Summary
Trauma cerebral aguda é uma lesão grave que não tem tratamento adequado à data. Microscopia Multiphoton permite estudar longitudinalmente o processo de desenvolvimento agudo trauma cerebral e sondagem estratégias terapêuticas em roedores. Dois modelos de trauma cerebral aguda estudou com in vivo de dois fótons de imagem de cérebro são demonstrados neste protocolo.
Abstract
Embora trauma cerebral aguda muitas vezes resulta de danos à cabeça em diferentes acidentes e afeta uma fração substancial da população, não existe um tratamento eficaz para ele ainda. Limitações dos modelos animais usados atualmente impedem a compreensão do mecanismo de patologia. Microscopia Multiphoton permite o estudo de células e tecidos dentro cérebros de animais intactos longitudinalmente sob condições fisiológicas e patológicas. Aqui, descrevemos dois modelos de lesão cerebral aguda estudados por meio de dois fótons de imagem de comportamento das células do cérebro em condições pós-traumáticas. A região do cérebro selecionado é ferido com uma agulha fina para produzir um trauma de largura controlada e profundidade no parênquima cerebral. O nosso método utiliza estereotáxico picada com uma agulha de seringa, que pode ser combinado com a aplicação simultânea de drogas. Propomos que este método pode ser utilizado como uma ferramenta avançada para estudar os mecanismos celulares de consequências fisiopatológicos de traumas agudos no cérebro dos mamíferos
Introduction
Lesão cerebral aguda é um problema significativo de saúde pública, com alta incidência de lesões em acidentes de trânsito, quedas ou agressões, e alta prevalência de incapacidade crônica subseqüente. As abordagens terapêuticas para o tratamento de lesões cerebrais permanecem totalmente sintomático, limitando assim a eficácia do atendimento pré-hospitalar, cirúrgico e crítico. Isso faz com que o impacto social e econômico da lesão cerebral particularmente grave. Por uma variedade de razões, a maioria dos ensaios clínicos não demonstraram melhoria na recuperação após a lesão cerebral usando novas abordagens terapêuticas.
Os modelos animais são cruciais para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas para uma fase em que a eficácia da droga pode ser previsto em pacientes com lesões cerebrais. Atualmente, existem vários modelos animais bem estabelecidos de traumatismo craniano, incluindo o impacto controlado cortical 1, o fluido lesão percussão 2, dinâmico deformação cortical 3, peso-drop4 e lesão foto 5. Uma série de modelos experimentais têm sido utilizados para estudar certos aspectos morfológicos, moleculares e comportamentais de cabeça associada a trauma patologia. No entanto, nenhum modelo animal único é totalmente bem-sucedido na validação de novas estratégias terapêuticas. Desenvolvimento de modelos animais confiáveis, reprodutíveis e controladas de lesão cerebral é necessário avaliar os processos patológicos complexos.
A nova combinação das mais recentes tecnologias de imagem microscópica e repórteres fluorescentes geneticamente codificados oferece uma oportunidade sem precedentes para investigar todas as fases da lesão cerebral, que incluem lesão primária, espalhando-se da lesão primária, a lesão secundária e regeneração. Em particular, in vivo microscopia de dois fótons é uma tecnologia óptica não-linear única que permite a visualização em tempo real das estruturas celulares e subcelulares mesmo em profundas camadas corticais do cérebro de roedores. Vários tipos de células e organelles podem ser visualizados simultaneamente, combinando diferentes marcadores fluorescentes. Usando essa poderosa ferramenta, podemos visualizar as alterações morfológicas e funcionais dinâmicos no cérebro vivendo sob condições pós-traumáticas. As vantagens da microscopia in vivo de dois fótons em estudar lesão cerebral foram recentemente demonstrado pelo Kirov e colegas 6. Usando um modelo de contusão cortical focal leve, estes autores mostraram que a lesão dendrítica aguda no córtex pericontusional é fechado pela diminuição do fluxo sanguíneo local. Além disso, demonstraram que o córtex metabolicamente comprometida em torno do local contusão é mais danificado pela despolarização espalhar. Este dano secundário afeta circuitos sinápticos, tornando as conseqüências da lesão cerebral traumática mais grave.
