Summary
פרוטוקול זה נועד להדגים שיטת חשיפה של תרביות תאים לכימיקלים רעילים בשאיפה. חשיפה של ממשק אוויר נוזלי מובחן תרבויות (עלי) של תאי אפיתל דרכי הנשימה מספקת מודל ייחודי של חשיפת דרכי הנשימה לגזים רעילים כגון כלור. בכתב יד זה אנו מתארים השפעה של חשיפת כלור בתרבויות ממשק אוויר הנוזלי של תאי האפיתל ותרבות שקועה של שריר לב. במבחנה מערכות חשיפה לאפשר מחקרים מכניסטית חשובים להעריך מסלולים כי אז יכול להיות מנוצל כדי לפתח סוכנים טיפוליים חדשניים.
Abstract
תרביות תאים הן הכרחיות כדי לפתח ולחקור את היעילות של סוכנים טיפוליים, לפני השימוש בם במודלים של בעלי חיים. יש לנו את היכולת הייחודית למודל תאי אפיתל דרכי הנשימה האנושית ושריר לב מובחנים היטב. זה יכול להיות כלי רב ערך כדי לחקור את ההשפעות המזיקות של כימיקלים רעילים בשאיפה, כגון כלור, שיכולים בדרך כלל אינטראקציה עם משטחי התאים, ויוצרים תוצרי לוואי שונים על מגיב עם מים, ולהגביל את ההשפעות שלהם בתרבויות מתחת למים. המודל שלנו באמצעות תרביות תאי אפיתל דרכי הנשימה אנושית מובחנות היטב בממשק אוויר liqiuid עוקף מגבלה זו, כמו גם מספק הזדמנות להעריך מנגנונים קריטיים של רעילות של כימיקלים בשאיפה רעילים פוטנציאליים. אנו מתארים אובדן משופר של שלמות קרום, שחרור caspase ומוות על כימי בשאיפה רעילה כגון חשיפת כלור. במאמר זה, אנו מציעים שיטות למודל חשיפת כלור בלב של יונקים ודרכי הנשימה אפיתל גאמות בתרבות ובבדיקות פשוטות כדי להעריך את השפעתה על אלו סוגי תאים.
Introduction
חשיפה לכימיקלים בשאיפה רעילה (טיקים) / גזים כגון כלור (Cl 2) נשארה דאגה לבריאות מתמשכת בחשיפה מקרית, כמו גם בשימוש בם פוטנציאל כסוכן איום כימי. למרות הריאות הן היעד העיקרי, איברים כמו לב ומוח מושפעים גם 1-3. בvivo מודלים משמשים בדרך כלל לבדיקת רעילות מטיקים, אבל במבחני חוץ גופית להערכת רעילות הם פשוט יותר, מהיר יותר וחסכוניים יותר. ב מבחנה מודלים גם לאפשר חקירה מקיפה של אינטראקציות סוכן תאים שעלולות להיות קשה להעריך in vivo. במבחנה מערכות חשיפה כזו הן נדירות ויותר מכך, בחלק מהדגמים קונבנציונליים שבו חומרים רעילים נוספים למדיום התרבות שבו תאים שקועים, את המאפיינים של הסוכנים יכולים להשתנות עקב אינטראקציות ומחייבים את רכיבים במדיום. במערכות כאלה תרחישי תא תרבות כגון ממשק אוויר נוזלי (ALIתרבויות) של תאים ראשוניים נשימה אנושית אפיתל, שהוצעו כאן, שיכול להיות חשוף ישירות לסוכנים של גזים יכולים להיות מבטיחות.
