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Cancer Research

ट्यूमर microenvironment की नकल: समृद्ध सेल आबादी सृजन और जांच कहनेवाला संचार के लिए एक सरल विधि

Published: September 20, 2016 doi: 10.3791/54429
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Radiology, New Jersey Medical School, Rutgers University

Abstract

कैंसर की कोशिकाओं और आसपास के गैर कैंसर स्ट्रोमा के बीच जल्दी heterotypic बातचीत को समझने की घटनाओं stromal सक्रियण और ट्यूमर microenvironment (TME) की स्थापना के लिए अग्रणी elucidating में महत्वपूर्ण है। इन विट्रो में और TME के vivo मॉडल में कई विकसित किया गया है; हालांकि, सामान्य रूप में इन मॉडलों को आसानी से अलग-अलग सेल आबादी के अलगाव की अनुमति नहीं है, गैर-perturbing परिस्थितियों में, आगे के अध्ययन के लिए। इस कठिनाई को नाकाम करने के लिए, हम एक पारगम्य microporous झिल्ली डालें कि अच्छी तरह से वृद्धि हुई अत्यधिक समृद्ध सेल आबादी के सरल पीढ़ी, अभी तक अलग से परमिट से मिलकर एक सेल के विकास सब्सट्रेट का उपयोग इन विट्रो TME मॉडल कार्यरत है विस्तारित सह के लिए डालने की झिल्ली के दोनों तरफ, -culture बार। इस मॉडल के उपयोग के माध्यम से, हम (सीएएफ) सामान्य द्विगुणित मानव fibroblasts से आबादी निम्न बहुत समृद्ध कैंसर से जुड़े fibroblast पैदा करने में सक्षम हैंसह संस्कृति (120 एचआर) अत्यधिक मेटास्टेटिक मानव स्तन कार्सिनोमा कोशिकाओं के साथ, फ्लोरोसेंट टैगिंग और / या सेल छँटाई के उपयोग के बिना। इसके अतिरिक्त, डालने के ध्यान में लीन होना आकार के नियमन से, हम दो heterotypic सेल आबादी के बीच कहनेवाला संचार (जैसे, अंतर-जंक्शन संचार, स्रावित कारकों) की विधा है, जो तंत्र के विकास अंतर्निहित की जांच के परमिट के लिए नियंत्रित कर सकते हैं TME, अंतर-जंक्शन पारगम्यता की भूमिका भी शामिल है। यह मॉडल प्रारंभिक कैंसर स्ट्रोमा दीक्षा, TME के ​​प्रारंभिक विकास, और चिकित्सीय एजेंट को कैंसर की कोशिकाओं की प्रतिक्रियाओं पर स्ट्रोमा के नियमन प्रभाव के लिए प्रमुख घटनाओं के बारे में हमारी समझ को बढ़ाने में एक महत्वपूर्ण उपकरण के रूप में कार्य करता है।

Introduction

ट्यूमर microenvironment (TME) एक अत्यधिक जटिल कार्सिनोमा कोशिकाओं है कि सह अस्तित्व और मेजबान स्ट्रोमा के साथ विकसित के शामिल प्रणाली है। यह stromal घटक आम तौर पर fibroblasts, myofibroblasts, endothelial कोशिकाओं, विभिन्न प्रतिरक्षा घटकों, साथ ही एक बाह्य मैट्रिक्स 1 के होते हैं। एक महत्वपूर्ण घटक है, अक्सर इस स्ट्रोमा का बहुमत है, सक्रिय fibroblasts, अक्सर कैंसर से जुड़े fibroblasts या कार्सिनोमा जुड़े fibroblasts (सीएएफ) 2,3 के रूप में करने के लिए भेजा जाता है। सामान्य, गैर सक्रिय fibroblasts के विपरीत, cafs ट्यूमर दीक्षा, प्रगति, angiogenesis, आक्रमण, मेटास्टेसिस, और पुनरावृत्ति 4-11 कार्सिनोमा की एक विस्तृत विविधता, स्तन, प्रोस्टेट, फेफड़े, अग्न्याशय, त्वचा, पेट, घेघा सहित करने के लिए योगदान है, और अंडाशय 5,6,12-17। फिर भी, कैंसर रोगजनन भर cafs के योगदान का सही स्वरूप खराब परिभाषित रहता है। इसके अलावा, नैदानिक ​​सबूत cafs की एक शकुन मूल्य का प्रदर्शन किया है, उच्च ग्रेड कैंसर, चिकित्सा विफलता है, और समग्र गरीब रोग का निदान करने के लिए 10,18,19 उनकी उपस्थिति correlating।

जाहिर है, सीएएफ विकास में की शुरुआत की घटनाओं, साथ ही कहनेवाला संचार TME के ​​भीतर अपनी भूमिका में मध्यस्थता के बारे में हमारी समझ को बढ़ाने, रोमांचक नई चिकित्सकीय लक्ष्यों को और बढ़ाया रणनीति है कि रोगी परिणामों में सुधार कर सकते हैं प्रदान कर सकता है। इस लक्ष्य की ओर, vivo में इन विट्रो मॉडल में कई विकसित किया गया है। जबकि इन विवो दृष्टिकोण मरीजों के TME के और अधिक चिंतनशील रहे हैं, वे बहुत जटिलता और विविधता दोनों के भीतर और ट्यूमर के बीच सहित सीमाओं, अधिकारी। इसके अलावा, मानव विषयों से ट्यूमर के नमूनों अक्सर अत्यधिक TME विकसित प्रतिनिधित्व करते हैं और TME की शुरुआत की घटनाओं में से एक समझ की अनुमति नहीं देते। प्रायोगिक जानवरों के अध्ययन श्री बुश में मतभेद के कारण कुछ फायदे हैं, तथापि मनुष्य के लिए पशु डेटा का सामान्यीकरण सावधानी से किया जाना चाहिए प्रदान करते हैंमनुष्यों और पशुओं के ऐसे मूषक (जैसे, thiol रसायन विज्ञान 20, चयापचय दर 21, सहिष्णुता 22 पर जोर देना, आदि) के रूप में के बीच ology। इसके अलावा, मानव आबादी है, जो प्रकृति में आनुवंशिक रूप से विषम है के विपरीत, प्रयोगशाला पशुओं आम तौर पर एकरूपता के लिए पैदा कर रहे हैं। इसके अलावा, यह अक्सर क्षणिक शारीरिक बदलाव और सेल phenotype परिवर्तन की जांच करने के लिए, साथ ही विशिष्ट प्रयोगात्मक ऐसे मूषक के रूप में पशुओं का उपयोग कर मापदंडों के लिए नियंत्रित करने के लिए मुश्किल है। इस प्रकार, इन विट्रो 2 और 3-आयामी (2 डी और 3 डी) टिशू कल्चर मॉडल में अक्सर TME विकास की बुनियादी समझ अग्रिम करने के लिए उपयोग किया जाता है। इन विवो प्रणालियों की जटिलता का एक सटीक चित्रण की कमी के बावजूद, इन मॉडलों लाभ है कि बहुत यंत्रवत जांच की सुविधा प्रदान करते हैं। इन विट्रो मॉडल TME के एक अधिक सरल केंद्रित है, और लागत प्रभावी विश्लेषण के लिए, जिससे सांख्यिकीय महत्वपूर्ण अनुमति देते हैं डेटा में उत्पन्न किया जा सकताप्रणालीगत बदलाव है कि जानवरों में पैदा की स्वतंत्र कोशिकाओं।

