Abstract
die frühen heterotypic Wechselwirkungen zwischen Krebszellen und der umgebenden Nicht-Krebs-Stroma zu verstehen ist wichtig, um die Ereignisse zu Aufklären Stromatumoren Aktivierung und Einrichtung des Tumor-Mikroumgebung (TME) führt. Mehrere in vitro- und in vivo - Modellen des TME entwickelt worden; im allgemeinen jedoch erlauben diese Modelle nicht ohne weiteres Isolierung einzelner Zellpopulationen, unter nicht-Stören Bedingungen für eine weitere Studie. Um diese Schwierigkeit zu umgehen, haben wir ein in vitro TME - Modell unter Verwendung eines Zellwachstumssubstrat , bestehend aus einem durchlässigen mikroporösen Membraneinsatz verwendet , die einfache Erzeugung von hoch angereicherten Zellpopulationen erlaubt innig gezüchtet, jedoch getrennt, auf jeder Seite der Membran des Einsatzes für längere co -Kultur mal. Durch die Verwendung dieses Modells sind wir stark angereicherte Krebs-assoziierte Fibroblasten (CAF) Populationen von normalen diploiden humanen Fibroblasten erzeugen kann folgendeCo-Kultur (120 h) mit stark metastatischen Zellen menschlichen Brustkarzinom, ohne die Verwendung von Fluoreszenzmarkierung und / oder Zellsortierung. Zusätzlich wird durch die Porengröße des Einsatzes zu modulieren, können wir für den Modus der interzellulären Kommunikation steuern (zB Gap-Junction - Kommunikation, sezerniert Faktoren) zwischen den beiden heterotypic Zellpopulationen, die Untersuchung der Mechanismen , die die Entwicklung der Genehmigungen zugrunde liegenden TME, einschließlich der Rolle der Gap-Junction-Permeabilität. Dieses Modell dient als wertvolles Werkzeug, um unser Verständnis für die anfänglichen Ereignisse bei der Verbesserung, die zu Krebs-Stroma-Initiation, die frühe Entwicklung des TME und die modulierende Wirkung des Stroma auf den Antworten von Krebszellen zu therapeutischen Mitteln.
Introduction
Der Tumor-Mikroumgebung (TME) ist ein hochkomplexes System von Karzinomzellen umfasst, die neben Wirts Stroma koexistieren und sich entwickeln. Diese stromalen Komponente besteht typischerweise aus Fibroblasten, Myofibroblasten, Endothelzellen, verschiedene Immunkomponenten sowie einer extrazellulären Matrix 1. Ein wesentlicher Bestandteil, oft die Mehrheit dieses Stroma aktiviert Fibroblasten, häufig als krebsassoziierte Fibroblasten oder Karzinom-assoziierten Fibroblasten (CAF) 2,3 bezeichnet. Im Gegensatz zu normalen, nicht aktivierten Fibroblasten, beitragen CAFs zu Tumor Initiation, Progression, Angiogenese, Invasion, Metastasierung und Wiederholung 4-11 in einer Vielzahl von Karzinomen, einschließlich Brust-, Prostata-, Lungen-, Pankreas-, Haut-, Darm-, Speiseröhren-, und Ovar 5,6,12-17. Doch die genaue Art des Beitrags von CAFs gesamten Krebs Pathogenese bleibt schlecht definiert. Darüber hinaus hat die klinische Evidenz einen prognostischen Wert von CAFs demonstriert, Ihre Anwesenheit zu hochwertigen malignen Erkrankungen, Therapieversagen, und die allgemeine schlechte Prognose 10,18,19 korreliert.
Offensichtlich unser Verständnis der auslösenden Ereignisse in CAF Entwicklung zu verbessern, sowie die interzelluläre Kommunikation, ihre Rolle innerhalb des TME Vermittlung kann spannende neue therapeutische Ziele und verbesserte Strategien, die Patientenergebnisse verbessern könnte. Zu diesem Ziel sind mehrere in vivo und in vitro - Modelle wurden entwickelt. Während in - vivo - Ansätzen mehr reflektierende der Patienten TME sind, besitzen sie Einschränkungen, einschließlich der immensen Komplexität und Heterogenität sowohl innerhalb als auch zwischen Tumoren. Weiterhin Tumorproben von menschlichen Probanden häufig darstellen TME hoch entwickelt und nicht das Verständnis der TME auslösenden Ereignissen ermöglichen. Tierexperimentelle Studien bieten einige Vorteile, aber Verallgemeinerung von Tierdaten auf den Menschen sollten aufgrund von Unterschieden in physi mit Vorsicht erfolgenLogie zwischen Menschen und Tieren, wie Nagetieren (beispielsweise Thiol - Chemie 20, die Stoffwechselrate 21, 22 Toleranz zu betonen, etc.). Außerdem, im Gegensatz zu der menschlichen Bevölkerung, die in der Natur genetisch heterogen ist, werden Labortiere typischerweise bis zur Homogenität gezüchtet. Auch ist es oft schwierig, transient physiologischen Variationen und Zellphänotyp Veränderungen zu untersuchen, sowie zur Kontrolle für bestimmte experimentelle Parameter Tiere wie Nagetieren verwenden. So wird in vitro 2- und 3-dimensionale (2D und 3D) Gewebekulturmodelle werden häufig das grundlegende Verständnis der TME Entwicklung voran verwendet. Trotz ihres Mangels einer genauen Darstellung der Komplexität der in vivo - Systeme bieten diese Modelle Vorteile, die sich stark mechanistische Untersuchungen zu erleichtern. In vitro - Modelle erlauben eine einfachere, konzentriert und kostengünstige Analyse des TME, wobei statistisch signifikante Daten können in erzeugt werdenZellen frei von systemischen Veränderungen, die bei Tieren entstehen.
