Abstract
Att förstå de tidiga hetero samspelet mellan cancerceller och den omgivande godartade stroma är viktigt att belysa de händelser som ledde till stromal aktivering och etablering av tumören mikro (TME). Flera in vitro och in vivo-modeller av TME har utvecklats; men i allmänhet är dessa modeller inte lätt tillåter isolering av enskilda cellpopulationer, under icke-störande förhållanden, för vidare studier. För att kringgå denna svårighet, har vi använt ett in vitro-TME modell med användning av en celltillväxtsubstrat bestående av ett permeabelt mikroporöst membran insert som medger enkel generering av höggradigt anrikade cellpopulationer odlas intimt, men separat, på vardera sidan av insatsen membran för utökad co -kultur gånger. Genom användning av denna modell, vi kan generera berikat cancer-associerade fibroblaster (CAF) populationer från normala diploida humana fibroblaster eftersamodling (120 h) med mycket metastatiska humana bröstkarcinomceller, utan användning av fluorescerande märkning och / eller cellsortering. Dessutom, genom att modulera porstorlek av insatsen, kan vi kontrollera för läget för kommunikationen mellan (t.ex. gap-junction kommunikation, utsöndrade faktorer) mellan de två heterocellpopulationer, som medger undersökning av mekanismerna bakom utvecklingen av TME även betydelsen av gap-junction permeabilitet. Denna modell fungerar som ett värdefullt verktyg för att öka vår förståelse av de inledande händelser som leder till cancer-stroma initiering, den tidiga utvecklingen av TME och modulerande effekten av stroma på svaren från cancerceller till terapeutiska medel.
Introduction
Tumören mikro (TME) är ett mycket komplext system bestående av cancerceller som samexistera och utvecklas tillsammans med värd stroma. Detta stromal komponent består typiskt av fibroblaster, myofibroblaster, endotelceller, olika immun komponenter, samt en extracellulärmatrix en. En betydande beståndsdel, ofta majoriteten av stroma, aktiveras fibroblaster, ofta kallad cancerassocierade fibroblaster eller karcinom-associerade fibroblaster (CAF) 2,3. Till skillnad från normala, icke-aktiverade fibroblaster, CAFS bidra till tumör initiering, progression, angiogenes, invasion, metastas, och återkommande 4-11 i en mängd olika karcinom, inklusive bröst, prostata, lunga, pankreas, hud, kolon, matstrupe, och äggstock 5,6,12-17. Men den exakta naturen av bidraget från CAFS hela cancer patogenes förblir dåligt definierad. Dessutom har kliniska bevis visat ett prognostiskt värde av CAFS, Korrelera sin närvaro till höggradig maligniteter, terapisvikt, och övergripande dålig prognos 10,18,19.
Tydligt, öka vår förståelse av de inledande händelser i CAF utveckling, liksom de inter kommunikation som förmedlar sin roll inom TME, kan ge spännande nya terapeutiska mål och förbättrade strategier som skulle kunna förbättra behandlingsresultat. Mot detta mål, flera in vivo och in vitro-modeller har utvecklats. Medan in vivo metoder är mer reflekterande av patienternas TME, de har begränsningar, bland annat den enorma komplexitet och heterogenitet både inom och mellan tumörer. Dessutom tumörprover från försökspersoner ofta representerar högt utvecklade TME och inte tillåter en förståelse för TME initierande händelser. Experimentella djurstudier har vissa fördelar, men generalisering av djurdata till människor bör göras med försiktighet på grund av skillnader i physiology mellan människa och djur, såsom gnagare (t ex, tiol kemi 20, ämnesomsättning 21, tolerans att betona 22, etc.). Vidare, till skillnad från den mänskliga befolkningen, som är genetiskt heterogen till sin natur, laboratoriedjur vanligtvis föds till homogenitet. Dessutom är det ofta svårt att undersöka transienta fysiologiska variationer och cellfenotyp förändringar, liksom att kontrollera för specifika experimentella parametrar som använder djur som gnagare. Således, in vitro 2- och 3-dimensionella (2D och 3D) vävnadsodlingsmodeller ofta utnyttjas för att främja grundläggande förståelse för TME utveckling. Trots sin brist på en rättvisande bild av komplexiteten i in vivo-system, dessa modeller erbjuder fördelar som kraftigt underlättar mekanistiska undersökningar. In vitro-modeller möjliggör en enklare, fokuserad och kostnadseffektiv analys av TME, varvid statistiskt signifikant data som kan genereras iceller fria från systemvariationer som uppstår i djur.
Det finns flera varianter av in vitro-system. De två vanligaste TME in vitro-modeller består av blandade enkelskikt eller sfäroida cellkulturer. Båda odlingsmetoder är fördelaktiga för grundläggande studier av intercellulära interaktioner (t.ex. normala celler med tumörceller) och för analys av olika TME specifika förändringar cell fenotyp (t.ex. uppkomsten av cancerassocierade fibroblaster från normala fibroblaster). Dessutom sfäroiderna kan skapa en mer reflekterande vävnadsliknande struktur av TME, och kan vara representativa för tumör heterogenitet 23. Men sfäroider producerar ofta mycket varierande syrespännings gradienter över lager, vilket kan komplicera experimentella slutsatser 24. Tyvärr är båda modellerna ytterst begränsade i sin förmåga att isolera rena cellpopulationer för ytterligare karakterisering och studie efter samarbetekultur. Att göra så skulle kräva åtminstone en celltyp att vara fluorescerande-taggade eller märkta med ett identifierande maker, och sedan utsätta den blandade sam-kultur till omfattande bearbetning och cellsortering för att separera cellpopulationer. Medan en cellsorterare är i stånd att isolera en ganska ren cellpopulation, måste man vara medveten om cellulär stress och eventuella mikrobiella kontamineringsrisker 25.