Aqui, propõe-se o método de picada estereotáxico com uma agulha de seringa, que pode ser combinado com a aplicação tópica de drogas em simultâneo, como um modelo avançado para o local do cérebrolesão e como uma ferramenta para estudar as consequências fisiopatológicas do trauma agudo no cérebro de mamíferos in vivo.
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Protocol
Todos os procedimentos aqui apresentados foram realizados de acordo com a orientação local para cuidar dos animais (A lei finlandesa de Experimentação Animal º 62/2006). Licença Animal (ESAVI/2857/04.10.03/2012) foi obtida de autoridade local (ELÄINKOELAUTAKUNTA-ELLA). Camundongos adultos de 1-3 meses de idade, peso 24-38 g, foram mantidos em gaiolas individuais no biotério da Universidade de certificado e desde que com comida e água ad libitum.
1. Lesão Cerebral de imagem através de uma janela Cranial
- Anestesiar animais e preparar o campo de operação
- Anestesiar os ratos por injecção peritoneal de uma mistura de cetamina (Ketalar, 80 mg / kg) e xilazina (Rompun, 10 mg / kg) dissolvido em solução salina tampão de fosfato, esterilizada por filtro (PBS), pH 7,4. Confira os reflexos do rato regularmente (cauda e sonda pitada tep) para verificar a profundidade da anestesia. Aumentar a dose se necessário, para manter a anestesia adequada, mas evitar Overdose.
- Manter o animal a 37,0 ° C utilizando uma almofada de aquecimento durante a operação cirúrgica, sessão de imagem e primeira hora após a recuperação da anestesia.
- Para proteger os olhos do rato de secar, aplique um lubrificante ocular.
- Administrar dexametasona (veterinário Rapidexon, 2 mg / kg) por injecção subcutânea para reduzir a inflamação e edema cerebral.
- Administrar um analgésico (por exemplo, por via intraperitoneal Ketoprophene) até 30 minutos antes ou imediatamente após a cirurgia. Se o animal apresenta quaisquer sintomas de dor, como a relutância em se movimentar, comer ou beber, ou perda de peso, salivação, piloereção, ou respiratória sons anormais após a cirurgia, repetir a injeção de analgésico.
- Raspar a cabeça de rato ", com uma máquina de barbear (ver Materiais e Equipamentos). Evite danificar os bigodes.
- Tratar a pele na cabeça do rato com uma solução de etanol 70% para limpar a área raspada.
- Usando uma tesoura cirúrgica (ver Materiais eEquipamentos) e fórceps (ver Materiais e Equipamentos), corte a pele da linha média entre as orelhas para a testa.
- Delicadamente raspar o tecido conjuntivo ligado ao crânio com uma lâmina microcirúrgica contundente.
- Deslize fronteiras de pele de lado e puxe barras de ouvido ligeiramente em orifícios auditivos do crânio para a cabeça e fixação da pele.
- Limpe o crânio com PBS estéril e tratar o local da cirurgia na cabeça do rato com 0,5% de digluconato de clorexidina, em seguida, secar a superfície do crânio usando uma combinação de cotonetes estéril e ar comprimido.
- Infliction da lesão picada
- Posicione um animal pequeno instrumento estereotáxico com um suporte de animais (ver Materiais e Equipamentos).
- Ajustar a posição do microscópio binocular ao lado do instrumento estereotáxico para focar na superfície do crânio do animal.
- Utilizando um microscópio binocular, localizar o ponto bregma no crânio.
- Identificar a region de interesse, utilizando as coordenadas estereotáxica.
NOTA: Evite as áreas de interesse que estão localizados diretamente sobre os vasos corticais superficiais. Destruição destes pode afetar fortemente a progressão trauma. - Posicione a agulha 30 G acima da região escolhida e marcar o local de destino, arranhando a superfície do crânio.
- Perfurar o crânio com todas as precauções possíveis para evitar a ampliação desnecessária da superfície osso afetado. Use uma broca cirúrgica de alta velocidade (ver Materiais e Equipamentos) sob o microscópio. Pare de perfurar se líquido aparece na área perfurada.
- Tocar no fundo do poço perfurado com agulha.