वहाँ इन विट्रो प्रणालियों के कई किस्में हैं। दो सबसे अधिक इस्तेमाल किया TME इन विट्रो मॉडल मिश्रित monolayer या अंडाकार आकृति सेल संस्कृतियों से मिलकर बनता है। दोनों संस्कृति तरीकों कहनेवाला बातचीत और विभिन्न TME विशेष सेल phenotype परिवर्तन के विश्लेषण के लिए (जैसे, ट्यूमर कोशिकाओं के साथ सामान्य कोशिकाओं) की बुनियादी पढ़ाई के लिए फायदेमंद हैं (जैसे, सामान्य fibroblasts से कैंसर से जुड़े fibroblasts के उद्भव)। इसके अतिरिक्त, spheroids TME का एक और अधिक चिंतनशील ऊतक की तरह संरचना बनाने में सक्षम हैं, और ट्यूमर विविधता 23 का प्रतिनिधि हो सकता है। हालांकि spheroids अक्सर परतों में व्यापक रूप से अलग ऑक्सीजन तनाव ढ़ाल, जो प्रयोगात्मक निष्कर्ष 24 को मुश्किल हो सकती उत्पादन। दुर्भाग्य से, दोनों मॉडलों अत्यंत आगे लक्षण वर्णन और अध्ययन के सह निम्नलिखित के लिए शुद्ध सेल आबादी को अलग-थलग करने की क्षमता में सीमित कर रहे हैंसंस्कृति। ऐसा करने के लिए fluorescently टैग या एक की पहचान निर्माता के साथ लेबल है, और फिर व्यापक संसाधन और सेल के लिए मिश्रित सह संस्कृति को subjecting सेल आबादी को अलग करने की छँटाई होना करने के लिए कम से कम एक सेल प्रकार की आवश्यकता होगी। जबकि एक सेल सॉर्टर एक नहीं बल्कि शुद्ध सेल की आबादी को अलग-थलग करने में सक्षम है, एक सेलुलर तनाव और संभावित माइक्रोबियल संदूषण के जानकार जोखिम 25 होना चाहिए।

कहनेवाला संचार की समझ की सुविधा के लिए, महान प्रयासों के विकास और इन विट्रो प्रणालियों है कि निकट vivo वातावरण की नकल है, जबकि एक सरलीकृत दृष्टिकोण की अनुमति देने में अनुकूलन के प्रति समर्पित किया गया है। ऐसा ही एक उपकरण पारगम्य microporous डालने, एक झिल्ली सब्सट्रेट है कि पहली बार 1953 26 में विकसित किया गया था और बाद में विभिन्न अनुप्रयोगों और अध्ययन (जैसे, सेल polarity 27, endocytosis 28, दवा परिवहन 29, ऊतक मॉडलिंग 30, फर्टिलाइजर्स के लिए अनुकूलित हैilization 31, दर्शक प्रभाव 32,33, आदि)। इस प्रणाली मार्करों 34,35 कि जब अभेद्य plasticware पर सुसंस्कृत नहीं मनाया जाता है vivo में इन विवो तरह संरचनात्मक और कार्यात्मक भेदभाव के साथ कोशिकाओं के विकास के साथ-साथ कई की अभिव्यक्ति के लिए परमिट। इसके अलावा, अत्यंत पतली झिल्ली झरझरा (10 माइक्रोन मोटी) अणुओं और संतुलन बार का तेजी से प्रसार, जो इन विवो पर्यावरण simulates और दोनों शिखर और basolateral सेल डोमेन पर स्वतंत्र सेलुलर कामकाज परमिट परमिट। जबकि झिल्ली छिद्रों के माध्यम से कहनेवाला संचार के विभिन्न साधनों को बनाए रखने के लिए एक प्रणाली के रूप में TME डालने की उपयोगिता का एक अतिरिक्त लाभ, एक ही पर्यावरण की स्थिति में झिल्ली के दोनों तरफ बड़े हो गए दो heterotypic सेल आबादी की अपनी शारीरिक जुदाई है। हालांकि शारीरिक रूप से अलग दो सेल आबादी पाचन secreted तत्वों के माध्यम से मिलकर कर रहे हैं और डी के रूप में,यहाँ मानते भी खाई-जंक्शनल चैनलों के माध्यम से। इसके अतिरिक्त, इन विवो आंशिक ऑक्सीजन तनाव में सम्मिलित करता है (पीओ 2) बनाए रखने के द्वारा, मॉडल अन्य प्रणालियों में मनाया ऑक्सीजन और रासायनिक ढ़ाल की जटिलताओं को कम कर देता। दरअसल, यह प्राकृतिक TME नियंत्रित तंत्र की समझ बढ़ जाती है। विशेष रूप से, दो सेल आबादी आसानी से, उच्च शुद्धता के साथ अलग किया जा सकता फ्लोरोसेंट टैगिंग और / या सेल छँटाई सह संस्कृति की विस्तारित अवधि के बाद बिना।

यहाँ हम झिल्ली छिद्रों के माध्यम से निरंतर द्वि-दिशात्मक संचार में इन विट्रो TME मानव स्तन कार्सिनोमा कोशिकाओं और मानव fibroblasts, उगाया क्रमश: एक पारगम्य microporous झिल्ली डालने के दोनों तरफ से मिलकर प्रोटोकॉल का वर्णन है, लेकिन अभी तक। हम बताते हैं कि विकास के लिए, कहनेवाला संचार का एक विशिष्ट प्रकार का योगदान (जैसे, स्रावित अंतराल जंक्शनों बनाम कारकों) अलग ताकना आकार के साथ झिल्ली का उपयोग करकेTME की जांच की जा सकती है।

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Protocol

1. संस्कृति, मीडिया और कक्ष की तैयारी

  1. मिलीलीटर प्रति स्ट्रेप्टोमाइसिन की 100 ग्राम 500 ईगल न्यूनतम आवश्यक के साथ 12.5% ​​(/ खंड खंड) पूरक मध्यम गर्मी निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), 2 मिमी एल alanyl-एल glutamine, और पेनिसिलिन की 100 इकाइयों की मिलीग्राम और तैयार करें।
    नोट: मध्यम विकास और पूरक (एस) आसानी से अन्य सेल उपभेदों या सेल लाइनों के विकास आवश्यकताओं के लिए विमर्श किया जा सकता है।
  2. प्रत्येक डालने (6 अच्छी तरह प्रारूप डालने) के लिए सेल संस्कृति के माध्यम से 70 μl तैयार: ईगल न्यूनतम आवश्यक मध्यम 50% (/ खंड खंड) गर्मी निष्क्रिय FBS, 2 मिमी एल alanyl-एल glutamine, और की 100 इकाइयों के साथ पूरक पेनिसिलिन और मिलीलीटर प्रति स्ट्रेप्टोमाइसिन की 100 माइक्रोग्राम।
    नोट: मध्यम डालने के नीचे की ओर (यानी, नीचे) को सेल लगाव की सुविधा के लिए 50% FBS के साथ पूरक है। मध्यम विकास और पूरक (एस) आसानी से अन्य सेल उपभेदों या सेल लाइनों के विकास आवश्यकताओं के लिए विमर्श किया जा सकता है।
  3. कोशिकाओं डालने के नीचे की ओर चढ़ाया जा किस्मत की एक सेल निलंबन तैयार करें।
    नोट: यहाँ, परिणाम AG1522 सामान्य मानव 75 सेमी 2 सेल संस्कृति बोतल में उगाई fibroblasts का उपयोग कर प्राप्त किया गया है, और इन कोशिकाओं इसलिए सेल निलंबन की तैयारी का विवरण का ध्यान केंद्रित किया जाएगा।
  4. कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए, मध्यम विकास को हटाने और 5 मिलीलीटर 1x फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) के साथ सेल monolayer 2x धो लें।
  5. पीबीएस निकालें और 2.21 मिमी ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA), आर टी (कमरे के तापमान) में कमरे के तापमान (आरटी) 2 मिनट के लिए कोशिकाओं से अधिक करने के लिए पूर्व गर्म के साथ trypsin 0.25% (/ खंड खंड) के 1 मिलीलीटर फैल गया।
  6. पूरा मध्यम विकास (1.1 चरण में तैयार) के 9 मिलीलीटर के साथ trypsin गतिविधि बुझा लेते हैं और धीरे कुप्पी 10x की सतह पर सेल निलंबन pipetting द्वारा कोशिकाओं को इकट्ठा।
  7. एक hemocytometer या इलेक्ट्रॉनिक काउंटर का उपयोग करके सेल एकाग्रता का निर्धारण और सेल निलंबन मात्रा है कि प्रदान करता होगा पिपेटई एक बाँझ 15 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में डालने के प्रति 250,000 कोशिकाओं।
  8. Centrifugation द्वारा सेल निलंबन (800 XG, 2 मिनट) गोली। 70 μl प्रति 250,000 कोशिकाओं के एक एकाग्रता बनाने के लिए मध्यम विकास (1.2 चरण में तैयार) के साथ सेल गोली निलंबित।
    नोट: के रूप में प्रवेश के योग्य microporous झिल्ली सम्मिलित में सेल संस्कृति 2 डी substrates पर आधारित है, सेल बोने छोड़कर कोशिकाओं शुरू 50% (/ खंड खंड) FBS युक्त लगाव की सुविधा के लिए माध्यम में निलंबित किया जाना चाहिए, वैसे ही किया जाता है।

