッチの上に置き、RTで30分間インキュベートします。
- 手順 3.4 で説明したように、ペトリ皿のふたを取り外し、2 つのカバーリップを分離して、アクティブな面を追跡し、触れないようにします。
- 25mlのPBSをアクティブな顔の上に25mlのピペットでPBSで両方の活性面をすすい、乾かしてすぐに使用しないでください。どのカバースリップ面がアクティブかを追跡してください。
- カバーリップを乾燥させず、PBSで満たされたビーカー内のテフロンラックに入れます。どのカバースリップ面がアクティブかを追跡してください。
- 準備したサンプルをすぐに利用するか、4°Cの適切なバッファーに最大3日間保存し、完全性を大幅に失うことなくお使いください。
5B.インソリューション抗体攻撃
この方法は、超分解能蛍光イメージングの標識戦略のオプションの強化です。イン溶液攻撃を施すことで、ウイルス表面に対する抗体被膜の向上が図れる。
- 実験ニーズに応じた比率で抗体溶液を混合する。0.01 mg/ml蛍光標識抗体に対する0.01mg/mlのバイオチン化抗体の例1:4比は、良好な結合親和性を与え、超解像イメージングアッセイにおいて良好なエンベロープ回収を可能にする。
- (5B.1)および(1.3)でそれぞれ調製した抗体およびウイルス溶液の等分を混合する。アリコートで数回上下にピペットを入れ、やさしく混ぜます。この結果の解決は4 °Cで24時間まで必要になるまで貯えることができる。
- ステップ4.6の完了時に、無菌ペトリ皿にアクティブフェイスアップを持つアビジン処理カバースリップを置きます。
- ピペットは、抗体溶液を有する適切な量のウイルス(ステップ5B.2で調製)を活性面の真ん中にする。
- サンドイッチ法で流体の上に別のカバースリップ(アクティブな顔を下向きに)配置します。アクティブな面はインキュベーションのために流体と接触することが重要であるため、アクティブな面に注意してください(ステップ3.2を参照)。
- ペトリ皿の蓋をカバースリップサンドイッチの上に置き、RTで45〜60分間インキュベートします。
- 手順 3.4 で説明したように、ペトリ皿のふたを取り外し、2 つのカバーリップを分離して、アクティブな面を追跡し、触れないようにします。
- アクティブな顔を2-4x上に25mlのPBSをピペット処理して、両方のアクティブな顔をPBSでリンスします。カバーリップを乾燥させず、代わりにテフロンラックに入れ、すぐにPBSで満たされたビーカーを入れてください。どのカバースリップ面がアクティブかを追跡してください。
- 準備したサンプルをすぐに利用するか、4°Cで最大3日間保存し、完全性を大幅に失うことなくお使いください。
6. 原子間力顕微鏡材料特性測定
- AFMレーザーをオンにして、AFMソフトウェアを開きます。開口ダイアログから目的のアッセイに適したスキャンモードを選択します。すべての必要なウィンドウは、既定で開く必要があります。ない場合は、目的のウィンドウを開くために、ユーザーのマニュアルを参照してください。
- 所望の測定に適した片持ち器を選択し、製造業者のガイドラインに従って片持ちハウジングに挿入する。さまざまなカンチレバーがある条件と実験の種類の広い範囲があります。実験者は、彼らの必要性に応じてカンチレバーを研究する必要があります。
- メーカーのガイドラインに従って、片持ちのハウジングをAFMヘッドに挿入します。
- サンプルを湿潤状態で使用する場合は、ストレージバッファからサンプルを取り出し、ステップ6.7に進みます。
- サンプルを周囲(乾燥)状態で使用する場合は、サンプルを貯蔵バッファから取り出し、超純水のビーカーに浸して簡単にすすいます。注:これは、低いばね定数を有する片持ち梁と毛細血管引力を誘発する可能性のあるサンプル上の薄い水和層を残します。
- 試料を周囲(乾燥)状態で利用する場合は、窒素気流でサンプルを軽く乾燥させます。
- カバースリップの裏側をダストフリーのフィルターペーパーで静かに乾燥させ、サンプルのアクティブな面に触れないようにします。
- サンプルを適切なAFMサンプルホルダーに入れ、サンプルをAFMステージに置きます。
- サンプルが湿潤状態で画像化される場合、サンプルの中心に少量のバッファー(〜10μl)をピペットします。
- AFMヘッドをサンプルの上に置きます。
- サンプルが濡れている場合は、カンチレバーとAFMチップが表層に浸透し、カンチレバーとカンチレバーハウジングの間に泡がないことを確認してください。
- 最適な信号を得るためにメーカーの推奨事項に従って、AFMレーザーを片持ちレバーに合わせます。
- カンチレバーの共振周波数を測定し、実験タイプに応じてスキャン周波数を設定します。
- AFMチップを表面に下げ、信号設定を最適化します。
- 選択したモードで20 μmの正方形のAFMスキャンを実行します。タッピング(AC)モードは、代表データを生成する際に使用されました。通常、ガラス表面に鋭いスパイクとして見ることができるおおよその高さによってウイルス候補を識別します。
- ウイルス候補を選択し、スキャンヘッドをその上に中央に配置します。
