Summary
Acuut hersenletsel is een ernstige verwonding die geen adequate behandeling tot op heden. Multifoton microscopie maakt het bestuderen van lengterichting van het proces van acuut hersenletsel ontwikkeling en indringende therapeutische strategieën bij knaagdieren. Twee modellen van acuut hersentrauma bestudeerd met in vivo twee-foton beeldvorming van de hersenen worden gedemonstreerd in dit protocol.
Abstract
Hoewel acuut hersenletsel vaak voort uit hoofd beschadiging verschillende ongevallen en een substantieel deel van de bevolking, is er geen effectieve behandeling voor is. Beperkingen van de momenteel gebruikte diermodellen belemmeren begrip van de pathologie mechanisme. Multifoton microscopie kan bestuderen cellen en weefsels in intacte hersenen van dieren langsrichting onder fysiologische en pathologische omstandigheden. Hier beschrijven we twee modellen van acuut hersenletsel onderzocht door middel van twee-foton beeldvorming van de hersenen celgedrag onder posttraumatische omstandigheden. Een geselecteerd gebied van de hersenen wordt verwond met een scherpe naald om een trauma van een gecontroleerde breedte en diepte in de hersenen parenchym produceren. Onze methode maakt gebruik stereotaxisch prik met een injectienaald, die kunnen worden gecombineerd met gelijktijdige drug toepassing. We stellen dat deze methode kan worden gebruikt als een instrument om geavanceerde cellulaire mechanismen van pathofysiologische gevolgen van acuut traumatische bestuderen zoogdierhersenen
Introduction
Acuut hersenletsel is een belangrijk probleem voor de volksgezondheid met een hoge incidentie van letsel bij auto-crashes, valt of aanvallen, en de hoge prevalentie van latere chronische handicap. Therapeutische benaderingen voor de behandeling van hersenbeschadiging blijven volledig symptomatisch, waardoor de doeltreffendheid van preklinische, chirurgische en intensive care beperken. Dit maakt de sociale en economische gevolgen van hersenletsel bijzonder ernstig. Om verschillende redenen, de meeste klinische onderzoeken kon verbeterd herstel na hersenletsel aangetoond middels nieuwe therapeutische benaderingen.
Diermodellen zijn cruciaal voor de ontwikkeling van nieuwe therapeutische strategieën voor een fase waarin drugdoeltreffendheid kan worden voorspeld bij patiënten met hersenletsel. Op dit moment is een aantal gevestigde diermodellen van hoofdtrauma bestaan, inclusief gecontroleerde corticale invloed 1, vloeistof percussie letsel 2, dynamische corticale vervorming 3, gewicht-drop4 en foto verwondingen 5. Een aantal experimentele modellen werden gebruikt om bepaalde morfologische, moleculaire en gedragsmatige aspecten hoofd-trauma geassocieerde pathologie. Echter, geen enkel dier model is volledig in het valideren van nieuwe therapeutische strategieën. Ontwikkeling van betrouwbare, reproduceerbare en gecontroleerde diermodellen van hersenletsel moet de complexe pathologische processen van.
De nieuwe combinatie van de nieuwste microscopische beeldvorming technologieën en genetisch-gecodeerde fluorescerende reporters biedt een ongekende kans om alle fasen van hersenletsel, die de primaire letsel omvatten, het verspreiden van het primaire letsel, secundaire schade, en regeneratie onderzoeken. Vooral in vivo twee-foton microscopie is een unieke lineair optische technologie die real-time visualisatie van de cellulaire en subcellulaire structuren zelfs in diepe corticale lagen knaagdierhersenen maakt. Verschillende soorten cellen en orgaNelles tegelijkertijd worden afgebeeld door verschillende fluorescente merkers. Met behulp van deze krachtige tool, kunnen we dynamisch morfologische en functionele veranderingen te visualiseren in levende hersenen onder posttraumatische omstandigheden. De voordelen van in vivo twee-foton microscopie bestuderen hersenletsel werden onlangs aangetoond door Kirov en collega 6. Met behulp van een milde focale corticale kneuzing model, deze auteurs toonden aan dat acute dendritische verwonding in de pericontusional cortex is omheind door de daling van de lokale bloedstroom. Bovendien toonden zij aan dat het metabolisch gecompromitteerd cortex in de kneuzing terrein verder beschadigd door de verspreiding depolarisatie. Deze secundaire gevolgen heeft synaptische circuits, waardoor de gevolgen van traumatisch hersenletsel ernstiger.