För att underlätta förståelsen av intercellulär kommunikation, har stora ansträngningar ägnats åt att utveckla och optimera in vitro-system som nära efterliknar in vivo miljö, medan den tillåter en förenklad metod. Ett sådant verktyg är det genomsläppliga mikro insatsen, en membransubstrat som först utvecklades 1953 26 och därefter anpassas för olika tillämpningar och studier (t.ex. cell polaritet 27 endocytos 28 läkemedelstransport 29, vävnadsmodellering 30, FERTsering 31, kringstående effekten 32,33, etc.). Detta system gör det möjligt att tillväxten av celler med in vivo-liknande anatomisk och funktionell differentiering, liksom uttryck av många in vivo markörer 34,35 som inte observeras när de odlas på ett ogenomträngligt plasten. Dessutom extremt tunna porösa membran (10 ^ m tjock) tillåter snabb diffusion av molekyler och jämviktstider, som simulerar in vivo miljö och tillåter oberoende cellulär funktion på både de apikala och basolaterala cell domäner. En ytterligare fördel med insatsens användbarhet som ett TME system är dess fysikalisk separation av två heterotypiska cellpopulationer som odlats på vardera sidan av membranet i samma miljöförhållanden, under upprätthållande av olika former av intercellulär kommunikation genom membranporerna. Men fysiskt separerade, är de två cellpopulationer metaboliskt kopplad via utsöndrade element och, såsom debeskrivs här, också genom gap-Junktional kanaler. Dessutom, genom att upprätthålla skären vid in vivo partiell syrespänning (PO 2), reducerar modellen komplikationerna av syre- och kemiska gradienter som observerats i andra system. Snarare ökar förståelsen för naturliga mekanismer som styr TME. Särskilt kan de två cellpopulationer enkelt isoleras med hög renhet, utan fluorescerande märkning och / eller cellsortering efter längre perioder av samodling.
Här beskriver vi en in vitro-TME-protokollet består av human bröstkarcinomceller och humana fibroblaster odlas, respektive, på ömse sidor om ett permeabelt mikroporöst membran insatsen, men ändå i en kontinuerlig dubbelriktad kommunikation genom membranporerna. Vi visar att genom att använda membran med olika porstorlekar, bidraget från en viss typ av kommunikationen mellan (t.ex. utsöndrade faktorer kontra gap junctions) till utvecklingav TME kan undersökas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Beredning av odlingsmedia och celler
- Bereda 500 ml av Eagles minimala essentiella medium kompletterat med 12,5% (vol / vol) värmeinaktiverat fetalt bovint serum (FBS), 2 mM L-alanyl-L-glutamin och 100 enheter penicillin och 100 | ig streptomycin per ml.
OBS: tillväxtmedium och supplement (er) kan lätt bytas ut mot tillväxtkrav andra cellstammar eller cellinjer. - Förbered 70 ul av cellodlingsmedium för varje insats (6-brunnsformat infoga): Eagles minimala essentiella medium kompletterat med 50% (vol / vol) värmeinaktiverat FBS, 2 mM L-alanyl-L-glutamin och 100 enheter av penicillin och 100 | ig streptomycin per ml.
OBS: Mediet kompletterades med 50% FBS för att underlätta cellvidhäftning till bottensidan (dvs. undersidan) av skäret. Tillväxtmediet och supplement (er) kan lätt bytas ut mot tillväxtkrav andra cellstammar eller cellinjer. - Förbereda en cellsuspension av cellerna destinerade som skall pläteras på bottensidan av skäret.
OBS: Här var de resultat som uppnås med hjälp av AG1522 normala humana fibroblaster odlas i 75 cm 2 cellodlingsflaskor, och dessa celler kommer därför att vara i fokus för beskrivningen av cellsuspensionen förberedelser. - Att samla upp celler, avlägsna tillväxtmediet och tvätta monoskiktet av celler 2x med 5 ml 1x Fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
- Avlägsna PBS och spreds 1 ml 0,25% (vol / vol) trypsin med 2,21 mM etylendiamintetraättiksyra (EDTA), värmts upp till rumstemperatur (RT) över cellerna för 2 min vid RT (rumstemperatur).
- Släck trypsin aktivitet med 9 ml av komplett odlingsmedium (framställt i steg 1,1) och samla cellerna genom att försiktigt pipettera cellsuspensionen över ytan av kolven 10x.
- Bestämma cellkoncentrationen med hjälp av en hemocytometer eller elektronisk räknare och pipettera cellsuspensionen volym som kommer provide 250.000 celler per insats i en steril 15 ml centrifugrör.
- Pelle cellsuspensionen genom centrifugering (800 x g, 2 min). Suspendera cellpelleten med tillväxtmedium (framställt i steg 1,2) för att skapa en koncentration av 250.000 celler per 70 | il.
OBS: Som cellodling i permeabla mikroporösa membraninsatser är baserad på 2D-substrat, är cellsådd fördes i likhet med undantag cellerna bör till en början suspenderas i medium innehållande 50% (vol / vol) FBS att underlätta fastsättning.
2. Framställning av Inserts
OBS: För att säkerställa sterila förhållanden, arbete i ett laminärt flöde skåp biologisk säkerhet tillägnad cellkultur.
- Välj skär med ett membran porstorlek av 0,4 pm, en pm eller 3 pm (bestäms av den experimentella intresse (s), som porstorlek kan användas för att undersöka betydelsen av olika typer av kommunikationen mellan).
OBS! 0,4 fim por är small tillräckligt för att begränsa bildandet av funktionella kanalforbindelser mellan celler på vardera sidan av insatsen membran och kan användas för att studera kommunikationen mellan av utsöndrade faktorer. Medan de 1 pm och 3 pm porer är tillräckligt stora för att tillåta bildning av funktionella kanalforbindelser och kan användas för att studera kommunikationen mellan både kanalförbindelser och utsöndrade faktorer. - Ta bort enskilda insatser ur förpackningen och placera i en lika stor flera brunnar skålen.
OBS: Skär finns med olika membranytor för att passa specifika behov (t.ex. 6 brunnar, 12 brunnar, och 24-hålsinlägg.). Här var de erhållna resultaten med hjälp av sex brunnar insats, och kommer därför att vara i fokus för modellbeskrivningen. - Täck skålen, som innehåller de skären med skålen lock. Håll flera brunnar skålen med båda händerna, vänd försiktigt skålen så att insatsen bottnar (dvs undersidan) är nu uppåt.
- avlägsna the botten av flerbrunnsskål, utsätta bottensidan av skären. Att arbeta med en insats i taget, använd en steril pincett och försiktigt hålla insatsen på plats. Med den fria handen, använd en pipett med en bred mun spets för att dra 70 pl av cellsuspensionen (framställd i steg 1,3-1,8), innehållande 250.000 celler.
- Till tallrik cellerna, placera pipettspetsen försiktigt på centrum av skäret membran, och långsamt pipettera 70 ul av cellsuspension under långsam förflyttning av pipettspetsen runt ytan av membranet. Var noga med att inte förlänga pipettspetsen och cellsuspension till kanten av insatsen.
OBS: rör vid kanten på insatsen kan leda till förlust av kapillär spänning av cellsuspensionen som leder till cellerna har torkat ut under fastsättning. - Upprepa för återstående insatser, med omsorg utövas inte arbeta direkt över de exponerade insatserna för att undvika potentiell mikrobiell förorening.
- återvända försiktigt flera brunnarmaträtt botten för att täcka insatserna. Hålla skålen med skär inverterad, inkubera i en fuktad luftatmosfär av 5% (volym / volym) CO2 vid 37 ° C under 30-45 min.
