Abstract
kanser hücreleri ve çevresindeki kanserli olmayan stroma arasındaki erken heterotypic etkileşimleri anlamak stromal aktivasyonu ve tümör mikro-(TME) kurulmasına yol açan olaylar durulaştırmada önemlidir. In vitro ve TME vivo modellerde çeşitli geliştirilmiştir; Bununla birlikte, genel olarak bu modeller hali hazırda daha fazla çalışma, bozucu olmayan koşullar altında, tek tek hücre popülasyonlarının izole izin vermez. Bu zorluğu aşmak için, uzun bir co Ucun zarın her iki tarafında ayrı ayrı iyice büyümüş zenginleştirilmiş hücre popülasyonlarının kolay üretilmesi, fakat izin veren bir geçirgen mikro gözenekli membran geçme oluşan bir hücre büyütme alt-tabaka kullanılarak bir in vitro TME modeli kullanmışlardır -Kültür kez. Bu modelin kullanımı sayesinde, normal diploid insan fibroblastlarında den (CAF) popülasyonu aşağıdaki önemli ölçüde zenginleştirilmiş kanserle ilişkili fibroblast üretme yeteneğine sahiptirFloresan etiketleme ve / veya hücre sıralama kullanılmadan yüksek düzeyde metastatik insan göğüs karsinom hücreleri ile birlikte-kültür (120 saat). Ayrıca, ekin gözenek boyutu modüle ederek, biz gelişimini altında yatan mekanizmaların soruşturma izin iki heterotypic hücre popülasyonları arasındaki hücrelerarası iletişimi (örneğin, boşluk kavşak iletişim, salgılanan faktörler) modu için kontrol edebilirsiniz gap junction geçirgenliği rolü de dahil olmak üzere TME,. Bu model kanser stroma başlatılması, TME erken evrimi ve terapötik ajanlar kanser hücrelerinin yanıtları stroma modüle etkisi yol açan ilk olayların anlayışımızı arttırmak değerli bir araç olarak hizmet vermektedir.
Introduction
tümör mikro (TME) arada var ve ev sahibi stroma yanında gelişmeye karsinom hücreleri oluşan son derece karmaşık bir sistemdir. Bu stromal bileşeni, tipik olarak fibroblastlar, miyofibroblastlar, endotel hücreleri, çeşitli bağışıklık bileşenlerinin, hem de hücre dışı bir matris 1 oluşur. Önemli bir bileşen, bu stroma genellikle çoğu, aktive edilmiş fibroblastlar, sıklıkla kanserle ilişkili fibroblast veya karsinoma ile ilişkili fibroblastlar (CAF) 2,3 olarak adlandırılır. Normal, aktif olmayan fibroblastlar aksine cafs meme, prostat, akciğer, pankreas, deri, kolon, özofagus olmak üzere karsinom, çok çeşitli tümör başlaması, ilerlemesi, anjiyogenez, invazyon, metastaz ve nüks 4-11 katkı ve 5,6,12-17 yumurtalık. Oysa, kanser patogenezinde boyunca cafs katkısı kesin doğası yetersiz tanımlanmış kalır. Ayrıca, klinik kanıtlar cafs bir prognostik değeri göstermiştirYüksek dereceli maligniteler, tedavi yetmezliği ve genel olarak kötü prognoz 10,18,19 kendi varlığını ilişkilendirilmesi.
Açıkçası, CAF geliştirme başlatılması olaylar yanı sıra TME içindeki rollerini aracılık hücrelerarası iletişim anlayışımızı geliştirerek, hasta sonuçlarını geliştirmek heyecan verici yeni tedavi hedefleri ve gelişmiş stratejileri sağlayabilir. Bu amaca yönelik olarak, in vivo ve in vitro modellerde çok geliştirilmiştir. In vivo yaklaşımlar hastaların TME daha yansıtıcı olmakla birlikte, içinde ve tümörler arasında hem muazzam karmaşıklığı ve heterojenliği dahil sınırlamalar sahiptirler. Ayrıca, insan denekler tümör örnekleri genellikle oldukça TME geliştirilen temsil ve TME başlatılması olayların bir anlayış izin vermez. Deneysel hayvan çalışmaları nedeniyle fiziksel durumları farklılıklardan ancak insanlara hayvan verilerinin genelleme dikkatli yapılmalıdır bazı avantajlar sunarBu tür kemirgenlerde (örn tiyol kimya 20, metabolizma hızı 21 tolerans vb 22 vurgulamak) olarak insanlar ve hayvanlar arasında ology. Ayrıca, doğada genetik olarak heterojen olan insan nüfusunun, aksine, laboratuvar hayvanları genellikle homojenlik için yetiştirilmektedir. Ayrıca, geçici fizyolojik değişimleri ve hücre fenotip değişiklikleri incelemek için, yanı sıra, kemirgenler gibi hayvan kullanarak belirli deneysel parametrelerin kontrol etmek için çoğu zaman zordur. Bu nedenle, in vitro, 2- ve 3-boyutlu (2D ve 3D) doku kültürü modelinde sık TME gelişmenin temel anlayışı ilerletmek için kullanılmaktadır. In vivo sistemlerinin karmaşıklığı doğru bir canlandırdığı onların eksikliği rağmen, bu modeller büyük ölçüde mekanik soruşturma kolaylaştırmak avantajlar sunmaktadır. In vitro modeller TME daha basitleştirilmiş odaklı ve uygun maliyetli analizi için, bu sayede istatistiksel olarak anlamlı izin veri oluşturulabilirhayvanlarda ortaya çıkan sistemik varyasyonlar serbest hücreleri.
In vitro sistemlerinde birçok çeşidi vardır. En sık kullanılan iki TME in vitro model karışık tek tabaka ya da sferoit hücre kültürleri içerir. Hem kültür yöntemleri arası etkileşimleri ve çeşitli TME spesifik hücre fenotipi değişikliklerin analizi için (tümör hücreleri ile, örneğin, normal hücreler) temel çalışmaları için avantajlıdır (örneğin normal fibroblastlardan kanserle ilişkili fibroblastlar ortaya çıkması). Ayrıca, küremsi TME daha yansıtıcı doku benzeri bir yapı oluşturmak edebiliyoruz, ve tümör heterojenliği 23 temsilcisi olabilir. Ancak sferoidler genellikle deneysel sonuçlar 24 zorlaştırabilir katmanlar arasında büyük ölçüde değişen oksijen basıncı geçişlerini, üretirler. Ne yazık ki, iki model son derece ko- aşağıdaki ileri karakterizasyon ve çalışma için saf hücre popülasyonlarının izole etme yeteneği sınırlıdırkültür. bu nedenle floresan etiketli veya tespit makinesi ile etiketlenmiş ve daha sonra hücre popülasyonları ayırmak için ayırma geniş işleme ve hücreye ko-kültür karıştırılır tabi olması için en azından bir hücre tipi gerektirecektir yapmak. Hücre sıralayıcı oldukça saf bir hücre popülasyonu izole edebilen birlikte, bir selüler stres ve muhtemel mikroplu kirliliklere farkında 25 riski olmalıdır.
