Summary
Levering blijft de belangrijkste uitdaging voor de therapeutische toepassing van kleine interfererende RNA (siRNA). Dit protocol omvat het gebruik van een multifunctionele en biocompatibele siRNA afleverplateau, bestaande uit arginine en polyethyleenimine geënte poreuze silicium microdeeltjes.
Introduction
Kleine interfererende RNA's (siRNA's) zijn dubbelstrengs RNA-moleculen die de expressie van genen onderdrukken. De laatste jaren zijn siRNAs ontwikkeld als een nieuwe generatie biodrugs die therapeutisch potentieel voor toekomstig gebruik vertonen in klinische toepassingen 1-5. Echter, de succesvolle implementatie van siRNA therapie blijft een grote uitdaging, als gevolg van afbraak door nucleasen, slechte intracellulaire opname, lage transfectie-efficiëntie en inefficiënt vrijlating uit de endosoom / lysosoom 5. Veel van deze hindernissen kunnen worden overwonnen door de ontwikkeling van platforms, die veilig en efficiënt leveren siRNA zieke weefsel. Vergeleken met virale dragers, niet-virale platforms aantal voordelen, zoals veiligheid, lage kosten en het gemak van maatwerk. Vooral kationische nanodeeltjes, zoals polymeren en lipiden zijn nuttig voor siRNA levering 3 bewezen.
Eerder hebben we een schijfvormige dr ontwikkeldug levering systeem, genaamd de meertraps vector (MSV). Dit platform is gebaseerd op opeenvolgende fasen, waarbij één voertuig vrijkomt uit andere. De eerste fase voertuig een microdeeltje gemaakt van biologisch afbreekbaar poreus silicium (psi), terwijl de tweede fase voertuigen nanodeeltjes geladen geneesmiddelen of contrastmiddelen 6,7. De nanodeeltjes die zijn ingebed in het ontvangende materiaal geleidelijk vrijgegeven als de Si degradeert 8. Een voordeel van het gebruik Si deeltjes is dat de morfologie en oppervlaktekenmerken gemakkelijk kan worden aangepast om optimale biologische verdeling en geneesmiddelafgifte te bereiken. Onlangs heeft het succesvolle gebruik van de MSV platform voor de levering van siRNA liposomen tumorweefsel werd voorgesteld in een eierstok- en borstkanker muismodel 9, 10.
In dit werk hebben we een universeel systeem voor de siRNA gebaseerd op de principes van de MSV-platform gefabriceerd. De werkzaamheid van dit afgiftesysteem eerder is ons geblekening verschillende siRNA moleculen 11. Het systeem is een polykation gefunctionaliseerd poreus silicium (PCPS) drager, bestaande uit psi geënt met polyethyleenimine (PEI) en arginine (Arg). PEI kan helpen bij het vormen van elektrostatische interacties met siRNA, terwijl Arg en PSI kan dienen om de toxiciteit van PEI verminderen, zoals eerder demonstarted 11. Bovendien kan de aanwezigheid van PEI helpen bij intracellulaire opname en endosomale ontsnapping, terwijl psi microdeeltjes mogelijk siRNA bescherming en aanhoudende afgifte. De psi deeltjes geleidelijk afgebroken onder fysiologische omstandigheden, hetgeen resulteert in de vorming van Arg-PEI / siRNA nanodeeltjes (figuur 1), die een afzonderlijk morfologie en een nauwe grootteverdeling 11 hebben. Voor details met betrekking tot de stabiliteit van de PCPS / siRNA-systeem, verwijzen wij u naar de studie van Shen et al. 11. Dit PCPS platform verschilt van de conventionele MSV, sinds de tweede fase nanodeeltjes worden in eerste instantie niet present in de drager, maar worden gevormd over de tijd als de eerste fase drager afbreekt 11, 12. siRNA beladingsrendement, cytotoxiciteit en silencing efficiëntie van het PCPS systeem is geëvalueerd in vitro. Transfectie-efficiëntie werd gemeten met siRNA tegen ataxia telangiectasia gemuteerde (ATM) oncogen, dat betrokken is bij DNA-herstel 10. Eerder heeft de onderdrukking van ATM aangetoond tumorgroei afnemen in een borstkankermodel 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. PCPS Particle Voorbereiding
- Oxideren niet- gefunctionaliseerde poreuze silicium deeltjes in een oplossing van waterstofperoxide met 30% bij 95 ° C gedurende 2 uur. Aminate de geoxideerde deeltjes in 2% (3-aminopropyl) triethoxysilaan oplossing in isopropylalcohol gedurende 2 dagen bij 65 ° C onder zacht roeren.
- Centrifugeer de oplossing gedurende 30 min bij 18.800 xg en was de deeltjes tweemaal in isopropanol en driemaal in ethanol, met korte sonicatie om de pellet te schorten. Laat de deeltjes in ethanol oplossing bij het uitvoeren van stap 1.3 en 1.4.
- Voeg een bekend volume deeltjessuspensie (bijvoorbeeld 10 pi) tot 10 ml isotoon verdunningsmiddel en telt de deeltjes met een deeltjestelling analysator om de deeltjes vast op de voorraadoplossing.