Es gibt mehrere Arten von in - vitro - Systemen. Die beiden am häufigsten verwendeten TME in vitro - Modelle bestehen aus gemischten Monoschicht oder Sphäroid Zellkulturen. Beide Kulturverfahren vorteilhaft sind für die grundlegende Studien der interzellulären Wechselwirkungen (zB normale Zellen mit Tumorzellen) und für die Analyse verschiedener TME spezifischen Zellphänotyp Veränderungen (beispielsweise Entstehung von Krebs-assoziierten Fibroblasten von normalen Fibroblasten). Zusätzlich werden die Sphäroide Lage , eine reflektierende gewebeartige Struktur des TME zu schaffen, und kann von Tumor Heterogenität 23 repräsentativ sein. Jedoch Sphäroiden produzieren oft sehr unterschiedlichen Sauerstoffspannung Gradienten über Schichten, die 24 Versuchs Schlussfolgerungen erschweren. Leider sind beide Modelle extrem in ihrer Fähigkeit beschränkt, für die weitere Charakterisierung und Untersuchung folgende Ko- reinen Zellpopulationen zu isolierenKultur. Um dies zu tun würde mindestens ein Zelltyp erforderlich fluoreszenzmarkierten oder markiert mit einer identifiziere maker zu sein, und dann Unterwerfen des gemischten Kokultur umfangreiche Verarbeitung und Zellsortierung, die Zellpopulationen zu trennen. Während ein Zellsortierer eine ziemlich reine Zellpopulation zu isolieren kann, muss man sich bewusst zellulären Stress und eine mögliche mikrobielle Kontamination sein 25 - Risiken.
Zur Erleichterung haben das Verständnis der interzellulären Kommunikation, große Anstrengungen unternommen worden , an der Entwicklung und in vitro - Systemen zu optimieren , die eng an die in - vivo - Umgebung nachzuahmen, während eine vereinfachte Ansatz erlaubt. Ein solches Instrument ist die durchlässige mikroporöse Einlage, ein Membransubstrat , die zuerst im Jahre 1953 entwickelt wurde , 26 und anschließend angepasst für vielfältige Anwendungen und Studien (zB Zellpolarität 27, Endozytose 28, Drogentransport 29, Modellierung Gewebe 30, fertlisation 31, Bystander - Effekt 32,33, etc.). Dieses System ermöglicht das Wachstum von Zellen , die mit in vivo -ähnlichen anatomischen und funktionellen Differenzierung sowie die Expression von vielen in vivo - Marker 34,35 , die beobachtet werden , wenn nicht kultiviert auf undurchlässige Kunststoffgeschirr . Weiterhin erlaubt die äußerst dünne poröse Membran (10 & mgr; m dick) , eine schnelle Diffusion von Molekülen und Äquilibrierungszeiten, die die in vivo - Umgebung simuliert , und ermöglicht unabhängige zelluläre Funktion an den beiden apikalen und basolateralen Zelldomänen. Ein zusätzlicher Vorteil der Nützlichkeit des Einsatzes als TME Systems ist die physikalische Trennung von zwei Populationen heterotypic Zelle auf jeder Seite der Membran in den gleichen Umgebungsbedingungen wachsen gelassen, während verschiedene Arten der interzellulären Kommunikation durch die Membranporen gehalten wird. Obwohl physikalisch getrennt sind, werden die beiden Zellpopulationen metabolisch gekoppelt via sekretiertes Elemente und als dehier, auch durch den Spalt-junctional Kanäle beschrieben. Zusätzlich wird durch die Einsätze bei in vivo partielle Sauerstoffspannung (PO 2) beibehalten wird , reduziert das Modell die Komplikationen von Sauerstoff und chemische in anderen Systemen beobachtet Steigungen. Vielmehr erhöht es das Verständnis der natürlichen Mechanismen der TME-Steuerung. Insbesondere können die beiden Zellpopulationen leicht mit hoher Reinheit, ohne Fluoreszenzmarkierung und / oder Zellsortierung nach länger andauernder Kokultur isoliert werden.
Hier beschreiben wir ein in vitro - Protokoll TME bestehend aus menschlichen Brustkarzinomzellen und humanen Fibroblasten gezüchtet, die jeweils auf beiden Seiten einer durchlässigen mikroporösen Membraneinsatzes, aber dennoch im kontinuierlichen bidirektionale Kommunikation durch die Membranporen. Wir zeigen , dass durch Membranen mit unterschiedlichen Porengrößen, der Beitrag einer bestimmten Art von interzellulären Kommunikation (beispielsweise sezernierte Faktoren gegen gap junctions) mit der Entwicklung mitkann der TME untersucht werden.
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Protocol
1. Herstellung von Kulturmedien und Zellen
- Bereiten 500 ml Eagle-Minimalmedium, ergänzt mit 12,5% (vol / vol) hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum (FBS), 2 mM L-Alanyl-L-Glutamin und 100 Einheiten Penicillin und 100 ug Streptomycin pro ml.
HINWEIS: Das Wachstumsmedium und Ergänzung (en) kann leicht für die Wachstumsanforderungen von anderen Zellstämmen oder Zelllinien ausgetauscht werden. - Vorbereitung 70 & mgr; l Zellkulturmedium für jeden Einsatz (6-well Format insert): essentiellem Eagle-Minimalmedium mit 50% (vol / vol) hitzeinaktiviertem FBS, supplementiert 2 mM L-Alanyl-L-Glutamin und 100 Einheiten Penicillin und 100 ug Streptomycin pro ml.
ANMERKUNG: Das Medium , das mit 50% FBS supplementiert ist Zellanheftung an der Unterseite (dh Unterseite) des Einsatzes zu erleichtern. Das Wachstumsmedium und Ergänzung (en) kann leicht für die Wachstumsanforderungen von anderen Zellstämmen oder Zelllinien ausgetauscht werden. - Vorbereitung einer Zellsuspension der bestimmten Zellen auf der unteren Seite des Einsatzes zu plattierenden.
HINWEIS: Hier wurden die Ergebnisse unter Verwendung von AG1522 normalen menschlichen Fibroblasten in 75 cm 2 Zellkulturflaschen, und diese Zellen werden daher im Mittelpunkt der Beschreibung der Suspensionszellzubereitung sein gezüchtet erhalten. - Um Zellen zu sammeln, entfernen Sie das Wachstumsmedium und waschen Sie die Zellschicht 2x mit 5 ml 1x Phosphat-gepufferte Saline (PBS).
- Entfernen Sie die PBS und verteilt 1 ml 0,25% (vol / vol) mit 2,21 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) Trypsin, vorgewärmt auf Raumtemperatur (RT) über die Zellen für 2 min bei RT (Raumtemperatur).
- Quenche die Trypsin-Aktivität mit 9 ml komplettem Wachstumsmedium (hergestellt in Schritt 1.1) und sammle die Zellen durch vorsichtiges Pipettieren die Zellsuspension über die Oberfläche des Kolbens 10x.
- Bestimmen Sie die Zellkonzentration durch ein Hämozytometer oder elektronischen Zähler mit und die Zellsuspension Volumen Pipette, die anbietest wirde 250.000 Zellen pro Einsatz in eine sterile 15 ml Zentrifugenröhrchen.