Hücrelerarası iletişimi anlaşılmasını kolaylaştırmak için, büyük çabalar geliştirmek ve basitleştirilmiş bir yaklaşım izin yakından, in vivo ortamda taklit in vitro sistemlerde optimize edilmesine yönelik tahsis edilmiştir. Böyle bir alet geçirgen mikro gözenekli insert, ilk 1953 26 yılında geliştirilen ve daha sonra farklı uygulamalar ve çalışmalar (örneğin, hücre polarite 27 endositoz 28, uyuşturucu taşımacılığı 29, doku modelleme 30, fert için adapte edilmiş bir zar substratyonu 31 seyirci kalma etkisi 32,33, vs.). Bu sistem geçirgen olmayan plasticware üzerinde kültürlendiklerinde gözlenmez 34,35 işaretleyicileri in vivo birçok in vivo benzeri anatomik ve fonksiyonel farklılaşma hücrelerin büyümesini, hem de ifadeyi verir. Ayrıca, son derece ince gözenekli membran (10 mikron kalınlığında) in vivo ortamda taklit ve hem üst ve taban hücre etki bağımsız hücre işleyişini izin moleküller ve dengeleme kez hızlı difüzyon izin verir. zar, gözenekler içinden içi çeşitli iletişim modu koruyarak TME sistemi olarak ucun yardımcı ilave bir avantajı, aynı çevre koşulları zarın her iki tarafında yetiştirilen iki heterotipik hücre popülasyonlarının fiziksel olarak ayrılmasıdır. Fiziksel olarak ayrılmış olmasına rağmen, iki hücre popülasyonları metabolik de olduğu gibi, salgılanan elemanları üzerinden bağlandığı veAyrıca boşluk kavşak kanallardan, burada tarif. Ayrıca, in vivo kısmi oksijen basıncı da ekler (PO 2) sürdürerek, model diğer sistemlerde gözlenen oksijen ve kimyasal geçişlerini komplikasyonlarını azaltır. Aksine, bu TME kontrol doğal mekanizmaların anlaşılması artırır. Özellikle, iki hücre popülasyonları kolaylıkla eş-kültür uzun süreler aşağıdaki flüoresan etiketleme ve / veya hücre sıralama olmaksızın, yüksek saflıkta izole edilebilir.
Burada membran gözenekleri sayesinde, sürekli iki-yönlü iletişim henüz insan meme karsinoma hücreleri ve geçirgen bir mikro gözenekli membran geçme her iki tarafında sırasıyla yetişkin insan fibroblastlarında oluşan bir in vitro TME protokol açıklar ama. Biz gösteriyor ki gelişimine farklı gözenek boyutları ile, hücrelerarası iletişimi belirli bir tip katkısı (gap junction karşı, örneğin salgılanan faktörler) membranlar kullanılarakTME araştırılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Kültür Medya ve Hücre 1. Hazırlık
- Eagle minimum zorunlu% 12.5 (hacim / hacim) ile desteklenen ortamda ısı ile inaktive edilmiş fetal büyükbaş hayvan serumu (FBS), 2 mM L-alanil-L-glutamin ve penisilin 100 birim 500 ml ml streptomisin, 100 ug hazırlayın.
Not: büyüme ortamı ve ek (ler) i, kolayca diğer hücre suşlan veya hücre hatları büyüme gereksinimleri için değiştirilebilir. - her bir ek (6-çukurlu format insert) hücre kültür ortamının 70 ul hazırlayın: bir Eagle minimum zorunlu ortam% 50 (hacim / hacim) ısı ile inaktive edilmiş FBS, 2 mM L-alanil-L-glutamin ve 100 birim ile desteklenmiş penisilin ve ml streptomisin, 100 ug.
Not: orta parçanın alt tarafında (yani, alt) hücre bağlanmasını kolaylaştırmak için% 50 FBS ile takviye edilmektedir. Büyüme ortamı, ve ek (ler) i, kolayca diğer hücre suşlan veya hücre hatları büyüme gereksinimleri için değiştirilebilir. - parçanın alt tarafında kaplama olan tahsis edilmiş hücrelerin bir hücre süspansiyonu.
NOT: Burada, sonuçları AG1522 75 cm 2 hücre kültürü şişeleri yetiştirilen normal insan fibroblastlar kullanılarak elde edildi ve bu hücreler bu nedenle hücre süspansiyonu hazırlık açıklamasının odak noktası olacaktır. - hücreleri toplamak için, büyüme ortamı çıkarın ve 5 mi 1X fosfat tamponlu salin (PBS) ile hücre mono tabakasının 2x yıkayın.
- PBS çıkarın ve RT (oda sıcaklığı), 2 dakika için bir hücre boyunca oda sıcaklığında (RT) önceden ısıtılmış 2.21 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA), tripsin,% 0.25 (hacim / hacim) 1 ml yayın.
- (Adım 1.1 hazırlandı) tam büyüme ortamında 9 ml tripsin aktivitesinin sönmesi yavaşça şişeye 10x yüzeyi üzerine hücre süspansiyonu pipetle hücreleri toplamak.
- Hemasitometre veya elektronik sayacı kullanarak hücre konsantrasyonunu belirleyin ve provid olacak hücre süspansiyonu hacmi pipetE, bir steril 15 ml santrifüj borusu ile ekleme başına 250.000 hücre.
- Santrifüjle hücre süspansiyonu (800 xg, 2 dakika) sonra pelet. 70 ul başına 250.000 hücre konsantrasyonu elde etmek için (adım 1.2 'de elde edilmiş) büyüme ortamı hücre pelletini süspanse edin.
Not: geçiren mikro gözenekli membran uçlar hücre kültürü 2B alt tabakalar göre gibi hücreleri başlangıçta bağlanmasını kolaylaştırmak için% 50 (hacim / hacim) FBS ihtiva eden bir ortam içinde askıya alınmalıdır hariç Hücre Serpilmesi benzer şekilde gerçekleştirilir.
Ek'lerin 2. Hazırlık
NOT: hücre kültürüne adanmış bir laminer akış biyolojik güvenlik kabininde steril koşullar, çalışmasını sağlamak için.
- 0.4 um membran gözenek boyutu, 1 mikron ya da 3 uM seçin uçlar ile (gözenek büyüklüğü deney çıkar (ler) ile tespit, hücreler arası iletişim farklı mod rolünü araştırmak için kullanılabilir).
NOT: 0,4 mikron gözenek smal olduğunuYeterince l uç zarın her iki tarafında hücreler arasında işlevsel boşluk bağlantıları oluşumunu sınırlamak ve salgılanan faktörlerle arası iletişim incelemek için kullanılabilir. Oysa, 1 um ile 3 um gözenekler, fonksiyonel boşluk bağlantıları oluşumuna izin verecek kadar büyüktür ve boşluk bağlantıları ve salgılanan faktörler hem arası iletişim incelemek için kullanılabilir. - ambalajından bireysel ekler çıkarın ve eşit büyüklükteki çok iyi çanak içine yerleştirin.
NOT: Uçlar belirli uygulama ihtiyaçlarını karşılamak üzere çeşitli membran yüzey alanları mevcuttur (örneğin, 6-kuyu, 12-kuyu ve 24 kuyu ekler.). Burada, sonuçlar 6-kuyu insert kullanılarak elde edildi ve bu nedenle modeli açıklaması odak noktası olacaktır. - çanak kapaklı ekler içeren, çanak örtün. Iki eliyle çok iyi yemek Holding, yavaşça ekleme dipleri (yani, alt) artık yukarı bakacak şekilde çanak ters çevirin.
- th kaldırinsertlerin alt tarafına maruz bırakılması çok çukurlu tabak E taban. Bir defada bir ekleme ile çalışarak, forseps steril bir çifti kullanmak ve yavaşça yerine insert tutun. serbest el ile 250,000 hücre ihtiva eden bir hücre süspansiyonu (adımları 1.3-1.8 hazırlandı) 70 ul çekmek için bir geniş ağızlı uç, bir pipet kullanın.