תאי האפיתל המצפים את דרכי הנשימה הם קווי ההגנה הראשונים נגד כימיקלים רעילים בשאיפה. אפיתל דרכי הנשימה האנושית מהווה מכשול פיזי בין לומן והתאים שבבסיס בריאה ומשתתף בתגובה של הריאות. היא מייצרת מספר ציטוקינים וסוכנים פרו ואנטי דלקתיים אחרים, כמו גם מפריש נוזל ריר פני השטח / בדרכי הנשימה (הגובה מעל פני הים) המכסה את האפיתל. אחת המגבלות בקונבנציונליות שקוע במערכות תרבות חוץ גופית הוא גם שהגובה מעל פני הים והריר שמכסים את פני השטח האפיתל מוסר או מדולל. זה אינו משקף את המצב הפיזיולוגי של תאי אפיתל ריאה שנחשפים לאוויר. לכן, אידיאלי במערכת מבחנה לבדיקת רעילות TIC צריך לשכפל ארכיטקטורה זו. יש עניין רב בפיתוח מ 'סינון מהירethods כי לחזות ברעילות vivo. תאי האפיתל גדלו בALI להבדיל ויש מבנים ופונקציות מובחנים היטב בהשוואה לתאים שגודל מתחת למים ולשמש מודל מעולה של דרכי הנשימה.
במחקר זה, אנו מתארים את השימוש של תרבות האוויר נוזלי ממשק של נשימה אנושית תאים (tracheobronchial) אפיתל לבדיקת רעילות גז בשאיפה רעילה ולהשוות אותו עם תרבית תאים שקועה של cardiomyocyte, ומכאן לומדים עוד יעד חשוב של רעילות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. תרבויות העכברוש Cardiomyocyte
- כל הניסויים בוצעו תחת פרוטוקולים שאושרו על ידי ועדת טיפול בבעלי החיים ושימוש המוסדית, IACUC.
- השג שריר לב חולדה מהלב (חדרים) של חולדות זכרים (240-260 ז) תוך שימוש בשיטות שתוארו קודם לכן 4. בקצרה, להרדים בעלי חיים באמצעות זריקת intraperitoneal של pentobarbital (100 מ"ג / קילוגרם; לאשר הרדמה בשיטת קמצוץ הבוהן) ולאחר מכן להסיר את לב ל10.0 מיליליטר, 1 מ"מ Ca המכיל חיץ קרבס רינגר, pH 7.4 2 +.
- יש לשטוף את הלבבות 5-6x כדי להסיר דם ולאחר מכן לעבור ל2 + חיץ קרבס רינגר בחינם Ca מכיל פרוטאז 0.02% ו0.06% collagenase (5.0 מיליליטר / לב). דגירה את לבם בפתרון זה עבור 10-15 דקות ב 37 ° C עם רעד מדי פעם.
- אחרי 10-15 דקות, לשטוף את הפתרון האנזימטית עם Ca 2 + חיץ קרבס רינגר ללא תשלום עבור 5 דקות נוספות. שחרר את התאים מהרקמות הרפויותing פיפטה 25 מיליליטר ידי pipetting ההשעיה מעלה ומטה מספר פעמים.
- הפרד את התאים מרקמות על ידי סינון דרך רשת ניילון 70 מיקרומטר ולאפשר להם להתיישב בחיץ קרבס רינגר המכיל 0.1 מ"מ Ca 2 +. להשעות את התא גלולה ב1.0 מיליליטר חיץ קרבס רינגר המכיל 0.2 מ"מ Ca + 2.
- שכבה בזהירות מעל 5.0 מיליליטר 60 מיקרוגרם / מיליליטר שור אלבומין בסרום, BSA, ב15 צינורות צנטריפוגה מיליליטר, כדי להפריד בין שריר לב מnonmyocytes ולאפשר להם להתיישב למשך 30 דקות. שריר הלב הוא כבדים יותר ולעבור לחלק התחתון של הצינור. להסיר בזהירות את התאים ותקשורת supernatant. חזור על שלב זה פעם אחת כדי לטהר עוד יותר את התאים.