- Activeer de zuurgroep van L-arginine (0,1 nmol) met N - (3-dimethylaminopropyl) - N 'ethylcarbodiimide hydrochloride (EDC, 0,1 nmol) / N
- Kort ultrasone trillingen de deeltjes voorraadoplossing en voeg 1 miljard deeltjes de L-arginine oplossing en laat het reactiemengsel gedurende 18 uur bij kamertemperatuur onder voorzichtig roeren.
- Activeer de eerste asparaginezuur groep van N - (tert-butoxycarbonyl) -L-asparaginezuur (Boc-Asp-OH, 1 nmol) met EDC (0,1 nmol) / NHS (0,1 nmol) in 20 ml ethanol gedurende 4 uur bij 4 ° C onder zacht roeren.
- Los 50 mg polyethyleenimine in 10 ml ethanol en voeg de oplossing van de Boc-Asp-OH mengsel. Laat de reactie verlopen gedurende 24 uur bij kamertemperatuur onder voorzichtig roeren.
- Activeer de tweede asparaginezuur groep van de Boc-Asp-OH / PEI-oplossing met EDC (0,1 nmol) / NHS (0,1 nmol) bij 4 ° C gedurende 6 uur onder zacht roeren.
- Om PCPS deeltjes te verkrijgen, voeg het deeltje oplossing uit stap 1.5 in de Boc-Asp-OH / PEI-oplossing van stap 1.8. Laat de reactie verlopen gedurende 18 uur bij kamertemperatuur onder zacht st irring.
- Centrifugeer de oplossing gedurende 30 min bij 18.800 xg en was het deeltje oplossing driemaal met ethanol, met korte sonicatie om de pellet te schorten.
2. PCPS deeltjes karakterisering
- Meet de grootte van de deeltjes met behulp van een scanning elektronenmicroscoop (SEM).
- Breng een druppel deeltje suspensie (10.000 deeltjes / ul in ethanol) op een schone silica SEM monster stomp en laten drogen bij kamertemperatuur onder vacuüm.
- Meet SEM beelden op 8 kV met een 3-5 mm werkafstand met behulp van een in-lens detector.
- Meet de zeta-potentiaal van de deeltjes met een deeltjes analysesysteem.
- Meng 10 ui deeltjessuspensie (10.000 deeltjes / ul in ethanol) met 1 ml van 10 mM fosfaatbuffer (pH 7,4).
- Plaats het monster in gevouwen capillaire cellen en meet de zeta potentiaal volgens de instructies van de fabrikant.
- Droog de PCPS deeltjes (van PCPS deeltje voorbereiding stap 1.9) onder vacuüm O / N.
- Voeg siRNA (4 pg) in nuclease-vrij water (20 pl) om de gedroogde PCPS deeltjes en ultrasone trillingen kort. Gebruik de volgende deeltje siRNA's: 2 x 10 5 deeltjes / 0,2 ug siRNA, 4 x 10 5 deeltjes / 0,2 ug siRNA, 6 x 10 5 deeltjes / 0,2 ug siRNA, 8 x 10 5 deeltjes / 0,2 ug siRNA, 10 × 10 5 deeltjes / 0,2 ug siRNA en 12 x 10 5 deeltjes / 0,2 ug siRNA.
- Incubeer 3 uur bij 4 ° C op een schudder (1000 rpm) om siRNA binding aan de deeltjes.
4. Optimalisatie van siRNA / PCPS deeltjesverhouding
- Voeg DNA laadkleurstof tot 20 ul van de PCPS / controle siRNA deeltjes met verschillende deeltjes om siRNA's (zie het laden van siRNA in PCPS deeltjes).
- Laad de samselen in een 2% agarose gel die DNA gel stain.
- Voer elektroforese bij een constante spanning van 120 V gedurende 20 minuten in loopbuffer.
- Analyseer de gel met afbeelding acquisitie en analyse software.
5. Laat van siRNA uit PCPS Deeltjes
- Meng 20 ul van de PCPS / control siRNA deeltjes met verschillende deeltje siRNA's (zie stap 3) natriumdodecylsulfaat (SDS, 2%) toe en laat 1 uur bij KT.
- Voeg DNA laadkleurstof de monsters.
- Samples in een 2% agarose gel die DNA gel stain.
- Voer elektroforese bij een constante spanning van 120 V gedurende 20 minuten in loopbuffer middels DNA elektroforese apparatuur en een voeding.
- Analyseer de gel met afbeelding acquisitie en analyse software.
6. confocale microscopie PCPS Deeltjes
- Voeg 5 ul van PCPS / fluorescerende controle siRNA deeltjes (10 × 10 5 deeltjes / 0.2 ug siRNA / 20 pi) om een glazen deksel slip.
- Visualiseren deeltje lagen door confocale microscopie.
7. Karakterisering van Arg-PEI / controle siRNA Nanodeeltjes
- De siliconen materiaal afgebroken en vormen Arg-PEI / control siRNA nanodeeltjes, voeg PCPS / siRNA deeltjes (10 x 10 6 PCPS deeltjes / 2 ug siRNA) 100 pl fosfaat gebufferde zoutoplossing en schud (1000 rpm) bij 37 ° C 2 dagen.