- Hücreleri plaka, Ucun zarının ortasına hafifçe pipet ucu yerleştirin ve yavaş yavaş zarın yüzeyi etrafında pipet hareket ederken yavaş yavaş hücre süspansiyonu 70 ul pipet. ucun kenarına pipet ve hücre süspansiyonu uzatmak için dikkatli olun.
Not: ekleme kenarına temas birleştirilmesi esnasında kurutma hücrelerine yol açmakta ve hücre süspansiyonu kapiler gerilimi kaybına neden olabilir. - bakım icra olmamak olası mikrobiyal kontaminasyonu önlemek maruz kalan uçlar üzerinde doğrudan çalışmak için birlikte kalan uçlar için tekrarlayın.
- Yavaşça çok-iyi dönüşçanak alt ekler kapsayacak. Ters uçlar ile çanak tutulması, 30-45 dakika süreyle 37 ° C de% 5 (hacim / hacim) CO2 bulunan nemli bir hava atmosferinde inkübe edin.
NOT: insert temas kuyunun alt hücre süspansiyonu, dikkatle çanak altını kaldırın ve hafif bir açı oluşturur ve çanak yüzeyi arasında daha fazla ayrılık yaratır, böylece yemeğin üstüne kenarında onu dinlenme halinde ve (hücreler numaralı seribaşı) ekler alt tarafı. Bu yerine geçmenin gözlerin yüzlerine takılarak hücreleri engeller. - 30-45 dk inkübasyon süresi sonrasında nazikçe ekler içeren çanak kaldırmak ve laminer akış biyolojik güvenlik kabini yerleştirin.
- İki elleri ve sıkı çanak kapağı tutulması ile yavaşça ekli hücreleri içeren ekler alt tarafı şimdi aşağı bakacak şekilde çanak yeniden ters çevirin.
- 3 mikron gözenek Migrati önlemek için ekler için yavaş ve dikkatli 2 ml (1 ml ekleyinekin alt kısmı batırılır ve böylece önceden ısıtılmış tam ortam insert gözenek) içinden hücre ile (her bir oyuğa adım 1.1), bkz.
- ekler içeren tüm kuyularda büyüme ortamı ekledikten sonra, nemlendirilmiş bir inkübatör geri çanak yerleştirin.
- uçlar 48 saat boyunca inkübatör rahatça durmasına izin verin. 48 saat sonra, kuyunun dibinden ortam 2 ml aspire ve taze büyüme ortamına 2 ml ekleyerek hücreleri beslenir.
- Bunlar için (daha önce alt tarafta artan ilk hücre nüfusu insert, üst tarafında ikinci hücre popülasyonunun süspansiyonu (~ 250,000 hücre / ml) de, tohum, 1 ml alt taze ortam ilave edildikten sonra deneyler, AG1522 (kontrol) hücreleri veya kanser (deney) hücreleri) eklentilerin alt tarafında büyüyen, cafs olmaya aday önce AG1522 hücrelerine sahip ekler, üst üste yerleştirilir. nemlendirilmiş bir inkübatör geri tabak koyun.
NOT: Eğer işekin alt de uygun olmayan hücrelerle ing, bu hücreler sokma üst tarafında yetiştirilebilir. - de insertinin alt ve üst, orta aspire ucun üst tarafına hücre popülasyonu ikinci bir tohumlama sonra 24, 72, orta ve 96 saat değiştirin. Yavaşça, çukurun tabanına ucun üst tarafına taze ortam 1 ml ve 2 ml ekleyin. İki hücre popülasyonları 120 saat boyunca geçirgen, mikro gözenekli membran çanağı her iki tarafında ko-kültür kalmasına izin verir.
3. Trypsinization tarafından Ekle gelen Hücreleri Toplama
Not: zenginleştirilmiş hücre popülasyonu elde etmek kolaylığı ek olarak, uç TME modeli aynı zamanda benzer bir deneysel tedavi için (örn, kimyasal maddeler, yukarıda belirtilen ya da çevre atmosferinde aşağıdaki oksijen koşullarına maruz, iyonize radyasyon tedavisi, vb inkübasyon) halinde diğer in vitro (in situ imüno-algılama, Batı beneklenmesinde örneğin) daha sonra bitiş noktası analizi için kullanılabilir zenginleştirilmiş popülasyonları elde etmek üzere uç zarın her iki tarafında hasat edilebilir ve daha sonraki deneyler 36 için yayılabilir.
- hücreleri toplamak için, büyüme ortamından parçayı çıkarın ve 1 ml PBS içeren 35 mm hücre kültürü çanak içine yerleştirin. 1 ml PBS ile uç 1x alt ve üst tarafı yıkanır.
- PBS çıkarın ve% 0.25 2.21 mM EDTA, tripsin (hacim / hacim), 200 ul, oda sıcaklığına kadar ön ısıtılmıştır.
- parçanın alt tarafında yetiştirilen hücreler toplanması için, 35 mm çanak içine tripsin solüsyonu yerleştirin ve yavaşça oda sıcaklığında 2 dakika boyunca tripsin solüsyonu içine ucun alt tarafının.
- hücrenin toplanması halindeekin üst tarafında yetiştirilen s, 35 mm tabak içine ekleme yeri ve ekin üstüne tripsin solüsyonu ekleyin ve oda sıcaklığında 2 dakika inkübe edilir.
- tam büyüme ortamında 800 ul ekleyerek tripsin aktivitesinin sönmesi.
- ekin alt yetiştirilen hücreler toplanması için, 35 mm çanak büyüme ortamı ilave edin ve yavaşça Hafifçe tutulmakta olan, ucun 10 kat yüzeyi üzerine hücre süspansiyonu 1 ml pipetleme hücreleri toplamak açı, hücre süspansiyonu çanak içine toplar şekilde.
- ucun üst tarafından hücrelerin toplanması, üst tarafına bir büyüme ortamı ilave edin ve yavaşça insertin 10x yüzeyi üzerine hücre süspansiyonu 1 ml pipetle.
Akış Sitometrisi ile Hücre Saflık 4. Karakterizasyonu
Not: t saflığını korumak için geçirgen, mikro gözenekli membran ekler karakterize etme kabiliyetini120 saat kadar bölümler 1-3, yeşil floresan protein (GFP) ile yapıldı (yani üst ve alt), iki hücre popülasyonları MDA-MB-231 hücreleri ucun üst tarafına kaplanan etiketli ve olmayan GFP etiketli AG1522 hücreleri, 0.4 μm- alt tarafındaki 1 μm- veya 3 mikron gözenek uçlar kaplanan.
- Parçanın alt taraftan hücreleri (yöntem Bölüm 3'te tarif edilmiştir) toplandı bir kez santrifüj ile hücre süspansiyonu (500 g, 30 sn) pelet.
- Süpernatantı ve% 1 (hacim / hacim) FBS ile desteklenmiş Hanks Dengelenmiş Tuz Çözeltisi (HBSS) içinde 400 ul hücre pelletini askıya.
- GFP ve GFP foton emisyonu 37 algılamak için 530/30 bir bant geçirici filtresi heyecanlandırmak için sitometresinde bir 488 nm lazer ile donatılmış bir akış sitometrik analizi yapın.
- Hücre tanımlama amacıyla, akış sitometresinde ileri ayarlamak için AG1522 kontrol hücre popülasyonları ve yan dağılım gerilimleri kullanın. ayarlamakGFP kanal voltaj GFP sinyali için alt saptama eşiği olarak hücresel otofloresans değerini ayarlamak için.
