Summary
טראומה מוחית חריפה היא פגיעה חמורה שאין לה טיפול הולם עד כה. מיקרוסקופיה multiphoton מאפשרת לימוד אורכי התהליך של התפתחות טראומה המוחית חריפה וחיטוט אסטרטגיות טיפוליות במכרסמים. שני דגמים של טראומה מוחית חריפה למדה אצל בשני פוטונים הדמיה vivo של המוח הם הפגינו בפרוטוקול זה.
Abstract
למרות טראומה מוחית חריפה לעתים קרובות תוצאות מנזק בראש בתאונות שונות ומשפיעה על חלק ניכר מהאוכלוסייה, אין טיפול יעיל לזה עדיין. מגבלות של מודלים של בעלי חיים המשמשים כיום לעכב הבנה של מנגנון פתולוגיה. מיקרוסקופיה multiphoton מאפשרת לימוד תאים ורקמות במוח של בעלי חיים ללא פגע אורכים בתנאים פיסיולוגיים ופתולוגיים. כאן, אנו מתארים שני מודלים של פגיעה מוחית חריפה למדו באמצעות הדמיה שני פוטונים של תאים במוח התנהגות בתנאי פוסט טראומתיים. אזור במוח שנבחר הוא נפגע עם מחט חדה כדי לייצר טראומה של רוחב ועומק שבשליטת parenchyma המוח. השיטה שלנו משתמשת בזין stereotaxic עם מחט מזרק, אשר יכול להיות בשילוב עם יישום תרופה בו זמנית. אנו מציעים כי בשיטה זו יכולה לשמש ככלי מתקדם ללמוד מנגנונים תאיים של השלכות pathophysiological של טראומה חריפה במוח של יונקים
Introduction
פגיעה מוחית חריפה היא בעיה משמעותית בבריאות הציבור עם שכיחות גבוהה של פגיעה בתאונות דרכים, נפילות או תקיפות, ושכיחות גבוהה של מוגבלות כרוניות שלאחר מכן. גישות טיפוליות לטיפול בפגיעה מוחית יישארו סימפטומטי לחלוטין, ובכך להגביל את האפקטיביות של טיפול prehospital, כירורגית וקריטי. זה הופך את ההשפעה החברתית והכלכלית של פגיעה מוחית חמורה במיוחד. עבור מגוון רחב של סיבות, רוב הניסויים הקליניים לא הצליח להוכיח שיפור בהתאוששות לאחר פגיעה מוחית תוך שימוש בגישות טיפוליות חדשניות.
מודלים של בעלי החיים הם קריטיים לפיתוח אסטרטגיות טיפוליות חדשות לקראת שלב שבו יעילות תרופה ניתן לחזות בחולים עם ניזק מוחי. נכון לעכשיו, כמה מודלים של בעלי חיים מבוססים היטב של חבלת הראש קיימים, כוללים השפעה מבוקרת קליפת המוח 1, פגיעת הקשה נוזל 2, עיוות בקליפת המוח דינמית 3, ירידה במשקל4, ופציעת תמונה 5. מספר המודלים הניסיוניים שנוצלו כדי ללמוד היבטים מורפולוגיים, מולקולריים והתנהגותיות מסוימים של פתולוגיה הקשורים חבלת הראש. עם זאת, אין מודל חיה אחת הוא מוצלח כולו באימות אסטרטגיות טיפוליות חדשות. פיתוח של מודלים של בעלי חיים אמינים, לשחזור ובשליטה של פגיעה מוחית יש צורך להעריך את התהליכים פתולוגיים המורכבים.
שילוב החדשני של הטכנולוגיות החדישות ביותר מיקרוסקופי ההדמיה וכתבי ניאון גנטי מקודדים מציע הזדמנות חסרת תקדים לחקור את כל השלבים של פגיעה מוחית, הכוללים פגיעה העיקרית, הפצה של הפגיעה העיקרית, פגיעה משנית, והתחדשות. בפרט, in vivo שני הפוטונים במיקרוסקופ הוא טכנולוגיה אופטית קוי ייחודית המאפשרת הדמיה של מבנים תאיים ואפילו subcellular בשכבות בקליפת המוח עמוקה של מוח מכרסם בזמן אמת. מספר סוגים של תאים וorgaניתן הדמיה Nelles בו זמנית על ידי שילוב סמני ניאון שונים. שימוש בכלי רב עוצמה זה, אנו יכולים לחזות שינויים מורפולוגיים ופונקציונליים דינמיים בחיים מוח בתנאי פוסט טראומתיים. היתרונות של במיקרוסקופ שני פוטונים vivo בלימוד פגיעה מוחית הודגמו לאחרונה על ידי קירוב ועמיתיו 6. שימוש במודל חבלה קל המוקדים בקליפת המוח, מחברים אלה הראו כי פציעה הדנדריטים חריפה בקליפת pericontusional היא מגודרת על ידי הירידה בזרימת הדם המקומית. יתר על כן, הם הראו כי קליפת המוח נפגעת מטבולית סביב אתר חבלת ניזוק עוד יותר על ידי שלילת קוטביות מתפשטת. נזק המשני זה משפיע על מעגלים סינפטיים, מה שהופך את ההשלכות של פגיעה מוחית טראומטית חמורות יותר.