Hier stellen we de methode van stereotaxisch prik met een injectienaald, die kunnen worden gecombineerd met gelijktijdige topische drug aanvraag, als een geavanceerd model voor lokale breinletsel en als een hulpmiddel om pathofysiologische gevolgen van acuut traumatische bestuderen hersenen van zoogdieren in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle hier gepresenteerde procedures werden uitgevoerd volgens de plaatselijke richtlijnen voor de verzorging van dieren (De Finse Wet op dierproeven 62/2006). Animal licentie (ESAVI/2857/04.10.03/2012) werd verkregen van de lokale overheid (ELÄINKOELAUTAKUNTA-ELLA). Volwassen muizen van 1-3 maanden leeftijd, gewicht 24-38 gram werden in individuele kooien gehouden in de gecertificeerde Universiteit dierfaciliteit en voorzien van voedsel en water ad libitum.
1. Hersenletsel Imaging Via een Cranial Window
- Verlamming dieren en de voorbereiding van de werking veld
- Verdoven muizen door peritoneale injectie van een mengsel van ketamine (Ketalar, 80 mg / kg) en xylazine (Rompun, 10 mg / kg) opgelost in steriel gefiltreerd fosfaatbuffer zoutoplossing (PBS), pH 7,4. Controleer de muis reflexen regelmatig (staart en teen knijpen sonde) om de diepte van de anesthesie te controleren. Verhoog de dosis indien nodig, om de juiste verdoving handhaven, maar Overd voorkomenose.
- Handhaaf het dier bij 37,0 ° C een verwarmingselement gebruikt tijdens chirurgische operatie, imaging sessie en eerste uur na het herstel van de anesthesie.
- Voor de ogen van de muis beschermen tegen uitdrogen, gelden oog smeermiddel.
- Dien dexamethason (Rapidexon dierenarts, 2 mg / kg) door subcutane injectie ontsteking en cerebraal oedeem te verminderen.
- Dien een analgeticum (bijvoorbeeld Ketoprophene intraperitoneaal) tot 30 minuten vóór of onmiddellijk na de operatie. Als het dier vertoont geen pijn symptomen, zoals onwil om te bewegen, eten of drinken, of gewichtsverlies, speekselvloed, pilo-erectie, of abnormale respiratoire klinkt na de operatie, herhaal de injectie van pijnstillende.
- Scheer de muis 'hoofd met een scheren machine (zie materialen en apparatuur). Voorkom beschadiging van de snorharen.
- Behandel de huid op het hoofd van de muis met 70% ethanol oplossing van het geschoren gebied schoon.
- Met behulp van chirurgische schaar (zie materialen enApparatuur) en pincet (zie materialen en apparatuur), snijd de huid van de middellijn tussen de oren op het voorhoofd.
- Voorzichtig schrapen het bindweefsel vastgemaakt aan de schedel met een botte microchirurgische mes weg.
- Schuif huid grenzen opzij en trek het oor bars iets in auditieve openingen van de schedel voor hoofd en huid fixatie.
- Reinig de schedel met steriele PBS en behandelen plaats van de operatie op het hoofd van de muis met 0,5% chloorhexidinedigluconaat, dan drogen de schedel oppervlak met behulp van een combinatie van steriele wattenstaafjes en perslucht.
- Toebrengen van de prik letsel
- Plaats een klein dier stereotaxisch instrument met een dier houder (zie materialen en apparatuur).
- Pas de positie van de binoculaire microscoop naast de stereotaxische apparaat te concentreren op het oppervlak van de schedel van het dier.
- Met behulp van een binoculair microscoop, zoek het bregma punt op de schedel.
- Identificeer de region van belang met behulp van de stereotactische coördinaten.
OPMERKING: Vermijd die aandachtsgebieden die direct zijn gelegen boven oppervlakkige corticale schepen. Vernietiging van deze kunnen sterk van invloed op de trauma progressie. - Plaats de 30 G naald boven de gekozen regio en markeer de target site door krabben de schedel oppervlak.
- Boor de schedel met alle mogelijke voorzorgsmaatregelen om onnodige verbreding van het aangetaste bot oppervlak te voorkomen. Gebruik een hoge snelheid chirurgische boor (zie materialen en apparatuur) onder de microscoop. Stop met boren als vloeistof wordt weergegeven in het geboorde gebied.
- Raak de onderkant van de geboorde put met de naald.
- Dompel de naald soepel in de hersenen (inbrengfrequentie 5-10 mm / min), de diepte van 0,5-2,0 mm volgens de coördinaten van de prik toedieningsplaats.
- Verwijder de naald direct na het bereiken van de gewenste diepte (terugtrekkingssnelheid 5-10 mm / min) en veeg het bloed verschijnt na de prik met een kleine tampon (see materialen en apparatuur).
- Voer micro-injectie van 100 uM Sulforhodamine 101 of een andere verbinding van belang in de laesie site met behulp van een micro-pomp (WPI) en 10 pi Hamilton spuit monteren met glazen pipet.