2. सम्मिलित की तैयारी

नोट: बाँझ की स्थिति, एक लामिना का प्रवाह जैविक सुरक्षा सेल संस्कृति को समर्पित कैबिनेट में काम सुनिश्चित करने के लिए।

  1. 0.4 माइक्रोन की एक झिल्ली में छेद के आकार, 1 माइक्रोन, या 3 माइक्रोन से चुनें सम्मिलित करता है (प्रायोगिक ब्याज (ओं) द्वारा निर्धारित, ताकना आकार के रूप में कहनेवाला संचार के विभिन्न साधनों की भूमिका का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है)।
    नोट: 0.4 माइक्रोन ताकना smal हैएल पर्याप्त डालने झिल्ली के दोनों तरफ की कोशिकाओं के बीच कार्यात्मक अंतराल जंक्शनों के गठन को सीमित करना और स्रावित कारकों से कहनेवाला संचार का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। जबकि, 1 माइक्रोन और 3 माइक्रोन pores काफी बड़े कार्यात्मक अंतराल जंक्शनों के गठन की अनुमति के लिए कर रहे हैं और दोनों अंतराल जंक्शनों और स्रावित कारकों से कहनेवाला संचार का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
  2. पैकेजिंग से व्यक्ति सम्मिलित निकालें और एक समान रूप से आकार बहु ​​अच्छी तरह से डिश में रखें।
    नोट: आवेषण विशिष्ट आवेदन जरूरतों को फिट करने के लिए विभिन्न झिल्ली सतह क्षेत्रों के साथ उपलब्ध हैं (जैसे, 6 अच्छी तरह से, 12 अच्छी तरह से, और 24 अच्छी तरह से सम्मिलित करता है।)। इधर, परिणाम 6 अच्छी तरह डालने का उपयोग कर प्राप्त किया गया है, और इसलिए मॉडल विवरण का ध्यान केंद्रित किया जाएगा।
  3. पकवान कवर, पकवान ढक्कन के साथ सम्मिलित हैं। दोनों हाथों से बहु अच्छी तरह से पकवान होल्डिंग, धीरे पकवान है कि इस तरह डालने के नीचे से (यानी, नीचे) अब ऊपर की ओर का सामना कर रहे पलटना।
  4. वें हटायेबहु अच्छी तरह से पकवान की ई तल, आवेषण के नीचे की ओर उजागर। एक समय में एक डालने के साथ काम करते हुए, संदंश की एक बाँझ जोड़ी का उपयोग करें और धीरे जगह में डालने का आयोजन करेगा। मुक्त हाथ से, सेल निलंबन (कदम 1.3-1.8 में तैयार) के 70 μl आकर्षित करने के लिए 250,000 कोशिकाओं से युक्त एक चौड़े मुंह टिप के साथ एक पिपेट का उपयोग करें।
  5. थाली कोशिकाओं के लिए, सम्मिलित की झिल्ली के केंद्र पर धीरे विंदुक टिप जगह है, और धीरे-धीरे सेल निलंबन के 70 μl पिपेट, जबकि धीरे-धीरे झिल्ली की सतह के आसपास विंदुक टिप बढ़ रहा है। डालने के किनारे करने के विंदुक टिप और सेल निलंबन का विस्तार करने के लिए नहीं सावधान रहना होगा।
    नोट: डालने के किनारे मार्मिक सेल निलंबन कोशिकाओं लगाव के दौरान बाहर सुखाने के लिए अग्रणी की केशिका तनाव के नुकसान में परिणाम सकता है।
  6. शेष सम्मिलित लिए दोहराएँ, देखभाल नहीं प्रयोग किया जा रहा संभावित माइक्रोबियल संक्रमण से बचने के संपर्क में सम्मिलित करता है पर सीधे काम करने के साथ।
  7. धीरे बहु अच्छी तरह से लौटने केपकवान नीचे सम्मिलित कवर करने के लिए। उल्टे आवेषण के साथ पकवान रखते हुए, 30-45 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% (/ खंड खंड) सीओ 2 के एक humidified हवा वातावरण में सेते हैं।
    नोट: डालने संपर्कों अच्छी तरह से नीचे पर सेल निलंबन, ध्यान से पकवान नीचे उठा और पकवान शीर्ष के किनारे पर यह आराम, इतना है कि यह एक मामूली कोण रूपों और पकवान की सतह के बीच अधिक से अधिक जुदाई बनाता है और आवेषण के नीचे की ओर (जहां कोशिकाओं वरीयता प्राप्त कर रहे हैं)। इस डालने के बजाय कुओं की सतह के लिए संलग्न से कोशिकाओं को रोकने जाएगा।
  8. 30-45 मिनट ऊष्मायन समय के बाद, धीरे सम्मिलित युक्त पकवान हटाने और लामिना का प्रवाह जैविक सुरक्षा कैबिनेट में जगह है।
  9. दो हाथों और डिश ढक्कन तंग रखने के साथ, धीरे पकवान फिर से पलटना है कि इस तरह जुड़ी कोशिकाओं से युक्त आवेषण के नीचे की ओर अब नीचे चेहरे।
  10. 3 माइक्रोन ताकना के लिए migrati से बचने के लिए सम्मिलित करता है धीरे धीरे और सावधानी से 2 मिलीलीटर (1 मिलीलीटर जोड़नेपूर्व गर्म पूरा माध्यम से डालने pores) के माध्यम से कोशिकाओं के पर (प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए कदम 1.1) देखते हैं, तो यह है कि डालने के नीचे डूब जाता है।
  11. सभी सम्मिलित युक्त कुओं में मध्यम विकास जोड़ने के बाद, humidified इनक्यूबेटर में वापस पकवान जगह है।
  12. सम्मिलित करता है 48 घंटे के लिए इनक्यूबेटर में अबाधित रहने के लिए अनुमति दें। 48 घंटे के बाद, अच्छी तरह से नीचे से मध्यम 2 मिलीलीटर श्वास और ताजा मध्यम विकास के 2 मिलीलीटर जोड़कर कोशिकाओं को खिलाओ।
  13. (इन के लिए अच्छी तरह से, बीज 1 डालने, जो पहले से ही नीचे की ओर बढ़ रही पहली सेल आबादी है के ऊपर की ओर दूसरी सेल की आबादी निलंबन (~ 250,000 कोशिकाओं / एमएल) की मिलीलीटर की तह तक ताजा मध्यम जोड़ने के बाद प्रयोगों, AG1522 (नियंत्रण) कोशिकाओं या कैंसर (प्रायोगिक) कोशिकाओं सम्मिलित करता है, जो पहले से ही AG1522 कोशिकाओं है, cafs बनने के लिए, सम्मिलित करता है के नीचे की ओर बढ़ रहा है) किस्मत के शीर्ष पर चढ़ाया जाता है। पकवान वापस humidified इनक्यूबेटर में रखें।
    नोट: यदि कामकोशिकाओं है कि डालने की तह तक अच्छी तरह से पालन नहीं करते के साथ हैैं, इन कोशिकाओं को वैकल्पिक रूप से डालने के ऊपर की ओर हो सकता है।
  14. डालें और अच्छी तरह से नीचे के ऊपर से मध्यम aspirating द्वारा डालने के ऊपर की ओर कोशिकाओं के दूसरे जनसंख्या बोने के बाद 24, 72 पर मध्यम, और 96 मानव संसाधन बदलें। धीरे अच्छी तरह से नीचे करने के लिए सम्मिलित के ऊपर की ओर करने के लिए ताजा माध्यम से 1 मिलीलीटर और 2 मिलीलीटर जोड़ें। दो सेल आबादी 120 घंटे के लिए पारगम्य microporous डालने झिल्ली के दोनों तरफ सह संस्कृति में रहने के लिए अनुमति दें।