- Mergulhar a agulha suavemente no cérebro (taxa de inserção 5-10 mm / min), para a profundidade de 0,5-2,0 mm, de acordo com as coordenadas do local de aplicação da picada.
- Remova a agulha imediatamente após atingir a profundidade desejada (taxa de retração 5-10 mm / min) e limpar o sangue que aparece após a picada com um pequeno tampão (see Materiais e equipamentos).
- Realize microinjeção de 100 M Sulforodamina 101 ou outro composto de interesse para o local da lesão usando uma bomba de micro-seringa (WPI) e 10 mL Hamilton seringa montar com pipeta de vidro.
NOTA: Durante a preparação da pipeta de vidro de borosilicato capilar de vidro, aguçar a ponta de um diâmetro de 10-20 m. - Infundir 250-1,500 nl de solução de injecção a uma taxa de 2-5 nl / seg.
NOTA: Deixe a pipeta após o término da infusão por pelo menos 5 minutos em parênquima cerebral, em seguida, removê-lo devagar e com cuidado para evitar a solução de saída.
- Craniotomia para janela craniana crônica
- Fure o crânio delicadamente e com cuidado para fazer uma janela de círculo em torno do local da lesão. Use diâmetro janela de 3-3,5 mm.
- Aplicar uma gota de tampão de córtex (NaCl 125 mM, KCl 5 mM, glicose 10 mM, HEPES 10 mM, CaCl2 2 mM e 2 mM de MgSO4 em H2O destilada) para cobrir o window.
- Coloque uma lamela de vidro redondo (# 1.5 espessura) na janela craniana.
- Remover o excesso de tampão de córtex em torno da lamela.
- Selar as bordas da lamínula com cola poliacrílico (ver Materiais e Equipamentos).
NOTA: Assegurar que a cola não é aplicada à superfície superior da lamela. Se a tampa de vidro está contaminado com cola, espere até que o vidro é estavelmente colado ao crânio e a cola na superfície do vidro fica seca, em seguida, retire cuidadosamente a cola contaminar com uma micro-lâmina. - Aguarde 5 minutos para deixar a cola secar.
- Usando os parafusos altura da barra de ouvido, ajuste a posição da cabeça, de modo que o suporte do metal pode ser colocado.
- Aplique uma pequena quantidade de cola poliacrílico no anel do suporte do aço (ver Materiais e Equipamentos).
- Cole o anel do suporte do aço na lamela de vidro com o punho suporte de metal dirigido para trás.
- Aguarde 5 minutos para deixar a cola secar.
- Mix cimento dental (ver Materiais e equipamentos) com cola poliacrílico em um prato de Petri 3,5 centímetros (ou analógico) para alcançar condições viscosos.
- Selar as bordas da janela craniana com a mistura de cola + cimento e cobrir a superfície exposta do crânio com a mesma mistura até a fronteira da pele.
- Aguarde 15 minutos para deixar a mistura de cola cimento + secar e, em seguida, remover as barras de ouvido.
- Realize dois fótons de excitação microscópica (TPEM) de imagem para a região de interesse e uma área de controle, uma vez que definido no protocolo 3.
- Depois de imagem, permitem que o animal se recuperar da anestesia em uma almofada de aquecimento e mantê-lo em uma gaiola indivíduo sob observação até a recuperação completa. Alimentos úmidos pode ser dada para facilitar a mastigação e hidratação.
2. Lesão Cerebral de imagem através do crânio afinado
- Anestesiar animais e preparar o campo de operação
- Anestesiar o mouse e prepará-lo para a indução do traumatal como descrito na etapa 1.1.
- Crânio afinamento e imposição da lesão picada
- Posicione um animal pequeno instrumento estereotáxico com o suporte do animal (ver Materiais e equipamentos).
- Ajustar a posição de um microscópio binocular ao lado do instrumento estereotáxico para focar na superfície do crânio do animal.
- Localize o ponto bregma no crânio usando o microscópio binocular, identificar a área do cérebro a ser trabalhada com base nas coordenadas estereotaxia e marcá-lo riscando.