LET OP: Tijdens de voorbereiding van de glazen pipet van borosilicaatglas capillaire, scherpen de tip om een diameter van 10-20 micrometer. - Bezielen 250-1,500 nl van de injectie-oplossing met een snelheid van 2-5 nl / sec.
OPMERKING: Laat de pipet na het einde van de infusie gedurende minstens 5 min in de hersenen parenchym, verwijder deze dan langzaam en voorzichtig om de oplossing uitstroom te voorkomen.
- Craniotomie voor chronische craniale venster
- Boor de schedel zachtjes en voorzichtig naar een cirkel venster rond het letsel site. Gebruik venstertje met een diameter van 3-3,5 mm.
- Breng een druppel cortex buffer (125 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM glucose, 10 mM HEPES, 2 mM CaCl2 en 2 mM MgSO 4 in gedestilleerd H2O) aan de wi te dekkenndow.
- Plaats een ronde glazen dekglaasje (# 1.5 dikte) op de craniale venster.
- Verwijder de overmaat aan cortex buffer rond het dekglaasje.
- Dicht de randen van het dekglaasje met polyacryl lijm (zie materialen en apparatuur).
OPMERKING: Controleer of de lijm niet wordt aangebracht op het bovenoppervlak van het dekglaasje. Als de dekking van glas is vervuild met lijm, wachten tot het glas stabiel is vastgelijmd aan de schedel en de lijm op het glas oppervlak droog wordt, verwijder dan zorgvuldig de verontreinigende lijm met een microblad. - 5 minuten wachten tot laat de lijm drogen.
- Met behulp van het oor bar hoogte schroeven, past u de positie van het hoofd, zodat de metalen houder kan worden geplaatst.
- Breng een kleine hoeveelheid van polyacryl lijm op de ring van de stalen houder (zie materialen en apparatuur).
- Lijm de ring van de stalen houder aan de glazen dekglaasje met de metalen houder handvat naar achteren gericht.
- 5 minuten wachten tot laat de lijm drogen.
- Mix tandheelkundig cement (zie materialen en apparatuur) met polyacryl lijm in een 3,5 cm petrischaal (of analoge) viskeuze omstandigheden te bereiken.
- Dicht de grenzen van de craniale venster met de cement + lijm mengsel en bedek het zichtbare oppervlak van de schedel met hetzelfde mengsel tot aan de grens huid.
- Wacht 15 minuten om te laten de cement + lijmmengsel opdrogen en verwijder oor bars.
- Voeren twee-foton excitatie microscopische (TPEM) beeldvorming voor de regio van belang en een controlegebied zoals beschreven in protocol 3.
- Na beeldvorming, zodat het dier te herstellen van narcose op een verwarmingselement en bewaar het in een individuele kooi onder observatie tot volledig herstel. Nat voer kan worden gegeven aan kauwen en hydratatie vergemakkelijken.
2. Hersenletsel Imaging Door de Verdunde Skull
- Verdovende dieren en de voorbereiding van de werking veld
- Verdoven van de muis en voor te bereiden voor trauma inductiezoals beschreven in stap 1.1.
- Schedel dunner en toebrengen van de prik letsel
- Plaats een klein dier stereotaxisch instrument met het dier houder (zie materialen en apparatuur).
- Pas de positie van een binoculaire microscoop naast de stereotaxische apparaat te richten op de schedel oppervlak dier.
- Zoek het bregma punt op de schedel met de binoculair microscoop, identificeren van de hersenen gebied dat moet worden afgebeeld op basis van stereotactische coördinaten en markeer deze door krabben.
OPMERKING: Skull dunner positie mag zich niet boven of in de omgeving schedelnaden, zoals de schedel stabiliteit in het gedrang komt in die gebieden. Bovendien, grote corticale of meningeale vaten en hersenvliezen onder de schedel hechtingen zich waarschijnlijk beeldvormingsartefacten veroorzaken. - Plaats de metalen houder bekleed met lijm over het gebied van de rente op de schedel van het dier, van toepassing lichte druk en wacht 5 minuten totdat de metalen houder stevig vastgelijmd aan de schedel. Meng tandheelkundig cement (zie materialen en apparatuur) met polyacryl lijm in een 3,5 cm petrischaal (of analoge) viskeuze omstandigheden te bereiken.
- Dicht de randen van de metalen houder met de cement + lijm mengsel en bedek het zichtbare oppervlak van de schedel met hetzelfde mengsel tot aan de grens huid.
- Wacht 15 minuten om te laten de cement en lijm mengsel opdrogen.
- Spoel de verdunde schedel gebied en de aangrenzende delen van de metalen houder meerdere malen met PBS, waardoor de resten van nonpolymerized lijm worden weggewassen.