3. trypsinization द्वारा डालने से कोशिकाओं को इकट्ठा

नोट: समृद्ध सेल आबादी प्राप्त करने में आसानी के अलावा, डालने TME मॉडल भी इसी तरह की प्रयोगात्मक उपचार के लिए अनुमति देता है (जैसे, रसायन, ऑक्सीजन की स्थिति है कि ऊपर या परिवेश वातावरण में नीचे हैं के लिए जोखिम, विकिरण उपचार, आदि के साथ ऊष्मायन) के रूप में अन्य में इन विट्रो (सीटू इम्युनो-पहचान, पश्चिमी सोख्ता में, उदाहरण के लिए) अत्यधिक समृद्ध आबादी प्राप्त करने के लिए डालने झिल्ली, जो तब समापन के विश्लेषण के लिए उपयोग किया जा सकता है की दोनों ओर से काटा या बाद के प्रयोगों के 36 प्रचारित किया जा सकता है।

  1. कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए, विकास के माध्यम से डालने को हटाने और एक 35 मिमी सेल संस्कृति 1 मिलीलीटर पीबीएस युक्त पकवान में जगह। 1 मिलीलीटर पीबीएस के साथ नीचे और सम्मिलित 1x के शीर्ष पक्षों को धो लें।
  2. पीबीएस निकालें और 0.25% (/ खंड खंड) 2.21 मिमी EDTA के साथ trypsin के 200 μl जोड़ने के लिए, आरटी के लिए पूर्व गर्म।
    1. कोशिकाओं डालने के नीचे की ओर पर हो एकत्रित करते हैं, तो 35 मिमी डिश में trypsin समाधान प्लेस और धीरे आरटी पर 2 मिनट के लिए trypsin समाधान में डालने के नीचे जगह है।
    2. सेल एकत्रित हैंडालने के ऊपर की ओर पर हो रहा है, एक 35 मिमी डिश में डालने के लिए जगह और डालने के शीर्ष करने के trypsin समाधान जोड़ें और आरटी पर 2 मिनट के लिए सेते हैं।
  3. पूरा मध्यम विकास के 800 μl जोड़कर trypsin गतिविधि बुझाने।
    1. कोशिकाओं डालने के तल पर हो एकत्रित करते हैं, तो 35 मिमी डिश के लिए मध्यम विकास जोड़ने और धीरे डालने के एक मामूली में आयोजित किया जा रहा है डालने 10x की सतह पर सेल निलंबन के 1 मिलीलीटर pipetting द्वारा कोशिकाओं को इकट्ठा कोण, सेल निलंबन डिश में एकत्र ऐसा है कि।
    2. डालने के शीर्ष की ओर से कोशिकाओं को इकट्ठा करते हैं, तो ऊपर की ओर करने के लिए मध्यम विकास जोड़ने और धीरे डालने 10x की सतह पर सेल निलंबन के 1 एमएल पिपेट।

से फ्लो द्वारा सेल शुद्धता की विशेषता 4.

नोट: टी की पवित्रता को बनाए रखने के लिए पारगम्य microporous झिल्ली सम्मिलित करता है की क्षमता को चिह्नित करने के लिएवह दो सेल आबादी (यानी, ऊपर और नीचे) के लिए 120 मानव संसाधन पर निर्भर है, वर्गों 1-3 हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) के साथ, प्रदर्शन किया गया -tagged एमडीए MB-231 कोशिकाओं डालने के ऊपर की ओर पर चढ़ाया जा रहा है, और गैर-GFP टैग AG1522 कोशिकाओं, 0.4 μm- के नीचे की ओर पर चढ़ाया जा रहा है 1 μm-, या 3 माइक्रोन ताकना सम्मिलित करता है।

  1. एक बार जब डालने के नीचे की ओर से कोशिकाओं (प्रक्रिया धारा 3 में वर्णित) एकत्र किए गए थे, centrifugation द्वारा सेल निलंबन (500 ग्राम, 30 सेकंड) गोली।
  2. तैरनेवाला निकालें और 1% (/ खंड खंड) FBS के साथ पूरक हैंक्स 'संतुलित नमक समाधान (HBSS) के 400 μl में सेल गोली निलंबित।
  3. GFP और GFP फोटान उत्सर्जन 37 पता लगाने के लिए 530/30 के एक bandpass फिल्टर उत्तेजित करने के लिए कोशिकामापी एक 488 एनएम लेजर के साथ सुसज्जित एक प्रवाह पर cytometric विश्लेषण करते हैं।
  4. सेल पहचान प्रयोजनों के लिए, प्रवाह पर आगे समायोजित करने के लिए AG1522 नियंत्रण सेल आबादी और पक्ष तितर बितर voltages का उपयोग करें। समायोजित करेंGFP चैनल वोल्टेज GFP संकेत के लिए कम का पता लगाने सीमा के रूप में सेलुलर autofluorescence मूल्य निर्धारित करने के लिए।
  5. नियंत्रण कोशिकाओं का उपयोग दहलीज gating निर्धारित करते हैं। प्रत्येक कोशिका नियंत्रण बनाम GFP पॉजिटिव कोशिकाओं की उपस्थिति के आधार पर जनसंख्या की पवित्रता का आकलन करें।
    ध्यान दें: एक शुद्ध आबादी का पता चला कोई जीपीएफ पॉजिटिव कोशिकाओं को प्रतिबिंबित करता होगा।

सीटू इम्यूनोफ्लोरेसेंस में से कोशिकाओं की विशेषता 5.