- Pellet die Zellsuspension durch Zentrifugation (800 · g, 2 min). Suspendiere das Zellpellet mit Wachstumsmedium (hergestellt in Schritt 1.2) mit einer Konzentration von 250.000 Zellen pro 70 & mgr; l zu erzeugen.
HINWEIS: Zellkultur in permeable mikroporöse Membraneinsätze auf 2D Substrate basiert, wird Zellaussaat ähnlicher Weise durchgeführt, mit der Ausnahme sollten die Zellen zunächst in Medium, das 50% FBS enthält, ausgesetzt werden, (vol / vol) Befestigung zu erleichtern.
2. Herstellung von Inserts
HINWEIS: Um sterile Bedingungen, die Arbeit in einer laminaren Strömung biologischen Sicherheitsschrank gewidmet Zellkultur zu gewährleisten.
- Wählen Einsätze mit einer Membranporengröße von 0,4 & mgr; m, 1 & mgr; m oder 3 & mgr; m (von der experimentellen Interesse bestimmt (s), als die Porengröße kann verwendet werden, um die Rolle der verschiedenen Arten der interzellulären Kommunikation zu entdecken).
HINWEIS: Die 0,4 um Poren ist Small genug zu begrenzen Bildung funktioneller gap junctions zwischen den Zellen auf jeder Seite des Einsatzes Membran und kann verwendet werden, die interzelluläre Kommunikation zu untersuchen sezerniert von Faktoren ab. Wohingegen sind die 1 um und 3 um Poren groß genug Bildung funktioneller gap junctions zu ermöglichen, und verwendet werden kann, die interzelluläre Kommunikation sowohl von gap junctions und sekretierten Faktoren zu untersuchen. - Entfernen Sie einzelne Einsätze aus der Verpackung nehmen und in eine gleich große Multi-Well-Platte.
HINWEIS: Die Einsätze sind mit verschiedenen Membranoberflächen spezifischen Anwendungsanforderungen zu passen (zB 6-Well, 12-Well und 24-Well - Einsätzen.). Hier wurden die Ergebnisse erhalten, die 6-Well-Einsatz mit und wird daher im Mittelpunkt der Modellbeschreibung sein. - Decken Sie die Schale, enthält die Einsätze mit dem Schalendeckel. Die Multi-Well - Platte mit beiden Händen vorsichtig umdrehen die Schale , so dass die Einsatzböden (dh Unterseite) nach oben stehen nun vor.
- entfernen Sie the Boden der Multiwell-Schale, die Unterseite der Einsätze aussetzt. Arbeiten mit einem Einsatz in einer Zeit, eine sterile Pinzette und sanft halten Sie den Einsatz an Ort und Stelle. Mit der freien Hand, verwenden Sie eine Pipette mit einem Weithalsspitze 70 ul der Zellsuspension zu zeichnen (hergestellt in Schritten von 1,3 bis 1,8), mit 250.000 Zellen.
- Um die Zellen zu plattieren, legen Sie die Pipettenspitze leicht auf die Mitte der Membran des Einsatzes, und langsam die 70 & mgr; l der Zellsuspension pipettiert, während langsam die Pipettenspitze um die Oberfläche der Membran bewegt. Achten Sie darauf, nicht die Pipettenspitze und Zellsuspension an den Rand des Einsatzes zu erweitern.
ANMERKUNG: Um den Rand des Einsatzes in Berührung Verlust der Kapillarspannung der Zellsuspension auf die Zellen während der Befestigung Austrocknung führt führen könnte. - Wiederholen Sie für verbleibende Einsätze, mit Sorgfalt ausgeübt werden nicht direkt über die freiliegenden Einsätzen, um potenzielle mikrobielle Kontamination zu vermeiden.
- Rückkehr vorsichtig die Multi-WellSchalenboden der Einsätze abzudecken. In einer befeuchteten Luftatmosphäre von 5% (vol / vol) CO 2 bei 37 ° C für 30-45 min halten die Schale mit Einsätzen invertiert, inkubiert.
HINWEIS: Wenn die Zellsuspension auf den Einsatz in Kontakt mit dem Boden des Bohrlochs, vorsichtig den Schalenboden anheben und auf den Rand der Schale oben ruhen, so dass es einen leichten Winkel bildet und schafft größere Trennung zwischen der Oberfläche der Schale und die untere Seite der Einsätze (wo die Zellen werden). Dadurch werden die Zellen von der Befestigung an der Oberfläche der Vertiefungen anstelle des Einsatzes verhindern. - Im Anschluss an die 30-45 min Inkubationszeit, entfernen Sie die Schale, die Einsätze und gibt ihn in der Laminar-Flow-biologischen Sicherheitsschrank.
- Mit zwei Händen zu halten und die Schalendeckel dicht, sanft wieder umkehren die Schale, so dass die Unterseite der Einsätze enthält nun die anhaftenden Zellen nach unten zeigt.
- Langsam und vorsichtig 2 ml (1 ml hinzufügen 3 um Poreneinsätze migrati zu vermeidenauf der Zellen durch die Poren Insert) Komplettmedium vorgewärmt (Schritt 1.1) in jede Vertiefung zu sehen, so dass der Boden des Einsatzes eingetaucht ist.
- Nach der Zugabe von Einsätzen Wachstumsmedium in alle Vertiefungen enthält, die Schale zurück in den befeuchteten Inkubator.
- Ermöglichen die Einsätze 48 h ungestört in den Inkubator zu bleiben. Nach 48 Stunden füttern die Zellen durch die 2 ml Medium aus dem Boden des Bohrlochs Absaugen und Zugabe von 2 ml frisches Wachstumsmedium.
- Nach der Zugabe von frischem Medium zu dem Boden des Bohrlochs, seed 1 ml der zweiten Zellpopulation Suspension (~ 250.000 Zellen / ml) auf der oberen Seite des Einsatzes, die bereits die erste Zellpopulation wächst auf der unteren Seite (für diese Experimente, AG1522 (Kontrolle) Zellen oder Krebs (experimentell) Zellen werden auf der Oberseite der Einsätze überzogen, die bereits AG1522 Zellen haben, die dazu bestimmt CAFs zu werden, auf der Bodenseite der Einsätze wächst). Die Schale zurück in den befeuchteten Inkubator.