- Centrifugeer het monster gedurende 30 min bij 18.800 xg en verzamel de bovenstaande vloeistof.
- Meet de grootte van de gevormde Arg-PEI / siRNA nanodeeltjes met dynamische lichtverstrooiing (DLS).
- Meng 10 ul van de supernatant met 1 ml 10 mM fosfaatbuffer (pH 7,4) en plaats in een plastic cuvet.
- Meet de grootte van de deeltjes met een deeltjesgrootte analysator volgens de instructies van de fabrikant.
- Bepaal de grootte en morfologie van de gevormde Arg / PEI-siRNAnanodeeltjes met atomic force microscopie.
- Neem 10 pi van het supernatant en plaats op een silicium wafer.
- Visualiseren deeltjes met atomic force microscopie (AFM).
8. Celkweek
- Cultuur MDA-MB-231 menselijke borstkankercellen in celkweekmedium aangevuld met 10% foetaal runderserum en 1% penicilline-streptomycine bij 5% CO2, 95% vochtigheid en 37 ° C.
9. confocale microscopie van levende cellen met PCPS Deeltjes
- Plaat cellen in 2-putjes objectglaasjes met een zaaidichtheid van 3 x 10 5 cellen / putje gedurende 24 uur.
- Voeg PCPS deeltjes geladen met fluorescerende control siRNA (10 x 10 5 deeltjes / 0,2 ug deeltje siRNA verhouding 50 nM siRNA) cellen.
- Neem een film van de cellen met een confocale microscoop (met een kamer, 5% CO2, 95% vochtigheid en 37 ° C toegevoerd) 12 uur na deeltje Expozeker.
10. confocale microscopie van Vaste Cellen met PCPS Deeltjes
- Plaat cellen in 2-putjes objectglaasjes met een zaaidichtheid van 3 x 10 5 cellen / putje gedurende 24 uur.
- Voeg PCPS deeltjes geladen met fluorescerende control siRNA (10 x 10 5 deeltjes / 0,2 ug deeltje siRNA verhouding 50 nM siRNA) cellen en incubeer gedurende 1 dag, 7 dagen en 10 dagen.
- Was de cellen tweemaal met fosfaatgebufferde zoutoplossing en vervolgens vast met 4% paraformaldehyde gedurende 10 min.
- Was de cellen met fosfaat gebufferde zoutoplossing.
- Permeabilize de cellen met 0,1% octylfenol ethoxylaat gedurende 10 minuten en daarna wassen driemaal met fosfaatgebufferde zoutoplossing.
- Blokkeer de cellen met albumine uit runderserum (10 mg / ml) in met fosfaat gebufferde zoutoplossing gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur onder voorzichtig roeren.
- Voor filamenteuze actine visualiseren, incubeer de cellen met fluorescent gemerkt falloïdine (1 ul / 40 ulblokkerende oplossing) gedurende 20 min bij kamertemperatuur onder zacht roeren en daarna wassen met fosfaat gebufferde zoutoplossing.
- Verwijder de dia's van het frame en voeg antifade reagens met 4 ', 6-diamidino-2-fenylindool (DAPI) de nucleus te visualiseren.
- Voeg een dekglaasje erop en nemen beelden van de cellen met confocale microscopie.
11. Flowcytometrie van Cellen met PCPS / TL Controle siRNA Deeltjes
- Plaat cellen in een 6-wells plaat met een zaaidichtheid van 3 x 10 5 cellen / putje gedurende 24 uur.
- Voeg PCPS deeltjes geladen met fluorescerende control siRNA (10 x 10 5 deeltjes / 0,2 ug deeltje siRNA verhouding 50 nM siRNA) aan de cellen en incubeer 24 uur.
- Was de cellen met fosfaat gebufferde zoutoplossing en schraap ze met een cel schraper.
- Bewaar de cellen in met fosfaat gebufferde zoutoplossing met 2% foetaal runderserum voorafgaand aan analyse. Gebruik onbehandelde cellen als een negatieve controle.
- Voeren stroom cytometry.
12. Cel levensvatbaarheid van cellen met PCPS Deeltjes en PCPS / controle siRNA Deeltjes
- Plaat cellen in een plaat met 96 putjes bij een celdichtheid van 3 x 10 3 cellen / putje gedurende 24 uur.
- Behandel de cellen met PCPS deeltjes (1,5 × 10 5 / goed en 6 × 10 5 / putje) of PCPS / controle siRNA deeltjes (10 × 10 5 deeltjes / 0,2 ug deeltje siRNA ratio, 10 nM en 100 nM siRNA) voor 48 uur en 72 uur. Gebruik onbehandelde cellen en cellen behandeld met fosfaatgebufferde zoutoplossing (zelfde volume als de toegevoegde deeltjes) als controles. Assay elk monster in drievoud.
- Voer een celproliferatie assay volgens de instructies van de fabrikant.