  1. डालने से कोशिकाओं की trypsinization के बाद (धारा 3 देखें), कोशिकाओं को इकट्ठा, थाली 5 एक्स 10 250 μl मध्यम विकास (देखें कदम 1.1) बाँझ कांच coverslips पर में 4 कोशिकाओं, और की एक humidified हवा वातावरण में 1 घंटे के लिए संलग्न करने की अनुमति 5% (/ खंड खंड) सीओ 2 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में।
  2. ऊष्मायन के अंत में, धीरे coverslip युक्त पकवान हटाने और लामिना का प्रवाह जैविक सुरक्षा कैबिनेट में जगह है।
  3. ध्यान से पूर्व गर्म पूरा मध्यम 2 मिलीलीटर जोड़ने (कदम देखना1.1) प्रत्येक पकवान है, ताकि coverslip डूब जाता है।
  4. सभी coverslips युक्त व्यंजनों के लिए मध्यम विकास को जोड़ने के बाद, बर्तन 5% (/ खंड खंड) सीओ 2 के एक humidified हवा वातावरण को 37 डिग्री सेल्सियस पर एक मशीन में 48 घंटे के लिए वापसी।
  5. 48 घंटा ऊष्मायन के बाद, पीबीएस के साथ नमूना 3x धोने और आरटी पर 10 मिनट के लिए 4% (wt / खंड) पीबीएस में formaldehyde के साथ तय कर लो।
  6. Tris बफर खारा (टीबीएस: 50 मिमी Tris-सीएल, पीएच 7.5, 150 मिमी NaCl) के साथ 5x कुल्ला और फिर 5 मिनट के लिए 0.25% (/ खंड खंड) ट्राइटन X-100, 0.1% (wt / खंड) सैपोनिन साथ permeabilize आर टी।
  7. 2% (/ खंड खंड) सामान्य बकरी सीरम (NGS), 1% (wt / खंड) गोजातीय सीरम albumin (बीएसए), 0.1% (/ खंड खंड) टीबीएस में ट्राइटन X-100 के साथ बाध्यकारी साइटों को ब्लॉक गैर विशिष्ट (अवरुद्ध समाधान) आरटी पर 1 घंटे के लिए।
  8. रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर समाधान को रोकने में: प्राथमिक एंटीबॉडी (1,000 विरोधी Caveolin 1 (CAV1), 1) के साथ सेते हैं।
  9. 0.2% NGS (/ खंड खंड), 1% (wt / खंड) बीएसए, 0.1% के साथ अनबाउंड प्राथमिक एंटीबॉडी (3x, 5 मिनट / धोने) से धो लें (वीओएल / खंड) टीबीएस में ट्राइटन X-100 (धोने समाधान)।
  10. समाधान को रोकने में 1 घंटे के लिए आरटी पर माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ सेते हैं (धारा 5.4 देखें)।
  11. अनबाउंड माध्यमिक एंटीबॉडी (3x, 5 मिनट / धोने) धोने के समाधान से धो लें (कदम 5.6 देखें)।
  12. माउंट एक विरोधी फीका बढ़ते मध्यम युक्त 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) के साथ एक स्लाइड पर coverslips, और नेल पॉलिश के साथ सील।
  13. एक औंधा प्रतिदीप्ति उत्तेजना के लिए एक बाहरी प्रकाश स्रोत के साथ सुसज्जित खुर्दबीन पर एक 63x तेल बढ़ाई उद्देश्य का उपयोग कोशिकाओं का निरीक्षण करें, और बाद के विश्लेषण के लिए एक संलग्न डिजिटल कैमरे का उपयोग कर छवियों पर कब्जा।

6. वेस्टर्न ब्लाट द्वारा कोशिकाओं की विशेषता

ध्यान दें: पश्चिमी धब्बा प्रक्रिया कहीं और 38 में वर्णित है। एक संक्षिप्त रूपरेखा यहाँ वर्णित है:

  1. trypsinization द्वारा डालने से कोशिकाओं की टुकड़ी के बाद (धारा 3 देखें), centrifugation (500 ग्राम, 30 सेकंड) द्वारा सेल निलंबन गोली।
  2. तैरनेवाला निकालें और 100 μl पीबीएस के साथ सेल गोली 2x निलंबित।
  3. संशोधित radioimmunoprecipitation परख के 50 μl में सतह पर तैरनेवाला और lyse कोशिकाओं निकालें (RIPA) बफर (Tris पीएच 7.5 50 मिमी, सोडियम क्लोराइड 150 मिमी, NP40 1% (/ खंड खंड), सोडियम deoxycholate monohydrate (डॉक्टर) 0.5% (/ खंड खंड), सोडियम dodecyl सल्फेट (एसडीएस) 0.1% (/ खंड खंड)), प्रोटीज और फॉस्फेट अवरोध कॉकटेल से युक्त।
  4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 19,000 ग्राम पर बर्फ और सेंट्रीफ्यूज पर 20 मिनट के लिए सेते हैं।
  5. एक प्रोटीन ऑप्टिकल घनत्व परख, RIPA बफर में डिटर्जेंट के साथ संगत का उपयोग कर सतह पर तैरनेवाला में प्रोटीन की एकाग्रता का निर्धारण।
  6. एक 0.2 माइक्रोन nitrocellulose झिल्ली पर सोडियम सल्फेट dodecyl जेल वैद्युतकणसंचलन (एसडीएस पृष्ठ) और electroblot द्वारा अलग प्रोटीन।
  7. 0.1% (/ खंड खंड) बीच -20 (TBST) और 4% (wt / खंड) युक्त टीबीएस में झिल्ली सेते हवा में घूमना 60 मिनट के लिए दूध (अवरुद्ध समाधान) और रात में 4 डिग्री सेल्सियस पर प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ प्रतिक्रिया (विरोधीCAV1, 1: 1000)।
  8. आर टी (5 मिनट / धोने) पर TBST के साथ झिल्ली 3x धो लें।
  9. समाधान को रोकने के लिए एक विरोधी माउस माध्यमिक एंटीबॉडी हॉर्सरैडिश peroxidase (एचआरपी) (: 5,000 1) के साथ संयुग्मित युक्त में 30 मिनट के लिए झिल्ली सेते हैं।
  10. आर टी (5 मिनट / धोने) पर TBST के साथ झिल्ली 3x धो लें।
  11. एक पश्चिमी सोख्ता का पता लगाने प्रणाली का उपयोग करते हुए chemiluminescence द्वारा प्रतिक्रिया उत्पादों कल्पना।

से फ्लो द्वारा कहनेवाला संचार की विशेषता 7.

नोट: पारगम्य microporous झिल्ली की अनुकूलन क्षमता को चिह्नित करने के लिए कहनेवाला संचार (जैसे, स्रावित कारकों अंतराल जंक्शनों) के विभिन्न साधनों की जांच करने के लिए सम्मिलित करता है। धारा 1-2.12 गैर फ्लोरोसेंट AG1522 कोशिकाओं 0.4 μm- के नीचे की ओर, 1 μm-, या 3 माइक्रोन ताकना सम्मिलित करता है पर चढ़ाया जा रहा है साथ प्रदर्शन किया गया।

  1. 90% confluency धारा 1.1 में वर्णित माध्यम का उपयोग करने के लिए एक 35 मिमी डिश में संस्कृति गैर लेबल AG1522 कोशिकाओं।
  2. आरINSE कोशिकाओं HBSS के 1 मिलीलीटर के साथ 1x।
  3. HBSS में कोशिकाओं incubating Calcein AM 30 माइक्रोन के द्वारा युक्त Calcein AM साथ लोड कोशिकाओं।
  4. 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% (/ खंड खंड) सीओ 2 के एक humidified हवा वातावरण में 15 मिनट के लिए सेते हैं।
  5. धो कोशिकाओं HBSS के 1 मिलीलीटर के साथ 2x।
  6. 0.25% के 200 μl समाधान (/ खंड खंड) आरटी पर 2 मिनट के लिए 2.21 मिमी EDTA के साथ trypsin जोड़कर कोशिकाओं Trypsinize।
  7. पूरा मध्यम 12.5% ​​से युक्त (/ खंड खंड) FBS के 800 μl जोड़कर trypsin गतिविधि बुझाने।
  8. निलंबन में दोहराया pipetting द्वारा कोशिकाओं को ले आओ।
  9. एक hemocytometer या इलेक्ट्रॉनिक काउंटर का उपयोग करके सेल एकाग्रता का निर्धारण और 250,000 कोशिकाओं सम्मिलित करता है कि पहले से ही नीचे की ओर बढ़ रहा है AG1522 कोशिकाओं के ऊपर की ओर करने के लिए Calcein AM साथ भरी हुई थाली।
  10. 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ 2 के एक humidified हवा वातावरण में सम्मिलित सेते 6 घंटे के लिए।
  11. 6 घंटे के बाद, के रूप में वर्णित है, आवेषण के नीचे की ओर से कोशिकाओं को इकट्ठाधारा 3 में।
  12. centrifugation द्वारा सेल निलंबन (500 ग्राम, 30 सेकंड) गोली।
  13. तैरनेवाला निकालें और 1% (/ खंड खंड) FBS के साथ पूरक HBSS के 400 μl में सेल गोली निलंबित।
  14. एक लेजर से लैस एक कोशिकामापी पर कोशिकाओं का विश्लेषण और रोमांचक करने में सक्षम फिल्टर और Calcein (496 एनएम और 516 एनएम, क्रमशः) के उत्सर्जन का पता लगाने, निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार।
  15. सेल पहचान प्रयोजनों के लिए, आगे प्रवाह पर और पक्ष तितर बितर voltages समायोजित करने के लिए एक बेदाग AG1522 नियंत्रण सेल की आबादी का उपयोग करें। Calcein संकेत के लिए कम का पता लगाने सीमा के रूप में सेलुलर autofluorescence मूल्य निर्धारित करने के लिए Calcein चैनल वोल्टेज समायोजित करें।
  16. Calcein से भरी हुई नियंत्रण कोशिकाओं का उपयोग ऊपरी सीमा निर्धारित करते हैं। प्रत्येक कोशिका नियंत्रण बनाम Calcein पॉजिटिव कोशिकाओं की उपस्थिति के आधार पर डालने के लिए संचार का आकलन करें।