כאן, אנו מציעים את השיטה של זין stereotaxic עם מחט מזרק, אשר יכול להיות בשילוב עם יישום תרופה אקטואלי בו זמנית, כמודל מתקדם למוח המקומיפציעה וככלי ללמוד השלכות pathophysiological של טראומה חריפה במוח של היונקים in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל ההליכים שהוצגו כאן בוצעו על פי הנחיות מקומיות לטיפול בבעלי חיים (החוק הפיני בניסויים בבעלי החיים 62/2006). רישיון בעלי חיים (ESAVI/2857/04.10.03/2012) הושג מרשות מקומית (ELÄINKOELAUTAKUNTA-ELLA). עכברים בוגרים של 1-3 חודשים גיל, משקל 24-38 גרם, הוחזקו בכלובים בודדים במתקן בעלי החיים מוסמך של האוניברסיטה ומקבל מזון ומים כהרצון.
1. פגיעה מוחית הדמיה דרך חלון גולגולתי
- הרדמת בעלי חיים ומכין את שדה הפעולה
- הרדימי עכברים על ידי הזרקת הצפק מתערובת של קטמין (Ketalar, 80 מ"ג / קילוגרם) ו xylazine (Rompun, 10 מ"ג / קילוגרם) מומס בתמיסת מלח פילטר מעוקר חיץ פוספט (PBS), pH 7.4. בדוק את הרפלקסים של העכבר באופן קבוע (זנב ובדיקת קמצוץ הבוהן) כדי לוודא את עומק ההרדמה. להגדיל את המינון בעת הצורך, כדי לשמור על הרדמה תקינה, אך להימנע overdOSE.
- לשמור על בעלי החיים ב37.0 מעלות צלזיוס באמצעות כרית חימום בפעולה כירורגית, פגישת הדמיה והשעה הראשונה לאחר התאוששות מן ההרדמה.
- כדי להגן על עיניו של העכבר מהתייבשות, להחיל סיכה העין.
- לנהל dexamethasone (וטרינר Rapidexon, 2 מ"ג / קילוגרם) על ידי הזרקה תת עורית כדי להפחית את הדלקת ובצקת מוחית.
- לנהל משכך כאבים (למשל, Ketoprophene intraperitoneally) עד 30 דקות לפני או מייד לאחר הניתוח. אם החיה מפגינה כל תסמיני כאב, כגון חוסר רצון לזוז, לאכול או לשתות, או ירידה במשקל, הפרשת ריר, piloerection, או נשימה לא נורמלית נשמעת לאחר ניתוח, חזור על הזריקה של משכך כאבים.
- לגלח את ראש העכבר 'עם מכונת גילוח (ראה חומרים וציוד). למנוע נזק לשפם.
- פנק את העור על ראשו של העכבר עם 70% אתנול פתרון כדי לנקות את האזור המגולח.
- בעזרת מספריים כירורגי (ראה חומרים וציוד) ומלקחיים (ראה חומרים וציוד), לחתוך את העור מהקו האמצעי בין אוזניים למצח.
- בעדינות לגרד ממנו את רקמת החיבור צמודה לגולגולת עם להב microsurgical בוטה.
- הסט גבולות עור הצידה ולמשוך ברים אוזן מעט לתוך פתחים שמיעתי של הגולגולת לראש וקיבעון עור.
- נקה את הגולגולת עם PBS סטרילי ולטפל באתר הניתוח בראשו של העכבר עם 0.5% digluconate כלורהקסידין, ולאחר מכן לייבש את משטח הגולגולת באמצעות שילוב של צמר גפן סטרילי ואוויר דחוס.
- גרימת פציעת הזין
- מקם מכשיר קטן בעלי חיים stereotaxic עם בעל חיים (ראה חומרים וציוד).
- להתאים את המיקום של המיקרוסקופ המשקפת ליד מכשיר stereotaxic להתמקד על פני השטח של הגולגולת של החיה.
- באמצעות מיקרוסקופ משקפת, לאתר את נקודת גבחת על הגולגולת.
- זהה את Region עניין באמצעות קואורדינטות stereotaxic.
הערה: יש להימנע מאותם אזורים של עניין הממוקמים ישירות על כלי קליפת המוח שטחיים. הרס של אלה יכול מאוד להשפיע על התקדמות הטראומה. - מקם את מחט G 30 מעל האזור הנבחר ולסמן את אתר המטרה על ידי מגרד את פני השטח הגולגולת.
- לקדוח את הגולגולת עם כל אמצעי הזהירות האפשרי כדי להימנע מהרחבה מיותרת של שטח פן עצם המושפע. השתמש במקדחה במהירות גבוהה כירורגי (ראה חומרים וציוד) תחת המיקרוסקופ. עצור קידוח אם נוזל מופיע באזור קדח.
- לגעת בתחתית הבאר שנקדחה עם המחט.
- טובלים את המחט בצורה חלקה לתוך המוח (שיעור ההכנסה 5-10 מ"מ / min), לעומק של 0.5-2.0 מ"מ לפי הקואורדינטות של אתר יישום הזין.
- הסר את המחט מייד לאחר שהגיע לעומק הרצוי (שיעור הכחשה 5-10 מ"מ / min) ולנגב את הדם המופיע לאחר הזין עם טמפון קטן (seחומרי דואר וציוד).