OPMERKING: Het is cruciaal om een stabiele bevestiging van de schedel te garanderen aan de houder. Dit maakt de bereiding stabiliteit tijdens de beeldvorming. - Met behulp van de hoge vergroting modus van de binoculair microscoop, verwijder de bovenste lagen van de schedel bot met een high-speed micro-boor een verdunde schedel gebied van ~ 0,5-1,5 mm in diameter te creëren. Gebruik perslucht bij het boren tot op het bot vuil te verwijderen. Voer het boren intermittently tijdens de dunning procedure om wrijving veroorzaakte oververhitting te voorkomen. Koel de boor met de oplossing bij kamertemperatuur en periodiek toepassen buffer om de verdunde gebied om warmte te absorberen.
OPMERKING: Om schade aan de cortex te voorkomen, niet boren over grote regio's (> 1,5 mm) tot een dunne laag (<50 micrometer).
OPMERKING: Het knaagdier schedelbot structuur bestaat uit twee dunne lagen compact bot gescheiden door een dikke laag sponsachtig bot. Tiny holten van het sponsachtige bot vorm concentrische cirkels en canaliculi, die de bloedvaten bevatten. Gebruik microboor kunnen zowel de compacta laag en de meeste sponsachtige laag te verwijderen. Verstoring van de bloedvaten in het sponsachtige bot kan bloedingen veroorzaken. Gebruik hemostase collageenspons om dit bloeden te stoppen. - Gebruik tweede harmonische generatie (SHG) beeldvorming te onderzoeken of de meerderheid van de sponsachtige bot is verwijderd. Wees voorzichtig om overmatig dunner te vermijden, zorg ervoor dat de resterende bot is thIcker dan 50 urn in dit stadium van de bereiding.
- Een druppel buffer warme (35-37 ° C) boven het verdunde gebied. Gebruik een microchirurgische blad of Micro Finishing Bur om verder te verwijderen bot lagen en vormen een gladde oppervlakte van ~ 700 micrometer in diameter met bot dikte van ~ 20 micrometer. Tijdens deze stap, is het nuttig om repetitieve SHG imaging uitvoeren en meet regelmatig het bot dikte.
- Voer TPEM beeldvorming voor de regio van belang en een controlegebied.
- Pas de positie van het hoofd met de oor bar hoogte schroeven zodanig dat uitgedund regio wordt strikt horizontaal geplaatst. Plaats de naald boven de verdunde regio en zorg ervoor dat er geen grote schepen onder de gerichte website.
- Maak een laesie door dompelen de naald in de hersenen, om de diepte van 0,5-2,0 mm van verdunde schedel oppervlak en volgens de coördinaten van de prik toedieningsplaats.
- Verwijder de naald en onderdrukken bloeding verschijnen na thij acuut hersenletsel met hemostatische tampon (zie materialen en apparatuur). Wacht tot het vormen van bloedstolsels en schip pulsatie op de schade-site stopt.
- Voer micro-injectie van 100 uM sulforhodamine 101 of een andere van belang zijnde verbinding in de laesie, zoals hierboven in sectie 1.2.10.
- Voer TPEM beeldvorming om te controleren de schade progressie en herstel zoals beschreven in protocol 3.
- Na beeldvorming, zodat het dier het bewustzijn van narcose op een verwarmingselement te herwinnen. Laat de dieren niet alleen laten en terug te sturen naar zijn kooi pas na volledige fysieke herstel.
3. Imaging
- Plaats het dier onder de microscoop door het aanbrengen van de metalen houder aan de custom-built frame.
- Voor de beeldvorming, gebruik bijvoorbeeld de FV1000MPE twee-foton microscoop uitgerust met Mai Tai DeepSee laser en XLPLN 25X 1,05 NA water immersie objectief geoptimaliseerd voor in vivo twee-fotonbeeldvorming.
- Identificeer de laesie site onder de microscoop met wide-field fluorescentie-modus. Gebruik lange pass filters om hersenenvasculature visualiseren en selecteer het controlegebied volgens de waargenomen patroon van de bloedvaten.
- Om het beeld van de tweede harmonische generatie (SHG) signaal, tunen van de femtoseconde laser om de 800 nm golflengte en verzamel het uitgezonden licht met behulp van de 380-410 nm bypass filter. Voor fluorescentie beeldvorming, gebruik de band pass filter (515-560 nm) om uitgezonden licht te verzamelen, en de volgende golflengten worden gebruikt om de fluorescentie op: GFP-860 nm, YFP-950 nm.
- Gebruik FluoView software voor het acquisitie.
- Store coördinaten van elke ROI voor volgend repetitieve beeldvorming. Afbeelding dezelfde ROI tijd en coördinaten passen telkens naar afbeelding overlap maximaliseren.