- Vertegenwoordigen gegevens als het gemiddelde ± standaardafwijking.
13. Western Blot van Cellen met PCPS / ATM Mutated siRNA Deeltjes
- Plaat cellen in een 6-well plaat bij een celdichtheid 2 x 10 5 cellen / well voor 24 uur.
- Incubeer de cellen met PCPS / control siRNA (50 nM) deeltjes of PCPS / ATM siRNA (50 nM) deeltjes gedurende 72 uur. Gebruik onbehandelde cellen als controle.
- Lyse van de cellen met een eiwit extractie reagens aangevuld met een cocktail van proteaseremmers.
- Centrifugeer de cellysaten gedurende 10 min bij 14.000 xg en de supernatant herstellen.
- Bepaal de eiwitconcentratie met een eiwit kwantificering bepaling volgens de instructies van de fabrikant.
- Voeg monster laadbuffer (met 5 pl 2-mercaptoethanol / ml buffer) de monsters en verwarm ze gedurende 6 min bij 99 ° C.
- Laad het eiwit monsters (20 ug / ul) in een 12% SDS-polyacrylamide gel in loopbuffer en uitvoeren polyacrylamide gelelektroforese (1 uur, 120 V) met elektroforese apparatuur en een voeding.
- Breng de gel in overdrachtsbuffer (20% methanol) naar een nitrocellulose membraan (1 uur, 100 V) met elektroforese apparatuur eneen voeding.
- Blokkeer het membraan met 5% droge melk gedurende 1 uur.
- Incubeer het membraan met de ATM primaire antilichaam (van konijnen) in blokkerende oplossing (van stap 13.9) bij een 1: 1000 verdunning O / N.
- Was het membraan met fosfaat gebufferde zoutoplossing die 0,1% polyethyleenglycol sorbitanmonolauraat en incubeer daarna met het secundaire antilichaam (anti-konijn) in blokkerende oplossing (van stap 13.9) bij een 1: 2500 verdunning gedurende 1 uur.
- Was het membraan met fosfaat gebufferde zoutoplossing die 0,1% polyethyleenglycol sorbitanmonolauraat en detecteren eiwitbanden met Western blot detectie reagens met beeldverwerving en analyse software.
- Voor het laden van controle, was het membraan en herhaal stap 13,9-13,12 met behulp van een β-actine primaire antilichaam (van muis, 1: 10.000 verdunning) en een secundair antilichaam (anti-muis 1: 4000 verdunning).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dit protocol beschrijft het gebruik van een niet-viraal afgiftesysteem voor veilige en efficiënte siRNA transfectie. De SEM resultaten blijkt dat de PCPS deeltjes cilindrisch van vorm en hebben een diameter van 2,6 urn (figuur 2A). De deeltjes zijn positief geladen bij een zeta-potentiaal van ongeveer 8,21 (figuur 2B), waardoor het mogelijk elektrostatische binding met negatief geladen nucleotiden. Confocale beelden van verschillende lagen van de PCPS deeltjes aantonen dat fluorescerende controle siRNA in het poreuze silicium deeltjes (figuur 2C) is geplaatst. De vorming en het vrijkomen van Arg-PEI / siRNA nanodeeltjes uit de PSI-deeltjes werd bevestigd met DLS en AFM. De grootteverdeling van de deeltjes varieerden 70-120 nm, met een gemiddelde grootte van 94 nm (figuur 2D). AFM afbeeldingen illustreren dat de nanodeeltjes een bolvorm (figuur 2E).
De ratio van deeltjes siRNA werd geoptimaliseerd door agarose gelelektroforese hoge bindingsaffiniteit (figuur 3A) te waarborgen. Een groot aantal deeltjes met siRNA's werd gebruikt (2 x 10 5, 4 x 10 5, 6 x 10 5, 8 x 10 5, 10 × 10 5 en 12 × 10 5 /0.2 ug siRNA). De resultaten geven aan dat siRNA nauwkeurig kunnen binden aan de deeltjes bij het deeltje hoeveelheid boven 8 x 10 5. Een verhouding van 10 x 10 5 PCPS / 0,2 ug siRNA werd geselecteerd voor verdere experimenten. Voorts werd siRNA succes vrijgelaten uit de drager worden behandeld met SDS, zie figuur 3B.
Vervolgens de kelder internalisatie PCPS / fluorescerende control siRNA deeltjes werd geëvalueerd in MDA-MB-231 cellen. Confocale beelden genomen na 24 uur van de behandeling blijkt dat de deeltjes effectief worden geïnternaliseerd in cellen (Figuur 4 Figuur 5 toont dat 89% van de cellen PCPS / siRNA deeltjes geïnternaliseerd na 24 uur incubatie. Bovendien werd de internalisatie proces geconstateerd gedurende 12 uur (Video 1). Deze resultaten geven aan dat de PCPS deeltjes efficiënt kunnen leveren siRNA in cellen. De langdurige accumulatie van siRNA in cellen werd eveneens door confocale microscopie. Op dag 7 en dag 10 was het siRNA steeds detecteerbaar in de cellen (figuur 6).