NOTA: Crânio posição desbaste não deve ser localizado sobre ou perto suturas cranianas, como a estabilidade crânio é comprometido nessas áreas. Além disso, grandes vasos e meninges localizados abaixo das suturas do crânio corticais ou meninges são susceptíveis de causar artefatos de imagem. - Colocar o suporte metálico revestido com cola ao longo da área de interesse no crânio do animal, aplicar uma ligeira pressão e esperar cinco minutos, até o suporte do metal é firmemente colado ao crânio. Misturar o cimento dental (ver Materiais e Equipamento) com cola poliacrílico em uma placa de Petri de 3,5 cm (ou análogo) para alcançar condições viscosos.
- Selar as bordas do suporte de metal com a mistura de cola + cimento e cobrir a superfície exposta do crânio com a mesma mistura-se até à fronteira da pele.
- Aguarde 15 minutos para deixar o cimento e mistura de cola secar.
- Lavar a região crânio diluído e as partes circundantes de suporte metálico várias vezes com PBS, de modo que os restos de cola nonpolymerized são lavados.
NOTA: É fundamental garantir a fixação estável do crânio ao titular. Isto permite que a estabilidade durante a preparação de imagem. - Usando o modo de alta ampliação do microscópio binocular, remover as camadas superiores do osso do crânio com um micro-broca de alta velocidade para criar uma área de crânio diluído de ~ 0,5-1,5 mm de diâmetro. Use ar comprimido durante a perfuração para remover os escombros do osso. Realize o intermittentl perfuraçãoy durante o processo de desbaste de modo a evitar o sobreaquecimento induzida por fricção. Arrefece-se a broca com a solução à temperatura ambiente e aplicar periodicamente tampão para a zona adelgaçada para absorver o calor.
NOTA: Para evitar danos ao córtex, não perfurar em grandes regiões (> 1,5 mm) até uma camada fina (<50 mm).
NOTA: A estrutura de roedor osso do crânio é constituído por duas camadas finas de osso compacto separadas por uma camada espessa de osso esponjoso. Cavidades minúsculas da forma de osso esponjoso círculos concêntricos e canalículos, que contêm vasos sanguíneos. Utilizar a microdrill para remover tanto a camada externa de osso compacto e mais da camada esponjosa. O rompimento dos vasos sanguíneos dentro do osso esponjoso pode provocar sangramento. Use esponja de colágeno hemostasia para parar o sangramento. - Use geração de segundo harmônico (SHG) de imagem para analisar se a maior parte do osso esponjoso foi removido. Tenha cuidado para evitar desbaste excessivo, certifique-se que o osso restante é thicker do que 50 um, nesta fase da preparação.
- Coloque uma gota de tampão quente (35-37 ° C) no topo da região diluído. Use uma lâmina microcirúrgica ou acabamento Micro Bur para remover mais camadas de osso e formam uma zona lisa de ~ 700 um de diâmetro com a espessura do osso de ~ 20 mM. Durante este passo, que é útil para realizar imagiologia de SHG repetitivo e regularmente medir a espessura do osso.
- Realize imagem TPEM para a região de interesse e uma área de controle.
- Ajustar a posição de cabeça utilizando os parafusos de barra de altura da orelha, de tal maneira que a região é diluído posicionados rigorosamente horizontalmente. Posicione a agulha acima da região diluída e certifique-se de que não existem grandes navios sob o local alvo.
- Fazer uma lesão por meio de imersão da agulha no cérebro, com a profundidade de 0,5-2,0 mm da superfície do crânio e afinada de acordo com as coordenadas do local de aplicação da picada.
- Remova a agulha e suprimir a hemorragia que aparece depois de tele lesão cerebral aguda com tampão hemostático (ver Materiais e equipamentos). Espere até que os coágulos de sangue forma e pulsação vaso no local da lesão pára.
- Realizar a microinjecção de 100 uM Sulforodamina 101 ou outro composto de interesse para o local da lesão, tal como acima descrito na secção 1.2.10.
- Realize imagem TPEM para monitorar a progressão de lesões e recuperação, conforme descrito no Protocolo no 3.
- Depois de imagem, permitem que o animal a recuperar a consciência da anestesia em uma almofada de aquecimento. Não deixe o animal sem supervisão e devolvê-lo à sua gaiola somente após a recuperação física completa.
3. Imagem
- Colocar o animal sob o microscópio, anexando o suporte do metal para o quadro personalizado construído.