HINWEIS: Wenn Arbeiting mit Zellen, die auch des Einsatzes auf den Boden nicht einhalten, können diese Zellen alternativ auf der Oberseite des Einsatzes gewachsen. - Ändern des Mediums bei 24, 72 und 96 Stunden nach der zweiten Population von Zellen auf der Oberseite des Einsatzes Animpfen durch Absaugen des Mediums von der Oberseite des Einsatzes und dem Boden des gut. Sanft 1 ml frisches Medium auf die Oberseite des auf dem Boden des Bohrlochs Einsatz und 2 ml hinzufügen. Ermöglichen die zwei Zellpopulationen in Co-Kultur auf beiden Seiten der mikroporösen permeablen Membran Einsatz für 120 Stunden bleibt.
3. Sammeln von Zellen aus Insert durch Trypsinisierung
HINWEIS: Zusätzlich zu der Leichtigkeit der angereicherten Zellpopulationen zu erhalten, wobei der Einsatz TME Modell ermöglicht auch für ähnliche experimentelle Behandlungen (beispielsweise Inkubation mit Chemikalien, Exposition gegenüber Sauerstoffbedingungen , die über oder unter Umgebungsatmosphäre sind, ionisierende Bestrahlung, etc.) als andere in vitro (beispielsweise in situ Immundetektion, Western Blot) oder für nachfolgende Experimente 36 propagiert.
- Um Zellen zu sammeln, entfernen Sie den Einsatz aus dem Wachstumsmedium und legen Sie es in eine 35 mm Zellkulturschale mit 1 ml PBS. Waschen Sie den unteren und oberen Seiten des Einsatzes 1x mit 1 ml PBS.
- Entfernen Sie die PBS und 200 ul von 0,25% (vol / vol) Trypsin mit 2,21 mM EDTA, vorgewärmt auf RT.
- Wenn die Zellen auf der Unterseite des Einsatzes gewachsen zu sammeln, legen Sie die Trypsin-Lösung in das 35-mm-Schale und sanft den Boden des Einsatzes in die Trypsin-Lösung für 2 min bei RT statt.
- Wenn die Zelle zu sammelns auf der Oberseite des Einsatzes gewachsen, legen Sie den Einsatz in einer 35-mm-Schale und fügen Sie für 2 min bei RT an die Spitze des Einsatzes und brüten die Trypsin-Lösung.
- Quenche die Trypsin-Aktivität durch Zugabe von 800 ul komplettem Wachstumsmedium.
- Wenn die Zellen auf dem Boden des Einsatzes gewachsen sammeln, fügen Sie das Wachstumsmedium zu den 35 mm-Schale und sammle die Zellen durch vorsichtiges Pipettieren die 1 ml der Zellsuspension über die Oberfläche des Einsatzes 10-fach, mit dem Insert in einem leichten gehalten wird Winkel, so daß die Zellsuspension in die Schale sammelt.
- Wenn das Sammeln der Zellen, die aus der Oberseite des Einsatzes, fügen Sie das Wachstumsmedium auf die Oberseite und vorsichtig 1 ml der Zellsuspension über die Oberfläche des Einsatzes 10x pipettieren.
4. Charakterisierung von Zell Reinheit durch Durchflusszytometrie
ANMERKUNG: Um die Fähigkeit der permeable mikroporöse Membraneinsätze charakterisieren die Reinheit von t zu haltener zwei Zellpopulationen (dh oben und unten) für bis zu 120 h, Abschnitte 1-3 wurden durchgeführt, mit grün fluoreszierendem Protein (GFP) -markierte MDA-MB-231 - Zellen auf der Oberseite des Einsatzes überzogen wird und nicht-GFP-markierten AG1522 Zellen auf der Unterseite des 0,4 μm-, 1 μm- plattiert wird, oder 3 & mgr; m Poreneinsätzen.
- Sobald die Zellen von der Unterseite des Einsatzes gesammelt wurden (Verfahren in Abschnitt 3 beschrieben ist ), pelletieren Sie die Zellsuspension durch Zentrifugation (500 g, 30 sec).
- Entfernen Sie den Überstand und suspendieren das Zellpellet in 400 ul Hanks 'Balanced Salt Solution (HBSS), supplementiert mit 1% (Vol / Vol) FBS.
- Führen zytometrische Analyse auf einem Durchflusszytometer mit einem 488 nm Laser ausgestattet GFP und ein Bandpassfilter von 530/30 zu erregen GFP Photonenemission 37 zu detektieren.
- Für die Zellidentifikationszwecke verwenden AG1522 Kontrollzellpopulationen anzupassen Vorwärts- und Seitenstreuspannungen auf dem Durchflusszytometer. Einstellendie GFP Kanalspannung der zellulären Autofluoreszenz-Wert als die untere Nachweisschwelle für das GFP-Signal zu setzen.
- Bestimmen Schwellenanschnittsteuerung Zellen. Beurteilen Sie Reinheit jeder Zellpopulation auf der Basis der Anwesenheit von GFP-positiven Zellen im Vergleich zu Kontrolle.
ANMERKUNG: Eine reine Population entdeckt von nicht GPF-positiven Zellen reflektierend sein würde.
5. Charakterisierung von Zellen durch In Situ Immunofluorescence
- Nach Trypsinisierung von Zellen aus dem Einsatz (siehe Abschnitt 3) Zellen, zu sammeln, Platte 5 x 10 4 Zellen in 250 & mgr; l Wachstumsmedium (siehe Schritt 1.1) auf sterile Glasplättchen, und lassen für 1 Stunde in einer befeuchteten Luftatmosphäre zu befestigen 5% (vol / vol) CO 2 bei 37 ° C Inkubator.
- Am Ende der Inkubation vorsichtig entfernen das Gericht das Deckglas und gibt ihn in der Laminar-Flow-biologischen Sicherheitsschrank.
- Vorsichtig 2 ml vorgewärmtes vollständigen Medium (siehe Schritt1.1) zu jeder Schale, so dass das Deckglas eingetaucht.
- Nach der Zugabe von Wachstumsmedium zu allen Schalen mit Deckgläsern, kehren das Geschirr einer befeuchteten Luftatmosphäre mit 5% (Vol / Vol) CO 2 bei 37 ° C in einem Inkubator für 48 Stunden.
- Nach der 48-stündigen Inkubation waschen Sie die Probe 3x mit PBS und fixieren mit 4% (wt / vol) Formaldehyd in PBS für 10 min bei RT.