- Kontrol hücreleri kullanılarak eşik yolluk belirleyin. kontrole karşı GFP pozitif hücrelerinin varlığı göre her hücrelerinin saflığı değerlendirmek.
NOT: Saf nüfus tespit hiçbir GPF-pozitif hücrelerin yansıtıcı olacaktır.
Yerinde imünofloresansta tarafından Hücreleri 5. Karakterizasyonu
- Ekin hücreleri tripsinizasyon sonra (bölüm 3) hücreleri toplamak, levha 5 x 10 4, steril cam kapak slipleri 250 ul büyüme ortamı (adım 1.1) hücreleri ve bir nemli hava atmosferinde 1 st için takmak için izin 37 ° C inkübatör% 5 (hacim / hacim) CO2.
- İnkübasyonun sonunda, yumuşak lamel ihtiva eden tabağı çıkarın ve bir laminer akış biyolojik güvenlik kabinine yerleştirin.
- Dikkatle (adıma bakın önceden ısıtılmış tam orta 2 ml ekleyin1.1) tabakların her birine, böylece lamel batırılır.
- Lamelleri içeren tüm yemekler için büyüme ortamı ilave edildikten sonra, 48 saat için bir kuluçka makinesi içinde 37 ° C 'de% 5 (hacim / hacim) CO2 nemlendirilmiş hava atmosferine geri yemekler döndürür.
- 48 saat inkübe edildikten sonra, PBS ile örnek 3x yıkama ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca PBS içinde% 4 (ağırlık / hacim) formaldehid ile tespit edin.
- Tris tamponlu tuz (TBS: 50 mM Tris-Cl, pH 7.5, 150 mM NaCI) ile 5x yıkayın ve daha sonra 5 dk için 0.25,% (hacim / hacim) Triton X-100,% 0.1 (ağırlık / hacim) bir saponin ile geçirgen hale RT.
- spesifik olmayan% 2 (hacim / hacim) normal keçi serumu (NGS),% 1 (ağırlık / hacim) sığır serum albümini (BSA),% 0.1 (hacim / hacim) TBS içinde Triton X-100 ile bağlanma sitesi bloğu (bloke oda sıcaklığında 1 saat için çözelti).
- gece boyunca 4 ° C'da, çözelti engelleme: birincil antikor (1.000 anti-Caveolin 1 (CAV1), 1) kuluçkalayın.
- % 0.2 NGS (hacim / hacim),% 1 (ağırlık / hacim) BSA,% 0.1, bağlanmamış birincil antikor (3x, 5 dak / yıkama) yıkayın (voL / hacim) TBS içinde Triton X-100 (yıkama çözeltisi).
- bloke etme çözeltisi 1 saat süre ile, oda sıcaklığında, ikincil antikor ile inkübe (bölüm 5.4).
- ilişkisiz ikincil antikor yıkama solüsyonu ile (3x, 5 dakika / yıkama) yıkayın (adım 5.6).
- Dağı 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) içeren bir anti-solmaya montaj orta ile bir slayt lamelleri ve tırnak cilası ile mühür.
- floresans uyarma için harici bir ışık kaynağı ile donatılmış bir inverted mikroskop üzerinde 63X petrol büyütme objektif kullanarak hücrelerin gözlemlemek ve sonraki analiz için bağlı bir dijital kamera kullanarak görüntü yakalamak.
Western Blot ile hücrelerin 6. Karakterizasyonu
NOT: Western blot süreciyle başka 38 tarif edilmiştir. Kısa bir anahat burada tarif edilir:
- Trypsinization tarafından Ovülden hücrelerin ayrılmasını takiben, (bkz bölüm 3) santrifüj (500 gr, 30 sn) ile hücre süspansiyonu pelet.
- Süpernatantı ve 100 ul PBS ile hücre topağı 2x askıya.
- değiştirilmiş Radyoimmunopresipitasyon tahlilinde 50 ul süpernatan ve lize hücreleri çıkarın (RIPA) tamponu (Tris pH 7.5, 50 mM NaCl 150 mM, NP-40,% 1 (hacim / hacim), sodyum deoksikolat monohidrat (DOC)% 0.5 (hacim / hacim), sodyum dodesil sülfat (SDS),% 0.1 (hacim / hacim)), proteaz ve fosfataz inhibitörü kokteyl ihtiva etmektedir.
- 4 ° C'de 15 dakika boyunca 19,000 g'de buz ve santrifüj 20 dakika boyunca inkübe edin.
- RIPA tamponu içinde deterjan uyumlu bir protein optik yoğunluk deneyi kullanılarak süpernatan protein konsantrasyonunu belirleyin.
- 0.2 um nitroselüloz zar üzerine elektroblot, sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) tarafından ayrı proteinler.
- % 0.1 (hacim / hacim) Tween-20 (TBST) ve% 4 (ağırlık / hacim) içeren TBS içerisinde zarlar inkübe 60 dakika süre ile, süt (engelleme çözelti) yağsız ve (bir gece boyunca 4 ° C'de ana antikorla reaksiyona antiCAV1, 1: 1,000).
- RT (5 dk / yıkama) de TBST ile zar 3x yıkayın.
- yaban turpu peroksidazı (HRP) (: 5.000: 1) ile konjuge edilmiş bir anti-fare ikincil antikoru içeren çözelti bloke 30 dakika boyunca zarların inkübe edin.
- RT (5 dk / yıkama) de TBST ile zar 3x yıkayın.
- Bir Western lekeleme algılama sistemi kullanarak kemilüminesans ile reaksiyon ürünleri gözünüzde canlandırın.
Akış Sitometrisi ile Hücreler arası İletişimin 7. Karakterizasyonu
NOT: geçirgen mikro gözenekli membran uyum karakterize etmek için hücreler arası iletişimi (örneğin, salgılanan faktörler, gap junction) farklı mod incelemek için ekler. Bölümler 1-2,12 floresan olmayan AG1522 hücreleri 0.4 μm- alt tarafı, 1 μm- veya 3 um gözenekli ekler ile kaplanan ile yapıldı.
- Kültür, Bölüm 1.1'de tarif edilen ortam kullanılarak% 90 konfluansa kadar 35 mm çanak AG1522 hücreleri etiketli olmayan.
- RINSE hücreleri HBSS 1 ml 1x.
- Kalsein AM ile 30 | im ihtiva eden HBSS içinde hücrelerin inkübe edilmesi ile Calcein AM Yük hücreleri.
- 37 ° C de% 5 (hacim / hacim) CO2 bulunan nemli bir hava atmosferinde 15 dakika boyunca inkübe edin.
- Yıkama hücresi HBSS 1 ml 2x.
- Oda sıcaklığında 2 dakika boyunca 2.21 mM EDTA,% 0.25 tripsin 200 ul çözelti (hacim / hacim) ilave edilerek Hücreleri tripsinize edin.
- % 12.5 içeren tam bir ortam (hacim / hacim) FBS, 800 ul ekleyerek tripsin aktivitesinin sönmesi.
- tekrarlanan pipetleme süspansiyon içine hücreleri getirin.
- Hemasitometre veya elektronik sayaç kullanılarak hücre konsantrasyonunu belirlemek önce alt tarafta büyüyen AG1522 hücrelerine sahip eklerin üst tarafına kalsein AM ile yüklendi 250.000 hücre plaka.
- 37 ° C de% 5 CO2 bulunan nemli bir hava atmosferinde uçlar inkübe 6 saat.
- tarif edildiği gibi 6 saat sonra, ara parça alt tarafından hücreleri toplamak3. bölümde.
- santrifüjle hücre süspansiyonu (500 g, 30 saniye) sonra pelet.