- 選択したウイルスについて 250 nm の正方形のスキャン (または適切な超解像度スキャン) を実行して、そのトポロジと向きを取得します。
- 材料特性測定のウイルス上の点(ヤング率測定の球体ウイルスの中心など )を選択し、メーカーの指示に従って測定を行います。
7. 超分解能イメージング法
- 超解像度のイメージングソフトウェアを開き、製造元のガイドラインに従ってソフトウェアをキャリブレーションします。
- 蛍光ビーズを利用したメーカーの指示に従って、超分解能イメージング装置を較正します。
- 1 M MEAの50 μlと10x Gloxyの100 μlを850 μlのストックバッファに組み合わせることにより、イメージング直前のストックからサンプルイメージングバッファを組み立てます。実験の間、氷の上にイメージングバッファーを保持します。
- 調製したカバースリップを保存バッファーからサンプルで取り出し、超純水のビーカーに浸して5倍すすいでください。
- ダストフリーのフィルターペーパーを利用して非アクティブなカバースリップ面を乾燥させます。アクティブな顔に触れないようにしてください。
- イメージングシステムのサンプルホルダーに挿入し、250 μlのイメージングバッファをサンプルホルダーに追加します。一貫した結果を維持するために、サンプル上のイメージングバッファを2時間ごとに交換するのが妥当です。
- サンプルホルダーをパラフィルムで覆い、室内環境との大気相互作用を低減します。
- サンプルホルダーをイメージング用のイメージング機器に入れる。
- メーカーの指示を利用してサンプルを焦点にします。
- 使用されている超解像度の手法に従ってサンプルを画像化します。光切り替え可能フルオロフォアの同時活性化を減少させながら、信号を最適化するために画像化条件を調整してください。
重要な注意: イメージング条件はサンプルに依存し、実験の必要性に応じて変化します。Alexa 647を利用した典型的な実験は、イメージングバッファ内の暗い状態に効率的に初期化され、405nm UV光の適用により光活性化することができる。画像は、緻密に標識されたサンプル内のAlexa 647分子のまばらなサブセットを刺激し、収集された光子の数によって主に制限された精度で各フルオロフォアを局所化することによって得られます。この手順は、所望の取得サイクルが発生するまで、ソフトウェアによって繰り返し繰り返されます。実験者は、この設定が、光漂白されたサンプル中の各蛍光色素と相関している必要があります。 - イメージングが完了したら、製造元の指示に従って画像機器をシャットダウンします。ソフトウェアは、データ分析のために開いたままにしておてもよい。
- データ分析は実験に大きく依存します。しかし、すべての場合において、既知のウイルス寸法と比較して、その全幅を半分の最大値で識別し、蛍光標識の追加サイズを考慮に入れます。
- より優れた視覚化を行うため、通常は超解像度イメージング ソフトウェアに含まれる等値レンダリング オプションまたは容積レンダリング オプションのいずれかを使用してサンプルを表示します。
Representative Results
AFMを使用した単一のビリオンイメージング:
上で概説したサンプル調製プロトコルは、野生型のビリオンをガラス表面に固定するのに用いた。VSVビリオンは、長さ180nm、直径80nmの弾丸形状です。この技術が適用される可能性のある様々なビリオンがあるので、この概念はビオチン化された36 nmビーズにもまた実証されています。結果として得られた AFM 実験を 図 1に示します。VSVビリオンは、非エンベロープウイルス(GPa)と比較してヤング率(100 MPa)が低い点に注意することが重要です。単一のビリオンVSVの特定の画像は、硬いカンチレバーを有する周囲条件下でタッピングモード下で得られた。その目的は、ウイルス内の余分なタンパク質密度がAFM画像内のバンプとして見えるようになる点までウイルスを変形させることを目的としている。この方法は、ウイルス空洞19内の余分なタンパク質密度を検出するために使用される。
単一のビリオン超解像度イメージング:
Alexa 647標識VSV-G抗体は、方法5Aを用いた超解像実験のために個々のVSVビリオンのエンベロープをコーティングするために使用された。テザリング密度と低い非特異的結合を示すために、サンプルの大きなスキャンを 図2Aに示します。代表的なビリオン上のウイルスエンベロープの回復は 図2B( 青色同一体面)に示されている。
図 1.機能化されたPEGG表面のビーズおよびVSVのAFMイメージ投射。36 nmビオチン化ビーズ(A、B)とVSVビリオン(C)をビオチン化VSVG抗体で表面に固定したAFMスキャン。AFMはACエアトポグラフィスキャンモードで行われました。先端半径は<25nmであり、測定は力変調および光タッピング下で行った。先端は3 N /mの力定数および15 kHzの不確実性の共振頻度75 kHzを有していた。ビーズはAFMスキャン中に高さを保持していましたが、VSVビリオンは若い弾性率が大幅に小さく、高さが有意に変形します。この画像では、ビリオンは、小さなキシコンボリューション(ウイルスの先端対鈍端を決定するために使用される)を生成するタッピングモードで硬い片持ち体で特異的に画像化され、ウイルスの先端と鈍い端の間の高さの差は、ウイルス19の鈍い端で余分なタンパク質密度を検出するために使用される。