OBS: Om cellsuspensionen på insert i kontakt med botten av brunnen, lyft försiktigt skålen botten och vilar den på kanten av skålen toppen, så att den bildar en liten vinkel och skapar större separation mellan ytan av skålen och bottensidan av skären (där cellerna ympas). Detta kommer att förhindra cellerna från att fästa till ytan av brunnarna i stället för insatsen. - Efter 30-45 min inkubationstid, försiktigt bort skålen innehåller skären och placera den i laminärt flöde biologiska säkerhetsskåp.
- Med två händer och hålla skålen locket tätt, försiktigt åter invertera skålen så att undersidan av skären innehåller bifogade cellerna nu står inför ner.
- Långsamt och försiktigt 2 ml (1 ml för 3 um por insatser för att undvika migratipå av celler genom insatsen porer) av pre-warmed fullständigt medium (se steg 1,1) till varje brunn, så att botten av insatsen är nedsänkt.
- Efter tillsats av odlingsmedium i alla brunnar innehållande insatser, placera skålen tillbaka i befuktad inkubator.
- Tillåta skären att förbli ostörd i inkubatorn under 48 h. Efter 48 h, mata cellerna genom att aspirera de 2 ml medium från botten av brunnen och tillsats av 2 ml färskt tillväxtmedium.
- Efter tillsats av färskt medium till botten av brunnen, frö 1 ml av den andra cellpopulationen suspension (~ 250.000 celler / ml) på den övre sidan av insatsen, som redan har den första cellpopulationen växer på bottensidan (för dessa experiment, är AG1522 (kontroll) celler eller cancer (experimentella) celler ströks ut på toppen av skären, som redan har AG1522-celler, förutbestämd att bli CAFS, växer på bottensidan av skären). Placera skålen tillbaka in i befuktad inkubator.
OBS: Om arbeteing med celler som inte vidhäftar väl till botten av insatsen, kan dessa celler alternativt odlas på den övre sidan av skäret. - Ändra mediet vid 24, 72, och 96 h efter sådd den andra populationen av celler på den övre sidan av skäret genom att aspirera mediet från toppen av insatsen och botten av brunnen. Försiktigt tillsätt 1 ml färskt medium till den övre sidan av skäret och 2 ml till botten av brunnen. Tillåta de två cellpopulationer att stanna kvar i samodling på vardera sidan av det permeabla mikroporösa insatsmembran för 120 timmar.
3. Samla Celler från Insert genom trypsinering
OBS: Förutom lätt att få anrikade cellpopulationer, insats TME modellen ger också liknande experimentella behandlingar (t.ex. inkubation med kemikalier, exponering för syreförhållanden som ligger över eller under omgivande atmosfär, joniserande strålning, etc.) som andra in vitro (t.ex., in situ immundetektering, Western blotting) eller propageras för efterföljande experiment 36.
- Att samla upp celler, avlägsna insatsen från tillväxtmediet och placera den i en 35 mm cellodlingsskål innehållande en ml PBS. Tvätta botten- och topp sidor av insatsen 1x med 1 ml PBS.
- Ta bort PBS och tillsätt 200 pl 0,25% (vol / vol) trypsin med 2,21 mM EDTA, värmts upp till rumstemperatur.
- Om uttag av de celler som odlats på undersidan av insatsen, placera trypsin lösningen i 35 mm skål och placera försiktigt botten av insatsen in i trypsinlösning under 2 minuter vid RT.
- Om samla cellens odlas på den övre sidan av insatsen, placera in insatsen i en 35 mm skål och tillsätt trypsinlösning till toppen av insatsen och inkubera under 2 min vid rumstemperatur.
- Släck trypsinaktiviteten genom att tillsätta 800 | il komplett tillväxtmedium.
- Om uttag av de celler som odlats på botten av insatsen, lägga tillväxtmedium till 35 mm skål och samla cellerna genom att försiktigt pipettera 1 ml av cellsuspension över ytan hos insatsen 10x, med insatsen hålls på en liten vinkel, så att cellsuspensionen samlar in i skålen.
- Om samla cellerna från den övre sidan av insatsen, lägga tillväxtmediet mot ovansidan och försiktigt pipettera 1 ml av cellsuspension över ytan av insatsen 10x.
4. Karakterisering av Cell Renhet med flödescytometri
OBS: För att karakterisera förmågan hos de permeabla mikroporösa membraninsatser för att upprätthålla renheten hos than två cellpopulationer (dvs övre och nedre) för upp till 120 timmar, 1-3 §§ utfördes, med grönt fluorescerande protein (GFP)-märkt MDA-MB-231-celler som ströks ut på ovansidan av insatsen, och icke-GFP-märkta AG1522-celler pläteras på bottensidan av 0,4 μm-, en μm-, eller 3 | j, m pore skär.
- När cellerna från den nedre sidan av insatsen uppsamlades (förfarande som beskrivs i avsnitt 3), pelletera cellsuspensionen genom centrifugering (500 g, 30 sek).
- Avlägsna supernatanten och suspendera cellpelleten i 400 | il Hanks balanserade saltlösning (HBSS) kompletterat med 1% (vol / vol) FBS.
- Utföra cytometrisk analys på en flödescytometer utrustad med en 488 nm laser för att excitera GFP och ett bandpassfilter av 530/30 för att detektera GFP fotonemission 37.
- För identifiering cell ändamål använder AG1522 kontroll cellpopulationer att justera framåt och Side Scatter spänningar på flödescytometern. JusteraGFP kanal spänning för att ställa in den cellulära autofluorescens värde som den nedre skiktgränsen för GFP signaldetektering.
- Bestäm slusströskeln med hjälp av kontrollceller. Bedöma renheten hos varje cellpopulation baserat på närvaron av GFP-positiva celler kontra kontrollen.
OBS: En ren population skulle återspegla inga GPF-positiva celler detekteras.
5. Karakterisering av celler genom in situ Immunofluorescens
- Efter trypsinering av celler från insatsen (se avsnitt 3), samla celler, plattan 5 x 10 4 celler i 250 pl odlingsmedium (se steg 1,1) på sterila täckglas, och låt fästa under en timme i en fuktad luftatmosfär av 5% (vol / vol) CO2 vid 37 ° C inkubator.
- Vid slutet av inkubationen försiktigt bort skålen som innehåller täck och placera den i laminärt flöde biologiska säkerhetsskåp.
- Tillsätt försiktigt 2 ml förvärmda fullständigt medium (se steg1,1) till varje skål, så att täckglaset är nedsänkt.