- Para imagens, use por exemplo, o FV1000MPE dois fótons microscópio equipado com Mai Tai DeepSee laser e XLPLN 25X 1,05 NA objetivo de imersão em água otimizado para in vivo de dois fótonsimagiologia.
- Identificar o local da lesão ao microscópio usando o modo de fluorescência de campo amplo. Utilize filtros passa longos para visualizar vasculatura cerebral e selecionar a área de controle de acordo com o padrão observado dos vasos sanguíneos.
- Para a imagem do sinal de geração de segundo harmônico (SHG), ajustar o laser de femtosegundos para o comprimento de onda de 800 nm e coletar a luz emitida usando o filtro de desvio nm 380-410. Para imagens de fluorescência, utilize o filtro passa-banda (515-560 nm) para coletar a luz emitida, e os seguintes comprimentos de onda são usados para excitar a fluorescência: GFP-860 nm, YFP-950 nm.
- Use software FluoView para aquisição de imagem.
- Coordena loja de cada ROI para posterior imagem repetitivo. Imagem da mesma ao longo do tempo de ROIs, e ajustar as coordenadas de cada vez para maximizar a sobreposição de imagem.
- Analisar as imagens com o software apropriado (por exemplo,. ImageJ). Reconstruções aqui apresentados foram feitos usando software Imaris.
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Representative Results
Nós otimizamos dois procedimentos de operação: 1) janela craniana crônica e 2) desbaste crânio, para imagiologia cerebral pós-traumático em camundongos transgênicos. Representação esquemática das preparações experimentais é apresentada na Figura 1. Traumática por picada de agulha de aço de 0,3 mm de diâmetro externo (30 L) é aplicada ao poço perfurado (Figura 1A). A preparação janela craniana bem sucedido permite imagens em profundidades de até 650 mícrons abaixo da superfície pial (Figura 1B), enquanto desbaste crânio tende a impor um limite de cerca de 300 mm (Figura 1C), como demonstrado na reconstrução 3D de Thy1-YFP- H rato neurônios piramidais corticais.
O trauma resultados picada em eliminação de dendritos e destruição de redes capilares em um volume controlado do córtex cerebral. Durante os primeiros dois dias, a área da lesão e o aumento do trauma induzido Blebbing dendrite e formação de dendrítica retracção bulbs nas áreas perilesion, tal como observado em microscópio utilizando multiphoton vivo (Figura 2).
Foi realizada crânio desbaste para activação imagem e migração da microglia em ratinhos CX3CR1-EGFP imediatamente após a lesão (Figura 3A). A imagiologia de SHG oferece uma ferramenta valiosa para delinear com precisão o local da lesão (Figura 3B). Moléculas da matriz extracelular que produzem sinais SHG são grandemente enriquecido em parênquima cerebral no trauma picada. Em primeiro lugar, os processos microgliais finas são recuperados, em seguida, as células microgliais migrar para a fronteira do local da lesão (Figura 3A).
Para estimar possíveis lesões induzidas pelo vidro fino pipeta de inserção e entrega de corante, realizamos experimentos de microscopia in vivo de dois fótons com Sulforodamina 101 microinjeção em ratos Thy1-YFP-H sem trauma cerebral. Imagens representativas mostradas na Figura 4 demonstram milhaslocal croinjection 3 horas após a injecção. O rastreio de inserção pipeta pode ser visto na meninges cerebrais visualizadas por SHG (Figura 4A). Os astrócitos são rotulados com Sulphorhodamine 101 introduzida através da injecção (Figura 4B). Dendritos expressando YFP sob Thy1 promotor não demonstram quaisquer sinais morfológicos de lesão como blebbing ou retração lâmpadas (Figura 4 C).
Figura 1. O método de lesão cerebral aguda, em combinação com janela craniana ou preparações crânio finas combinadas com microscopia de dois fótons in vivo. A picada. Traumático por agulha de aço de 0,3 milímetros OD (30G) aplicado a bem da perfurado. A agulha é brevemente imersa no cérebro 0,5-2 mm de profundidade a partir do fundo do poço. B, C (C). D. Campo de visão brilhante dos vasos sanguíneos superficiais através da janela de vidro imediatamente após a lesão aguda do cérebro. E. Diluído crânio antes da aplicação lesão. A região de interesse escolhida (quadro branco) e do local de aplicação picada (círculo vermelho). A área diferente (moldura vermelha) da região diluída deve ser trabalhada para monitorar possíveis artefatos induzida por cirurgia.