- בצע microinjection של 100 מיקרומטר sulforhodamine 101 או תרכובת אחרת של עניין לאתר הנגע באמצעות משאבה microsyringe (WPI) ומזרק 10 μl המילטון להרכיב עם פיפטה מזכוכית.
הערה: במהלך ההכנה של פיפטה הזכוכית מזכוכית הנימים ורוסיליקט, לחדד את הקצה לקוטר של 10-20 מיקרומטר. - להשרות 250-1,500 NL של פתרון ההזרקה בשיעור של 2-5 NL / sec.
הערה: השאר את פיפטה לאחר תום העירוי במשך לפחות 5 דקות בparenchyma המוח, ולאחר מכן להסיר אותו לאט ובעדינות כדי למנוע יצוא פתרון.
- פתיחת גולגולת לחלון גולגולתי כרוני
- מקדחה הגולגולת בעדינות ובזהירות כדי להפוך את חלון עיגול מסביב לאתר פציעה. השתמש בקוטר חלון של 3-3.5 מ"מ.
- החל ירידה של חיץ קליפת המוח (125 mM NaCl, 5 מ"מ KCl, גלוקוז 10 מ"מ, 10 HEPES מ"מ, 2 מ"מ CaCl 2 ו 2 מ"מ MgSO 4 בO 2 H מזוקק) כדי לכסות את window.
- מקם coverslip זכוכית עגול (# 1.5 עובי) על החלון גולגולתי.
- להסיר את העודפים של חיץ קליפה סביב coverslip.
- חותם את הקצוות של coverslip עם דבק polyacrylic (ראה חומרים וציוד).
הערה: ודא שהדבק אינו מוחל על פני השטח העליון של coverslip. אם מכסה הזכוכית מזוהמת עם דבק, לחכות עד שהזכוכית מודבקת ביציבות לגולגולת ואת הדבק על משטח הזכוכית מקבל יבש, ולאחר מכן להסיר בזהירות את הדבק לזהם עם microblade. - מתן 5 דקות כדי לאפשר לדבק להתייבש.
- שימוש בברגי גובה אוזן בר, להתאים את מיקום הראש, כך שניתן למקם את מחזיק המתכת.
- למרוח כמות קטנה של דבק polyacrylic על הטבעת של מחזיק הפלדה (ראה חומרים וציוד).
- הדבק את הטבעת של מחזיק הפלדה לcoverslip הזכוכית עם ידית מתכת בעל מופנה לאחור.
- מתן 5 דקות כדי לאפשר לדבק להתייבש.
- Mix מלט שיניים (ראה חומרים וציוד) עם דבק polyacrylic בצלחת פטרי 3.5 סנטימטר (או אנלוגית) כדי להשיג תנאים צמיגות.
- לאטום את הגבולות של החלון גולגולתי עם תערובת הדבק + המלט ולכסות את פני השטח החשופים של הגולגולת עם אותה התערובת עד לגבול העור.
- חכה 15 דקות כדי לאפשר לתערובת הדבק + המלט תתייבש ולאחר מכן להסיר את סורגי אוזן.
- לבצע הדמיה שני פוטונים מיקרוסקופיים עירור (TPEM) לאזור של עניין ואזור בקרה כפי שהוא מתואר בפרוטוקול 3.
- לאחר הדמיה, מאפשר לבעלי החיים להתאושש מהרדמה על כרית חימום ולשמור אותו בכלוב נפרד תחת השגחה עד להחלמה מלאה. ניתן לתת מזון רטוב כדי להקל על לעיסה ולחות.
2. פגיעה מוחית הדמיה באמצעות הגולגולת הדלילה
- מרדים בעלי חיים ומכין את שדה הפעולה
- להרדים את העכבר ולהכין אותו לזירוז טראומהכפי שמתואר בשלב 1.1.
- דילול בגולגולת ובגרימת פציעת הזין
- מקם מכשיר קטן בעלי חיים stereotaxic עם בעל החיים (ראה חומרים וציוד).
- להתאים את המיקום של מיקרוסקופ משקפת ליד מכשיר stereotaxic להתמקד פני הגולגולת של בעלי החיים.
- לאתר את נקודת גבחת על הגולגולת באמצעות מיקרוסקופ המשקפת, לזהות את האזור במוח להיות צילם מבוסס על קואורדינטות stereotactic ולסמן אותו על ידי גירוד.
הערה: עמדה דלילה גולגולת לא צריכה להיות ממוקמת מעל או בקרבת מקום תפרי גולגולת, כמו יציבות הגולגולת נפגעת באזורים אלו. יתר על כן, כלי קליפת המוח או קרום מוח גדול וקרומי מוח הממוקמים מתחת לתפרי הגולגולת עלולים לגרום לממצאי הדמיה. - הנח את מחזיק המתכת מצופה בדבק על פני השטח של ריבית על הגולגולת של החיה, להפעיל לחץ קל ולחכות 5 דקות עד שבעל המתכת מודבק היטב לגולגולת. מערבבים מלט שיניים (ראה חומרים וציוד) עם דבק polyacrylic בצלחת פטרי 3.5 סנטימטר (או אנלוגית) כדי להשיג תנאים צמיגות.