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Representative Results

यहाँ हम एक पारगम्य microporous झिल्ली डालने अनुकूलित इन विट्रो heterotypic सेल सह संस्कृति प्रणाली है कि इन विवो ट्यूमर microenvironment (चित्रा 1) mimics विकसित करने के लिए। इस प्रणाली के लिए दो अलग अलग सेल आबादी (120 मानव संसाधन तक, हमारे उपयोग में) समय की विस्तारित अवधि के लिए डालने के झरझरा झिल्ली के दोनों ओर विकसित किया जा करने के लिए अनुमति देता है। महत्वपूर्ण बात यह प्रणाली सेल आबादी की पवित्रता को बनाए रखने में सक्षम के रूप में 0.4-, 1-, या 3 मीटर ताकना सम्मिलित करता है के ऊपर की ओर GFP टैग एमडीए MB-231 कोशिकाओं चढ़ाना और उन में विकसित करने की अनुमति के द्वारा निर्धारित किया जाता है, AG1522 कोशिकाओं, डालने के नीचे की ओर बढ़ रहा है 120 घंटे के लिए के साथ सह-संस्कृति। इस समय के बाद, कोशिकाओं डालने के नीचे की ओर से एकत्र की है और प्रवाह cytometry द्वारा विश्लेषण किसी भी GFP पॉजिटिव एमडीए MB-231 कोशिकाओं है, जो सेल की आबादी पवित्रता का एक नुकसान का संकेत होगा की उपस्थिति की पहचान करने के लिए किया गया। विश्लेषण 99.9% और 99.8% पु का पता चला0.4 और 1 माइक्रोन ताकना सम्मिलित करता है, क्रमशः से आबादी पुन; हालांकि, 3 माइक्रोन pores के साथ डालें, सेल आबादी की जुदाई बनाए रखने में असमर्थ था के रूप में pores काफी बड़े झिल्ली में प्रवास करने के GFP पॉजिटिव एमडीए MB-231 कोशिकाओं की एक महत्वपूर्ण संख्या अनुमति देने के लिए थे (चित्रा 2) ।

महत्वपूर्ण बात है, सीटू immunofluorescence और पश्चिमी धब्बा विश्लेषण के माध्यम से हम इस प्रणाली को प्रभावी ढंग से एमडीए MB-231 स्तन कैंसर सेल के साथ सह संस्कृति निम्नलिखित सामान्य मानव द्विगुणित AG1522 fibroblasts से कैंसर से जुड़े fibroblasts उत्पन्न करने की क्षमता का प्रदर्शन करने में सक्षम, के रूप में द्वारा निर्धारित किया गया Caveolin -1 की कम अभिव्यक्ति, एक अच्छी तरह से स्थापित सीएएफ बायोमार्कर 39-42 (चित्रा 3)। CAV1 एक मचान प्रोटीन है कि प्लाज्मा झिल्ली, जो कई सेलुलर प्रक्रियाओं 43 में शामिल है के लिपिड बेड़ा डोमेन caveolae रूपों है। पश्चिमी धब्बा मेंदो अलग बैंड मनाया गया, CAV1 44 की α और β isoforms के लिए इसी। दुर्भाग्य से, थोड़ा isoforms के बीच का अंतर (s), विशेष रूप से सीएएफ बायोमार्कर के रूप में उनकी भूमिका के बारे में जाना जाता है।

हम भी दो heterotypic सेल आबादी (चित्रा 4) के बीच कहनेवाला संचार मिलाना डालने प्रणाली सह संस्कृति की प्रवीणता से पता चला है। गैर लेबल, अंतर-जंक्शन सक्षम मानव द्विगुणित AG1522 fibroblasts डालने के नीचे की ओर confluency को सुसंस्कृत थे। AG1522 कोशिकाओं की एक दूसरे सेट Calcein AM, एक हरे रंग का फ्लोरोसेंट अंतराल जंक्शन पारगम्य डाई के साथ भरी हुई है, और डालने के ऊपर की ओर चढ़ाया गया। दो सेल आबादी 6 घंटे के लिए बातचीत करने के लिए अनुमति दी गई है, और फिर डालने के नीचे की ओर कोशिकाओं को अलग और प्रवाह cytometry द्वारा विश्लेषण किया गया। डालने के नीचे की ओर से Calcein पॉजिटिव कोशिकाओं कोशिकाओं है कि तों की चिंतनशील होगाडालने के छिद्रों के माध्यम से अंतर-जंक्शनल युग्मन tablished। 0.4 माइक्रोन ताकना के आकार डालने के दोनों तरफ बढ़ कोशिकाओं के बीच सीमित कार्यात्मक खाई जंक्शन गठन सम्मिलित करते हैं, इस प्रकार स्रावित कारकों (जैसे, वृद्धि कारक है, microvesicles, आदि) के लिए संचार में बाधा। वैकल्पिक रूप से, 1 माइक्रोन और 3 माइक्रोन pores के आकार जाहिरा तौर पर काफी बड़े अंतराल जंक्शनों के माध्यम से कोशिकाओं के कार्यात्मक युग्मन अनुमति देने के लिए कर रहे हैं। इसलिए, ध्यान में लीन होना आकार नियमन करके, एक विविध भूमिका (ओं) कहनेवाला संचार के विभिन्न साधनों TME विकास और विकास पर हो सकता है कि समझने के लिए शुरू कर सकते हैं।

आकृति 1
चित्रा 1:। पारगम्य microporous झिल्ली सम्मिलित मॉडल योजना (क) जाहिरा तौर पर सामान्य मानव द्विगुणित AG1522 fibroblasts (कम बीतने कोशिकाओं) cafs बनने के लिए किस्मत उल्टे पर वरीयता प्राप्त कर रहे हैंपारगम्य microporous 0.4 माइक्रोन, 1 माइक्रोन, या 3 माइक्रोन pores के साथ एक 10 माइक्रोन मोटी पॉलिएस्टर झिल्ली से मिलकर सम्मिलित करता है। कुर्की के बाद, सम्मिलित करता है और उल्टे confluency करने के लिए प्लेटों के कुओं में रखा गया है और सुसंस्कृत हैं। (ख) कैंसर कोशिकाओं और नियंत्रण fibroblasts से पहले नीचे की ओर बढ़ रहा परिचित fibroblasts के साथ सम्मिलित करता है के ऊपर की ओर वरीयता प्राप्त किया जा रहा करने के लिए बोतल में अलग हो रहे हैं। (ग) के सह-संवर्धित कोशिकाओं हर दूसरे दिन तंग आ गया और वांछित समय के लिए रखा जाता है। (घ) संबंधित कई बार सह संस्कृति और / या प्रयोगात्मक उपचार के बाद, cafs (सम्मिलित के नीचे की ओर) और / या कैंसर की कोशिकाओं (डालने के ऊपर की ओर) ध्यान trypsinization द्वारा अलग कर रहे हैं, अत्यधिक शुद्ध सेल आबादी उपज, जो समापन के विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है या बाद में पढ़ाई के लिए प्रचार किया। कृपया यहाँ क्लिक करेंयह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए।