- Süpernatantı ve% 1 (hacim / hacim) FBS ile desteklenmiş HBSS 400 ul hücre pelletini askıya.
- lazer ile donatılmış bir sitometresindeki hücreleri analiz ve heyecan verici yeteneğine sahip filtre ve üretici protokol uyarınca, Calcein (496 nm ve 516 nm, sırasıyla) emisyonunu tespit.
- Hücre tanımlama amacıyla, akış sitometresinde ileri ve yan dağılım gerilimleri ayarlamak için bir lekesiz AG1522 kontrol hücre popülasyonu kullanın. Calcein sinyali için alt saptama eşiği olarak hücresel otofloresans değerini ayarlamak için Calcein kanal gerilimini ayarlamak.
- Calcein yüklü kontrol hücreleri kullanılarak üst eşik sınırını belirleyin. kontrole karşı Kalsein-pozitif hücrelerinin varlığı temelinde her bir hücre ekleme için iletişim değerlendirmek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Burada in vivo tümör mikro-(Şekil 1) taklit eden bir in vitro heterotipik hücresi eş-kültür sistemi geliştirmek için geçirgen bir mikro gözenekli membran inserti adapte. İki farklı hücre popülasyonları (eden kullanım sırasında, 120 saat kadar) uzun zaman süreleri için ucun gözenekli membranın her iki tarafındaki yetiştirilmeye Bu sistem sağlar. 0.4-, 1- veya 3 m gözenekli eklerin üst tarafında GFP etiketli, MDA-MB-231 hücreleri kaplama ve bunların büyümesini sağlayarak belirlenen Önemli sistemi, hücre popülasyonlarının saflığını muhafaza edebilen AG1522 hücreler 120 saat, parçanın alt tarafında büyüyen ile birlikte kültür. Bundan sonra, hücreler, parçanın alt tarafında toplanmış ve hücre popülasyonu saflık kaybına işaret eder bir GFP pozitif MDA-MB-231 hücrelerinin varlığını tespit etmek akış sitometrisi ile analiz edilmiştir. Analiz% 99.9 ve% 99.8 pu ortayasırasıyla 0.4 ve 1 mikron gözenek ekler, gelen nüfus yeniden; Gözenekler zarı boyunca GFP-pozitif, MDA-MB-231 hücrelerinin önemli sayıda izin vermek için yeterince büyük olduğu gibi, ancak 3 um gözeneklere sahip uç, hücre popülasyonlarının ayrılığı korumak için mümkün olduğu (Şekil 2) .
Ile belirlendiği üzere Önemli olarak, in situ, bağışıklık ve Western blot analizinde sayesinde, etkin bir şekilde, MDA-MB-231 göğüs kanseri hücre ile ko-kültür, aşağıdaki normal insan diploid AG1522 fibroblastlardan kanserle ilişkili fibroblastlar oluşturmak için bu sistemi kapasitesini göstermek mümkün caveolin-1 azaltılmış ekspresyonu, iyi kurulmuş CAF biyomarker 39-42 (Şekil 3). CAV1 çok hücresel süreçleri 43 dahil olan, plazma membranı, lipid salı etki kaveolanın oluşturan bir iskele proteindir. Western blotIki farklı bantlar CAV1 44 α ve β izoformlarına karşılık gözlenmiştir. Ne yazık ki, küçük izoformu arasındaki fark (lar), CAF biyomarkerlerin özellikle rolleri hakkında bilinmektedir.
Ayrıca, iki heterotipik hücre popülasyonlarının (Şekil 4) arasında hücreler arası iletişim modüle etmek için uç eş-kültür sistemine yeterliliğini göstermektedir. Etiketli olmayan boşluk kavşak yetkin insan diploid AG1522 fibroblastlar parçanın alt tarafında konfluansa kadar kültürlendi. AG1522 hücrelerin ikinci bir grubu kalsein AM, yeşil floresan boşluk birleşim geçirgen boya ile yüklenir ve ucun üst tarafına konuldu. İki hücre popülasyonları 6 saat iletişim için izin verildi ve daha sonra, alt taraf üzerindeki hücreler izole edilmiş ve akış sitometrisi ile analiz edilmiştir. parçanın alt taraftan Kalsein-pozitif hücreler, ES hücrelerinin yansıtıcı oluruç gözenekleri sayesinde boşluk kavşak kaplin tesis edilmiştir. 0.4 um gözenek boyutu bu şekilde (örneğin, büyüme faktörleri, microvesicles, vs.) salgılanan faktörlerle iletişim kısıtlamaktadır ucun her iki yanı üzerinde büyüyen hücreler arasında sınırlı fonksiyonel boşluğu birleşim oluşumunu yerleştirin. Seçenek olarak ise, 1 um ile 3 um gözenek boyutu boşluk bağlantıları yoluyla hücrelerin fonksiyonel bağlanmasını izin verecek kadar belli büyüktür. Bu nedenle, gözenek boyutu modüle ederek, bir içi iletişimin farklı mod TME gelişim ve evrim üzerine olabileceğini çeşitli rol (ler) anlamaya başlayabiliriz.
Şekil 1:. Geçirgen Mikro Membran takın Model Programı (a) Görünüşe göre normal bir insan diploid AG1522 fibroblastlar cafs olmaya yazgılı (düşük geçit hücreleri) ters üzerine ekilir0.4 um, 1 um ya da 3 um gözeneklere sahip 10 um kalınlıkta polyester membrandan oluşan geçirgen bir mikro-gözenekli ekler. bağlanmasının ardından, uçlar ters çevrilir ve konfluansa kadar plakalarının oyuklarına yerleştirilir ve kültürlendi. (B) kanser hücreleri ve kontrol fibroblastlar önce alt tarafta iyice büyüyen fibroblastlar ile eklerin üst tarafında ekilmiş olan şişelerde ayrı olarak büyütülür. (C) eş kültürlenmiş hücreler her gün beslenen ve arzu edilen süre boyunca muhafaza edilir. Ko-kültür ve / veya Deneme, ilgili zamanlarda (d); cafs (eklentilerin alt tarafı) ve / veya kanser hücrelerinin (insertin üst kısım) dikkatli bir şekilde, yüksek ölçüde saf bir hücre popülasyonu elde tripsinizasyonla izole edilir son noktaların analizi için kullanılan ya da sonraki çalışmalar için yayılır edilebilir. tıklayınızBu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için.