- Spülen 5x mit Tris Buffered Saline (TBS: 50 mM Tris-Cl, pH 7,5, 150 mM NaCl) und dann mit 0,25% (vol / vol) Triton X-100, 0,1% (wt / vol) Saponin für 5 min permeabilisieren bei RT.
- Blockieren nicht-spezifischer Bindungsstellen mit 2% (vol / vol) normalem Ziegenserum (NGS), 1% (wt / vol) Rinderserumalbumin (BSA), 0,1% (vol / vol) Triton X-100 in TBS (Sperr Lösung) für 1 Stunde bei RT.
- Inkubieren mit dem primären Antikörper (anti-Caveolin 1 (CAV1), 1: 1000) über Nacht in Lösung bei 4 ° C blockiert.
- Abwaschen ungebundenen primären Antikörper (3x 5 min / Wäsche) mit 0,2% NGS (vol / vol), 1% (Gewicht / Volumen) BSA, 0,1% (vol / vol) Triton X-100 in TBS (Waschlösung).
- Inkubieren mit sekundärem Antikörper bei RT für 1 h in Blockierungslösung (siehe Abschnitt 5.4).
- Abwaschen ungebundenen sekundären Antikörper (3x 5 min / Wäsche) mit Waschlösung (siehe Schritt 5.6).
- Berg Deckgläser auf einem Schlitten mit einem anti-fade Eindeckmediums mit 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) und Dichtung mit Nagellack.
- Beobachten Zellen eine 63X Öl vergrößerndes Objektiv auf einem inversen Mikroskop mit einer externen Lichtquelle zur Fluoreszenzanregung ausgestattet ist, und die Aufnahmen eine angeschlossene Digitalkamera zur nachfolgenden Analyse.
6. Charakterisierung von Zellen, die durch Western Blot
HINWEIS: Die Western - Blot - Verfahren wird an anderer Stelle 38 beschrieben. Eine kurze Übersicht ist hier beschrieben:
- Nach Ablösung von Zellen aus dem Einsatz durch Trypsinierung, Pellet, das die Zellsuspension durch Zentrifugation (500 g, 30 sec) (siehe Abschnitt 3).
- Überstand entfernen und setzt die Zellpellet 2 x mit 100 ul PBS.
- Überstand entfernen und lysieren Zellen in 50 & mgr; l von modifizierten Radioimmunpräzipitation Assays (RIPA) Puffer (Tris pH 7,5 50 mM, NaCl 150 mM, NP40 1% (vol / vol), Natriumdesoxycholat Monohydrat (DOC) 0,5% (vol / vol), Natriumdodecylsulfat (SDS), 0,1% (vol / vol)), enthaltend Protease und Phosphatase-Inhibitor-Cocktail.
- Inkubieren für 20 min auf Eis und Zentrifugieren bei 19.000 g für 15 min bei 4 ° C.
- Die Konzentration der Proteine in dem Überstand einen Protein optische Dichte Assay kompatibel mit den Waschmitteln in der RIPA Puffer.
- Getrennten Proteine durch Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) und Elektroblot auf eine 0,2 & mgr; m Nitrocellulosemembran.
- Inkubieren Membranen in TBS, das 0,1% (vol / vol) Tween-20 (TBST) und 4% (Gew / Vol) Magermilch (Blockierungslösung) für 60 min und reagieren mit primärem Antikörper bei 4 ° C über Nacht (anti-CAV1, 1: 1000).
- Waschen Sie die Membran 3x mit TBST bei RT (5 min / Wäsche).
- Inkubieren Membranen für 30 min in Lösung eine blockierende anti-Maus-Sekundär-Antikörper, konjugiert mit Meerrettich-Peroxidase (HRP) (1: 5000) enthält.
- Waschen Sie die Membran 3x mit TBST bei RT (5 min / Wäsche).
- Visualisieren Reaktionsprodukte durch Chemilumineszenz eine Western-Blot-Detektionssystem verwendet wird.
7. Charakterisierung der interzellulären Kommunikation durch Durchflusszytometrie
ANMERKUNG: Um die Anpassungsfähigkeit der permeable mikroporöse Membran zu charakterisieren fügt verschiedene Modi der interzellulären Kommunikation (beispielsweise sezernierte Faktoren, gap junctions) zu untersuchen. Abschnitte 1 bis 2,12 wurden mit nicht-fluoreszierenden AG1522 Zellen durchgeführt, an der Unterseite von 0,4 μm-, 1 μm- plattiert wird, oder 3 & mgr; m-Poreneinsätzen.
- Kultur nicht markierten AG1522-Zellen in einer 35-mm-Schale auf 90% Konfluenz Medium in Abschnitt 1.1 beschrieben ist.
- Rinse Zellen 1x mit 1 ml HBSS.
- Wägezellen mit Calcein AM durch Zellen in HBSS Inkubation 30 & mgr; M Calcein AM enthält.
- Inkubieren für 15 min in einer befeuchteten Luftatmosphäre mit 5% (Vol / Vol) CO 2 bei 37 ° C.
- Wasche die Zellen 2x mit 1 ml HBSS.
- Trypsinize Zellen durch Zugabe von 200 & mgr; l Lösung von 0,25% (vol / vol) für 2 min bei RT mit 2.21 mM EDTA Trypsin.
- Quenche die Trypsin-Aktivität durch Zugabe von 800 ul vollständigem Medium, das 12,5% (vol / vol) FBS.
- Bringen Sie Zellen in Suspension durch wiederholtes Pipettieren.
- Bestimmen Zellkonzentration von einer Zählkammer oder elektronischen Zähler mit und Platte mit Calcein AM beladen 250.000 Zellen an der Oberseite der Einsätze, die bereits AG1522 Zellen wachsen auf der Unterseite haben.
- Inkubiere die Einsätze in einer befeuchteten Luftatmosphäre mit 5% CO 2 bei 37 ° C für 6 Stunden.
- Nach 6 h, sammelt Zellen von der Bodenseite der Einsätze, wie beschriebenin Abschnitt 3.
- Pellet die Zellsuspension durch Zentrifugation (500 g, 30 sec).
- Entfernen Sie den Überstand und suspendieren das Zellpellet in 400 ul HBSS, ergänzt mit 1% (Vol / Vol) FBS.
- Analysieren Sie die Zellen auf einem Zytometer mit einem Laser ausgestattet und Filter der Lage, spannende und Erfassung der Emission von Calcein (496 nm und 516 nm, jeweils), pro Hersteller-Protokoll.