図 2.PEGG機能表面上のVSVビリオンの蛍光ベースのイメージング。 A)広視野蛍光で画像化されたビオチン化抗VSVG抗体を用いてPEGG表面に固定化された組換えVSVビリオン。 B)ビオチン化された抗VSVG抗体を介してPEGG表面に取り付けられ、アレクサ647標識抗VSVG抗体で飾られたVSVのエンベロープの高分解能再構築(方法5Aはこれらの画像を作成するために使用された)。青のサーフェスは、2D 等値面投影です。左は弾丸型ウイルスのモデルを示す。
| カバースリップサイズ | 流体 |
| 40 mm | 65 μl |
| 35 mm | 50 μl |
| 30 mm | 36 μl |
| 25 mm | 25 μl |
| 20 mm | 16 μl |
表 1.カバースリップサイズに応じた流体アリコート。
Discussion
AFMおよび高解像蛍光イメージングによる単一のビリオンイメージングは、CryoEM断層撮影の代替方法として使用することができます。これらの方法論のそれぞれは、それぞれの特定の強みを持っています。例えばAFMは、サンプルまたは内部ウイルスタンパク質のタグ付けに必要のないWTビリオンで行うことができます。ウイルス構造の位置は、ビリオンの弾性特性への寄与から減少する。
新たに開発されたウイルス逆遺伝的アプローチと組み合わせて単一のビリオン超分解能イメージングは、低コピー数ウイルスタンパク質20を局在化するための強力な技術となる。タンパク質を蛍光タンパク質と融合させたタンパク質との置換を伴う組換えウイルスは、これらの逆遺伝的アプローチを用いて作製および精製することができる。超解像イメージングは遺伝的タグ付けによる特異性を有するが、変異型ウイルスの使用が必要である。
AFM と超解像度イメージングは、非常に類似したサンプル準備を利用する無料の方法です。この論文で概説した方法は、初期の単一分子イメージングアッセイの形態であり、ビリオンのトポロジーにほとんど影響を与えずに単一のビリオンを固定することを可能にする。
Disclosures
著者らは、この論文に競合する金銭的利益を持っていません。
Acknowledgments
私たちは、元の単一分子調製プロトコルのためにDr.ティル・ベッキングに感謝します。 この作業は、NSF 許可 1121972 (SS) によってサポートされました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass coverslips (fPALM) | Electron Microscopy Services | 72225-01 | 25 mm Coverslips |
| PLL(20)-g[3.5]-PEG(2)/PEG(3.4)-Biotin (20%) | SuSoS | - | Stock: 0.5 mg/ml in PBS |
| NeutrAvidin biotin-binding protein | Invitrogen | A2666 | Stock: 0.25 mg/ml in PBS |
| Alexa Fluor 647 goat anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | A21245 | 1:200 in 0.2 M KPO4, 0.15 M NaCl, 10% Glycol, pH 7.2 buffer |
| α-VSV-G | Invitrogen | ab34774 | 1:200 in 0.2 M KPO4, 0.15 M NaCl, 10% Glycol, pH 7.2 buffer |
| Gluox | Sigma | G2133-250KU | Glucose oxidase type seven from Aspergillius |
| Catalase | Sigma | C40-100mg | Catalase from Bovine liver |
| MEA | Sigma | 30070-10G | Cysteamine (MEA |
| Stock Buffer | 50 mM Tris-HCl (pH 8.0) + 10 mM NaCl + 10% glucose | ||
| NTE | 10 mM Tris pH 7.4, 100 mM NaCl, 66 mM EDTA | ||
| Slide-A-Lyzer, mini dialysis unit | Thermo Scientific | 10,000 MW | |
| Microscope Cover Glass: 35 CIRCLE #1 | Fisherbrand | 35 CIRCLE #1 |
References
- Pang, H. -B., et al. Virion stiffness regulates immature HIV-1 entry. Retrovirology. 10, 4 (2013).