- המעבר בהדרגה על ידי שטיפה (בצעדים באמצעות 0.25 מ"מ, 0.5 מ"מ, 0.75 מ"מ, ו1.0 מ"מ Ca 2 חיץ + מכיל) myocytes / cardiomyocytes חדרית ל1.0 מ"מ Ca 2 + המכיל חיץ וresuspended במדיום ACCT בהיקף של הנשר בינוני השתנה Dulbecco , Containi DMEMng 2 מ"ג / מיליליטר BSA, L-קרניטין 2 מ"מ, 5 מ"מ קריאטין, טאורין 5 מ"מ, 100 IU / ml פניצילין, ו100 מיקרוגרם / מיליליטר סטרפטומיצין.
- פלייט שריר הלב במדיום ACCT בצפיפות של 100-150 תאים / מ"מ 2 ב100 מ"מ או 35 laminin מ"מ מצופה צלחות פלסטיק תרבות או 40 x 22 coverslips זכוכית מ"מ precoated עם laminin (1 מיקרוגרם / 2 סנטימטר). אחרי שעה 1, לשטוף את הכלים עם 2.0 מיליליטר ACCT כדי להסיר תאים שאינם מצורפים. הוספת 10.0 מיליליטר של תקשורת טרי ודגירת התאים.
2. ממשק האוויר נוזלי בדיל (ALI) תרבות של אדם תאי אפיתל Airway בסל
- להשיג רקמות tracheobronchial אדם מלאומיים מחלת מחלף מחקר לפי סקירה מוסדית דירקטוריון פרוטוקולים. קציר תא ולבצע תרבות באמצעות 5,6 הליך שפורסם. הליך זה משתמש בתרביות תאים כפי שהם מודל מדויק לחשיפות שאיפה אנושית לטיקים, עם זאת, במידת הצורך ניתן לבודד ולצמוח במו ALIשימוש ו / או תאי אפיתל דרכי הנשימה החולדה 7,8.
- בקצרה, להפוך את החתיכות קטנות (~ ¼ אינץ') של הרקמה לאחר הסרת כל צמתים רקמות הלימפה והחיבור. שטוף רקמה מספר פעמים בפתרון Lactated רינגר. הוספת רקמות לצינור חרוטי 50 מיליליטר ולהוסיף פתרון פרוטאז (1% DNase Protease/0.01% בתקשורת מינימאלית חיונית, MEM, רקמת יחס נוזל (1:10)).
- רוק הרקמות על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. בסופו של דיסוציאציה של הרקמה על ידי הוספת 10% בסרום שור העובר. לגרד את פני השטח אפיתל עם אזמל כירורגי ולאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה (2,000 סל"ד 10 דקות).
- פלייט תאים בקטע אחד בsnapwells מצופה קולגן במדיום ALI מיוחד שהכין כפי שתואר בפירוט על ידי Fulcher ואח' 9. תרבות במשך 5 ימים לפני שינוי לממשק אוויר נוזלי (עלי) על ידי הסרת תקשורת הפסגה.
- להאכיל את התאים באמצעות תקשורת ALI כל יום חלופי ולאפשר לתאים להתמיין ל2-3 שבועות נוספים (להתבונן cilia רב מכות והפרשת ריר) לפני ביצוע חשיפות. שטוף את משטח הפסגה עם PBS החם יחד עם שינויים בתקשורת.
3. חשיפת כלור
- להכיל את מערכת חשיפת כלור (CES) בתוך מנדף כימי מוסמך עם תפעולי פני מהירות של 100 FPM המספק בלימה המשנית הדרושה כדי למנוע חשיפה של אנשים במקרים של דליפת כלור בשוגג.
- להפעיל את המערכת תחת לחץ קל חיובי (0.5 סנטימטרים של מים). אוויר יבש מוזן ב15 ליטר / דקה ורמה מתאימה של כלור מוזן להשיג את ריכוז הכלור הסופי הרצוי. יש תאי מכסה נעילה עם 4 מנעולי BCU מיני ואטם סיליקון מד קשיות נמוך כדי לספק את חותם הלחץ.