- לאטום את גבולותיו של מחזיק המתכת עם תערובת הדבק + המלט ולכסות את פני השטח החשופים של הגולגולת עם אותה התערובת עד לגבול העור.
- חכה 15 דקות כדי לאפשר לתערובת המלט והדבק יתייבשו.
- יש לשטוף את אזור הגולגולת דליל וחלקים שמסביב של בעל המתכת מספר פעמים עם PBS, כך שהשאריות של דבק nonpolymerized נשטפות.
הערה: זה חיוני כדי להבטיח התקשרות יציבה של גולגולת לבעל. זה מאפשר יציבות ההכנה במהלך הדמיה. - שימוש במצב בהגדלה הגדול של המיקרוסקופ המשקפת, להסיר שכבות העליונות של עצם הגולגולת עם מיקרו תרגיל במהירות גבוהה כדי ליצור אזור גולגולת דליל של ~ 0.5-1.5 מ"מ קוטר. השתמש באוויר דחוס במהלך קידוח כדי להסיר את פסולת העצם. לבצע את קידוח intermittently במהלך ההליך הדליל על מנת למנוע התחממות יתר הנגרם חיכוך. לקרר את המקדח באמצעות פתרון טמפרטורת חדר ומעת לעת להחיל חיץ לאזור דליל לספוג חום.
הערה: כדי למנוע נזק לקליפת המוח, לא לקדוח מעל אזורים גדולים (> 1.5 מ"מ) עד לשכבה דקה (<50 מיקרומטר).
הערה: מבנה עצמות גולגולת מכרסמים מורכב משתי שכבות דקות של עצם קומפקטי מופרדות על ידי שכבה עבה של עצם ספוגי. חללים זעירים של צורת עצם המעגלים קונצנטריים הספוגיות ונקבות, אשר מכילים כלי דם. השתמש microdrill להסיר הן את שכבת עצם קומפקטי החיצונית ורוב השכבה הספוגית. הפרעה של כלי הדם בתוך העצם הספוגי עשויה לגרום לדימום. השתמש בספוג קולגן עצירת דימום כדי לעצור את הדימום הזה. - השתמש בהדמית הדור השנייה הרמוני (SHG) לבחון האם רובו של העצם הספוגי הוסר. להיות זהיר, כדי למנוע דילול מוגזם, לוודא כי העצם שנותר הוא הicker מ -50 מיקרומטר בשלב זה של ההכנה.
- שים טיפה של חיץ חם (C ° 35-37) על גבי האזור דליל. השתמש בלהב microsurgical או מיקרו גימור Bur להסיר עוד שכבות עצם וליצור אזור חלק של ~ 700 מיקרומטר בקוטר עם עובי עצם של ~ 20 מיקרומטר. במהלך שלב זה, כדאי לבצע הדמיה SHG חוזר על עצמו ולמדוד באופן קבוע את עובי העצם.
- לבצע הדמיה TPEM לאזור של עניין ואזור בקרה.
- התאם את מיקום הראש באמצעות ברגי גובה אוזן בר בצורה כזו שדללה אזור ממוקם בצורה אופקית בקפדנות. מקם את המחט מעל האזור דליל ולוודא שאין כלי גדול מתחת לאתר הממוקד.
- הפוך נגע על ידי טבילה את המחט לתוך המוח, לעומק של 0.5-2.0 מ"מ ממשטח גולגולת דליל ולפי הקואורדינטות של אתר יישום הזין.
- הסר את המחט ולדכא את הדימום המופיע לאחר tהוא אקוטי פגיעה מוחית עם טמפון עוצר דמום (ראה חומרים וציוד). חכה עד שצורת קרישי דם ופעימת אונייה באתר הפציעה מפסיקה.
- בצע microinjection של 100 מיקרומטר sulforhodamine 101 או תרכובת אחרת של עניין לאתר הנגע, כפי שתואר לעיל בסעיף 1.2.10.
- לבצע הדמיה TPEM כדי לפקח על התקדמות פציעה והתאוששות כפי שתואר בפרוטוקול 3.
- לאחר הדמיה, מאפשר לבעלי החיים כדי להכרה מהרדמה על כרית חימום. אל תשאיר את בעלי החיים ללא השגחה ולהחזיר אותו לכלוב בביתה רק לאחר התאוששות פיזית מלאה.
3. הדמיה
- מניחים את החיה מתחת למיקרוסקופ על ידי הצמדת למחזיק המתכת למסגרת הבנויה המותאם אישית.
- עבור הדמיה, השתמש למשל מיקרוסקופ שני הפוטונים FV1000MPE מצוידים בליזר מאי טאי DeepSee ו1.05 מטרת טבילה במי XLPLN 25X NA מותאמת לin vivo שני פוטוניםהדמיה.
- זהה את אתר הנגע תחת מיקרוסקופ באמצעות מצב הקרינה רחב בתחום. להשתמש במסנני מסירה ארוכים כדי לחזות בכלי דם במוח ובחר את אזור השליטה על פי הדפוס שנצפה של כלי דם.