- Efter tillsats av odlingsmedium till alla skålar innehållande täckglas, återgå skålarna till en fuktad luftatmosfär av 5% (volym / volym) CO2 vid 37 ° C i en inkubator under 48 timmar.
- Efter den 48 timmars inkubation, tvätta prov 3x med PBS och fixa med 4% (vikt / volym) formaldehyd i PBS under 10 min vid RT.
- Skölj 5x med Tris-buffrad saltlösning (TBS: 50 mM Tris-Cl, pH 7,5, 150 mM NaCl) och sedan permeabilisering med 0,25% (vol / vol) Triton X-100, 0,1% (vikt / vol) saponin under 5 minuter vid RT.
- Blockera icke-specifika bindningsställen med 2% (vol / vol) normalt getserum (NGS), 1% (vikt / volym) bovint serumalbumin (BSA), 0,1% (vol / vol) Triton X-100 i TBS (blockering lösning) under 1 h vid RT.
- Inkubera med primär antikropp (anti-Caveolin 1 (CAV1), 1: 1000) i blockerande lösning vid 4 ° C över natten.
- Tvätta bort obundna primära antikroppar (3x, 5 min / tvätt) med 0,2% NGS (vol / vol), 1% (vikt / volym) BSA, 0,1% (vol / vol) Triton X-100 i TBS (tvättlösning).
- Inkubera med sekundär antikropp vid RT under 1 timme i blockeringslösning (se avsnitt 5.4).
- Tvätta obunden sekundär antikropp (3x, 5 min / tvätt) med tvättlösning (se steg 5,6).
- Mount täck på en bild med en anti-fade monteringsmedium innehållande 4 ', 6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) och försegla med nagellack.
- Observera celler med hjälp av en 63x förstoring olja mål på ett inverterat mikroskop utrustat med en extern ljuskälla för fluorescens excitation, och ta bilder med hjälp av en bifogad digital kamera för efterföljande analys.
6. Karakterisering av celler genom Western Blot
OBS: Western blot förfarande beskrivs på annat håll 38. En kort sammanfattning beskrivs här:
- Efter avlossning av celler från insatsen genom trypsinering (se avsnitt 3), pellets cellsuspensionen genom centrifugering (500 g, 30 sek).
- Avlägsna supernatanten och suspendera cellpelleten 2x med 100 pl PBS.
- Avlägsna supernatanten och lyserar celler i 50 | il modifierat analys med radioimmunoprecipitation (RIPA) buffert (Tris pH 7,5 50 mM, NaCl 150 mM, NP40 1% (vol / vol), natriumdeoxikolat monohydrat (DOC) 0,5% (vol / vol), natriumdodecylsulfat (SDS) 0,1% (volym / volym)), innehållande proteas och fosfatas-inhibitor cocktail.
- Inkubera i 20 minuter på is och centrifugera vid 19000 g under 15 min vid 4 ° C.
- Bestäm koncentrationen av proteiner i supernatanten med hjälp av ett protein optisk densitet analys kompatibel med tvättmedel i RIPA-buffert.
- Separata proteiner genom natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektrofores (SDS-PAGE) och elektroblot på en 0,2 | im nitrocellulosamembran.
- Inkubera membranen i TBS innehållande 0,1% (vol / vol) Tween-20 (TBST) och 4% (vikt / vol) skummjölk (blockeringslösning) under 60 min och reagerar med primär antikropp vid 4 ° C över natten (anti-CAV1, 1: 1000).
- Tvätta membran 3x med TBST vid RT (5 min / tvätt).
- Inkubera membranen i 30 min i blockerande lösning innehållande en anti-mus sekundär antikropp konjugerad med pepparrotsperoxidas (HRP) (1: 5000).
- Tvätta membran 3x med TBST vid RT (5 min / tvätt).
- Visualisera reaktionsprodukter genom kemiluminescens med användning av en Western-blotting detektionssystem.
7. Karakterisering av intercellulär kommunikation med flödescytometri
OBS: För att karakterisera anpassningsförmåga hos det permeabla mikroporösa membranet insatser för att undersöka olika typer av intercellulär kommunikation (t.ex. utsöndrade faktorer, gap junctions). Sektionerna 1-2.12 utfördes med icke-fluorescerande AG1522-celler pläteras på bottensidan av 0,4 μm-, en μm-, eller 3 ^ m-porer skär.
- Kultur omärkt AG1522-celler i en 35 mm maträtt till 90% sammanflytning med hjälp av medel som beskrivs i avsnitt 1.1.
- RInse celler 1x med 1 ml HBSS.
- Lastceller med kalcein AM genom inkubation celler i HBSS innehållande 30 ^ M kalcein AM.
- Inkubera i 15 min i en fuktad luftatmosfär av 5% (volym / volym) CO2 vid 37 ° C.
- Tvätta cellerna 2x med 1 ml HBSS.
- Trypsinisera cellerna genom tillsats av 200 | j, l lösning av 0,25% (vol / vol) trypsin med 2,21 mM EDTA under 2 min vid RT.
- Släck trypsinaktiviteten genom att tillsätta 800 | il komplett medium innehållande 12,5% (vol / vol) FBS.
- Bringa celler i suspension genom upprepad pipettering.
- Bestämma cellkoncentrationen med hjälp av en hemocytometer eller elektronisk räknare och plattan 250.000 celler laddade med kalcein AM till den övre sidan av skär som redan har AG1522 celler som växer på undersidan.
- Inkubera skären i en fuktad luftatmosfär av 5% CO2 vid 37 ° C under 6 timmar.
- Efter 6 h, samla celler från bottensidan av skären, såsom beskrivitsi avsnitt 3.
- Pelle cellsuspensionen genom centrifugering (500 g, 30 sek).
- Avlägsna supernatanten och suspendera cellpelleten i 400 | il HBSS supplementerat med 1% (vol / vol) FBS.
- Analysera cellerna på en flödescytometer utrustad med en laser och filtrera kunna spännande och upptäcka utsläpp av kalcein (496 nm och 516 nm, respektive), enligt tillverkarens protokoll.
- För identifiering cell ändamål använda en ofärgad AG1522 kontroll cellpopulation att justera framåt och Side Scatter spänningar på flödescytometern. Justera kanalspänningen kalcein att ställa in cell autofluorescens värde som den nedre skiktgränsen för Calcein signaldetektering.