- לספק את תערובת Cl 2 עד בקר זרימה המונית. CES משתמש בגליל גז דחוס המכיל 1.0% Cl 2 בחנקן יבש.
- להסדיר את זרימת אוויר הדילול באמצעותמעוצב בהתאמה אישית בלוח בקרה ובאופן דומה לווסת את הריכוז Cl 2 נמסר לתאי החשיפה. משאבת דגימה בנפח נמוך מושכת את הפליטה מהתאים למנתח כלור כדי לפקח על ריכוזים שלאחר מכן נרשמו באוגר נתונים מחוברים למנתח.
- למדוד את הספיקות בתוך התאים לפני החשיפה באמצעות מד זרימה כדי להבטיח את תעריפי משלוח ופליטה שווים.
- הכן את תרביות תאים לחשיפה על ידי הסרת תקשורת supernatant ולהוסיף תקשורת טריות (מדיה basolateral בתרבויות ALI). כל pretreatments עם סוכנים יכול להתבצע בשלב זה.
- לחשוף את תרבויות ALI של תאי האפיתל בדרכי אוויר לCl 2 גז (50, 100, או 300 עמודים לדקה ל30 דקות) בשני חדרי biocontainment polysulfone אטומים. שריר הלב (מתחת למים או מחוברות תרבויות על קרומים) חשוף ל50 או 100 ppm Cl 2 ל15 דקות.
- לאחר החשיפה לשטוף את התאים עם אוויר עד Cl 2 רמה יורדת מתחת לדקה 1 וניתן לפתוח בבטחה להסרת תאים (תוך 5 דקות).
4. Transepithelial חשמל התנגדות מדידה (TER)
- מדוד את TER של אוויר נוזלי ממשק, עלי, תרבויות באמצעות voltohmmeter אפיתל עם זוג אלקטרודות כסף כלוריד "מקל".
- לאזן את האלקטרודה המקל בדקות ALI תקשורת 15 לפני השימוש.
- הוסף מדיה חמה למשטח הפסגה (1.0 מיליליטר) וbasolateral (2.0 מיליליטר) ולמדוד את TER באמצעות אלקטרודות המקל של voltohmmeter.
- טובלים את הזרוע הקצרה של האלקטרודה בתקשורת הפסגה וזרוע ארוכה יותר בתקשורת basolateral. לחץ על כפתור ה 'המדד' בvoltohmmeter כדי להעריך את ההתנגדות החשמלית.
- יש voltohmmeter האפשרות למדוד אוהם או אוהם k. הפחת את ההתנגדות על פני תמיכה בתרבות תא ללא מהתנגדות שנמדדה על פני כל שכבת תא להניב טרנסהתנגדות אפיתל (TER).
5. מדידת caspase
- הוסף מדיה טרי ALI (2.0 מיליליטר) לתפקיד חשיפת פני השטח basolateral דגירה התא בטמפרטורת חדר. לאסוף תקשורת supernatant ב 4 ו24 שעות.
- מדוד caspase פעילות 3/7 בsupernatants התקשורת באמצעות caspase מסחרי 3/7 ערכת assay.
6. כתם מערבי וImmunocytochemistry
- בצע כתמים מערביים באמצעות lysates תא כ10 שתוארו קודם לכן. להשעות את lysate החלבון (20 מיקרוגרם) ב5x חיץ מדגם מופחת ולהרתיח במשך 5 דקות. נושא lysate החלבון ל- SDS (4-15%) ולהעביר את החלבונים המופרדים לקרום ניטרוצלולוזה ידי סופג electrophoretic.