- לתמונה את אות דור הרמוני השני (SHG), לכוון את לייזר femtosecond לגל 800 ננומטר ולאסוף את האור הנפלט באמצעות 380-410 ננומטר עוקף המסנן. עבור דימות פלואורסצנטי, השתמש במסנן מעביר להקה (515-560 ננומטר) כדי לאסוף את האור הנפלט, ואורכי הגל הבאים משמשים כדי לעורר את הקרינה: ה-GFP-860 ננומטר, YFP-950 ננומטר.
- השתמש בתוכנת FluoView לרכישת תמונה.
- חנות קואורדינטות של כל החזר על השקעה עבור הדמיה חוזר על עצמו לאחר מכן. תמונה זהה ROIs לאורך זמן, ולהתאים את קואורדינטות בכל פעם על מנת למקסם את החפיפה התמונה.
- ניתוח תמונות עם התוכנה המתאימה (למשל. ImageJ). שחזורים המוצגים כאן נעשו שימוש בתוכנת Imaris.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
יש לנו אופטימיזציה שני הליכי פעולה: 1) חלון כרוני גולגולת ו2) דלילה גולגולת, להדמיה מוחית פוסט טראומטית בעכברים מהונדסים. בתצוגה סכמטית של ההכנות הניסיוניות מוצגת באיור 1. זין טראומטי על ידי מחט פלדה של OD 0.3 מ"מ (30 G) מוחל (איור 1 א) גם נקדח. חלון הכנת גולגולת מוצלחת מאפשרת הדמיה בעומקים עד 650 מיקרומטר מתחת לפני השטח pial (איור 1), ואילו דילול גולגולת נוטה להטיל מגבלה של כ 300 מיקרומטר (איור 1 ג), כפי שמודגמת בשחזור 3D של Thy1-YFP- נוירונים פירמידליים בקליפת המוח עכבר H.
תוצאות טראומת זין בחיסול של דנדריטים והרס של רשתות נימים בנפח מבוקר של קליפת המוח. במהלך היומיים הראשונים, באזור הנגע גדל וblebbing הטראומה הנגרם דנדריט והיווצרות של b הכחשה הדנדריטיםulbs באזורי perilesion, כפי שנצפה באמצעות מיקרוסקופ בmultiphoton vivo (איור 2).
ביצענו גולגולת דליל להפעלת תמונה והגירה של מיקרוגליה בעכברי CX3CR1-EGFP מייד לאחר (איור 3 א) פציעה. ההדמיה SHG מציעה כלי רב ערך כדי לשרטט במדויק את אתר פציעה (איור 3 ב). מולקולות מטריצה תאית המייצרות אותות SHG מועשרות מאוד בparenchyma המוח בטראומת הזין. ראשית, תהליכי microglial משובחים להיאסף, ולאחר מכן תאי microglial להגר לגבול של פגיעה באתר (איור 3 א).
להעריך פציעות פוטנציאליות הנגרמות על ידי החדרת פיפטה זכוכית דקה ואספקה של צבע, שאנו מבצעים בניסויי vivo שני פוטונים במיקרוסקופ עם sulforhodamine 101 microinjection בעכברי Thy1-YFP-H בלי טראומה מוחית. נציג תמונות מוצגות באיור 4 מדגימות מילאתר croinjection 3 שעות לאחר הזרקה. שמץ של הכנסת פיפטה ניתן לראות בקרומי מוח המוח דמיינו ידי SHG (איור 4 א). האסטרוציטים מסומנים עם Sulphorhodamine 101 הוצג על ידי ההזרקה (איור 4). דנדריטים מבטאים YFP תחת אמרגן Thy1 לא להפגין סימנים מורפולוגיים של פציעה כמו נורות blebbing או הכחשה (איור 4 ג).
איור 1. השיטה של פגיעה מוחית חריפה בשילוב עם חלון גולגולתי או תכשירי גולגולת דקים בשילוב עם מיקרוסקופ שני פוטונים in vivo. זין טראומטי. ידי מחט פלדה של 0.3mm OD (30G) פנה למתורגל היטב. המחט היא שקועה בקצרה לתוך מוח מ"מ 0.5-2 העמוק מתחתית הבאר. B, C ד (ג). תצוגה מוארת תחום כלי דם השטחי מבעד לחלון הזכוכית מייד לאחר הפגיעה המוחית חריפה. E. דליל גולגולת לפני יישום פציעה. האזור שנבחר עניין (מסגרת לבנה) ואתר דקירת יישום (העיגול אדום). אזור אחר (מסגרת אדומה) של האזור דליל צריך להיות צילם כדי לפקח על חפצים-Induced ניתוח אפשריים.
איור 2. דוגמא להדמית multiphoton אורך של פיתוח טראומת מוח דרך הגולגולת דליל. . כדיצפה בעמ 'של הפגיעה באתר מוקף בדנדריטים שכותרת YFP של נוירונים בקליפת המוח 20 דקות לאחר גרימת טראומה, כפי שצלם דרך הכנת הגולגולת דליל. ב'. תצוגה מוגדלת של האזור המוגדר בפנל. C. באותו האזור של המוח, כמו בB, reimaged 5 ימים לאחר הטראומה. blebbing דנדריט מוצג עם חצים לבנים, פקעות הכחשה הדנדריטים - עם חצים אדומים.