- Analyseer beelden met de juiste software (bijv.. ImageJ). Reconstructies hier gepresenteerd werden gedaan met behulp van Imaris software.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
1) chronische craniale venster en 2) de schedel dunner, voor posttraumatische beeldvorming van de hersenen in transgene muizen: We hebben twee operatie procedures geoptimaliseerd. Schematische weergave van de experimentele preparaten wordt getoond in Figuur 1. Traumatische prik door stalen naald van 0,3 mm OD (30 G) wordt toegepast op de geboorde put (Figuur 1A). Een succesvolle craniale venster voorbereiding beeldvorming maakt het mogelijk tot een diepte van 650 micrometer onder de pial oppervlak (Figuur 1B), terwijl schedel dunner neiging om een limiet van ongeveer 300 micrometer (figuur 1C) op te leggen, zoals gedemonstreerd in de 3D-reconstructie van Thy1-YFP- H muis corticale piramidale neuronen.
De prik trauma leidt tot eliminatie van dendrieten en vernietiging van capillaire netwerken in een gecontroleerde volume van de hersenen cortex. Tijdens de eerste twee dagen, het beschadigde oppervlak vergroot en de trauma geïnduceerde dendriet blebbing en vorming van dendritische terugtrekken bulbs in perilesion gebieden, zoals waargenomen met in vivo multifoton microscopie (figuur 2).
We uitgevoerd schedel dunner op de foto om de activering en migratie van microglia in CX3CR1-EGFP muizen onmiddellijk na verwonding (figuur 3A). De SHG beeldvorming biedt een waardevol instrument om nauwkeurig de schade (figuur 3B) af te bakenen. Extracellulaire matrix moleculen die SHG signalen produceren zijn sterk verrijkt in de hersenen parenchym op de prik trauma. Eerst worden fijne microgliale processen teruggehaald, dan microgliale cellen naar de rand van de verwonding (figuur 3A).
Om mogelijke verwondingen veroorzaakt door dunne glazen pipet inbrengen en levering van kleurstof schatten, voeren we in vivo twee-foton microscopie experimenten met Sulforhodamine 101 micro-injectie in Thy1-YFP-H muizen zonder hersentrauma. Representatieve beelden weergegeven in figuur 4 tonen microinjection ter 3 uur na injectie. Het spoor van pipet insertie kan worden gezien in de hersenen hersenvliezen gevisualiseerd door SHG (Figuur 4A). Astrocyten zijn gelabeld met sulphordodamine 101 geïntroduceerd door de injectie (Figuur 4B). Dendrieten uiten YFP onder Thy1 promotor geen morfologische tekenen van letsel zoals blebbing of intrekken bollen (Figuur 4 C) aan te tonen.
Figuur 1. Werkwijze acuut hersenletsel in combinatie met craniale raam of dunne schedel preparaten gecombineerd met in vivo twee-foton microscopie. Een. Traumatische prik door stalen naald van 0.3mm OD (30G) toegepast op zowel de geboord. De naald wordt kort gedompeld in de hersenen 0,5-2 mm diep vanaf de bodem van de put. B, C (C). D. Helder gezichtsveld van de oppervlakkige bloedvaten door het glazen raam onmiddellijk na de acute hersenschade. E. Uitgedund schedel vóór de blessure toepassing. De gekozen regio van belang (wit frame) en de prik toedieningsplaats (rode cirkel). Een ander gebied (rood kader) van de verdunde regio moet worden afgebeeld om mogelijke operatie veroorzaakte artefacten te monitoren.
Figuur 2. Voorbeeld van longitudinale multiphoton beeldvorming van hersentrauma ontwikkeling door middel van de verdunde schedel. Een. Top Gezien de verwondingsplaats omringd door YFP-gelabeld dendrieten van corticale neuronen 20 minuten na trauma toebrengen, zoals afgebeeld door de verdunde schedel voorbereiding. B. Vergrote weergave van het gebied die in paneel A. C. Hetzelfde gebied van de hersenen als in B, reimaged 5 dagen na een trauma. Dendriet blebbing wordt met witte pijlen, dendritische terugtrekken bollen - met rode pijlen.
Figuur 3. Voorbeelden van controle ontsteking en glia activering tijdens de ontwikkeling van hersentrauma met verschillende markers voor in vivo beeldvorming multiphoton bijvoorbeeld fluorescerende eiwitten, kleurstoffen en frequentieverdubbeling signaal. De beelden werden 3 uur verkregen na hersenletsel.