- חסום את הלא ספציפי מחייב על ידי דוגרים הקרום עם חלב 5% בחיץ לשטוף (PBS + 0.1% חומר ניקוי) ולחקור את הקרומים עם נוגדנים ראשוניים כנגד SERCA2 או אקטין sarcomeric ב1:1,000 דילול, הלילה בשעה 4 ° C. בשלב הבא, לשטוף ודגירת קרומים עם הנוגדנים משני peroxidase-מצומדות בהתאמה ולפתח עבור זיהוי כפי שתואר קודם 10 באמצעות ערכת זיהוי peroxidase מסחרית.
- לimmunocytochemistry טיפול בתאי חיים שגדלו על מוסיף או coverslips זכוכית 6 צלחות היטב עם 0.4% Triton-X-100 ב10 חיץ ציטרט הנתרן מ"מ עבור 20 דקות לאחר שטיפה עם PBS.
- בלוק ספציפי מחייב על ידי טיפול בתאים עם 5% בסרום חמור עבור 20 דקות, ולאחר מכן דגירה התאים עם IgG אינו ספציפי או נוגדנים עיקריים אדם ספציפי ליקטין sarcomeric או קי 67.
- לשטוף את התאים עם PBS ו דגירה עם נוגדנים משני ניאון מצומדות כדי לזהות את הנוגדן הראשוני וכתם גרעיני (DAPI מיקרוגרם / מיליליטר 1).
- לשטוף עם PBS והר coverslips באמצעות תקשורת הרכבה מסחרית.
- דמיין את ההכתמה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
שריר לב בצורת מוט עיקרי לצרף במטריצות laminin והתפשט ולהתמיין לתרבויות מחוברות (איור 1 א והבלעתה). תאים אלה מתאפיינים נוספים על הבסיס אקטין sarcomeric וביטוי SERCA2 (איורים 1B ו 1C). שריר לב חולדה הוא רגיש מאוד להרעלת כלור כ15 חשיפת דקות ל100 כלור עמודים לדקה נגרם עיגול תא נרחב ומוות בתרבויות שקועות ושיבוש שכבות מחוברות על תאים שגודל בקרומי laminin מצופים (1D איור). גם שם היה משופר מוות של תאים אפופטוטיים כפי שצוין על ידי caspase 3/7 שחרור בשריר לב גדל על מוסיף (איור 1E).
חשיפה של אפיתל דרכי הנשימה אנושית המובחן (איור 2, הבלעה ללוח 1 מראה חתך של תרבית תאים מוסיפה עם עמודים, ריסים וגביע תאים) כלור גרם נשל וlifטבעת של קרום תא בשני נמוך (100 עמודים לדקה) וריכוזים גבוהים (300 עמודים לדקה) (איור 2 פנל A2 ו-A3). נזק על ידי ריכוזי כלור נמוכים התהפך במהירות (איור 2 A5 פנל), לעומת זאת, בתאים שנחשפו לריכוזי כלור גבוהים יותר עכבו או ללא יכולת תיקון (איור 2 A6 פנל), כפי שמוצג על ידי בדיקה חזותית, כמו גם הערכת התפשטות תאים על ידי קי 67 הכתמה (איור 2 A9 פנל). התנגדות חשמלית אפיתל, מדידות TER חוצה ופעילות caspase כמו כן, אשרו את התוצאות הללו ולספק ראיות לאובדן שלמות הממברנה ומוות של תאים אפופטוטיים בחשיפה כלור (איור 2, לוח B ו-C). לכן המחקרים שלנו לתאר את התפתחותה של מערכת חשיפת Cl 2 במבחנה שגורמת לאובדן של שלמות קרום ומותו של אפיתל דרכי הנשימה ושריר לב. אפקט זה לא יכול להיות בגלל שאינם פיסיולוגי שינויי pH בשריר הלב כה-pH של התקשורת לאחר חשיפה לכלור נשמרה ב ~ 7.4 כפי שנמדד על ידי שימוש במד pH בpostexposure התקשורת שנאסף.