- Bestäm övre gränsvärdet med hjälp av kalcein-laddade kontrollceller. Bedöma kommunikation för varje cell insats baserat på närvaron av Calcein-positiva celler kontra kontrollen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Här har vi anpassat ett permeabelt mikroporöst membran insats för att utveckla ett in vitro hetero cell co-kultursystem som härmar in vivo tumörmikro (Figur 1). Detta system möjliggör för två olika cellpopulationer som skall odlas på vardera sidan om insatsens porösa-membran under längre tidsperioder (upp till 120 h, i vår användning). Viktigare systemet är i stånd att bibehålla renheten hos de cellpopulationer, såsom bestämt genom utstrykning GFP-märkta MDA-MB-231-celler på ovansidan av 0,4-, 1-, eller 3 m-pore skär och tillåta dem att växa i samodling med AG1522-celler som växer på undersidan av skäret, till 120 timmar. Efter denna tid uppsamlades cellerna från bottensidan av insatsen och analyserades med flödescytometri för att identifiera närvaron av någon GFP-positiva MDA-MB-231-celler, vilket skulle tyda på en förlust av cellpopulation renhet. Analys visade 99,9% och 99,8% pure populationer från 0,4 och 1 um porer skär respektive; emellertid insatsen med 3 | j, m porer inte kunde upprätthålla separationen av cellpopulationer, såsom porerna var tillräckligt stora för att medge ett betydande antal av de GFP-positiva MDA-MB-231-celler att migrera över membranet (Figur 2) .
Viktigt är genom in situ immunofluorescens och Western blot-analys kunde vi påvisa förmågan hos detta system för att effektivt generera cancerassocierade fibroblaster från normal human diploida AG1522 fibroblaster efter samodling med MDA-MB-231 bröstcancerceller, som bestäms av reducerat uttryck av Caveolin-1, en väletablerad CAF biomarkör 39-42 (Figur 3). CAV1 är en byggnadsställning protein som bildar caveolae i lipidaggregat domän av plasmamembranet, som är involverat i multipla cellulära processer 43. I Western blötAdes två distinkta band observeras, motsvarande a- och p-isoformer av CAV1 44. Tyvärr lite är känt om skillnaden (s) mellan isoformerna, särskilt deras roll som CAF biomarkörer.
Vi har också visat den färdighet av insatsen samodlingssystemet att modulera intercellulär kommunikation mellan de två heterotypiska cellpopulationer (figur 4). Icke-märkta, gap-junction behöriga humana diploida AG1522 fibroblaster odlades till sammanflytning på bottensidan av skäret. En andra uppsättning av AG1522-celler laddades med kalcein AM, en grönfluorescerande gap-junction permeabla färgämne, och ströks ut på översidan av skäret. De två cellpopulationer tilläts kommunicera i 6 h, och sedan cellerna på bottensidan av insatsen isolerades och analyserades med flödescytometri. Calcein-positiva celler från bottensidan av insatsen skulle vara reflekterande av celler som esblerat gap-Junktional koppling genom insatsen porer. Storleken på 0,4 | j, m por infoga begränsad funktionell gap junction bildning mellan celler som växer på vardera sidan av insatsen och därigenom hindra kommunikation till utsöndrade faktorer (t.ex., tillväxtfaktorer, mikrovesiklar, etc.). Alternativt kan storleken av de 1 ^ m och 3 | j, m porer är uppenbarligen tillräckligt stor för att tillåta funktionell koppling av cellerna genom kanalförbindelser. Därför genom att modulera porstorlek, kan man börja förstå de olika roll (s) att olika former av intercellulär kommunikation kan ha på TME utveckling och evolution.
Figur 1:. Diffusionsöppen mikroporösa membranet in Model Scheme (a) Tydligen normala humana diploida AG1522 fibroblaster (lågt passageceller) förutbestämd att bli CAFS ympas på inverteradpermeabla mikroporösa skär bestående av en 10 um tjock polyestermembran med 0,4 um, en pm eller 3 pm porer. Efter bindning, är skären inverteras och placeras i brunnarna på plattor och odlades till sammanflytning. (B) Cancerceller och kontroll fibroblaster odlas separat i kolvar innan de såddes på översidan av skären med fibroblaster växer intimt på undersidan. (C) De samodlade celler matas varannan dag och bibehålls under önskad tid. (D) vid respektive tidpunkter efter samodling och / eller experimentella behandlingar, är CAFS (undersidan av skären) och / eller cancerceller (övre sidan av insatsen) noggrant isoleras genom trypsinisering, vilket ger mycket rena cellpopulationer, som kan användas för analys av endpoints eller propageras för senare studier. klicka häratt se en större version av denna siffra.
Figur 2:. Generering av höganrikat cellpopulationer Representativa flödescytometri resultat demonstrerar förmågan hos insatsen för att bibehålla kraftigt anrikad, men ändå oberoende heterotypiska cellpopulationer efter 120 h samodling. (A) AG1522 celler skördade från bottensidan av 0,4 | j, m por insert visar 99,9% av befolkningen att vara fri från GFP-märkta MDA-MB-231-celler som växer på ovansidan av insatsen (nedre vänstra kvadranten). (B) AG1522 celler skördade från bottensidan av en fim por insert visar också 99,8% anrikad population (nedre vänstra kvadranten). (C) AG1522 celler skördade från bottensidan av 3 | j, m pore insert avslöjar att endast 68,5% av befolkningen är fri från GFP-märkta celler (nedre vänstra kvadranten), Vilket tyder på att ett stort antal av GFP-positiva MDA-MB-231-celler kunde migrera genom 3 pm porer. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3:. Bildning av cancerassocierade fibroblaster minskat uttryck av CAV1 är en konsekvent och pålitlig CAF biomarkör. (A) Mikroskopiska bilder av in situ immunofluorescens (skala bar = 20 pm), och (b) Western blot-analys av CAV1 i AG1522-celler som hade varit i samodling med AG1522-celler (kontroll) (vänster), eller med MDA- MB-231 bröstcancerceller (höger) för 120 timmar. Färgning med Ponceau S Red användes för lastning kontroll och bestämma faldig förändring i Western blöts. Resultaten är representativa förtre separata experiment. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4:. Modulering av intercellulär kommunikation genom insats porstorlek Flödescytometri analyser som visar anpassningsförmåga hos det permeabla mikroporösa membranet insats TME modell för att välja olika typer av intercellulär kommunikation mellan kalcein AM laddade AG1522-celler som växer på toppen av insatsen och AG1522 kontroll celler som växer på sin bottensida. (A) Celler skördade från bottensidan av 0,4 | j, m pore skär visar mycket låga nivåer av kalcein-positiva celler (0,57%), vilket indikerar begränsat gap-junction kommunikation genom insats porer. (B) Celler som skördats från undersidan av 1 pm porer insatser visar higher nivåer av kalcein-positiva celler (9,98%), vilket indikerar bildning av funktionella kanalforbindelser. (C) Celler som skördats från undersidan av 3 um porer insatser visar höga nivåer av kalcein-positiva celler (87,8%), vilket tyder på omfattande spalt Junktional kommunikation. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollet som beskrivs här är en enkel, anpassningsbar in vitro förfarande (figur 1) som utnyttjar ett genomträngligt mikroporöst membran insatsen generera höganrikat individuella cellpopulationer från en samodling av hetero celler. Betecknande nog är modellen lämpar sig för att undersöka olika typer av intercellulär kommunikation. De kritiska stegen inkluderar att välja den lämpliga porstorlek insatsen för specifik experimentell intresse (s), sådd den första cellpopulationen på bottensidan av skäret i medium kompletterat med 50% FBS, sådd den andra cellpopulationen på den övre sidan av infoga, och co-odling av de två distinkta cellpopulationer under en lämplig tid tid. Vi visar att detta system är i stånd att imitera olika in vivo egenskaper, vilket ger en större möjlighet att förstå den molekylära, fenotypiska och latenta förändringar som sker under tidig TME evolution, som behandlar en stor disadvantage av många etablerade TME in vitro-modeller (figur 2).