Figuur 4. Onderzoek van weefsel-effect van de oplossing injectie via een glazen micropipet. Een. Een trace (shown met stippellijn) in SHG visualiseren hersenen hersenvliezen 3 uur na de injectie. B. Astrocyten gelabeld met sulphordodamine geïntroduceerd door de injectie. C. Dendrieten uiten YFP onder Thy1 promotor. D. Gecombineerde beeld van A (SHG - grijs), B (astrocyten - red), C (neuronale dendrieten - geel).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hersentrauma is een abrupt, onvoorspelbare gebeurtenis. Hier beschrijven we de diermodel dat een spectrum van pathologische veranderingen waargenomen bij menselijke patiënten na hersenletsel zoals neurodegeneratie, eliminatie van dendrieten, hersenoedeem, gliale litteken, bloedingen in de cerebrale cortex in combinatie met focale subarachnoïdale bloedingen en verhoogde permeabiliteit van de reproduceert bloed-hersenbarrière. Primaire en secundaire pathogenese, evenals herstel na trauma te bestuderen, werd dit letsel model in combinatie met longitudinale in vivo visualisatie van fijne neuronale en gliale structuren. Transgene muis lijnen werden gebruikt die fluorescerende eiwitten tot expressie in neuronen (Thy1-YFP-H) 7, astrocyten (GFAP-EGFP) 8, of microglia (CX3CR1-EGFP) 9. Daarnaast gebruikten we tweede harmonische generatie (SHG) beeldvorming en astrocyten laden met Sulfarhodamine 101 10.
De hier beschreven model recapituleert penetrating type hersenletsel. Daarom is een beperking van de onderhavige model is dat het geen informaties mechanismen gesloten hoofdletsel biedt wel. Onlangs Sword en medeauteurs gemeld multifoton beeldvorming resultaten op mobiele gedrag in pericontusional cortex 6. Ermee rekening houdend dat hoofdletsel gesloten is een frequenter medisch geval, wordt de methodologische aanpak die door de auteurs zeer veelbelovend voor de traditionele methoden van onderzoek op het gebied van effecten hersentrauma 11 aanvullen.
We gebruikten zowel de chronische craniale venster 12 en de schedel dunner 13 voorbereidingen naar cel gedrag te bestuderen onder posttraumatische omstandigheden in levende brein. Beide methoden hebben bepaalde voordelen en beperkingen. Zo is de chronische craniale venster biedt een betere resolutie, optische dieper doordringen in het hersenweefsel en het gemak voor meerdere beeldvorming sessies. Omgekeerd schedel dunner is minder kans op ontstekingen veroorzaken bij The beeldvorming plaats, en, misschien nog belangrijker, het laat zich herhalende verzoeken van drugs en kleurstoffen. Enkele voorbeelden van farmacologische middelen in dergelijke proeven worden toegepast worden in tabel 1.
| Agenttype | Ingespoten middel | Gebieden van de biologie / apotheek onderzoek |
| Ontstekingsremmende | Cyclosporine A | Traumatisch hersenletsel, secundaire schade, neurodegeneratie |
| Gifstoffen | Tetrodotoxine | TBI - secundaire schade, excytotoxicity |
| Bicuculline | TBI - secundaire schade, chloride homeostase | |
| Remmers van signaalwegen | PD98059 (MAPKK remmer) | signalerende mechanismen van ontsteking, secundaire schade, posttraumatische celdood, neurodegeneratie en regeneratie |
| SU6656 (SRC-familie kinase remmer) | ||
| Neurotrofe factoren | Brain-derived neurotrophic factor, BDNF | TBI - neuronale overleving na een blessure, neuroprotection in het voortgezet posttraumatische hersenbeschadiging |
| Virussen | lentivirale vectoren voor eiwitexpressie | moleculaire mechanismen van posttraumatische neurodegeneratie en regeneratie, differentiële labeling celtypen beschadigde hersenen in vivo beeldvorming |
| adenovirale vectoren voor eiwitexpressie | ||
| Ca 2 + TL-indicatoren | Fluo-2, 4 | signaleringsmechanismen van posttraumatische ontsteking, celdood, migratie, axonale / dendritische regeneratie |
Tabel 1. Farmacologische middelen en kleurstoffen voor corticale injectie in prik letsel model.
Een breed scala van biochemische gebeurtenissen die van groot belang zijn onder fysiologische en pathologische aandoeningen kan worden gemerkt met chemische inhibitoren, fluorescente indicatoren en mutante eiwitten ingebracht via virale constructen. Voordelen voor de keuze bepaald tijdvenster door de schedel dunner preparaat kan zeer relevant voor die studies.
In de huidige studie, gebruikten we tweede harmonische generatie signaal om de schade ter plaatse af te bakenen. Alternatief zou de verwonding grenzen aangegeven met een zwak diffunderende fluorescerende kleurstof, bijvoorbeeld een hoog molecuulgewicht dextran fluorescente conjugaat (2.000.000 Dalton).