चित्र 2
चित्रा 2:। अत्यधिक समृद्ध सेल आबादी की पीढ़ी परिणाम cytometry प्रतिनिधि प्रवाह उच्च संवर्धित 120 मानव संसाधन सह संस्कृति के बाद, अभी तक स्वतंत्र heterotypic सेल आबादी को बनाए रखने के लिए डालने की क्षमता प्रदर्शित करता है। (क) AG1522 कोशिकाओं 0.4 माइक्रोन ताकना डालने के नीचे की ओर से काटा आबादी का 99.9% GFP लेबल एमडीए MB-231 डालने (निचले बाएँ चक्र) के ऊपर की ओर बढ़ कोशिकाओं से मुक्त होने के लिए दिखा। (ख) AG1522 कोशिकाओं 1 माइक्रोन ताकना डालने के नीचे की ओर से काटा भी 99.8% समृद्ध आबादी (निचले बाएँ चक्र) दिखा। (ग) AG1522 कोशिकाओं 3 माइक्रोन ताकना डालने के नीचे की ओर से काटा पता चलता है कि जनसंख्या का केवल 68.5% GFP लेबल कोशिकाओं से मुक्त (निचले बाएँ चक्र है), यह दर्शाता है कि GFP पॉजिटिव एमडीए MB-231 कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या 3 माइक्रोन छिद्रों के माध्यम से विस्थापित करने में सक्षम थे। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3:। कैंसर से जुड़े fibroblasts की पीढ़ी CAV1 की कम अभिव्यक्ति एक सुसंगत और विश्वसनीय सीएएफ बायोमार्कर है। (क) सीटू इम्यूनोफ्लोरेसेंस में की सूक्ष्म छवियों (पैमाने बार = 20 माइक्रोन), और AG1522 कोशिकाओं में CAV1 (ख) पश्चिमी धब्बा विश्लेषण है कि AG1522 कोशिकाओं (नियंत्रण) के साथ सह संस्कृति में किया गया था (बाएं), या MDA- साथ MB-231 स्तन कैंसर की कोशिकाओं (दाएं) 120 घंटे के लिए। रक्तवर्ण रंग लाल के साथ धुंधला लोडिंग नियंत्रण के लिए इस्तेमाल किया गया था और पश्चिमी blots में गुना परिवर्तन का निर्धारण करने के लिए। परिणामों के प्रतिनिधि हैंतीन अलग-अलग प्रयोगों। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4:। द्वारा सम्मिलित ताकना आकार कहनेवाला संचार के मॉड्यूलेशन से फ्लो कहनेवाला संचार के विभिन्न साधनों के बीच Calcein AM लोड AG1522 कोशिकाओं डालने और AG1522 नियंत्रण के शीर्ष पर बढ़ के लिए चयन करने के लिए पारगम्य microporous झिल्ली डालने TME मॉडल की अनुकूलन क्षमता का प्रदर्शन विश्लेषण उसके नीचे की ओर बढ़ कोशिकाओं। (क) 0.4 माइक्रोन ताकना आवेषण के नीचे की ओर से काटा कोशिकाओं Calcein पॉजिटिव कोशिकाओं (0.57%), डालने छिद्रों के माध्यम से सीमित अंतराल जंक्शन संचार का संकेत का स्तर बहुत कम दिखा। (ख) 1 माइक्रोन ताकना आवेषण के नीचे की ओर से काटा कोशिकाओं ज दिखानेCalcein पॉजिटिव कोशिकाओं (9.98%), कार्यात्मक अंतराल जंक्शनों के गठन का संकेत के igher स्तरों। (ग) 3 माइक्रोन ताकना आवेषण के नीचे की ओर से काटा कोशिकाओं Calcein पॉजिटिव कोशिकाओं (87.8%), व्यापक अंतर-जंक्शनल संचार का संकेत के उच्च स्तर दिखा। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

यहां वर्णित प्रोटोकॉल एक सरल, इन विट्रो प्रक्रिया में अनुकूलनीय (चित्रा 1) एक पारगम्य microporous झिल्ली डालने heterotypic कोशिकाओं के एक सह-संस्कृति से अलग-अलग सेल आबादी अत्यधिक समृद्ध उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल करता है। गौरतलब है कि मॉडल कहनेवाला संचार के विभिन्न साधनों की जांच के लिए उपयुक्त है। महत्वपूर्ण कदम, विशिष्ट प्रयोगात्मक ब्याज (एस) के लिए उपयुक्त ताकना आकार डालने का चयन 50% FBS के साथ पूरक माध्यम में डालने के नीचे की ओर पहला सेल की आबादी बोने, के ऊपर की ओर दूसरी सेल की आबादी बोने शामिल डालें, और समय का एक उचित अवधि के लिए दो अलग-अलग सेल आबादी सह संवर्धन। हम बताते हैं कि इस प्रणाली के विभिन्न विवो विशेषताओं की नकल उतार, इस प्रकार आणविक, प्ररूपी समझने के लिए एक बड़ा अवसर उपलब्ध कराने में सक्षम है, और जल्दी TME विकास है, जो एक प्रमुख डी के पते दौरान अव्यक्त परिवर्तन से होने वालीकई स्थापित TME इन विट्रो मॉडल के isadvantage (चित्रा 2)।

मॉडल को आसानी से कैंसर स्ट्रोमा विकास और TME विकास (चित्रा 4) में सेल सेल बातचीत के विभिन्न पहलुओं की जांच की अनुमति के लिए संशोधित किया जा सकता है। 0.4 माइक्रोन ताकना डालने दो सेल आबादी 45 के बीच अंतरंग युग्मन परमिट है, यह काफी (चित्रा 4) डालने झिल्ली के दोनों ओर विकसित कोशिकाओं के बीच कार्यात्मक अंतराल जंक्शनों के गठन को प्रतिबंधित। इसलिए, इस प्रकार प्रसारण कारकों (जैसे, वृद्धि कारक) और / या बाह्य पुटिकाओं (जैसे, exosomes), जो सीएएफ विकास 46-48 मध्यस्थता की भूमिका की जांच की सुविधा। वैकल्पिक रूप से, 1 माइक्रोन और 3 माइक्रोन pores काफी बड़े कार्यात्मक अंतराल जंक्शनों के गठन की अनुमति देने के लिए, इस प्रकार जंक्शनल चैनलों और के माध्यम से अप्रत्यक्ष रूप से संचार के माध्यम से दोनों प्रत्यक्ष चयापचय युग्मन के अध्ययन की अनुमति देने हैंप्रसारण स्रावित कारकों। हालांकि, के रूप में 3 माइक्रोन ताकना डालने के छिद्रों के माध्यम से सेल प्रवास परमिट (देखें चित्र 2), यह विस्तारित सह संस्कृति समय के दौरान दो अलग-अलग heterotypic सेल आबादी की पवित्रता को बनाए रखने के लिए नहीं करता है (उदाहरण के लिए।, 120 मानव संसाधन)। जबकि वर्तमान मॉडल TME के कई पहलुओं के अध्ययन के लिए सक्षम बनाता है, यह जटिल शारीरिक बातचीत है कि एक विवो TME (जैसे, नाड़ी तरल पदार्थ का आदान-प्रदान, आदि) के भीतर होने से कई के लिए खाते में करने के लिए अपनी क्षमता में सीमित है।