- Für die Zwecke Zellidentifikation, verwenden Sie einen ungefärbten Kontrollzelle AG1522 Bevölkerung Vorwärts- und Seitenstreuspannungen auf dem Durchflusszytometer einzustellen. Stellen Sie die Calcein Kanalspannung der zellulären Autofluoreszenz-Wert als die untere Nachweisschwelle für das Calcein Signal zu setzen.
- Bestimmen Sie den oberen Grenzwert mit Calcein belasteter Kontrollzellen. Beurteilen Sie die Kommunikation für jede Zelle Einsatz, basierend auf der Anwesenheit von Calcein-positiven Zellen im Vergleich zu Kontrolle.
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Representative Results
Angepasst hier wir einen durchlässigen Einsatz mikroporöse Membran eine in vitro Zell heterotypic Cokultur - System zu entwickeln, das die in vivo Tumor - Mikroumgebung (Abbildung 1) nachahmt. Dieses System ermöglicht es für zwei verschiedene Zellpopulationen, die auf beiden Seiten der porösen Membran für längere Zeiträume des Einsatzes angebaut werden (bis zu 120 Stunden, in unserer Anwendung). Wichtig ist das System in der Lage ist, die Reinheit der Zellpopulationen aufrechterhalten wird, bestimmt, wie von GFP-markiertem MDA-MB-231-Zellen auf der Oberseite der 0,4-, 1- oder 3 m-pore Einsätze Plattieren und es ihnen ermöglicht, zu wachsen in Co-Kultur mit AG1522 Zellen auf der unteren Seite des Einsatzes, für 120 Stunden wachsen. Nach dieser Zeit wurden die Zellen von der Bodenseite des Einsatzes und durch Durchflusszytometrie analysiert gesammelt, um das Vorhandensein von GFP-positive MDA-MB-231-Zellen zu identifizieren, die einen Verlust der Zellpopulation Reinheit anzeigen würde. Die Analyse ergab, 99,9% und 99,8% pure Populationen von 0,4 und 1 & mgr; m-pore-Einsätze sind; der Einsatz mit 3 & mgr; m Poren war jedoch nicht imstande , die Trennung der Zellpopulationen zu erhalten, da die Poren groß genug waren , eine signifikante Anzahl der GFP-positive MDA-MB-231 - Zellen zu ermöglichen , durch die Membran (2) zu migrieren , .
Wichtig waren in der Lage, durch in situ Immunfluoreszenz und Western - Blot - Analyse , die wir die Fähigkeit dieses Systems zu demonstrieren , um effektiv Krebs assoziierten Fibroblasten von normalen humanen diploiden AG1522 Fibroblasten folgenden Kokultur mit MDA-MB-231 Brustkrebszelle erzeugen, wie bestimmt durch verminderte Expression von Caveolin-1, ein gut etabliertes CAF biomarker 39-42 (Abbildung 3). CAV1 ist ein Gerüstprotein, das die Caveolae in der Lipidfloß - Domäne der Plasmamembran bildet, die 43 in mehreren zellulären Prozessen beteiligt ist. Im Western-BlotWurden zwei distinkte Banden beobachtet, 44 an die α und β - Isoformen CAV1 entspricht. Leider ist wenig über die Differenz (s) zwischen den Isoformen bekannt, vor allem ihre Rolle als CAF-Biomarker.
Wir haben auch die Kenntnisse des Einsatzes Kokultursystem gezeigt interzelluläre Kommunikation zwischen den beiden heterotypic Zellpopulationen (4) zu modulieren. Nicht markierten, Gap-Junction zuständigen menschlichen diploiden Fibroblasten wurden bis zur Konfluenz AG1522 auf der Unterseite des Einsatzes kultiviert. Ein zweiter Satz von AG1522-Zellen wurden mit Calcein AM, einem grün fluoreszierenden Gap-Junction-durchlässigen Farbstoff und plattiert auf der Oberseite des Einsatzes geladen. Die beiden Zellpopulationen wurden 6 h kommunizieren dürfen, und dann werden die Zellen auf der unteren Seite des Einsatzes wurden isoliert und mittels Durchflusszytometrie analysiert. Calcein-positive Zellen von der Unterseite des Einsatzes würde reflektierenden von Zellen sein, die eSspalt junctional Kopplung durch den Einsatz Poren tablished. Die Größe der 0,4 um Poreneinsatz begrenzt funktionelle gap junction Bildung zwischen Zellen , die auf beiden Seiten des Einsatzes wächst, wodurch die Kommunikation sekretierten Faktoren beschränke (zB Wachstumsfaktoren, Mikrovesikel, etc.). Alternativ werden die Größe der 1 um und 3 um Poren offenbar groß genug funktionelle Kopplung der Zellen durch gap junctions zu ermöglichen. Daher ist es durch die Porengröße zu modulieren, kann man damit beginnen, die vielfältige Rolle zu verstehen (n), dass verschiedene Formen der interzellulären Kommunikation auf TME Entwicklung und Evolution haben können.