Onlangs, Schaffer en zijn collega's 14 hebben een chronische gebruikt preparaatmet reopenable craniale venster voor herhalende levering van fluorescerende kleurstoffen muis cortex. Het is waarschijnlijk dat craniale venster heropening ongunstig het hersenweefsel transparantie kunnen beïnvloeden. Bovendien is het moeilijk om het tijdsverloop van de heropening-geïnduceerde ontsteking, waarbij het bindweefsel hergroei invloed kunnen voorspellen.
Een groot voordeel van de verdunde schedel voorbereiding is de mogelijkheid om therapeutische verbindingen (en andere materialen die topische injectie in hersenweefsel) meerdere keren tijdens voortgang van het trauma, zonder complicerende artefacten (bijvoorbeeld zonder craniale venster heropening) leveren.
Als repetitieve verbinding levering direct om de schade site is gewenst, moet men speciale middelen overwegen om de schedel uitdrogen en bacteriële infectie te voorkomen. Aldus houden de geopereerde kopgebied onder steriele omstandigheden en toepassing van antibiotica (zoals enrofloxacine) aanbevolen. Om de t behoudenhinned schedel gebied van drogen, vul de metalen houder met 1,5% agarose en dek deze af met ronde glazen dekglaasje. In de meeste gevallen zal dit mogelijk maken met behoud van dezelfde transparantie of uitgedund schedel over de periode van maximaal 10 dagen. Sommige extra geboden als meerdere beeldvorming sessies in de verdunde schedel bereiding gepland gedurende een langdurige tijdsperiode. Vlak voor elke opnamesessie, verwijder voorzichtig de nieuw gevormde bindweefsel van de uitgedund regio met behulp van een microchirurgische mes. Gebruik de TPEM beeldvorming van SHG om de beeldkwaliteit en meten botdichtheid te controleren. Weefsel hergroei kan de beeld indringdiepte en vervaging vergezeld van een toename van de achtergrond fluorescentie compromitteren. Vernieuw de schedel dunner voorzichtig met een microchirurgische blad om hoge beeldkwaliteit te herwinnen.
In die gevallen dat geen directe toegang tot het letsel plaats nodig hebben, raden we voor de uitgedund gebied van de schedel met een glas coverslip zoals beschreven in het artikel op gepolijste en gewapend verdund schedel voorbereiding door Kleinfeld en collega 15. Dit zou kunnen gebeuren door de volgende facultatieve procedure. Plaats een kleine druppel agarose (1,5%) op de verdunde schedel regio, wachten tot het een gel, verwijder alle onnodige agarose, dus laat het alleen op de schade ter plaatse. Agarose moet het letsel website te beschermen tegen externe effecten. Droogt de verdunde schedel regio met behulp van perslucht. Drop een kleine hoeveelheid polyacryl lijm op een klein stukje van # 0 coverglass en plaats het op de verdunde schedel regio. De polyacryl lijm voorkomt bot-en bindweefsel hergroei, waardoor het houden van de verdunde schedel onder het raam bewaard.
Een combinatie van deze procedures maakt het bestuderen van acute en chronische posttraumatische processen, het leveren van drugs lokaal of systemisch en direct monitoren van de effecten van behandeling. Het gebruik van dubbele of drievoudige transgene muis lijnen kan ook nuttig, parti zijncularly voor gelijktijdige weergave van meerdere posttraumatische processen zoals gliale littekenvorming en neuronale tak hergroei. Wij verwachten dat onze modellen van acuut hersenletsel studeerde met intravitale twee-foton microscopie vruchtbaar voor kandidaat-geneesmiddel testen om te bewijzen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij zijn diep dankbaar aan Dr Frank Kirchhoff voor het verstrekken van GFAP-EGFP en CX3CR1-EGFP muisspanningen. Het werk werd ondersteund door subsidies van het Centrum voor Internationale Mobiliteit van Finland, Tekes, Fins voor Neurowetenschappen (FGSN) en de Academie van Finland.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2A-sa dumb Tweezers, 115 mm | XYtronic | XY-2A-SA | |
| 30 G ½ in needle | BD | REF 304000 | |
| Animal trimmer, shaving machine | Aesculap | Isis GT420 | |
| Binocular Microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
| Biological Temperature Controller with stainless steel heating pad | Supertech | TMP-5b | |
| Blunt microsurgical blade | BD | REF 374769 | |
| Borosilicate tube with filament | Sutter Instruments | BF120-69-10 | For glass pipette production |