Modellen kan lätt modifieras för att tillåta undersökning av olika aspekter av cell-cell interaktioner i cancer stroma utveckling och TME evolution (Figur 4). Medan 0,4 fim por insatsen medger intim koppling mellan de två cellpopulationer 45, avsevärt begränsar bildandet av funktionella kanalforbindelser mellan celler odlade på vardera sidan av insatsmembran (Figur 4). Därför, vilket underlättar undersökning av rollen av diffunderbara faktorer (t.ex. tillväxtfaktorer) och / eller extracellulära vesiklar (t.ex. exosomes), som förmedlar CAF utveckling 46-48. Alternativt, 1 | j, m och 3 | j, m porer är tillräckligt stora för att tillåta bildning av funktionella kanalforbindelser, vilket sålunda medger studier av både direkt metabolisk koppling via junctionala kanaler och indirekt kommunikation genomdiffunderbara utsöndrade faktorer. Emellertid, som den 3 ^ m por insert tillåter cellmigration genom porerna (se figur 2), betyder det inte att upprätthålla renheten av två separata heterotypiska cellpopulationer under förlängda sam-odlingstider (eg., 120 h). Den nuvarande modellen möjliggör studier av flera aspekter av TME, är den begränsad i sin förmåga att redogöra för många av de komplexa fysiologiska samspel som sker inom ett in vivo TME (t.ex. vaskulära vätske utbyten, etc.).
Att förstå de tidiga händelserna i cancer-stroma aktivering och utveckling av TME är viktigt att belysa stegen inblandade i primärtumör initiering och progression, samt metastaser. Det är nu allmänt accepterat att cancern glatta särskilt CAFS, har en avgörande roll för att stödja carcinogenes (översikt i 49). Detta har lett till utvecklingen av många i vitro 2D- och 3D-modeller, måled på lysande strategier för att rikta de tidiga mekanismer som bidrar till stromal-aktivering och tumörprogression. Tyvärr har många av dessa modeller är begränsade av deras oförmåga att medge isolering av individuella cellpopulationer, utan tidsödande och påfrestande bearbetning, för vidare studier. Således detta protokoll ger ett betydande tillskott till området för TME forskning, eftersom den kombinerar in vivo liknande egenskaper med möjligheten att enkelt och snabbt få höganrikat eller rena cellpopulationer för omedelbar analys eller förökning för senare studier.
När tekniken behärskas kan insatsen TME modell utnyttjas för att undersöka diverse TME dubbelriktade interaktioner (t.ex. cancer till endotel, cancer till immunceller, etc.). Dessutom, kan komplexiteten i samodling förstärkas genom att placera en blandad cellpopulation på en sida av insatsen och en enda population på den alternativa sidan, på så sätt fåing en mer in vivo som TME cellpopulation komplexitet. Dock bör försiktighet iakttas vid val av en insats med rätt porstorlek om användning av celler av särskilt liten diameter (t.ex. humana lymfocyter med en diameter på ~ 7 pm 50), eftersom de kan vara i stånd att migrera genom de mindre porerna ( t.ex., 0,4 | j, m eller 1 | j, m). Före co-kultur, kan migrationsförsök (Figur 2) vara motiverat för att säkerställa upprätthållandet av rena cellpopulationer genom utökade samodling experiment.
Denna modell är också mottaglig för att undersöka effekterna av olika terapeutiska utmaningar (t.ex. joniserande strålning, kemoterapeutika, hypertermi) och fysiologiska förändringar (t.ex. hypoxi, hyperoxia, biologiska hämmare) i blandade cellpopulationer som är kopplade över det permeabla mikroporösa membranet insats. Modellen har visat sin förmåga att framgångsrikt generera CAFS, identified av en allmänt accepterad CAF biomarkör (dvs., nedreglering av CAV1) 39-42 (figur 3), som ytterligare minskades med 55% när insatsen systemet hölls vid in vivo som PO 2 (7 mm Hg; 0,5% O 2) 51, med fokus på modellens anpassningsförmåga för olika experimentell design och villkor (data visas ej). Sammanfattningsvis ger denna modell en förenklad metod och en möjlighet att modulera tids och externa faktorer för att få djupare insikter i cancer stroma aktivering, den tidiga utvecklingen av TME och cellulära svar på terapeutiska eller miljöfarliga ämnen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande eller motstridiga intressen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| For Cell Culture | |||
| AG01522 (i.e., AG1522) human diploid fibroblast | Coriell | 107661 | Passage 8-13 |
| MDA-MB-231-luc-D3H1 breast adenocarcinoma cell line | PerkinElmer | 119261 | Parental line: ATCC (#HTB-26) |
| MDA-MB-231/GFP breast adenocarcinoma cell line | Cell Biolabs | AKR-201 | |
| Eagle's minimal essential medium (MEM) | Corning Cellgro | 15-010-CV | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Qualified | Sigma | F6178-500mL | |
| Corning Glutagro Supplement (200 mM L-alanyl-L-glutamine) | Corning Cellgro | 25-015-Cl | |
| Penicillin Streptomycin Solution, 100x | Corning Cellgro | 30-002-Cl | |
| Transwell Insert (i.e., permeable microporous membrane insert) (0.4 μm pore) | Costar | 3450 | |
| Transwell Insert (i.e., permeable microporous membrane insert) (1 μm pore) | Greiner bio-one | 657610 | |
| Transwell Insert (i.e., permeable microporous membrane insert) (3 μm pore) | Costar | 3452 | |
| 6-well Culture Plate | Greiner Bio-One Cellstar | 657160-01 | |
| 75 cm2 cell culture flask | CellStar | 658 170 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS), 1x | Corning Cellgro | 21-040-CV | without calcium & magnesium |
| 0.25% (vol/vol) Trypsin, 2.21 mM EDTA, 1x | Corning Cellgro | 25-053-Cl | |
| 15 ml Centrifuge Tube | CellTreat | 229411 | |
| 35 mm x 10 mm Cell Culture Dish | Greiner bio-one | 627 160 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| For Immunofluorescent Microscopy | |||
| Mouse anti-Caveolin 1 | BD Transduction Laboratories | 610406 | In situ Immunofluorescence - 1:5,000 |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | ThermoFisher Scientific | A-11029 | In situ Immunofluorescence - 1:2,000 |
| Bovine Serum Albumin - Fraction V | Rockland | BSA-50 | Immunoglobulin and protease free |
| 16% (wt/vol) Formaldehyde Solution | ThermoFisher Scientific | 28908 | Dilute to 4% with 1x PBS |
| Premium Cover Glass (22 mm x 22 mm No.1) | Fisher | 12548B | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787-50ML | |
| SlowFade Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | S36938 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| For Flow Cytometric Analysis | |||
| Calcein, AM | Molecular Probes | C3100MP | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14025-076 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| For Western Blot Analysis | |||
| Mouse anti-Caveolin 1 | BD Transduction Laboratories | 610406 | Western Blot - 1:1,000 |
| Tween-20 | BioRad | 170-6531 | |
| Nitrocellulose Membrane (0.2 μm) | BioRad | 162-0112 | |
| Western Lightning Plus-ECL | PerkinElmer | NEL104001EA | |
| BioRad DC Protein Assay | BioRad | 500-0116 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | BioRad | 161-0302 | |
| Sodium deoxycholate monohydrate (DOC) | Sigma | D5670 | |
| IGEPAL CA-630 (NP40) | Sigma | I8896 | |
| 30% Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1 | BioRad | 161-0158 |
References
- Hanahan, D., Weinberg, R. A.