איור 3. דוגמאות של דלקת ניטור והפעלת גליה במהלך ההתפתחות של טראומה מוחית באמצעות סמנים שונים המתאימים בחלבוני vivo הדמיה multiphoton למשל ניאון, צבעים, ואות דור שנייה הרמוני. התמונות נרכשו 3 שעות לאחר הפגיעה המוחית.
איור 4. בחינת השפעת הרקמה שנעשתה על ידי הזרקת פתרון באמצעות micropipette זכוכית. . עקבות (shown עם קו מקווקו) בSHG לדמיין קרומי המוח מוח 3 שעות לאחר הזרקה. ב '. האסטרוציטים שכותרתו עם sulphorhodamine הוצגו על ידי ההזרקה. C. דנדריטים מבטאים YFP תחת אמרגן Thy1. ד. תמונה משולבת של (SHG - אפור), B (האסטרוציטים - אדומים), C (דנדריטים עצביים - צהובים).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
טראומה מוחית היא אירוע פתאומי, בלתי צפוי. כאן, אנו מתארים את מודל החיה שמתרבה ספקטרום של שינויים פתולוגיים שנצפו בחולים אנושיים לאחר פגיעה מוחית כגון ניוון מוחיים, חיסול של דנדריטים, בצקת במוח, צלקת גליה, דימומים בקליפת המוח בשילוב עם דימום תת עכבישי מוקד וחדירות מוגברות של מחסום דם מוח. ללמוד פתוגנזה ראשית ומשנית, כמו גם התאוששות לאחר טראומה, מודל פציעה זה היה בשילוב עם אורכי בהדמית vivo של עצבי עדינים ומבני גליה. קווי עכבר מהונדסים שימשו המבטאים חלבוני ניאון בתאי עצב (Thy1-YFP-H) 7, האסטרוציטים (GFAP-EGFP) 8, או מיקרוגליה (CX3CR1-EGFP) 9. בנוסף, אנו משמשים דור שני הרמוני הדמיה (SHG) וטעינת astrocyte עם Sulfarhodamine 101 10.
המודל שתואר כאן משחזר פןסוג trating של פגיעה מוחית. לכן הגבלה של המודל הנוכחי היא שזה לא מספק מידע על מנגנונים של פגיעת ראש סגורה. לאחרונה חרב ועמיתים דיווחו על תוצאות ההדמיה multiphoton על התנהגות תא בpericontusional קליפת 6. אם ניקח בחשבון שנסגר פגיעת ראש הוא מקרה רפואי תכוף יותר, הגישה המתודולוגית שדווחה על ידי המחברים מבטיחה ביותר כדי להשלים את שיטות מחקר מסורתיות בתחום של טראומה מוחית השפעת 11.
אנחנו השתמשנו בשני החלון הכרוני גולגולת 12 והגולגולת הדליל 13 הכנות ללמוד התנהגות תא בתנאי פוסט טראומתיים בחיים מוח. שני שיטות יש יתרונות ומגבלות מסוימים. לכן, החלון גולגולתי הכרוני מספק רזולוציה טובה יותר, חדירה אופטית עמוקה יותר לתוך רקמת המוח והנוחות לפגישות הדמיה מרובות. לעומת זאת, דילול גולגולת הוא פחות סביר לגרום לדלקת בהאתר דואר הדמיה, ואולי יותר חשוב, זה מאפשר ליישומים חוזרים ונשנים של תרופות וצבעים. כמה דוגמאות של סוכנים תרופתיים להיות מיושמים בסוג זה של ניסויים מוצגות בטבלה 1.
| סוג של סוכן | סוכן שהוחדר | תחומי מחקר בביולוגיה / בית מרקחת |
| אנטי דלקתי | ציקלוספורין | פגיעה מוחית טראומטית, נזק משני, ניוון מוחיים |
| רעלים | Tetrodotoxin | TBI - נזק המשני, excytotoxicity |
| Bicuculline | TBI - נזק המשני, הומאוסטזיס כלוריד | |
| מעכבים של מסלולי איתות | PD98059 (מעכב MAPKK) | איתות מנגנונים של דלקת, נזק המשני, מוות של תאי פוסט טראומתיים, ניוון מוחיים והתחדשות |
| SU6656 (מעכב קינאז משפחת Src) | ||
| גורמי neurotrophic | גורם נוירוטרופי שמקורם במוח, BDNF | TBI - הישרדות עצבית לאחר פציעה, neuroprotection בנזק מוחי פוסט טראומטי המשני |
| וירוסים | וקטורי lentiviral לביטוי חלבון | מנגנונים מולקולריים של ניוון מוחיים והתחדשות פוסט, תיוג ההפרש של סוגי תאים במוח שנפגע לin vivo הדמיה |
| וקטורי adenoviral לביטוי חלבון | ||
| Ca 2 + אינדיקטורים ניאון | Fluo-2, 4 | , מוות של תאים, נדידת תאים, אקסון / התחדשות הדנדריטים איתות מנגנונים של דלקת פוסט טראומטית |
טבלת 1. סוכנים תרופתי וצבעים להזרקה בקליפת המוח במודל פציעת דקירה.
מגוון רחב של אירועים ביוכימיים, כי הם חשובים מאוד בתנאים פיסיולוגיים ופתולוגיים יכול להיות נחקר עם מעכבים כימיים, אינדיקטורים ניאון וחלבון המוטציה הציגו באמצעות מבנים נגיפיים. יתרונות לבחירת חלון זמן מסוים הניתנים על ידי ההכנה דלילה גולגולת עשויים להיות רלוונטיים מאוד ללימודים אלה.