Een van de belangrijkste factoren om te overwegen bij het ontwikkelen van een siRNA levering systeem is de veiligheid van de drager 13. PEI is bekend dat polyplexen met siRNA, hulp in de cellulaire opname en trekker vrijlating uit de endosoom / lysosoom vormen. Echter, PEI toxische effecten, door de aanwezigheid van positief geladen primaire aminogroepen in de hoofdketen 14,15. Bijvoorbeeld, PEI binding aan de glycocalyx op het celoppervlak kan resulteren in de formatie van grote clusters 16. Om deze lading geïnduceerde toxiciteit elimineren, werd PEI covalent geconjugeerd arginine via een brug linker, het aantal primaire aminogroepen verminderen. De levensvatbaarheid van de cellen bleef meer dan 95% na 48 uur en 72 uur wanneer deeltjes en siRNA werden gebruikt in een concentratie van maximaal 6 x 10 5 / putje en 100 nM (Figuur 7A). Vervolgens de transfectie efficiëntie van siRNA tegen oncogen ATM geëvalueerd in MDA-MB-231 cellen. Western blot resultaten tonen aan dat de eiwit niveaus van ATM worden verminderd na behandeling met PCPS / ATM siRNA (figuur 7B). De resultaten suggereren dat de PCPS platform is een veilige en efficiënte levering systeem voor siRNA.
Figuur 1. Schematische weergave van polykation gefunctionaliseerde poreus silicium (PCPS) deeltjes. strong> Arginine (Arg) -polyethylenimine (PEI) / kleine interfererende RNA (siRNA) nanodeeltjes worden gevormd na de afbraak van silicium (Si).
Figuur 2. Karakterisatie van PCPS deeltjes. (A) Scanning elektronenmicroscopie (SEM) beeld van PCPS deeltjes. (B) Zeta potentieel PCPS deeltjes. (C) confocale beelden van verschillende lagen van de PCPS / fluorescerende control siRNA deeltjes. (D) grootteverdeling van de arginine Arg-PEI / control siRNA nanodeeltjes afgegeven uit de poreuze silicium microdeeltjes. (E) Atomic Force Microscopy (AFM) beelden van Arg-PEI / controle siRNA nanodeeltjes. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3. Agarose gel voor optimalisering van de PCPS / siRNA afgiftesysteem. (A) De bindingsaffiniteit tussen PCPS deeltjes en controle siRNA. De bands vertegenwoordigen ongebonden siRNA. (B) siRNA afgifte na incubatie met 2% SDS gedurende 1 uur. De banden met de totale siRNA (ongebonden en gebonden). Voorbeeld 1: siRNA; monster 2: 2 × 10 5 PCPS deeltjes / 0,2 ug siRNA; voorbeeld 3: 4 x 10 5 PCPS deeltjes / 0,2 ug siRNA; steekproef 4: 6 × 10 5 PCPS deeltjes / 0,2 ug siRNA; steekproef 5: 8 x 10 5 PCPS deeltjes / 0,2 ug siRNA; monster 6: 10 × 10 5 PCPS deeltjes / 0,2 ug siRNA; monster 7: 12 × 10 5 PCPS deeltjes / 0,2 ug siRNA.
75 / 52075fig4.jpg "/>
Figuur 4. Confocale microscoop afbeeldingen PCPS / siRNA fluorescente deeltjes (rood) in MDA-MB-231-cellen (24 uur incubatie). De kern en filamenteus actine werd zichtbaar gemaakt met 4 ', 6-diamidino-2-fenylindool (DAPI, blauw ) en phalloidin (groen), respectievelijk. Drie verschillende lagen werden afgebeeld (top, midden en basaal). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 5. Kwantitatieve stromingscytometrie analyse van fluorescent MDA-MB-231 cellen na incubatie met PCPS / control siRNA fluorescerende deeltjes. Onbehandelde cellen werden gebruikt als negatieve controle. 89% van de cellen de deeltjes was geïnternaliseerd.
igure 6 "src =" / files / ftp_upload / 52075 / 52075fig6.jpg "/>
Figuur 6. Confocale beelden fluorescerende controle siRNA (rood) in MDA-MB-231 cellen. Cellen werden geïncubeerd met PCPS / fluorescerende control siRNA deeltjes gedurende 1 dag, 7 dagen en 10 dagen. Cellen werden vervolgens zichtbaar gemaakt met confocale microscopie. De kern en draadvormige actine werd gevisualiseerd met 4 ', 6-diamidino-2-fenylindool (DAPI, blauw) en phalloidin (groen), respectievelijk. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 7. Cellevensvatbaarheid en silencing in vitro. (A) Een cel levensvatbaarheid assay cellen geïncubeerd met PCPS deeltjes en PCPS / control siRNA deeltjes (SCR). Experiment werd uitgevoerd in reiskunst op en de resultaten worden gepresenteerd als gemiddelde ± standaarddeviatie. Onbehandelde cellen (blanco) en cellen geïncubeerd met PBS als controles. (B) Western blot van PCPS / ataxie telangiectasia gemuteerd (ATM) siRNA deeltjes. Cellen werden blootgesteld aan PCPS / control siRNA (SCR) deeltjes en PCPS / ATM siRNA deeltjes. Onbehandelde cellen (mock) werden gebruikt als controle. β-actine werd gebruikt als ladingcontrole.