Figura 2. Exemplo de imagem multiphoton longitudinal do cérebro desenvolvimento trauma através do crânio diluída. A. Paravista p do local da lesão cercado por dendrites YFP-rotulados de neurônios corticais 20 min após trauma imposição, como fotografada através da preparação crânio diluída. B. Visão ampliada da área descrita no painel A. C. A mesma área do cérebro como em B, reimaged 5 dias após o trauma. Dendrite blebbing é mostrado com setas brancas, lâmpadas de retração dendríticas - com setas vermelhas.
Figura 3. Exemplos de inflamação monitoramento e ativação glia durante o desenvolvimento de trauma cerebral utilizando diferentes marcadores adequados para in vivo de proteínas de imagem multiphoton por exemplo fluorescentes, corantes e segundo sinal geração harmônica. As imagens foram adquiridas 3 horas após a lesão cerebral.
Figura 4. Exame de impacto tecido feito por injecção de solução através de uma micropipeta de vidro. A. Uma trace (shown com linha tracejada) em SHG visualizando meninges cerebrais 3 horas após a injecção. B. Os astrócitos marcadas com sulfo introduzidas pela injecção. C. Dendritos expressando YFP sob Thy1 promotor. D. Imagem combinada de A (SHG - cinza), B (astrócitos - vermelho), C (dendritos neuronais - amarelo).
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Discussion
Trauma cerebral é um evento abrupto, imprevisível. Aqui, nós descrevemos o modelo animal que reproduz um espectro de alterações patológicas observadas em pacientes humanos após a lesão do cérebro, tais como a neurodegeneração, a eliminação de dendritos, edema cerebral, cicatriz glial, hemorragias no córtex cerebral, juntamente com uma hemorragia subaracnóide focal e aumento da permeabilidade da barreira sangue-cérebro. Estudar patogênese primário e secundário, bem como a recuperação após o trauma, este modelo foi combinado com lesão longitudinal na visualização in vivo de neuronal multa e estruturas gliais. Linhagens transgênicas de rato foram usados que expressam proteínas fluorescentes em neurônios (Thy1-YFP-H) 7, os astrócitos (GFAP-EGFP) 8, ou microglia (CX3CR1-EGFP) 9. Além disso, usamos geração de segundo harmônico (SHG) de imagem e astrócitos carregamento com Sulfarhodamine 101 10.
O modelo descrito aqui recapitula penetrating tipo de lesão cerebral. Portanto, uma limitação do presente modelo é que ele não fornece informações sobre os mecanismos de traumatismo craniano fechado. Recentemente Espada e co-autores relataram resultados de imagem multiphoton sobre o comportamento das células no córtex pericontusional 6. Tendo em conta que fechou ferimento na cabeça é um caso médico mais frequente, a abordagem metodológica relatado pelos autores é altamente promissora para complementar os métodos tradicionais de pesquisa na área de trauma impacto cérebro 11.
Usamos tanto a janela do crânio crônica 12 e do crânio desbaste 13 preparações para estudar o comportamento das células em condições pós-traumáticas no cérebro vivo. Ambos os métodos possuem certas vantagens e limitações. Assim, a janela craniana crónica proporciona uma melhor resolução, a penetração mais profunda óptico para dentro do tecido cerebral e conveniência para múltiplas sessões de imagem. Por outro lado, desbaste crânio é menos provável de induzir inflamação no thlocal de imagem e, e, talvez mais importante, permite que aplicações repetidas de drogas e corantes. Alguns exemplos de agentes farmacológicos para ser aplicadas neste tipo de ensaios estão apresentados na Tabela 1.