איור 1. בידוד cardiomyocyte עכברוש וחשיפה לכלור. Cardiomyocytes העכברוש היו מבודדים כפי שתוארו בפרוטוקול ומצופים על מנות מצופים laminin פלסטיק (פנל, תמונה מיקרוסקופית אור הנציג) או מוסיף laminin מצופה. הבלעה ללוח תערוכות cardiomyocyte צורת מוט מתפשט ומבדל. Cardiomyocytes התאפיינו גם המבוסס על ביטוי sarcomeric אקטין (לוח ב 'מראה תמונה מייצגת זוהתה על ידי immunofluorescence וליין C פנל מראה סריקת כתם המערבי נציג) וביטוי שפע SERCA2 (ב נתיב C פנל). חשיפת כלור (דקות 15 100 עמודים לדקה) גרמה למוות של תאים רבים בתרבויות שקועות כמו גם שיבוש של monolayer התא במוסיף (ד 'הפנל מראה photomicrographs הנציג). Caspase 3/7 שחרור (E פנל) בתקשורת supernatant של שריר לב גדל על מוסיף, בשעת 4 ו24 חשיפת כלור לאחר שעות נמדד גם כפי שמתואר בטקסט. ערכים המוצגים הם ממוצע ± SEM ו* מציין הבדל מובהק (p <0.05) משליטת 0 עמודים לדקה.
איור 2. השפעת חשיפת כלור בממשק האוויר נוזלי הבדיל אפיתל דרכי הנשימה אנושית תרבויות (עלי). תאים הבזליים אפיתל דרכי הנשימה אדם היו בתרבית בsnapwells קולגן מצופה. לאחר היום 5 תקשורת הפסגה הוסרה. תרבויות מובחנים (בהיקף של בסיס, ריסים, עמודים, וגביע תאים כפי שמוצג בהבלעה בLEF העליוןפנל לא של פנל) נחשף לכלור (100 או 300 עמודים לדקה) ל30 דקות. TER נמדד ומדיה שונה ותאים טופחו במשך 24 שעות. ב24 TER שעה נמדדה שוב ותקשורת הפסגה נאספה למדידת שחרור caspase וקרום התא היו קבוע לאימונוהיסטוכימיה. החץ הפתוח בחלקי פנל 2 ו -3 מופעים השיל מעל שכבת האפיתל וחצים שחורים מראים חללים ריקים על להכניס. ראש החץ בפנל חלק 5 מראה האפיתל מחדש. חלקים 7, 8, והתרבות תאים 9 תכנית כפי שהוערך על ידי קי 67 immunostaining. ערכים המוצגים הם ממוצע ± SEM ו* מציין הבדל מובהק (p <0.05) משליטת 0 עמודים לדקה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הסוג הנפוץ ביותר של חשיפות רעילות אקוטיות מתרחש כאשר אחד נושם כימי רעילה לריאות. כימיקלים אלו יכולים גם להיות שנלקחו במהירות במחזור הדם ועלולים להשפיע על איברים אחרים כגון מוח ולב. רעילות שאיפה של סוכנים שונים תוך שימוש במודלים של בעלי חיים נלמדות ודווחה בהרחבה, לעומת זאת המנגנונים הם הבינו פחות טובים. זהו מכשול מרכזי בפיתוח טיפולים יעילים. היעדר במבחנה מערכות חשיפה הוא סיבה העיקרית מאחורי חוסר תובנות מכניסטית. כאן אנו מתארים מודלים תרבית תאים של שריר לב ודרכי נשימה כדי ללמוד את ההשפעה של כימיקלים בשאיפה רעילים כגון חשיפת כלור. כלור מגיב במהירות עם משטחים מימיים ליצירת חומצה הידרוכלורית וhypochlorous 3,11,12. כלור יכול גם לשלב עם מיני חמצן תגובתי (ROS) כדי לייצר תרכובות תגובתי שעשויות להוביל לחמצון של חלבונים ואנזימים קריטיים של דרכי הנשימה משטחי 13. מחקריםבאמצעות תרביות שקועות יכול רק להדגים השפעות של ידי מוצרים כגון HOCl במקרה של כלור ולא את הגז עצמו. חשיפה של תרבויות ALI מובחנים של תאי אפיתל דרכי הנשימה אנושיות המתוארים כאן תאפשר מחקר של אינטראקציות ישירות של טיקים כגון כלור עם משטחי תא בהעדר תקשורת המימית דומה למה שמתרחש בגוף חי.