- Olive, K. P., Jacobetz, M. A., et al. Inhibition of Hedgehog signaling enhances delivery of chemotherapy in a mouse model of pancreatic cancer. Science. 324 (5933), 1457-1461 (2009).
- Pandol, S., Edderkaoui, M., Gukovsky, I., Lugea, A., Gukovskaya, A. Desmoplasia of pancreatic ductal adenocarcinoma. Clinical Gastroenterology and Hepatology: the Official Clinical Practice. Journal of the American Gastroenterological Association. 7 (11 Suppl), S44-S47 (2009).
- Dabbous, M. K., Haney, L., Carter, L. M., Paul, A. K., Reger, J. Heterogeneity of fibroblast response in host-tumor cell-cell interactions in metastatic tumors. Journal of Cellular Biochemistry. 35 (4), 333-344 (1987).
- Olumi, A. F., Grossfeld, G. D., Hayward, S. W., Carroll, P. R., Tlsty, T. D., Cunha, G. R. Carcinoma-associated fibroblasts direct tumor progression of initiated human prostatic epithelium. Cancer Research. 59 (19), 5002-5011 (1999).
- Orimo, A., Gupta, P. B., et al. Stromal fibroblasts present in invasive human breast carcinomas promote tumor growth and angiogenesis through elevated SDF-1/CXCL12 secretion. Cell. 121 (3), 335-348 (2005).
- Schürch, W., Seemayer, T. A., Lagacé, R., Gabbiani, G. The intermediate filament cytoskeleton of myofibroblasts: an immunofluorescence and ultrastructural study. Virchows Archiv. A, Pathological Anatomy and Histopathology. 403 (4), 323-336 (1984).
- Nakagawa, H., Liyanarachchi, S., et al. Role of cancer-associated stromal fibroblasts in metastatic colon cancer to the liver and their expression profiles. Oncogene. 23 (44), 7366-7377 (2004).
- Choi, Y. P., Lee, J. H., et al. Cancer-associated fibroblast promote transmigration through endothelial brain cells in three-dimensional in vitro models. International Journal of Cancer. Journal International du Cancer. 135 (9), 2024-2033 (2014).
- Ito, M., Ishii, G., Nagai, K., Maeda, R., Nakano, Y., Ochiai, A. Prognostic impact of cancer-associated stromal cells in patients with stage I lung adenocarcinoma. Chest. 142 (1), 151-158 (2012).
- Gaggioli, C., Hooper, S., et al. Fibroblast-led collective invasion of carcinoma cells with differing roles for RhoGTPases in leading and following cells. Nature Cell Biology. 9 (12), 1392-1400 (2007).
- Navab, R., Strumpf, D., et al. Prognostic gene-expression signature of carcinoma-associated fibroblasts in non-small cell lung cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (17), 7160-7165 (2011).
- Hwang, R. F., Moore, T., et al. Cancer-associated stromal fibroblasts promote pancreatic tumor progression. Cancer Research. 68 (3), 918-926 (2008).
- Sneddon, J. B., Zhen, H. H., et al. Bone morphogenetic protein antagonist gremlin 1 is widely expressed by cancer-associated stromal cells and can promote tumor cell proliferation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (40), 14842-14847 (2006).
- De Wever, O., Nguyen, Q. -D., et al. Tenascin-C and SF/HGF produced by myofibroblasts in vitro provide convergent pro-invasive signals to human colon cancer cells through RhoA and Rac. FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 18 (9), 1016-1018 (2004).
- Zhang, C., Fu, L., et al. Fibroblast growth factor receptor 2-positive fibroblasts provide a suitable microenvironment for tumor development and progression in esophageal carcinoma. Clinical Cancer Research. 15 (12), 4017-4027 (2009).
- Yao, Q., Qu, X., Yang, Q., Wei, M. CLIC4 mediates TGF-β1-induced fibroblast-to-myofibroblast transdifferentiation in ovarian cancer. Oncology Reports. , (2009).
- Crawford, Y., Kasman, I., et al. PDGF-C mediates the angiogenic and tumorigenic properties of fibroblasts associated with tumors refractory to anti-VEGF treatment. Cancer Cell. 15 (1), 21-34 (2009).
- Paulsson, J., Micke, P. Prognostic relevance of cancer-associated fibroblasts in human cancer. Seminars in Cancer Biology. 25, 61-68 (2014).
- Messina, J. P., Lawrence, D. A. Effects of 2-mercaptoethanol and buthionine sulfoximine on cystine metabolism by and proliferation of mitogen-stimulated human and mouse lymphocytes. International Journal of Immunopharmacology. 14 (7), 1221-1234 (1992).
- Ames, B. N. Endogenous oxidative DNA damage, aging, and cancer. Free Radical Research Communications. 7 (3-6), 121-128 (1989).