| Tipo de Agente | Agente Injetado | Áreas de investigação em biologia / farmácia |
| Anti-inflamatório | A ciclosporina A | Traumatismo crânio-encefálico, lesão secundária, neurodegeneração |
| Toxinas | Tetrodotoxin | TCE - dano secundário, excytotoxicity |
| Bicuculina | TCE - danos secundários, a homeostase cloreto | |
| Os inibidores da sinalização de vias | PD98059 (inibidor MAPKK) | mecanismos de sinalização de inflamação, danos secundários, a morte celular pós-traumático, neurodegeneração e regeneração |
| SU6656 (inibidor da quinase da família Src) | ||
| Os factores neurotróficos | O factor neurotrófico derivado do cérebro, o BDNF | TCE - sobrevivência neuronal após a lesão, neuroproteção em danos cerebrais pós-traumático secundário |
| Vírus | lentivirais para a expressão da proteína | mecanismos moleculares da neurodegeneração pós-traumático e regeneração, rotulagem diferencial de tipos de células no cérebro danificado por imagem in vivo |
| vectores adenovirais para a expressão de proteínas | ||
| Ca 2 + indicadores fluorescentes | Fluo-2, 4 | mecanismos de sinalização de inflamação pós-traumática, morte celular, migração celular, axonal / regeneração dendrítica |
Tabela 1. Agentes farmacológicos e corantes para injeção cortical em modelo de lesão picada.
Uma vasta gama de eventos bioquímicos que são altamente importante em condições fisiológicas e patológicas podem ser sondados com inibidores químicos, os indicadores fluorescentes e proteína mutante introduzidas através de construções virais. Vantagens para a escolha de determinada janela de tempo fornecidos pela preparação desbaste crânio pode ser altamente relevante para os estudos.
No presente estudo, foram utilizados segundo sinal geração harmônica para delinear o local da lesão. Alternativamente, as bordas da lesão local pode ser indicado por um corante fluorescente fracamente difusão, por exemplo, um conjugado de peso molecular elevado de dextrano fluorescente (2 milhões de Dalton).
Recentemente, Schaffer e colegas 14 usaram uma preparação crônicacom reopenable janela craniana para entrega repetitiva de corantes fluorescentes para rato córtex. É provável que a janela reabertura craniana pode afetar adversamente a transparência do tecido cerebral. Além disso, é difícil prever o curso de tempo da inflamação induzida reabrindo-, o que pode afectar a regeneração do tecido conjuntivo.
Uma grande vantagem da preparação do crânio diluído é a possibilidade de fornecer compostos terapêuticos (e outros materiais que necessitam de injecção tópica no tecido do cérebro) várias vezes durante a progressão do trauma, sem complicar estruturas (por exemplo, sem a janela craniana reabertura).
Se a entrega composto repetitivo diretamente para o local da lesão é desejado, deve-se considerar meios especiais para evitar crânio seco-out e infecção bacteriana. Assim, é recomendado manter a região da cabeça operado em condições estéreis e aplicação de antibióticos (como enrofloxacina). Para preservar a thinned região crânio de secagem, preencha o suporte do metal com 1,5% de agarose e cobri-lo com rodada lamela de vidro. Na maioria dos casos isto irá permitir manter a mesma transparência ou crânio diluído ao longo do período de até 10 dias. Alguns adicional deve ser tomado se várias sessões de imagem na preparação crânio diluído são planejadas ao longo de um período prolongado de tempo. Imediatamente antes de cada sessão de imagens, remova o tecido conjuntivo recém-formado a partir da região diluído com uma lâmina de microcirurgia. Use a imagem TPEM de SHG para verificar a qualidade de imagem e medida a espessura do osso. Regeneração dos tecidos pode comprometer a imagem causa da profundidade de penetração e a desfocagem acompanhada por um aumento da fluorescência de fundo. Atualizar o crânio diluindo suavemente com uma lâmina de microcirurgia para recuperar a alta qualidade de imagem.
Nos casos em que não requerem acesso direto ao local da lesão, é altamente recomendável que cobre a região diluída do crânio com um coversli vidrop, conforme descrito no artigo sobre polido e reforçado diluído preparação do crânio por Kleinfeld e colegas 15. Isto pode ser feito usando o seguinte procedimento opcional. Coloque uma pequena gota de agarose (1,5%) na região crânio diluído, espere até que ele se torna um gel, remova todo agarose desnecessário, ou seja, deixá-lo apenas no local da lesão. Agarose deve proteger o local da lesão a partir de efeitos externos. Seque a região crânio diluído com ar comprimido. Largar uma pequena quantidade de cola poliacrílico em um pequeno pedaço de # 0 lamela e colocá-lo na região crânio diluída. A cola poliacrílico impede óssea e regeneração dos tecidos conjuntivos, mantendo, assim, o crânio diluído sob a janela preservada.