| Carprofene | Pfizer | Rimadyl vet | |
| Chlorhexidine digluconate | Sigma | C9394 | |
| Dental cement | DrguDent, Dentsply | REF 640 200 271 | |
| Dexamethasone | FaunaPharma | Rapidexon vet | |
| Disposable drills | Meisinger | HP 310 104 001 001 008 | |
| Dulbeco’s PBS 10x | Sigma | D1408 | |
| Dumont #5 forceps, 110 mm | FST | 91150-20 | |
| Ealing microelectrode puller | Ealing | 50-2013 | Vertical puller for glass pipette production |
| Eye ointment | Novartis | Viscotears | |
| Foredom drill control | Foredom | FM3545 | |
| Foredom micromotor handpiece | Foredom | MH-145 | |
| Gas anesthesia platform for mice | Stoelting | 50264 | Assembled on stereotaxic instrument |
| Hemostasis Collagen Sponge | Avitene, Ultrafoam BARD | Ref 1050050 | |
| Imaris | Bitplane | ||
| Ketamine | Intervet | Ketaminol vet | |
| Mai Tai DeepSee laser | Spectra-Physics | ||
| Metal holder | Neurotar | ||
| Microdressing forceps, 105 mm | Aesculap | BD302R | |
| Microfil | WPI | MF34G-5 | Micro syringe filling capillaries |
| Mineral oil | Sigma | M8410 | |
| Multiphoton Laser Scanning Microscope | Olympus | FV1000MPE | |
| NanoFil Syringe 10 μl | WPI | NANOFIL | Hamilton syringe |
| Nonwoven swabs 5 x 5 | Molnlycke Health Care | Mesoft | Surgical tampons |
| Polyacrylic glue | Henkel | Loctite 401 | |
| Round glass coverslip | Electron Microscopy Sciences | ||
| 1.5 thickness | |||
| Small animal stereotaxic instrument | David Kopf Instruments | 900 | |
| Stoelting mouse and neonatal rat adaptor | Stoelting | 51625 | Assembled on stereotaxic instrument. |
| Student iris scissors, straight 11.5 cm | FST | 91460-11 | |
| Sulforhodamine 101 | Molecular Probes | S-359 | |
| UMP3 microsyringe pump and Micro 4 microsyringe pump controller | WPI | UMP3-1 | Microinjector and controller |
| Xylazine | Bayer Health Care | Rompun vet |
References
- Lighthall, J. W. Controlled cortical impact: A new experimental brain injury model. J. Neurotrauma. 5 (1), 1-15 (1988).
- Lindgren, S., Rinder, L.
- Shreiber, D. I., et al. Experimental investigation of cerebral contusion: histopathological and immunohistochemical evaluation of dynamic cortical deformation. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 58 (2), 153-164 (1999).
- Feeney, D. M., Boyeson, M. G., Linn, R. T., Murray, H. M., Dail, W. G. Responses to cortical injury: I. Methodology and local effects of contusions in the rat. Brain Res. 211 (1), 67-77 (1981).
- Bardehle, S., et al. Live imaging of astrocyte responses to acute injury reveals selective juxtavascular proliferation. Nat. Neurosci. 16 (5), 580-586 (2013).
- Sword, J., Masuda, T., Croom, D., Kirov, S. A. Evolution of neuronal and astroglial disruption in the peri-contusional cortex of mice revealed by in vivo two-photon imaging. Brain. 136 (5), 1446-1461 (2013).
- Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
- Nolte, C., et al. GFAP promoter-controlled EGFP-expressing transgenic mice: a tool to visualize astrocytes and astrogliosis in living brain tissue. Glia. 33 (1), 72-86 (2001).
- Jung, S., et al. Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion. Mol. Cell. Biol. 20 (11), 4106-4114 (2000).
- Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Kerr, J. N. D., Helmchen, F. Sulforhodamine 101 as a specific marker of astroglia in the neocortex in vivo. Nat. Methods. 1 (1), 31-37 (2004).
- Carré, E., et al. Technical aspects of an impact acceleration traumatic brain injury rat model with potential suitability for both microdialysis and PtiO2 monitoring. J. Neurosci. Methods. 140, 23-28 (2004).
- Holtmaat, A., et al. Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nat. Protoc. 4 (8), 1128-1144 (2009).
- Yang, G., Pan, F., Parkhurst, C. N., Grutzendler, J., Gan, W. B. Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice. Nat. Protoc. 5, 201-208 (2010).
- Cianchetti, F. A., Kim, D. H., Dimiduk, S., Nishimura, N., Schaffer, C. B. Stimulus-evoked calcium transients in somatosensory cortex are temporarily inhibited by a nearby microhemorrhage. PloS one. 8 (5), (2013).
- Shih, A. Y., Mateo, C., Drew, P. J., Tsai, P. S., Kleinfeld, D. A polished and reinforced thinned-skull window for long-term imaging of the mouse brain. J. Vis. Exp. 61, (2012).