Şekil 2:. Son derece Zenginleştirilmiş hücre popülasyonlarının Nesil sitometri sonuçları Temsilcisi akışı son derece 120 saat ko-kültür aşağıdaki henüz bağımsız heterotypic hücre popülasyonlarının zenginleştirilmiş saklamalıdır için ucun yeteneğini göstermek. 0.4 mikron gözenek ekin alt tarafından hasat: (a) AG1522 hücre nüfusunun% 99.9 parçası (altta,) üst tarafında büyüyen GFP-etiketli, MDA-MB-231 hücrelerinin olmadığını göstermiştir. (B) 1 mikron gözenek ekin alt tarafında toplanan AG1522 hücreleri de% 99.8 zenginleştirilmiş popülasyonu (altta,) göstermektedir. 3 mikron gözenek parçanın alt kısmından toplanır (c) AG1522 hücreleri nüfusun sadece% 68.5 (altta, GFP-etiketli hücre serbest olduğunu göstermektedir), GFP pozitif MDA-MB-231 hücrelerinin çok sayıda 3 mikron gözenekler aracılığıyla göç başardık belirten. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3:. Kanser-İlişkili Fibroblast Nesil CAV1 ve İndirimli ifadesi tutarlı ve güvenilir bir CAF biyomarkerdir. (A) 'ya MDA-in situ immünofloresan içinde mikroskopik resimleri (ölçek çubuğu = 20 um) ve AG1522 hücreleri (kontrol) ile birlikte kültür olmuştur AG1522 hücrelerinde CAV1 (b) Western Blot analizi, (sol) MB-231 göğüs kanseri hücreleri (sağ) 120 saat. yükleme kontrolü için kullanıldı ve Western blotlar kat değişimi saptamak için Ponceau S Kırmızı boyama. Sonuçlar temsilcisiÜç ayrı deney. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 4:. Ekle Gözenek-Boyutu Hücreler arası iletişim modülasyonu sitometri Calcein AM AG1522 hücreleri ekleme ve AG1522 denetiminin üstünde büyüyen yüklenen arasındaki hücrelerarası iletişimi farklı mod seçmek için geçirgen mikro gözenekli membran eklemek TME modelinin uyum gösteren analizleri Akış alt tarafında büyüyen hücreler. (A) 0.4 mikron gözenek uçlar alt kısmından elde edilen hücrelerin uç gözenekler boyunca sınırlı bir boşluk birleşim iletişimi gösteren Calcein-pozitif hücrelerin (% 0.57), çok düşük seviyelerde göstermektedir. (B) 1 mikron gözenek uçlar alt kısmından elde edilen hücrelerin h göstermektedirFonksiyonel boşluk bağlantıları oluşumunu gösteren Calcein-pozitif hücrelerin (% 9.98) 'in igher seviyeleri. 3 mikron gözenek ekler alt tarafında toplanan (c) Hücreler geniş boşluk-kavşak iletişimi gösteren Calcein-pozitif hücrelerin (% 87.8), yüksek düzeyde göstermektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada açıklanan protokol geçirgen bir mikro gözenekli membran geçme heterotipik hücre ko-kültür zenginleştirilmiş bir hücre popülasyonlarının üretmek için kullanıldığı bir basit, in vitro prosedür adapte edilebilir (Şekil 1). Belirgin bir şekilde, örnek arası çeşitli iletişim modu araştırılması için uygundur. kritik adımlar üst tarafında ikinci bir hücre popülasyonu tohumlama,% 50 FBS ile takviye edilmiş ortam içinde parçanın alt tarafında, ilk hücre popülasyonunu tohumlama, spesifik deneysel çıkar (lar) için uygun bir gözenek boyutu insert seçimi; yerleştirin ve uygun bir zaman süresi için, iki farklı hücre popülasyonlarının ko-kültür. Biz bu sistemin böylece moleküler, fenotipik anlamak için büyük bir fırsat sağlayarak, çeşitli in vivo özelliklerini taklit yeteneğine sahip olduğunu göstermek ve gizli değişiklikler önemli bir d adresleri erken TME evrim sırasında meydana gelenbirçok kurulan TME in vitro modellerin isadvantage (Şekil 2).
Model kolayca kanser stroma gelişimi ve TME evrim (Şekil 4) hücre-hücre etkileşimleri çeşitli yönlerini soruşturma izni için modifiye edilebilir. 0.4 mikron gözenek İki adet hücre popülasyonlarının 45 arasındaki yakın akuple edilmesini sağlar iken, önemli ölçüde uç zarın her iki tarafında yetiştirilen hücreler (Şekil 4) arasında işlevsel boşluk bağlantıları oluşumunu kısıtlar. Bu nedenle, böylece CAF gelişimini 46-48 aracılık yayılabilir faktörlerden (örneğin, büyüme faktörleri) ve / veya hücre dışı kesecikler (örneğin, eksozomlar), rolü soruşturma kolaylaştırılması. Seçenek olarak ise, 1 um ile 3 um gözenekler, böylece kavşak kanalları aracılığıyla dolaylı iletişim ile iki direkt metabolik kuplaj incelenmesine olanak sağlayan fonksiyonel boşluk bağlantıları oluşumuna izin verecek kadar büyüktüryayılabilir salgılanan faktörler. 3 mikron gözenek uç gözenekler aracılığıyla hücre göçünü sağlar Ancak, genişletilmiş ko-kültür zamanlarında iki ayrı heterotipik hücre popülasyonlarının saflığını muhafaza etmez, (bakınız Şekil 2) (örn., 120 saat). Bu model, TME çeşitli yönlerini çalışma sağlar iken, bir in vivo TME (örneğin, damar sıvısı değişimi, vs.) içinde meydana kompleks fizyolojik etkileşimlerin birçok hesaba yeteneği sınırlıdır.
TME kanseri stromanın aktivasyonu ve gelişiminin erken olayların anlaşılması primer tümör başlaması ve ilerlemesi, hem de metastaz implike adımları açıklık önemlidir. Artık yaygın kanser stroma, özellikle cafs, (49 gözden) karsinogenezisi destekleyen kritik bir rol sahip olduğu kabul edilmektedir. Bu in vitro 2D ve 3D modellerinde bir çok geliştirilmesine yol açmıştır amaçaydınlatıcı stratejileri ed stromal-aktivasyonu ve tümör ilerlemesi katkıda erken mekanizmaları hedef. Ne yazık ki, bu model, birçok daha fazla çalışma, zaman alıcı ve stresli işlem olmadan, tek tek hücre popülasyonlarının izole edilmesine olanak verecek yetersizlik ile sınırlıdır. Kolayca ve hızlı bir şekilde takip eden çalışmalar için acil analiz veya yayılması için son derece zenginleştirilmiş veya saf hücre popülasyonlarının elde etmek için yeteneği ile özellikleri gibi in vivo birleştiren Dolayısıyla bu protokol, TME araştırma alanında önemli bir ek sağlar.
Teknik hakim sonra, uç TME model, çeşitli TME çift yönlü etkileşimleri incelemek için kullanılabilir (örneğin, kanser, bağışıklık sistemi hücrelerine vs kanser endotel). Buna ek olarak, ortak-kültürünün karmaşıklığı elde Dolayısıyla, bir ucun yan ve diğer yan üzerinde, tek nüfus bir karma hücre grubunun yerleştirilmesi ile arttırılabilirTME hücre popülasyonu karmaşıklığı gibi in vivo bir daha ing. Bununla birlikte, dikkatli özellikle küçük çaplı (~ 7 um 50 bir çap ile, örneğin, insan lenfositler) hücreleri kullanılarak, eğer, uygun gözenek büyüklüğüne sahip bir insert seçiminde dikkat edilmelidir, onlar (daha küçük gözenekler boyunca göç yeteneğine sahip olabilir örneğin, 0.4 mm veya 1 uM). Için ko-kültür öncesinde, göç deneyleri (Şekil 2) genişletilmiş ko-kültür deneyler boyunca saf hücre popülasyonlarının bakım sağlamak için gerekli olabilir.