A combinação desses procedimentos permite estudar os processos pós-traumáticas agudas e crônicas, entregando drogas tópica ou sistêmica e monitorar diretamente os efeitos do tratamento. O uso de linhas de camundongo transgênico dupla ou tripla também pode ser benéfico, particularmente para gravação simultânea de múltiplos processos pós-traumáticos, tais como a formação da cicatriz glial e rebrota ramo neuronal. Esperamos que os nossos modelos de lesão cerebral aguda estudou com microscopia de dois fótons intravital para revelar-se útil para o teste de droga candidatos.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Estamos profundamente agradecidos ao Dr. Frank Kirchhoff para a prestação de GFAP-EGFP e cepas CX3CR1-EGFP do mouse. O trabalho foi suportado por concessões do Centro de Mobilidade Internacional da Finlândia, Tekes, o finlandês Graduate School of Neuroscience (FGSN) e da Academia da Finlândia.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2A-sa dumb Tweezers, 115 mm | XYtronic | XY-2A-SA | |
| 30 G ½ in needle | BD | REF 304000 | |
| Animal trimmer, shaving machine | Aesculap | Isis GT420 | |
| Binocular Microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
| Biological Temperature Controller with stainless steel heating pad | Supertech | TMP-5b | |
| Blunt microsurgical blade | BD | REF 374769 | |
| Borosilicate tube with filament | Sutter Instruments | BF120-69-10 | For glass pipette production |
| Carprofene | Pfizer | Rimadyl vet | |
| Chlorhexidine digluconate | Sigma | C9394 | |
| Dental cement | DrguDent, Dentsply | REF 640 200 271 | |
| Dexamethasone | FaunaPharma | Rapidexon vet | |
| Disposable drills | Meisinger | HP 310 104 001 001 008 | |
| Dulbeco’s PBS 10x | Sigma | D1408 | |
| Dumont #5 forceps, 110 mm | FST | 91150-20 | |
| Ealing microelectrode puller | Ealing | 50-2013 | Vertical puller for glass pipette production |
| Eye ointment | Novartis | Viscotears | |
| Foredom drill control | Foredom | FM3545 | |
| Foredom micromotor handpiece | Foredom | MH-145 | |
| Gas anesthesia platform for mice | Stoelting | 50264 | Assembled on stereotaxic instrument |
| Hemostasis Collagen Sponge | Avitene, Ultrafoam BARD | Ref 1050050 | |
| Imaris | Bitplane | ||
| Ketamine | Intervet | Ketaminol vet | |
| Mai Tai DeepSee laser | Spectra-Physics | ||
| Metal holder | Neurotar | ||
| Microdressing forceps, 105 mm | Aesculap | BD302R | |
| Microfil | WPI | MF34G-5 | Micro syringe filling capillaries |
| Mineral oil | Sigma | M8410 | |
| Multiphoton Laser Scanning Microscope | Olympus | FV1000MPE | |
| NanoFil Syringe 10 μl | WPI | NANOFIL | Hamilton syringe |
| Nonwoven swabs 5 x 5 | Molnlycke Health Care | Mesoft | Surgical tampons |
| Polyacrylic glue | Henkel | Loctite 401 | |
| Round glass coverslip | Electron Microscopy Sciences | ||
| 1.5 thickness | |||
| Small animal stereotaxic instrument | David Kopf Instruments | 900 | |
| Stoelting mouse and neonatal rat adaptor | Stoelting | 51625 | Assembled on stereotaxic instrument. |
| Student iris scissors, straight 11.5 cm | FST | 91460-11 | |
| Sulforhodamine 101 | Molecular Probes | S-359 | |
| UMP3 microsyringe pump and Micro 4 microsyringe pump controller | WPI | UMP3-1 | Microinjector and controller |
| Xylazine | Bayer Health Care | Rompun vet |
References
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