במחקר הנוכחי, השתמשנו אות דור שנייה הרמוני להתוות לאתר פציעה. לחלופין, גבולות אתר פציעה יכולים להיות מצויינים על ידי צבע פלואורסצנטי בחולשה לשדר, למשל המצומד משקל מולקולרי גבוה dextran ניאון (2 מיליון דלתון).
לאחרונה, שפר ועמיתים 14 השתמשו הכנה כרוניתעם חלון גולגולתי reopenable למסירה חוזרת ונשנית של צבעי ניאון לקליפת מוח עכבר. סביר להניח כי חלון פתיחת גולגולת עלולה להשפיע לרעה על שקיפות רקמת המוח. יתר על כן, קשה לחזות את המהלך של הדלקת הנגרמת פתיחתו מחדש, אשר עשוי להשפיע על צמיחה מחודשת של רקמת חיבור הזמן.
אחד יתרונות עיקריים של הכנת הגולגולת דליל הוא האפשרות לספק תרכובות טיפוליות (וחומרים אחרים הדורשים הזרקה מקומית לרקמת מוח) מספר פעמים במהלך ההתקדמות של הטראומה, בלי מסבך את החפצים (למשל ללא חלון גולגולתי פתיחתו מחדש).
אם משלוח מתחם חוזר על עצמו באופן ישיר לאתר הפציעה הוא רצוי, יש לשקול אמצעים מיוחדים כדי למנוע יבש מתוך גולגולת וזיהום חיידקים. לכן, שמירה על אזור הראש פעל בתנאים ויישום של אנטיביוטיקה (כגון Enrofloxacin) סטרילי מומלץ. כדי לשמר את thinned אזור גולגולת מייבוש, למלא את מחזיק המתכת עם agarose 1.5% ולכסות אותו עם coverslip זכוכית עגול. ברוב המקרים זה יאפשר שמירה על אותה שקיפות או גולגולת דלילה בהשוואה לתקופה של עד 10 ימים. חלק נוסף יש לנקוט אם פגישות הדמיה מרובות בהכנת הגולגולת דליל מתוכננות על פני תקופה ממושכת של זמן. מייד לפני כל פגישת הדמיה, בעדינות להסיר את רקמת חיבור החדש שנוצרה מהאזור דליל באמצעות סכין microsurgical. השתמש בהדמית TPEM של SHG לאמת עובי עצם איכות תמונה ומידה. צמיחה מחודשת של רקמות עלולה לפגוע בעומק החדירה ותמונת גורם טשטוש מלווה בעלייה בקרינת הרקע. רענן הגולגולת הדליל בעדינות עם להב microsurgical להחזיר לעצמו איכות הדמיה גבוהה.
באותם מקרים שאינם דורשים גישה ישירה לאתר פציעה, אנו ממליצים בחום המכסים את האזור דליל של הגולגולת עם coversli זכוכיתעמ ', כמתואר במאמר על מלוטש וחיזק דליל הכנת גולגולת על ידי קליינפלד ועמיתים 15. זה יכול להיעשות באמצעות ההליך האופציונלי הבא. מקום טיפה קטנה של agarose (1.5%) באזור הגולגולת דליל, לחכות עד שזה הופך לג'ל, להסיר את כל agarose המיותר, כלומר להשאיר אותו רק באתר הפציעה. Agarose צריך להגן על הפגיעה באתר מהשפעות חיצוניות. ייבש את אזור הגולגולת דליל באמצעות אוויר דחוס. זרוק כמות קטנה של דבק polyacrylic על פיסה קטנה של # 0 coverglass ולמקם אותו באזור הגולגולת דליל. דבק polyacrylic מונע עצם וצמיחה מחודשת של רקמת חיבור, ובכך שמירה על הגולגולת דליל מתחת לחלון השתמר.