Bu model aynı zamanda çeşitli tedavi zorlukları (örneğin, iyonize radyasyon, kemoterapötikler, hipertermi) ve geçirgen mikro gözenekli membran ekleme boyunca bağlandığı karışık hücre popülasyonları fizyolojik değişiklikler (örneğin, hipoksi, hiperoksi, biyolojik inhibitörleri) etkilerini araştırmak için müsait. modeli başarıyla cafs oluşturmak için yeteneğini göstermiştir, idesokma sistemi 2 (7 mm Hg PO gibi in vivo olarak muhafaza edildiğinde daha% 55 azalmıştır yaygın olarak kabul gören CAF belirteç (CAV1 yani, aşağı ayarlanmasını) 39-42 (Şekil 3) ile ntified% 0.5 çeşitli deneysel tasarımlar ve koşullar için modelin uyum vurgulayarak O 2) 51 (veriler gösterilmemiştir). Özetle, bu model terapötik veya çevresel ajanlara basitleştirilmiş bir yaklaşım ve kanser stroma aktivasyonu, TME erken evrim hakkında daha ayrıntılı bilgiler elde etmek için zamansal ve dış faktörleri modüle etmek için bir fırsat ve hücresel yanıtları sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir rakip veya çakışan çıkarları olduğunu beyan ederim.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| For Cell Culture | |||
| AG01522 (i.e., AG1522) human diploid fibroblast | Coriell | 107661 | Passage 8-13 |
| MDA-MB-231-luc-D3H1 breast adenocarcinoma cell line | PerkinElmer | 119261 | Parental line: ATCC (#HTB-26) |
| MDA-MB-231/GFP breast adenocarcinoma cell line | Cell Biolabs | AKR-201 | |
| Eagle's minimal essential medium (MEM) | Corning Cellgro | 15-010-CV | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Qualified | Sigma | F6178-500mL | |
| Corning Glutagro Supplement (200 mM L-alanyl-L-glutamine) | Corning Cellgro | 25-015-Cl | |
| Penicillin Streptomycin Solution, 100x | Corning Cellgro | 30-002-Cl | |
| Transwell Insert (i.e., permeable microporous membrane insert) (0.4 μm pore) | Costar | 3450 | |
| Transwell Insert (i.e., permeable microporous membrane insert) (1 μm pore) | Greiner bio-one | 657610 | |
| Transwell Insert (i.e., permeable microporous membrane insert) (3 μm pore) | Costar | 3452 | |
| 6-well Culture Plate | Greiner Bio-One Cellstar | 657160-01 | |
| 75 cm2 cell culture flask | CellStar | 658 170 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS), 1x | Corning Cellgro | 21-040-CV | without calcium & magnesium |
| 0.25% (vol/vol) Trypsin, 2.21 mM EDTA, 1x | Corning Cellgro | 25-053-Cl | |
| 15 ml Centrifuge Tube | CellTreat | 229411 | |
| 35 mm x 10 mm Cell Culture Dish | Greiner bio-one | 627 160 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| For Immunofluorescent Microscopy | |||
| Mouse anti-Caveolin 1 | BD Transduction Laboratories | 610406 | In situ Immunofluorescence - 1:5,000 |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | ThermoFisher Scientific | A-11029 | In situ Immunofluorescence - 1:2,000 |
| Bovine Serum Albumin - Fraction V | Rockland | BSA-50 | Immunoglobulin and protease free |
| 16% (wt/vol) Formaldehyde Solution | ThermoFisher Scientific | 28908 | Dilute to 4% with 1x PBS |
| Premium Cover Glass (22 mm x 22 mm No.1) | Fisher | 12548B | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787-50ML | |
| SlowFade Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | S36938 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| For Flow Cytometric Analysis | |||
| Calcein, AM | Molecular Probes | C3100MP | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14025-076 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| For Western Blot Analysis | |||
| Mouse anti-Caveolin 1 | BD Transduction Laboratories | 610406 | Western Blot - 1:1,000 |
| Tween-20 | BioRad | 170-6531 | |
| Nitrocellulose Membrane (0.2 μm) | BioRad | 162-0112 | |
| Western Lightning Plus-ECL | PerkinElmer | NEL104001EA | |
| BioRad DC Protein Assay | BioRad | 500-0116 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | BioRad | 161-0302 | |
| Sodium deoxycholate monohydrate (DOC) | Sigma | D5670 | |
| IGEPAL CA-630 (NP40) | Sigma | I8896 | |
| 30% Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1 | BioRad | 161-0158 |
References
- Hanahan, D., Weinberg, R. A.
- Olive, K. P., Jacobetz, M. A., et al. Inhibition of Hedgehog signaling enhances delivery of chemotherapy in a mouse model of pancreatic cancer. Science. 324 (5933), 1457-1461 (2009).
- Pandol, S., Edderkaoui, M., Gukovsky, I., Lugea, A., Gukovskaya, A. Desmoplasia of pancreatic ductal adenocarcinoma. Clinical Gastroenterology and Hepatology: the Official Clinical Practice. Journal of the American Gastroenterological Association. 7 (11 Suppl), S44-S47 (2009).
- Dabbous, M. K., Haney, L., Carter, L. M., Paul, A. K., Reger, J. Heterogeneity of fibroblast response in host-tumor cell-cell interactions in metastatic tumors. Journal of Cellular Biochemistry. 35 (4), 333-344 (1987).
- Olumi, A. F., Grossfeld, G. D., Hayward, S. W., Carroll, P. R., Tlsty, T. D., Cunha, G. R. Carcinoma-associated fibroblasts direct tumor progression of initiated human prostatic epithelium. Cancer Research. 59 (19), 5002-5011 (1999).
- Orimo, A., Gupta, P. B., et al. Stromal fibroblasts present in invasive human breast carcinomas promote tumor growth and angiogenesis through elevated SDF-1/CXCL12 secretion. Cell. 121 (3), 335-348 (2005).
- Schürch, W., Seemayer, T. A., Lagacé, R., Gabbiani, G. The intermediate filament cytoskeleton of myofibroblasts: an immunofluorescence and ultrastructural study. Virchows Archiv. A, Pathological Anatomy and Histopathology. 403 (4), 323-336 (1984).
- Nakagawa, H., Liyanarachchi, S., et al. Role of cancer-associated stromal fibroblasts in metastatic colon cancer to the liver and their expression profiles. Oncogene. 23 (44), 7366-7377 (2004).
- Choi, Y. P., Lee, J. H., et al. Cancer-associated fibroblast promote transmigration through endothelial brain cells in three-dimensional in vitro models. International Journal of Cancer. Journal International du Cancer. 135 (9), 2024-2033 (2014).
- Ito, M., Ishii, G., Nagai, K., Maeda, R., Nakano, Y., Ochiai, A. Prognostic impact of cancer-associated stromal cells in patients with stage I lung adenocarcinoma. Chest. 142 (1), 151-158 (2012).
- Gaggioli, C., Hooper, S., et al. Fibroblast-led collective invasion of carcinoma cells with differing roles for RhoGTPases in leading and following cells. Nature Cell Biology. 9 (12), 1392-1400 (2007).
- Navab, R., Strumpf, D., et al. Prognostic gene-expression signature of carcinoma-associated fibroblasts in non-small cell lung cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (17), 7160-7165 (2011).
- Hwang, R. F., Moore, T., et al. Cancer-associated stromal fibroblasts promote pancreatic tumor progression. Cancer Research. 68 (3), 918-926 (2008).
- Sneddon, J. B., Zhen, H. H., et al. Bone morphogenetic protein antagonist gremlin 1 is widely expressed by cancer-associated stromal cells and can promote tumor cell proliferation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (40), 14842-14847 (2006).
- De Wever, O., Nguyen, Q. -D., et al. Tenascin-C and SF/HGF produced by myofibroblasts in vitro provide convergent pro-invasive signals to human colon cancer cells through RhoA and Rac. FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 18 (9), 1016-1018 (2004).
- Zhang, C., Fu, L., et al. Fibroblast growth factor receptor 2-positive fibroblasts provide a suitable microenvironment for tumor development and progression in esophageal carcinoma. Clinical Cancer Research. 15 (12), 4017-4027 (2009).
- Yao, Q., Qu, X., Yang, Q., Wei, M. CLIC4 mediates TGF-β1-induced fibroblast-to-myofibroblast transdifferentiation in ovarian cancer. Oncology Reports. , (2009).