שימוש בשריר לב חולדה עיקרי, אנחנו גם מתארים כי חשיפת כלור גורמת למות תאים מהיר בתרבויות מתחת למים. תאים אלה אינם מסוגלים לגדול בALI כמו שהם לא לקטב ויוצרים צמתים הדוקים. לכן, אנו מנוצלים גם תרבויות ומחוברות של שריר לב גדל על מוסיף בשכבה דקה של תקשורת. חשיפה של monolayers התאים אלה לכלור הפגינה שיבוש קרום ושחרור caspase משופר המצביע על אפופטוזיס עשוי לשחק תפקיד.
מחקר זה מוכיח כי דרכי הנשימה (היעד העיקרי של שאיפה שיכולה להיות משוכפלת על ידי cultur ALIes), כמו גם איברים כגון לב שלא גדל בALI ניתן ללמוד באמצעות במערכות חשיפה חוץ גופית. יכולים בקלות להיות מותאמים במבחנה מודלים חשיפה אלה כדי להעריך את ההשפעות של כימיקלים בשאיפה רעילים אחרים (טיקים). שימוש במודלים אלו אנו צופים לספק הבנת מכניסטית מפורטת של הרעילויות ולפתח אסטרטגיות חדשניות למתן את האירועים הרעילים הקשורים TIC / כלור ולאחר מכן להעריך אותם עוד יותר in vivo. אמנם, החשיפות הן קצרות משך מערכת החשיפה צריכה לשכפל טוב יותר בתנאי תרבית תאים. חשיפה לגזים כגון כלור מגבילה את השימוש בלחות מכיוון שהוא עלול לגרום לשיתוק המכשיר. תרבויות ALI יכולים להיות התנדנדו כדי לדמות נשימה כנוצלה בעבר ב14,15 מערכת חשיפת אוזון שלנו. כרגע אנחנו עובדים בכיוונים אלה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
מחקר זה נתמך על ידי התכנית לנטרל, המכונים הלאומיים לבריאות (NIH), משרדו של המנהל, והמכון הלאומי למדעי בריאות הסביבה (NIEHS) גרנט מספר U54 ES015678 (CWW). SA נתמך גם על ידי בית החולים לילדים בית הספר למכרות שיתוף הפעולה G0100394 # טייס פרס ו# G0100471 החולים קולורדו "מכון מחקר פיילוט פרס לילדים קולורדו / קולורדו.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rats | Harlan Laboratories | Sprague-Dawley | |
| Pentobarbital | Sigma-Aldrich | P3761 | |
| Chlorine | AirGas, Inc | X02NI99CP163LS1 | |
| Caspase 3/7 kit | Promega | G8091 | |
| Epithelial voltohmmeter and chopstick electrode | World Precision Instruments | EVOM and STX2 | |
| Snapwell inserts | Corning | 07-200-708 | |
| 70 micron nylon cell strainer | Corning | #352360 | |
| Polysulfone biocontainment chambers | BCU, Allentown Cage Equipment | BCU | |
| DMEM | Life technologies | 12491-015 | |
| Sarcomeric actin antibody | Abcam Cambridge, MA | ab28052 | |
| SERCA2 antibody | Affinity Bioreagents, Golden, CO | MA3-9191 | |
| Ki-67 antibody | Dako, Carpinteria, CA | M7248 | |
| Alexa 488-conjugated secondary antibody | Invitrogen, Grand Island, NY | A11029 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Carnitine | Sigma-Aldrich | C0283 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T8691 | |
| Creatinine | Sigma-Aldrich | C6257 | |
| Krebs Ringer Buffer | Sigma-Aldrich | K4002 | |
| Protease | Sigma-Aldrich | P5147 | |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | C6885 | |
| DNAase | Sigma-Aldrich | DN-25 | |
| Lactated Ringer solution | Abott Laboratories | 7953 | |
| Donkey serum | Fisher Scientific | 017-000-001 | |
| PBS, phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | D1408 | |