Video 1 . Tijdsafhankelijk opname van PCPS / fluorescerende control siRNA deeltjes in levende MDA-MB-231 cellen. De video werd voor 12 uur na blootstelling van de cellen aan deeltjes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol beschrijft een werkwijze voor de succesvolle levering en transfectie van siRNA in cellen. In het bijzonder wordt de afgifte van siRNA gemaakt van een multifunctioneel platform bestaande uit gefunctionaliseerde psi polykation deeltjes. Het gebruik van siRNA therapie groot potentieel, zoals kankerbehandeling, diverse oncogenen kan worden gericht met een hoge specificiteit. Derhalve bestaat er behoefte aan siRNA bestelwagens ontwikkelen die de uitdagingen van siRNA therapie verminderen. Tot slot hebben we een protocol dat belofte voor de veilige en efficiënte levering van siRNA toont geschetst. Echter, er zijn een aantal belangrijke factoren waarmee rekening moet worden gehouden bij het uitvoeren van de beschreven techniek. Bijvoorbeeld, een belangrijke overweging bij de opstelling van PCPS deeltjes de siRNA behandelen voorzichtig om degradatie te vermijden door nucleasen. Vooral schone handschoenen en RNAse vrij buizen en water worden gebruikt allen tijde bij het werken metsiRNA. Als de siRNA transfectie efficiëntie laag is, kan een spray die RNAse verontreiniging verwijdert worden gebruikt om handschoenen en werkruimtes te spuiten. Bovendien, indien de transfectie mislukt, het siRNA worden getest met commerciële transfectie reagens, om te bepalen of het probleem wordt veroorzaakt door de siRNA of deeltjes. Een andere kritische beschouwing voor een succesvolle implementatie van de PCPS / siRNA levering systeem is om zorg te dragen bij het uitvoeren van centrifugeren en wassen stappen. Namelijk, moet de supernatant volledig verwijderd om overtollige reagentia die nodig zijn gehele deeltje bereidingsstappen verwijderen.
Een belangrijk voordeel van de PCPS / siRNA afgiftesysteem is veiligheid. Verschillende siRNA transfectie middelen een hoge kationische lading, wat bijdraagt aan cellulaire toxiciteit 13,15. Inderdaad, de meeste commerciële protocols aangeven dat de reagentia worden geïncubeerd met de cellen gedurende enkele uren, om celdood te voorkomen. Integendeel, cells kan worden blootgesteld aan de PCPS deeltjes enkele dagen zonder enige tekenen van toxiciteit, zoals blijkt uit de cellevensvatbaarheid resultaten. De PCPS deeltjes kunnen siRNA met hoge affiniteit binden door de aanwezigheid van PEI. Maar de lading geïnduceerde toxiciteit van PEI wordt voorkomen door de unieke opzet van het platform voor de levering. Vooral de covalente binding van Arg naar PEI en de inkapseling van PEI in de Si poriën bijdragen tot verlaagde toxiciteit. Een ander voordeel van de PCPS platform is dat siRNA transfectie kan plaatsvinden in aanwezigheid van serum. Andere bestaande werkwijzen vereisen gewoonlijk het gebruik van serumvrije celkweekmedium, waardoor extra stappen toevoegen aan het transfectie proces en mogelijk interfereren met gewone mobiele signaalwegen.
Een bijkomend voordeel van het PCPS systeem is dat het geen wijziging van de siRNA moleculen vereist. Terwijl sommige van de huidige methoden vereisen ingewikkelde vervoeging stappen om de siRNA te stabiliseren of c mogelijkellular internalisatie 13 PCPS het systeem berust op het mengen van siRNA laden. De binding aan PEI en de poriën in de Si materiaal een beschermende omgeving voor het siRNA, waardoor contact met nucleasen gereduceerd. De PCPS deeltjes kunnen worden opgeslagen voor langere tijd gedroogde materiaal of isopropylalcohol. Bovendien, als de PCPS / siRNA deeltjes worden gevriesdroogd kunnen worden bewaard gedurende ten minste drie maanden bij 4 ° C. De gevriesdroogde PCPS deeltjes moeten RNase vrij water worden gesuspendeerd net voor transfectie, en mag niet worden opgeslagen in oplossing. Ten slotte PCPS platform toelaat aanhoudende afgifte van siRNA, zoals eerder vermeld 11 derhalve de periode waarin doelgenen onderdrukt blijven verhogen. Dienovereenkomstig, na cellulaire internalisatie, Si deeltjes degraderen, waardoor de vorming van Arg-PEI / siRNA nanodeeltjes. Vervolgens wordt de siRNA langzaam vrij in het cytoplasma, waar het kan binden aan messevinger RNA (mRNA), waardoor biologische activiteit uitoefenen. Hoewel PCPS deeltjes bieden verschillende voordelen ten opzichte van bestaande methoden voor siRNA levering een beperking van de techniek is dat niet gefunctionaliseerd psi microdeeltjes dienen als uitgangsmateriaal. Terwijl de deeltjes worden gesynthetiseerd met fotolithografie en elektrochemisch etsen 17 deze technieken zijn niet beschikbaar in alle instellingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polyethylenimine (PEI), branched | Sigma-Aldrich | 408727 | Average molecular weight ~25,000 Da |