שילוב של נהלים אלה מאפשר לחקור תהליכי פוסט טראומתיים אקוטיים וכרוניים, מתן תרופות למריחה או מערכתי ובאופן ישיר ניטור השפעות הטיפול. שימוש בקווי עכבר מהונדסים כפולים או משולשים יכול גם להיות מועיל, Particularly הדמיה בו זמנית של תהליכי פוסט טראומתיים מרובים, כגון היווצרות צלקת גליה וצמיחה מחודשת של הסניף עצבית. אנו מצפים המודלים של פגיעה מוחית חריפה שלנו למדו עם שני הפוטונים במיקרוסקופ intravital להוכיח פורה לבדיקת מועמד תרופה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
יש המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
אנו אסירי תודה לד"ר פרנק קירכהוף למתן GFAP-EGFP וזני עכבר CX3CR1-EGFP. העבודה נתמכה על ידי מענקים ממרכז ניידות הבינלאומית של פינלנד, טקס, בית הספר פיני בוגר מדעי המוח (FGSN) והאקדמיה של פינלנד.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2A-sa dumb Tweezers, 115 mm | XYtronic | XY-2A-SA | |
| 30 G ½ in needle | BD | REF 304000 | |
| Animal trimmer, shaving machine | Aesculap | Isis GT420 | |
| Binocular Microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
| Biological Temperature Controller with stainless steel heating pad | Supertech | TMP-5b | |
| Blunt microsurgical blade | BD | REF 374769 | |
| Borosilicate tube with filament | Sutter Instruments | BF120-69-10 | For glass pipette production |
| Carprofene | Pfizer | Rimadyl vet | |
| Chlorhexidine digluconate | Sigma | C9394 | |
| Dental cement | DrguDent, Dentsply | REF 640 200 271 | |
| Dexamethasone | FaunaPharma | Rapidexon vet | |
| Disposable drills | Meisinger | HP 310 104 001 001 008 | |
| Dulbeco’s PBS 10x | Sigma | D1408 | |
| Dumont #5 forceps, 110 mm | FST | 91150-20 | |
| Ealing microelectrode puller | Ealing | 50-2013 | Vertical puller for glass pipette production |
| Eye ointment | Novartis | Viscotears | |
| Foredom drill control | Foredom | FM3545 | |
| Foredom micromotor handpiece | Foredom | MH-145 | |
| Gas anesthesia platform for mice | Stoelting | 50264 | Assembled on stereotaxic instrument |
| Hemostasis Collagen Sponge | Avitene, Ultrafoam BARD | Ref 1050050 | |
| Imaris | Bitplane | ||
| Ketamine | Intervet | Ketaminol vet | |
| Mai Tai DeepSee laser | Spectra-Physics | ||
| Metal holder | Neurotar | ||
| Microdressing forceps, 105 mm | Aesculap | BD302R | |
| Microfil | WPI | MF34G-5 | Micro syringe filling capillaries |
| Mineral oil | Sigma | M8410 | |
| Multiphoton Laser Scanning Microscope | Olympus | FV1000MPE | |
| NanoFil Syringe 10 μl | WPI | NANOFIL | Hamilton syringe |
| Nonwoven swabs 5 x 5 | Molnlycke Health Care | Mesoft | Surgical tampons |
| Polyacrylic glue | Henkel | Loctite 401 | |
| Round glass coverslip | Electron Microscopy Sciences | ||
| 1.5 thickness | |||
| Small animal stereotaxic instrument | David Kopf Instruments | 900 | |
| Stoelting mouse and neonatal rat adaptor | Stoelting | 51625 | Assembled on stereotaxic instrument. |
| Student iris scissors, straight 11.5 cm | FST | 91460-11 | |
| Sulforhodamine 101 | Molecular Probes | S-359 | |
| UMP3 microsyringe pump and Micro 4 microsyringe pump controller | WPI | UMP3-1 | Microinjector and controller |
| Xylazine | Bayer Health Care | Rompun vet |
References
- Lighthall, J. W. Controlled cortical impact: A new experimental brain injury model. J. Neurotrauma. 5 (1), 1-15 (1988).
- Lindgren, S., Rinder, L.
- Shreiber, D. I., et al. Experimental investigation of cerebral contusion: histopathological and immunohistochemical evaluation of dynamic cortical deformation. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 58 (2), 153-164 (1999).
- Feeney, D. M., Boyeson, M. G., Linn, R. T., Murray, H. M., Dail, W. G. Responses to cortical injury: I. Methodology and local effects of contusions in the rat. Brain Res. 211 (1), 67-77 (1981).
- Bardehle, S., et al. Live imaging of astrocyte responses to acute injury reveals selective juxtavascular proliferation. Nat. Neurosci. 16 (5), 580-586 (2013).
- Sword, J., Masuda, T., Croom, D., Kirov, S. A. Evolution of neuronal and astroglial disruption in the peri-contusional cortex of mice revealed by in vivo two-photon imaging. Brain. 136 (5), 1446-1461 (2013).
- Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
- Nolte, C., et al. GFAP promoter-controlled EGFP-expressing transgenic mice: a tool to visualize astrocytes and astrogliosis in living brain tissue. Glia. 33 (1), 72-86 (2001).
- Jung, S., et al. Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion. Mol. Cell. Biol. 20 (11), 4106-4114 (2000).
- Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Kerr, J. N. D., Helmchen, F. Sulforhodamine 101 as a specific marker of astroglia in the neocortex in vivo. Nat. Methods. 1 (1), 31-37 (2004).
- Carré, E., et al. Technical aspects of an impact acceleration traumatic brain injury rat model with potential suitability for both microdialysis and PtiO2 monitoring. J. Neurosci. Methods. 140, 23-28 (2004).
- Holtmaat, A., et al. Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nat. Protoc. 4 (8), 1128-1144 (2009).
- Yang, G., Pan, F., Parkhurst, C. N., Grutzendler, J., Gan, W. B. Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice. Nat. Protoc. 5, 201-208 (2010).
- Cianchetti, F. A., Kim, D. H., Dimiduk, S., Nishimura, N., Schaffer, C. B. Stimulus-evoked calcium transients in somatosensory cortex are temporarily inhibited by a nearby microhemorrhage. PloS one. 8 (5), (2013).
- Shih, A. Y., Mateo, C., Drew, P. J., Tsai, P. S., Kleinfeld, D. A polished and reinforced thinned-skull window for long-term imaging of the mouse brain. J. Vis. Exp. 61, (2012).