Abb . 1: durchlässigem mikroporösen Membran Insert Modell Scheme (a) Offensichtlich normale menschliche diploide AG1522 Fibroblasten (niedrige Passage - Zellen) bestimmt CAFs zu werden sind ausgesät auf invertiertdurchlässige mikroporöse Einsätze aus einem 10 um dicken Polyestermembran mit 0,4 & mgr; m, 1 & mgr; m oder 3 & mgr; m Poren besteht. Folgende Befestigung werden die Einsätze invertiert und in die Vertiefungen von Platten kultiviert und bis zur Konfluenz gebracht. (B) Krebszellen und Kontrollfibroblasten werden getrennt in Kolben gezüchtet , bevor auf der Oberseite der Einsätze mit Fibroblasten beimpft wird wachsenden innig an der Unterseite. (C) Die co-kultivierten Zellen jeden zweiten Tag gefüttert und für die gewünschte Zeit gehalten. (D) zu den jeweiligen Zeitpunkten nach der Co-Kultur und / oder experimentelle Behandlungen, die CAFs (Unterseite der Einsätze) und / oder Krebszellen (Oberseite des Einsatzes) werden durch Trypsinisierung sorgfältig isoliert hochreine Zellpopulationen ergeben, die für die Analyse von Endpunkten oder propagiert für nachfolgende Studien verwendet werden können. Bitte klicken Sie hiereine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2:. Generierung von hoch angereichertem Zellpopulationen Repräsentative Durchflusszytometrie Ergebnisse zeigen die Fähigkeit des Einsatzes hochangereichertes zu halten, noch unabhängige heterotypic Zellpopulationen folgenden 120 h Co-Kultur. (A) AG1522 Zellen von der Unterseite des 0,4 um Poreneinsatz geerntet zeigen 99,9% der Bevölkerung frei von GFP-markiertem MDA-MB-231 - Zellen auf der Oberseite des Einsatzes (untere linke Quadrant) zu wachsen. (B) AG1522 Zellen von der Unterseite des Einsatzes 1 um Poren geerntet zeigen auch 99,8% angereicherte Population (Quadrant unten links). (C) AG1522 Zellen von der Bodenseite des 3 & mgr; m Poreneinsatz geerntet zeigen , dass nur 68,5% der Bevölkerung frei von GFP-markiertem ist Zellen (unteren linken Quadranten), Was darauf hinweist , dass eine große Anzahl von GFP-positiven MDA-MB-231 Zellen in der Lage zu migrieren waren durch die 3 & mgr; m Poren. Bitte hier klicken um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3:. Die Erzeugung von Krebs-assoziierten Fibroblasten verminderte Expression von CAV1 ist eine konsistente und zuverlässige CAF - Biomarker. (A) Mikroskopische Aufnahmen von in situ Immunfluoreszenz (Maßstabsbalken = 20 um), und (b) Western - Blot - Analyse von CAV1 in AG1522 - Zellen , die in Co-Kultur mit AG1522 Zellen (Kontrolle) (links) oder mit MDA- gewesen MB-231 Brustkrebszellen (rechts) für 120 Stunden. Die Färbung mit Ponceau S Red wurde für Ladekontrolle verwendet und fache Änderung in Western-Blots zu bestimmen. Die Ergebnisse sind repräsentativ fürdrei separate Experimente. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4:. Modulation der interzellulären Kommunikation durch Insert Porengröße Durchflusszytometrie analysiert die Anpassungsfähigkeit der durchlässigen mikroporösen Membran Einsatz TME - Modell für verschiedene Modi der interzellulären Kommunikation auszuwählen demonstrieren zwischen Calcein AM AG1522 Zellen auf der Oberseite des Einsatzes und AG1522 unkontrolliert zu wachsen geladen Zellen, die auf ihrer Unterseite wächst. (A) Zellen von der unteren Seite von 0,4 um Poren Inserts geerntet zeigen sehr geringe Mengen an Calcein-positive Zellen (0,57%), was darauf hinweist begrenzten Spalt-junction Kommunikation durch den Einlege Poren. (B) Die Zellen von der unteren Seite von 1 & mgr; m Poren Inserts geerntet zeigen höhere Ebenen der Calcein-positiven Zellen (9,98%), was auf die Bildung von funktionellen Gap Junctions. (C) Zellen von der unteren Seite von 3 um Poreneinsätzen geerntet zeigen ein hohes Maß an Calcein-positiven Zellen (87,8%), was auf umfangreiche spalt junctional Kommunikation. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Das hier beschriebene Protokoll ist ein einfaches, anpassungsfähig in vitro - Verfahren (Abbildung 1) , die eine durchlässige mikroporöse Membran verwendet Einsatz aus einer Co-Kultur von Zellen heterotypic hoch angereicherten einzelnen Zellpopulationen zu erzeugen. Bezeichnenderweise ist das Modell für verschiedene Arten der interzellulären Kommunikation zu untersuchen. Die kritischen Schritte umfassen die geeignete Porengröße Einsatz für spezielle experimentelle Interesse (e) Auswahl der ersten Zellpopulation auf der Unterseite des Einsatzes in Medium mit 50% FBS supplementiert Säen, die zweite Zellpopulation auf der Oberseite der Aussaat einzufügen, und Co-Kultivieren der zwei verschiedenen Zellpopulationen für eine geeignete Zeitdauer. Wir zeigen , dass dieses System der Nachahmung verschiedener in vivo Eigenschaften fähig ist, damit eine größere Chance , die Bereitstellung der molekularen, phänotypischen zu verstehen und latente Veränderungen in der frühen Evolution TME auftreten, die einen großen d - Adressenachteil vieler etablierter TME in - vitro - Modellen (Abbildung 2).
Das Modell kann leicht Untersuchung verschiedener Aspekte der Zell-Zell - Wechselwirkungen in Krebs-Stroma Entwicklung und TME evolution (Figur 4) zu ermöglichen , modifiziert werden. Während die 0,4 um Poreneinsatz innige Kopplung zwischen den beiden Zellpopulationen 45 ermöglicht es schränkt erheblich Bildung funktioneller gap junctions zwischen den auf beiden Seiten des Einsatzes Membran (Figur 4) gewachsenen Zellen. Daher erleichtert so Untersuchung der Rolle der diffundierbare Faktoren (zB Wachstumsfaktoren) und / oder extrazelluläre Vesikel (beispielsweise Exosomen), die 46-48 CAF Entwicklung vermitteln. Alternativ werden die 1 um und 3 um die Poren groß genug, um die Bildung von funktionellen gap junctions zu ermöglichen, wodurch die Untersuchung von sowohl direkten metabolischen Kopplung über junctional Kanäle und indirekte Kommunikation ermöglicht durchdiffusionsfähig sezerniert Faktoren. Da jedoch die 3 um Poreneinsatz Zellmigration durch die Poren ermöglicht (siehe Abbildung 2), ist es nicht die Reinheit von zwei getrennten heterotypic Zellpopulationen während der ausgedehnten Co-Kulturzeiten zu erhalten (z. B. 120 h). Wohingegen das vorliegende Modell die Untersuchung mehrerer Aspekte des TME ermöglicht, ist es in seiner Fähigkeit beschränkt , für viele der komplexen physiologischen Wechselwirkungen zu berücksichtigen , die innerhalb einer in vivo TME (zB vaskulären Flüssigkeitsaustausch, etc.) auftreten.
die frühen Ereignisse der Krebs-Stroma-Aktivierung und Entwicklung des TME Verständnis ist wichtig, in den Schritten in Primärtumor Initiierung und Progression sowie Metastasierung beteiligt Aufklären. Es ist nun allgemein anerkannt , dass der Krebs Stroma, insbesondere CAFs, bei der Unterstützung der Karzinogenese eine kritische Rolle besitzen ( beschrieben in 49). Dies hat zu der Entwicklung von vielen in vitro 2D- und 3D - Modellen, Aimed bei Beleuchtungs Strategien die frühen Mechanismen beitragen zu stromal-Aktivierung und der Tumorprogression zu zielen. Leider sind viele dieser Modelle durch ihre Unfähigkeit zu ermöglichen Isolierung einzelner Zellpopulationen, ohne zeitaufwendige und belastende Verarbeitung, für weitere Studien begrenzt. Somit bietet dieses Protokoll eine wichtige Ergänzung zu dem Gebiet der TME Forschung, wie es in vivo ähnlichen Eigenschaften mit der Fähigkeit kombiniert , um einfach und schnell hochangereichertes oder reine Zellpopulationen für die sofortige Analyse oder Fortpflanzung für nachfolgende Studien erhalten.