| L-Arginine | Sigma-Aldrich | A5006 | Reagent grade, ≥98% |
| Boc-Asp-OH | Sigma-Aldrich | 408-468 | 99% |
| Hydrogen peroxide solution | Sigma-Aldrich | 216763 | 30 wt. % in H2O |
| Sulfuric acid | Sigma-Aldrich | 339741 | 100.00% |
| Isopropyl alcohol | Sigma-Aldrich | W292907 | ≥99.7% |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 459844 | ≥99.5% |
| N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDC) | Sigma-Aldrich | 03449 | ≥99% |
| Albumin from bovine serum | Sigma-Aldrich | A7030-10G | Blocking agent |
| Ataxia-telangiectasia mutated siRNA | Sigma-Aldrich | Designed in-house | |
| Tris Acetate-EDTA buffer | Sigma-Aldrich | T9650 | For DNA agarose gel electrophoresis |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| TWEEN 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | Polyethylene glycol sorbitan monolaurate |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M6250 | For Western blot |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | L3771 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | 71496 | For making phosphate buffer |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | 71640 | For making phosphate buffer |
| Anti-Mouse IgG | Sigma-Aldrich | A4416 | Secondary antibody (anti-mouse) for Western blot |
| N-Hydroxysuccinimide (NHS) | Sigma-Aldrich | 130672 | 98% |
| CELLSTAR 96W Microplate Tissue Culture Treated Clear w/ Lid | Greiner Bio-One | 655182 | 96-well plate |
| 10x Tris-Glycine Liquid | Li-Cor | 928-40010 | Transfer buffer for Western blot |
| Paraformaldehyde solution 4% in PBS | Santa Cruz | Sc-281692 | Fixation of cells |
| CellTiter 96 AQueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay (MTS) | Promega | G5421 | Proliferation assay |
| Phosphate buffered saline | Fisher Scientific | BP399-500 | 10x Solution |
| Corning cellgro Dulbecco's Modification of Eagle's (Mod.) | Fisher Scientific | MT-15-017-CM | Cell culture media, 1x solution |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | AC21568-2500 | Octyl phenol ethoxylate, permeabilization agent |
| Cover glass | Fisher Scientific | 12-530C | |
| Methanol | Fisher Scientific | A412-1 | For Western blot transfer buffer |
| Plastic Cuvettes | Fisher Scientific | 14-377-010 | For size measurements using Zetasizer Nano ZS |
| Molecular BioProducts RNase AWAY Surface Decontaminant | Fisher Scientific | 14-754-34 | Spray for removing RNAse contamination |
| Agarose | Fisher Scientific | BP165-25 | Low melting point, for running RNA samples |
| ProLong Gold Antifade Reagent with DAPI | Invitrogen | P36935 | Antifade reagent with DAPI, nucelus detection |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Invitrogen | A12379 | Dissolve 300 units in 1.5 ml methanol, detection of filamentous actin |
| SYBR Safe DNA Gel Stain | Invitrogen | S33102 | Visualization of RNA |
| Negative Control siRNA | Qiagen | 1022076 | Control siRNA |
| AllStars Neg. siRNA AF 555 | Qiagen | 1027294 | Fluorescent control siRNA |
| Cell scraper | Celltreat | 229310 | |
| BioLite Multidishes and Microwell Plates | Thermo Scientific | 130184 | 6-well plate |
| Pierce LDS Sample Loading Buffer (4x) | Thermo Scientific | 84788 | Sample loading buffer for Western blot |
| Pierce BCS Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23227 | Protein quantification assay |
| Halt Protease Inhibitor Single-Use Cocktails (100x) | Thermo Scientific | 78430 | Protease inhibitor cocktail, use at 1x |
| M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent | Thermo Scientific | 78501 | Protein extraction reagent |
| Sorvall Legend Micro 21R | Thermo Scientific | 75002440 | Centrifuge |
| Beta Actin Antibody | Thermo Scientific | MA1-91399 | β-actin primary antibody (from mouse) for western blot |
| 6x TriTrack DNA Loading Dye | Thermo Scientific | R1161 | DNA loading dye |
| Nuclease-Free Water | Life Technologies | AM9938 | |
| Non-Fat Dry Milk | Lab Scientific | M0841 | For Western blot |
| 2-well BD Falcon culture slides | BD Biosciences | 354102 | 2-well culture slides |
| Amersham ECL Western blot detection reagent | GE Healthcare Life Sciences | RPN2106 | Western blot detection reagent |