- Kol, N., et al. A Stiffness Switch in Human Immunodeficiency Virus. Biophys. J. 92, 1777-1783 (2007).
- Ortega-Esteban, A., et al. Minimizing tip–sample forces in jumping mode atomic force microscopy in liquid. Ultramicroscopy. 114, 56-61 (2012).
- Ortega-Esteban, A., et al. Monitoring dynamics of human adenovirus disassembly induced by mechanical fatigue. Sci. Rep. 3, (2013).
- Hernando-Pérez, M., et al. Physical Virology: Direct Measurement of Phage. phi29 Stiffness Provides Evidence of Internal Pressure (Small 15/2012). Small. 8, 2365-2365 (2012).
- Carrasco, C., et al. DNA-mediated anisotropic mechanical reinforcement of a virus. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 13706-13711 (2006).
- Sofia, S. J., Premnath, V. V., Merrill, E. W. Poly(ethylene oxide) Grafted to Silicon Surfaces: Grafting Density and Protein Adsorption. Macromolecules. 31, 5059-5070 (1998).
- Visnapuu, M. -L., Duzdevich, D., Greene, E. C. The importance of surfaces in single-molecule bioscience. Mol. Biosyst. 4, 394-403 (2008).
- Elenko, M. P., Szostak, J. W., Van Oijen, A. M. Single-molecule binding experiments on long time scales. Rev. Sci. Instrum. 81, (2010).
- van Oijen, A. M., et al. Single-Molecule Kinetics of λ Exonuclease Reveal Base Dependence and Dynamic Disorder. Science. 301, 1235-1238 (2003).
- Böcking, T., Aguet, F., Harrison, S. C., Kirchhausen, T. Single-molecule analysis of a molecular disassemblase reveals the mechanism of Hsc70-driven clathrin uncoating. Nat. Struct. Mol. Biol. 18, 295-301 (2011).
- Cocucci, E., Aguet, F., Boulant, S., Kirchhausen, T. The First Five Seconds in the Life of a Clathrin-Coated Pit. Cell. 150, 495-507 (2012).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. W. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy. 3, 793-795 (2006).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313, 1642-1645 (2006).
- Hess, S. T., Girirajan, T. P. K., Mason, M. D. Ultra-High Resolution Imaging by Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy. Biophys. J. 91, 4258-4272 (2006).
- Juette, M. F., et al. Three-dimensional sub-100 nm resolution fluorescence microscopy of thick samples. Nat. Methods. 5, 527-529 (2008).
- Xu, K., Zhong, G., Zhuang, X. Actin, Spectrin, and Associated Proteins Form a Periodic Cytoskeletal Structure in Axons. Science. 339, 452-456 (2013).
- Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-Dimensional Super-Resolution Imaging by Stochastic Optical Reconstruction Microscopy. Science. 319, 810-813 (2008).
- Hodges, J., et al. Asymmetric packaging of polymerases within vesicular stomatitis virus. Biochemical and Biophysical Research Communications. 440, 271-276 (2013).
- Lawson, N. D., Stillman, E. A., Whitt, M. A., Rose, J. K. Recombinant vesicular stomatitis viruses from DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 4477-4481 (1995).