- Crawford, Y., Kasman, I., et al. PDGF-C mediates the angiogenic and tumorigenic properties of fibroblasts associated with tumors refractory to anti-VEGF treatment. Cancer Cell. 15 (1), 21-34 (2009).
- Paulsson, J., Micke, P. Prognostic relevance of cancer-associated fibroblasts in human cancer. Seminars in Cancer Biology. 25, 61-68 (2014).
- Messina, J. P., Lawrence, D. A. Effects of 2-mercaptoethanol and buthionine sulfoximine on cystine metabolism by and proliferation of mitogen-stimulated human and mouse lymphocytes. International Journal of Immunopharmacology. 14 (7), 1221-1234 (1992).
- Ames, B. N. Endogenous oxidative DNA damage, aging, and cancer. Free Radical Research Communications. 7 (3-6), 121-128 (1989).
- Cheng, Y., Ma, Z., et al. Principles of regulatory information conservation between mouse and human. Nature. 515 (7527), 371-375 (2014).
- Upreti, M., Jamshidi-Parsian, A., et al. Tumor-endothelial cell three-dimensional spheroids: new aspects to enhance radiation and drug therapeutics. Translational Oncology. 4 (6), 365-376 (2011).
- Mehta, G., Hsiao, A. Y., Ingram, M., Luker, G. D., Takayama, S. Opportunities and challenges for use of tumor spheroids as models to test drug delivery and efficacy. Journal of Controlled Release: Official Journal of the Controlled Release Society. 164 (2), 192-204 (2012).
- Muraki, Y., Hongo, S., Ohara, Y. Contamination of the cell sorter fluidics system with the water-borne bacterium Burkholderia cepacia. Cytometry. Part A: the Journal of the International Society for Analytical Cytology. 81 (2), 105-107 (2012).
- Grobstein, C. Morphogenetic interaction between embryonic mouse tissues separated by a membrane filter. Nature. 172 (4384), 869-870 (1953).
- Tan, S., Tompkins, L. S., Amieva, M. R. Helicobacter pylori usurps cell polarity to turn the cell surface into a replicative niche. PLoS Pathogens. 5 (5), e1000407 (2009).
- Hyman, T., Shmuel, M., Altschuler, Y. Actin is required for endocytosis at the apical surface of Madin-Darby canine kidney cells where ARF6 and clathrin regulate the actin cytoskeleton. Molecular Biology of the Cell. 17 (1), 427-437 (2006).
- Ghaffarian, R., Muro, S. Models and methods to evaluate transport of drug delivery systems across cellular barriers. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (80), e50638 (2013).
- Braian, C., Svensson, M., Brighenti, S., Lerm, M., Parasa, V. R. A 3D human lung tissue model for functional studies on mycobacterium tuberculosis infection. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (104), e53084 (2015).
- Bath, M. L. Inhibition of in vitro fertilizing capacity of cryopreserved mouse sperm by factors released by damaged sperm, and stimulation by glutathione. PLoS ONE. 5 (2), e9387 (2010).
- Zhao, Y., De Toledo, S. M., Hu, G., Hei, T. K., Azzam, E. I. Connexins and cyclooxygenase-2 crosstalk in the expression of radiation-induced bystander effects. British Journal of Cancer. 111 (1), 125-131 (2014).
- Buonanno, M., de Toledo, S. M., Azzam, E. I. Increased frequency of spontaneous neoplastic transformation in progeny of bystander cells from cultures exposed to densely ionizing radiation. PLoS ONE. 6 (6), e21540 (2011).
- Byers, S. W., Hadley, M. A., Djakiew, D., Dym, M. Growth and characterization of polarized monolayers of epididymal epithelial cells and Sertoli cells in dual environment culture chambers. Journal of Andrology. 7 (1), 59-68 (1986).
- Pitt, A., Gabriels, J. Epithelial cell culture on microporous membranes. American Biotechnology Laboratory. 4 (5), 38-45 (1986).
- Buonanno, M., de Toledo, S. M., Pain, D., Azzam, E. I. Long-term consequences of radiation-induced bystander effects depend on radiation quality and dose and correlate with oxidative stress. Radiation Research. 175 (4), 405-415 (2011).
- Ducrest, A. -L., Amacker, M., Lingner, J., Nabholz, M. Detection of promoter activity by flow cytometric analysis of GFP reporter expression. Nucleic Acids Research. 30 (14), e65 (2002).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot. , JoVE. Cambridge, MA. Available from: http://www.jove.com/science-education/5065/the-western-blot (2016).
- Mercier, I., Casimiro, M. C., Wang, C. Human breast cancer-associated fibroblasts (CAFs) show caveolin-1 down-regulation and RB tumor suppressor functional inactivation: implications for the response to hormonal therapy. Cancer Biology & Therapy. , (2008).
- Martinez-Outschoorn, U. E., Pavlides, S., et al. Tumor cells induce the cancer associated fibroblast phenotype via caveolin-1 degradation: implications for breast cancer and DCIS therapy with autophagy inhibitors. Cell Cycle. 9 (12), 2423-2433 (2010).
- Witkiewicz, A. K., Dasgupta, A., et al. Loss of stromal caveolin-1 expression predicts poor clinical outcome in triple negative and basal-like breast cancers. Cancer Biology & Therapy. 10 (2), 135-143 (2014).
- Zhao, X., He, Y., et al. Caveolin-1 expression level in cancer associated fibroblasts predicts outcome in gastric cancer. PLoS ONE. 8 (3), e59102 (2013).
- Shaul, P. W., Anderson, R. G. Role of plasmalemmal caveolae in signal transduction. The American Journal of Physiology. 275 (5 Pt 1), L843-L851 (1998).
- Fujimoto, T., Kogo, H., Nomura, R., Une, T. Isoforms of caveolin-1 and caveolar structure. Journal of Cell Science. 113 (Pt 19), 3509-3517 (2000).
- Wartiovaara, J., Lehtonen, E., Nordling, S., Saxen, L. Do Membrane Filters prevent Cell Contacts. Nature. 238 (5364), 407-408 (1972).
- Tyan, S. -W., Kuo, W. -H., et al. Breast cancer cells induce cancer-associated fibroblasts to secrete hepatocyte growth factor to enhance breast tumorigenesis. PLoS ONE. 6 (1), e15313 (2011).
- Xu, J., Lu, Y., Qiu, S., Chen, Z. -N., Fan, Z. A novel role of EMMPRIN/CD147 in transformation of quiescent fibroblasts to cancer-associated fibroblasts by breast cancer cells. Cancer Letters. 335 (2), 380-386 (2013).
- Hoffman, R. M. Stromal-cell and cancer-cell exosomes leading the metastatic exodus for the promised niche. Breast Cancer Research : BCR. 15 (3), 310 (2013).
- Franco, O. E., Shaw, A. K., Strand, D. W., Hayward, S. W. Cancer associated fibroblasts in cancer pathogenesis. Seminars in Cell & Developmental Biology. 21 (1), 33-39 (2010).
- Kuse, R., Schuster, S., Schübbe, H., Dix, S., Hausmann, K. Blood lymphocyte volumes and diameters in patients with chronic lymphocytic leukemia and normal controls. Blut. 50 (4), 243-248 (1985).
- Vaupel, P., Schlenger, K., Knoop, C., Höckel, M. Oxygenation of human tumors: evaluation of tissue oxygen distribution in breast cancers by computerized O2 tension measurements. Cancer Research. 51 (12), 3316-3322 (1991).