Sobald die Technik beherrscht wird, kann der Einsatz TME - Modell für die Untersuchung von unterschiedlichen TME bidirektionalen Wechselwirkungen verwendet werden (beispielsweise Krebs, Krebs zu Immunzellen Endothelzellen, etc.). Zusätzlich kann die Komplexität der Co-Kultur erhöht werden, indem eine gemischte Zellpopulation auf einer Seite des Einsatzes und einer einzelnen Population auf der alternativen Seite platzieren, somit erhalten,ing eine in vivo wie TME Zellpopulation Komplexität. Allerdings ist Vorsicht bei der Auswahl eines Einsatzes mit der richtigen Porengröße ausgeübt werden , wenn Zellen von besonders kleinem Durchmesser (zB menschliche Lymphozyten mit einem Durchmesser von ~ 7 um 50), da sie von der Migration durch die kleineren Poren geeignet sein können ( beispielsweise 0,4 & mgr; m oder 1 & mgr; m). Vor der Ko-Kultur, Migrationsexperimente (Figur 2) kann im ganzen verlängert Kokultur Experimente Aufrechterhaltung der reinen Zellpopulationen , um sicherzustellen , gerechtfertigt sein.
Dieses Modell eignet sich auch für die Wirkungen von verschiedenen therapeutischen Herausforderungen zu untersuchen (beispielsweise ionisierende Strahlung, Chemotherapeutika, Hyperthermie) und physiologische Veränderungen (zB Hypoxie, Hyperoxie, biologischen Inhibitoren) in gemischten Zellpopulationen, die sich über der durchlässigen mikroporösen Membraneinsatzes gekoppelt sind. Das Modell hat seine Fähigkeit unter Beweis gestellt, um erfolgreich CAFs erzeugen, identified durch eine weithin akzeptierte CAF biomarker (dh Herunterregulierung der CAV1) 39-42 (Figur 3), die weiter um 55% verringert wurde , wenn der Einsatz - System bei in vivo wie PO 2 (7 mm Hg gehalten wurde, 0,5% O 2) 51, Hervorhebung der Wandlungsfähigkeit des Modells für verschiedene experimentelle Designs und Bedingungen (Daten nicht gezeigt). zu erhalten, tiefere Einblicke in Krebs-Stroma-Aktivierung, die frühe Entwicklung des TME und zellulären Reaktionen auf therapeutische oder Umwelteinflüsse In der Summe bietet dieses Modell eine vereinfachte Ansatz und die Möglichkeit, zeitliche und externe Faktoren, um zu modulieren.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine oder widersprüchliche Interessen haben.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| For Cell Culture | |||
| AG01522 (i.e., AG1522) human diploid fibroblast | Coriell | 107661 | Passage 8-13 |
| MDA-MB-231-luc-D3H1 breast adenocarcinoma cell line | PerkinElmer | 119261 | Parental line: ATCC (#HTB-26) |
| MDA-MB-231/GFP breast adenocarcinoma cell line | Cell Biolabs | AKR-201 | |
| Eagle's minimal essential medium (MEM) | Corning Cellgro | 15-010-CV | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Qualified | Sigma | F6178-500mL | |
| Corning Glutagro Supplement (200 mM L-alanyl-L-glutamine) | Corning Cellgro | 25-015-Cl | |
| Penicillin Streptomycin Solution, 100x | Corning Cellgro | 30-002-Cl | |
| Transwell Insert (i.e., permeable microporous membrane insert) (0.4 μm pore) | Costar | 3450 | |
| Transwell Insert (i.e., permeable microporous membrane insert) (1 μm pore) | Greiner bio-one | 657610 | |
| Transwell Insert (i.e., permeable microporous membrane insert) (3 μm pore) | Costar | 3452 | |
| 6-well Culture Plate | Greiner Bio-One Cellstar | 657160-01 | |
| 75 cm2 cell culture flask | CellStar | 658 170 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS), 1x | Corning Cellgro | 21-040-CV | without calcium & magnesium |
| 0.25% (vol/vol) Trypsin, 2.21 mM EDTA, 1x | Corning Cellgro | 25-053-Cl | |
| 15 ml Centrifuge Tube | CellTreat | 229411 | |
| 35 mm x 10 mm Cell Culture Dish | Greiner bio-one | 627 160 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| For Immunofluorescent Microscopy | |||
| Mouse anti-Caveolin 1 | BD Transduction Laboratories | 610406 | In situ Immunofluorescence - 1:5,000 |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | ThermoFisher Scientific | A-11029 | In situ Immunofluorescence - 1:2,000 |
| Bovine Serum Albumin - Fraction V | Rockland | BSA-50 | Immunoglobulin and protease free |
| 16% (wt/vol) Formaldehyde Solution | ThermoFisher Scientific | 28908 | Dilute to 4% with 1x PBS |
| Premium Cover Glass (22 mm x 22 mm No.1) | Fisher | 12548B | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787-50ML | |
| SlowFade Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | S36938 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| For Flow Cytometric Analysis | |||
| Calcein, AM | Molecular Probes | C3100MP | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14025-076 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| For Western Blot Analysis | |||
| Mouse anti-Caveolin 1 | BD Transduction Laboratories | 610406 | Western Blot - 1:1,000 |
| Tween-20 | BioRad | 170-6531 | |
| Nitrocellulose Membrane (0.2 μm) | BioRad | 162-0112 | |
| Western Lightning Plus-ECL | PerkinElmer | NEL104001EA | |
| BioRad DC Protein Assay | BioRad | 500-0116 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | BioRad | 161-0302 | |
| Sodium deoxycholate monohydrate (DOC) | Sigma | D5670 | |
| IGEPAL CA-630 (NP40) | Sigma | I8896 | |
| 30% Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1 | BioRad | 161-0158 |
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