- Cheng, Y., Ma, Z., et al. Principles of regulatory information conservation between mouse and human. Nature. 515 (7527), 371-375 (2014).
- Upreti, M., Jamshidi-Parsian, A., et al. Tumor-endothelial cell three-dimensional spheroids: new aspects to enhance radiation and drug therapeutics. Translational Oncology. 4 (6), 365-376 (2011).
- Mehta, G., Hsiao, A. Y., Ingram, M., Luker, G. D., Takayama, S. Opportunities and challenges for use of tumor spheroids as models to test drug delivery and efficacy. Journal of Controlled Release: Official Journal of the Controlled Release Society. 164 (2), 192-204 (2012).
- Muraki, Y., Hongo, S., Ohara, Y. Contamination of the cell sorter fluidics system with the water-borne bacterium Burkholderia cepacia. Cytometry. Part A: the Journal of the International Society for Analytical Cytology. 81 (2), 105-107 (2012).
- Grobstein, C. Morphogenetic interaction between embryonic mouse tissues separated by a membrane filter. Nature. 172 (4384), 869-870 (1953).
- Tan, S., Tompkins, L. S., Amieva, M. R. Helicobacter pylori usurps cell polarity to turn the cell surface into a replicative niche. PLoS Pathogens. 5 (5), e1000407 (2009).
- Hyman, T., Shmuel, M., Altschuler, Y. Actin is required for endocytosis at the apical surface of Madin-Darby canine kidney cells where ARF6 and clathrin regulate the actin cytoskeleton. Molecular Biology of the Cell. 17 (1), 427-437 (2006).
- Ghaffarian, R., Muro, S. Models and methods to evaluate transport of drug delivery systems across cellular barriers. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (80), e50638 (2013).
- Braian, C., Svensson, M., Brighenti, S., Lerm, M., Parasa, V. R. A 3D human lung tissue model for functional studies on mycobacterium tuberculosis infection. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (104), e53084 (2015).
- Bath, M. L. Inhibition of in vitro fertilizing capacity of cryopreserved mouse sperm by factors released by damaged sperm, and stimulation by glutathione. PLoS ONE. 5 (2), e9387 (2010).
- Zhao, Y., De Toledo, S. M., Hu, G., Hei, T. K., Azzam, E. I. Connexins and cyclooxygenase-2 crosstalk in the expression of radiation-induced bystander effects. British Journal of Cancer. 111 (1), 125-131 (2014).
- Buonanno, M., de Toledo, S. M., Azzam, E. I. Increased frequency of spontaneous neoplastic transformation in progeny of bystander cells from cultures exposed to densely ionizing radiation. PLoS ONE. 6 (6), e21540 (2011).
- Byers, S. W., Hadley, M. A., Djakiew, D., Dym, M. Growth and characterization of polarized monolayers of epididymal epithelial cells and Sertoli cells in dual environment culture chambers. Journal of Andrology. 7 (1), 59-68 (1986).
- Pitt, A., Gabriels, J. Epithelial cell culture on microporous membranes. American Biotechnology Laboratory. 4 (5), 38-45 (1986).
- Buonanno, M., de Toledo, S. M., Pain, D., Azzam, E. I. Long-term consequences of radiation-induced bystander effects depend on radiation quality and dose and correlate with oxidative stress. Radiation Research. 175 (4), 405-415 (2011).
- Ducrest, A. -L., Amacker, M., Lingner, J., Nabholz, M. Detection of promoter activity by flow cytometric analysis of GFP reporter expression. Nucleic Acids Research. 30 (14), e65 (2002).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot. , JoVE. Cambridge, MA. Available from: http://www.jove.com/science-education/5065/the-western-blot (2016).
- Mercier, I., Casimiro, M. C., Wang, C. Human breast cancer-associated fibroblasts (CAFs) show caveolin-1 down-regulation and RB tumor suppressor functional inactivation: implications for the response to hormonal therapy. Cancer Biology & Therapy. , (2008).
- Martinez-Outschoorn, U. E., Pavlides, S., et al. Tumor cells induce the cancer associated fibroblast phenotype via caveolin-1 degradation: implications for breast cancer and DCIS therapy with autophagy inhibitors. Cell Cycle. 9 (12), 2423-2433 (2010).
- Witkiewicz, A. K., Dasgupta, A., et al. Loss of stromal caveolin-1 expression predicts poor clinical outcome in triple negative and basal-like breast cancers. Cancer Biology & Therapy. 10 (2), 135-143 (2014).
- Zhao, X., He, Y., et al. Caveolin-1 expression level in cancer associated fibroblasts predicts outcome in gastric cancer. PLoS ONE. 8 (3), e59102 (2013).
- Shaul, P. W., Anderson, R. G. Role of plasmalemmal caveolae in signal transduction. The American Journal of Physiology. 275 (5 Pt 1), L843-L851 (1998).
- Fujimoto, T., Kogo, H., Nomura, R., Une, T. Isoforms of caveolin-1 and caveolar structure. Journal of Cell Science. 113 (Pt 19), 3509-3517 (2000).
- Wartiovaara, J., Lehtonen, E., Nordling, S., Saxen, L. Do Membrane Filters prevent Cell Contacts. Nature. 238 (5364), 407-408 (1972).
- Tyan, S. -W., Kuo, W. -H., et al. Breast cancer cells induce cancer-associated fibroblasts to secrete hepatocyte growth factor to enhance breast tumorigenesis. PLoS ONE. 6 (1), e15313 (2011).
- Xu, J., Lu, Y., Qiu, S., Chen, Z. -N., Fan, Z. A novel role of EMMPRIN/CD147 in transformation of quiescent fibroblasts to cancer-associated fibroblasts by breast cancer cells. Cancer Letters. 335 (2), 380-386 (2013).
- Hoffman, R. M. Stromal-cell and cancer-cell exosomes leading the metastatic exodus for the promised niche. Breast Cancer Research : BCR. 15 (3), 310 (2013).
- Franco, O. E., Shaw, A. K., Strand, D. W., Hayward, S. W. Cancer associated fibroblasts in cancer pathogenesis. Seminars in Cell & Developmental Biology. 21 (1), 33-39 (2010).
- Kuse, R., Schuster, S., Schübbe, H., Dix, S., Hausmann, K. Blood lymphocyte volumes and diameters in patients with chronic lymphocytic leukemia and normal controls. Blut. 50 (4), 243-248 (1985).
- Vaupel, P., Schlenger, K., Knoop, C., Höckel, M. Oxygenation of human tumors: evaluation of tissue oxygen distribution in breast cancers by computerized O2 tension measurements. Cancer Research. 51 (12), 3316-3322 (1991).