| BA Membranes | GE Healthcare Life Sciences | 10402096 | Nitrocellulose membrane for Wester blot |
| ATM (D2E2) Rabbit mAb | Cell Signaling | 2873S | ATM primary antibody (from rabbit) for Western blot |
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling | 7074 | Secondary antibody (anti-rabbit) for Western blot |
| Folded capillary cells | Malvern | DTS 1061 | For zeta potentail measurements using Zetasizer Nano ZS |
| MDA-MB-231 cell line | ATCC | HTB-26 | Mammary Gland/Breast |
| 12% Mini-PROTEAN TGX Gel | Bio-rad | 456-1043 | For Western blot |
| Biorad PowerPac HC | Bio-rad | 164-5052 | Power supply for electrophoresis |
| 10x Tris/Glycine/SDS Buffer | Bio-rad | 161-0732 | Running buffer for Western blot |
| Wide Mini-Sub Cell GT Cell | Bio-rad | 170-4405 | Electrophoresis equipment for DNA agarose gel |
| Mini-PROTEAN Tetra cell | Bio-rad | 165-8000 | Electrophoresis equipment for Western blot |
| ChemiDoc XRS+ System with Image Lab Software | Bio-rad | 170-8265 | Image acquisition and analysis software for gels and blots |
| 4" (10 cm) dia., 5 x 7 mm diced Silicon Wafer | Ted Pella | 16007 | Silicon waferfor scanning electron microscopy and atomic force microscopy |
| Thermomixer R | Eppendorf | 22670107 | Shaker |
| Isoton II diluent | Beckman Coulter | 8546719 | Isoton diluent |
| Multisizer 4 Coulter Counter | Beckman Coulter | A63076 | Particle counting analyzer |
| Non-functionalized porous silicon particles | Microelectronics Research Center, University of Texas at Austin | Dicoidal shape. 2.6 μm (diameter) x 0.7 μm (height), provided in isopropyl alcohol | |
| Zetasizer Nano ZS | Malvern | Particle analyzer system for size and zeta potential | |
| Scanning Electron Microscope | FEI | Particle size and shape | |
| Atomic Force Microscope | Bruker | Particle size and shape | |
| Fluo ViewTM 1000 Confocal Microscope | Olympus | Visualization of fixed and live cells |
References
- De Fougerolles, A., Vornlocher, H. P., Maraganore, J., Lieberman, J. Interfering with disease: a progress report on siRNA-based therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 6 (6), 443-453 (2007).
- Rolland, A.
- Oh, Y. K., Park, T. G. siRNA delivery systems for cancer treatment. Adv Drug Deliv Rev. 61 (10), 850-862 (2009).
- Mintzer, M. A., Simanek, E. E. Nonviral vectors for gene delivery. Chem Rev. 109 (2), 259-302 (2009).
- Whitehead, K. A., Langer, R., Anderson, D. G. Knocking down barriers: advances in siRNA delivery. Nat Rev Drug Discov. 8 (2), 129-138 (2009).
- Decuzzi, P., et al. Size and shape effects in the biodistribution of intravascularly injected particles. J Control Release. 141 (3), 320-327 (2010).
- Decuzzi, P., Ferrari, M. Design maps for nanoparticles targeting the diseased microvasculature. Biomaterials. 29 (3), 377-384 (2008).
- Martinez, J. O., Evangelopoulos, M., Chiappini, C., Liu, X., Ferrari, M., Tasciotti, E. Degradation and biocompatibility of multistage nanovectors in physiological systems. J Biomed Mater Res A. 102 (10), 3540-3549 (2014).
- Shen, H., et al. Enhancing chemotherapy response with sustained EphA2 silencing using multistage vector delivery. Clin Cancer Res. 19 (7), 1806-1815 (2013).
- Xu, R., et al. Multistage vectored siRNA targeting ataxia-telangiectasia mutated for breast cancer therapy. Small. 9 (9-10), 1799-1808 Forthcoming.
- Shen, J., et al. High capacity nanoporous silicon carrier for systemic delivery of gene silencing therapeutics. ACS Nano. 7 (11), 9867-9880 (2013).
- Zhang, M., et al. Polycation-functionalized nanoporous silicon particles for gene silencing on breast cancer cells. Biomaterials. 35 (1), 423-431 (2014).
- Ozpolat, B., Sood, A. K., Lopez-Berestein, G. Nanomedicine based approaches for the delivery of siRNA in cancer. J Intern Med. 267 (1), 44-53 (2010).
- Philipp, A., Dehshahri, A., Wagner, A., E, Simple modifications of branched PEI lead to highly efficient siRNA carriers with low toxicity. Bioconjug Chem. 19 (7), 1448-1455 (2008).
- Hunter, A. C. Molecular hurdles in polyfectin design and mechanistic background to polycation induced cytotoxicity. Adv Drug Deliv Rev. 58 (14), 1523-1531 (2006).
- Andrews, P. M., Bates, S. B. Dose-dependent movement of cationic molecules across the glomerular wall. Anat Rec. 212 (3), 223-231 (1985).
- Ananta, J. S., et al. Geometrical confinement of gadolinium-based contrast agents in nanoporous particles enhances T1 contrast. Nat Nanotechnol. 5 (11), 815-821 (2010).