| 4-15% SDS-PAGE gels | Bio-Rad | 456-1083 | |
| Nitrocellulose membrane | Bio-Rad | 162-0115 | |
| Dergent, Tween | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Peroxidase detection kit | Pierce | 3402 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Mounting media, Fluormount G | eBiosciences | 00-4958-02 | |
| Sodium citrate | Sigma-Aldrich | 71497 | |
| Collagen | Sigma-Aldrich | C7521 | |
| MEM | Sigma-Aldrich | M8028 | |
| Laminin | BD biosciences | 354259 | |
| Penicillin/streptomycin | Life Technologies | 15070063 | |
| FBS | Gibco | 200-6140AJ |
References
- Mohan, A., et al. Acute accidental exposure to chlorine gas: clinical presentation, pulmonary functions and outcomes. Indian J Chest Dis Allied Sci. 52, 149-152 (2010).
- Kose, A., et al. Myocardial infarction, acute ischemic stroke, and hyperglycemia triggered by acute chlorine gas inhalation. Am J Emerg Med. 27, 1021-1024 (2009).
- Das, R., Blanc, P. D. Chlorine gas exposure and the lung: a review. Toxicol Ind Health. 9, 439-455 (1993).
- Claycomb, W. C., Palazzo, M. C. Culture of the terminally differentiated adult cardiac muscle cell: a light and scanning electron microscope study. Dev Biol. 80, 466-482 (1980).
- Ahmad, S., et al. Bcl-2 suppresses sarcoplasmic/endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase expression in cystic fibrosis airways: role in oxidant-mediated cell death. Am J Respir Crit Care Med. 179, 816-826 (2009).
- Ahmad, S., et al. Tissue factor signals airway epithelial basal cell survival via coagulation and protease-activated receptor isoforms 1 and 2. Am J Respir Cell Mol Biol. 48, 94-104 (2013).
- Lam, H. C., et al. Isolation of mouse respiratory epithelial cells and exposure to experimental cigarette smoke at air liquid interface. J Vis Exp. (48), (2011).
- Hosokawa, T., et al. Differentiation of tracheal basal cells to ciliated cells and tissue reconstruction on the synthesized basement membrane substratum in vitro. Connect Tissue Res. 48, 9-18 (2007).
- Fulcher, M. L., et al. Well-differentiated human airway epithelial cell cultures. Methods Mol Med. , 107-183 (2005).
- Ahmad, S., et al. SERCA2 regulates non-CF and CF airway epithelial cell response to ozone. PloS One. 6, e10 (2011).
- Martin, J. G., et al. Chlorine-induced injury to the airways in mice. Am J Respir Crit Care Med. 168, 568-574 (2003).
- Evans, R. B.
- Vliet, A., et al. Formation of reactive nitrogen species during peroxidase-catalyzed oxidation of nitrite. A potential additional mechanism of nitric oxide-dependent toxicity. J Biol Chem. 272, 7617-7625 (1997).
- Ahmad, S., et al. Lung epithelial cells release ATP during ozone exposure: signaling for cell survival. Free Radic Biol Med. 39, 213-226 (2005).
- Allen, C. B. An automated system for exposure of cultured cells and other materials to ozone. Inhal Toxicol. 15, 1039-1052 (2003).