कैंसर से स्ट्रोमा सक्रियण और TME के ​​विकास के प्रारंभिक घटनाओं को समझने कदम प्राथमिक ट्यूमर दीक्षा और प्रगति, साथ ही मेटास्टेसिस में फंसा elucidating में महत्वपूर्ण है। अब यह व्यापक रूप से स्वीकार किया है कि कैंसर स्ट्रोमा, विशेष रूप से cafs, कैंसरजनन (49 में समीक्षा) के समर्थन में एक महत्वपूर्ण भूमिका होती है। यह इन विट्रो 2 डी और 3 डी मॉडल में कई के विकास के लिए नेतृत्व किया गया है, उद्देश्यरोशन रणनीतियों पर एड stromal-सक्रियण और ट्यूमर प्रगति में योगदान दे जल्दी तंत्र को निशाना बनाने। दुर्भाग्य से, इन मॉडलों में से कई आगे के अध्ययन के लिए अलग-अलग सेल आबादी के अलगाव की अनुमति के लिए, समय लेने वाली और तनावपूर्ण प्रसंस्करण के बिना, अपनी असमर्थता द्वारा सीमित हैं। इस प्रकार इस प्रोटोकॉल, के रूप में यह क्षमता आसानी से और तेजी से तत्काल विश्लेषण या बाद में पढ़ाई के लिए प्रचार-प्रसार के लिए अत्यधिक समृद्ध या शुद्ध सेल आबादी प्राप्त करने के साथ संपत्ति की तरह विवो में जोड़ती है TME अनुसंधान के क्षेत्र में एक महत्वपूर्ण इसके अलावा प्रदान करता है।

एक बार जब तकनीक में महारत हासिल है, डालने TME मॉडल विविध TME द्वि-दिशात्मक बातचीत की जांच के लिए उपयोग किया जा सकता है (जैसे, कैंसर प्रतिरक्षा कोशिकाओं को endothelial करने के लिए, कैंसर, आदि)। इसके अतिरिक्त, सह संस्कृति की जटिलता डालने के एक तरफ और वैकल्पिक पक्ष पर एक भी आबादी पर एक मिश्रित सेल की आबादी रखकर बढ़ाया जा सकता है, इस प्रकार प्राप्तTME सेल की आबादी जटिलता की तरह विवो में एक और अधिक हैैं। हालांकि, सतर्कता उचित ध्यान में लीन होना आकार के साथ एक डालने का चयन करता है, तो विशेष रूप से छोटे व्यास (जैसे, ~ 7 माइक्रोन 50 के एक व्यास के साथ मानव लिम्फोसाइट) की कोशिकाओं का उपयोग करने में प्रयोग किया जाना चाहिए, क्योंकि वे छोटे छिद्रों के माध्यम से पलायन करने में सक्षम हो सकता है ( उदाहरण के लिए, 0.4 माइक्रोन या 1 माइक्रोन)। प्रायर को सह-संस्कृति, प्रवास प्रयोगों (चित्रा 2) बढ़ाया सह संस्कृति प्रयोगों के दौरान शुद्ध सेल आबादी के रखरखाव सुनिश्चित करने के लिए warranted जा सकता है।

यह मॉडल भी विभिन्न चिकित्सीय चुनौतियों (जैसे, विकिरण, केमोथेरापी, अतिताप) और मिश्रित सेल आबादी कि पारगम्य microporous झिल्ली डालने भर में मिलकर कर रहे हैं में शारीरिक परिवर्तन (जैसे, हाइपोक्सिया, hyperoxia, जीवविज्ञान अवरोधकों) के प्रभाव की जांच के लिए उत्तरदायी है। मॉडल अपनी क्षमता को सफलतापूर्वक cafs उत्पन्न करने के लिए प्रदर्शन किया है, आईडीईएक व्यापक रूप से स्वीकार कर लिया सीएएफ बायोमार्कर (यानी, CAV1 के नीचे विनियमन) 39-42 (चित्रा 3) है, जो आगे 55% से कम हो गया था जब डालने प्रणाली 2 (7 मिमी पारा पीओ की तरह इन विवो पर बनाए रखा गया था द्वारा ntified; 0.5% हे 2) 51, विभिन्न प्रयोगात्मक डिजाइन और स्थितियों के लिए मॉडल की अनुकूलन क्षमता पर प्रकाश डाला (डेटा) नहीं दिखाया। संक्षेप में, यह मॉडल एक सरल दृष्टिकोण और व्यवस्था कैंसर स्ट्रोमा सक्रियण, TME के ​​प्रारंभिक विकास में गहरी अंतर्दृष्टि प्राप्त करने के लिए लौकिक और बाह्य कारकों मिलाना करने का अवसर है, और चिकित्सीय या पर्यावरण एजेंटों के लिए सेलुलर प्रतिक्रियाओं प्रदान करता है।

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Disclosures

लेखकों घोषणा की कि वे कोई प्रतिस्पर्धा या परस्पर विरोधी हितों है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
For Cell Culture
AG01522 (i.e., AG1522) human diploid fibroblast Coriell 107661 Passage 8-13
MDA-MB-231-luc-D3H1 breast adenocarcinoma cell line PerkinElmer 119261 Parental line: ATCC (#HTB-26)
MDA-MB-231/GFP breast adenocarcinoma cell line Cell Biolabs AKR-201
Eagle's minimal essential medium (MEM) Corning Cellgro 15-010-CV
Fetal Bovine Serum (FBS), Qualified Sigma F6178-500mL
Corning Glutagro Supplement (200 mM L-alanyl-L-glutamine) Corning Cellgro 25-015-Cl
Penicillin Streptomycin Solution, 100x Corning Cellgro 30-002-Cl
Transwell Insert (i.e., permeable microporous membrane insert) (0.4 μm pore) Costar 3450
Transwell Insert (i.e., permeable microporous membrane insert) (1 μm pore) Greiner bio-one 657610
Transwell Insert (i.e., permeable microporous membrane insert) (3 μm pore) Costar 3452
6-well Culture Plate Greiner Bio-One Cellstar 657160-01
75 cm2 cell culture flask CellStar 658 170
Phosphate-Buffered Saline (PBS), 1x Corning Cellgro 21-040-CV without calcium & magnesium
0.25% (vol/vol) Trypsin, 2.21 mM EDTA, 1x Corning Cellgro 25-053-Cl
15 ml Centrifuge Tube CellTreat 229411
35 mm x 10 mm Cell Culture Dish Greiner bio-one 627 160
Name Company Catalog Number Comments
For Immunofluorescent Microscopy
Mouse anti-Caveolin 1 BD Transduction Laboratories 610406 In situ Immunofluorescence - 1:5,000
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate ThermoFisher Scientific A-11029 In situ Immunofluorescence - 1:2,000
Bovine Serum Albumin - Fraction V Rockland BSA-50 Immunoglobulin and protease free
16% (wt/vol) Formaldehyde Solution ThermoFisher Scientific 28908 Dilute to 4% with 1x PBS
Premium Cover Glass (22 mm x 22 mm No.1) Fisher 12548B
Triton X-100 Sigma T8787-50ML
SlowFade Gold antifade reagent with DAPI Invitrogen S36938
Name Company Catalog Number Comments
For Flow Cytometric Analysis
Calcein, AM Molecular Probes C3100MP
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) Gibco 14025-076
Name Company Catalog Number Comments
For Western Blot Analysis
Mouse anti-Caveolin 1 BD Transduction Laboratories 610406 Western Blot - 1:1,000
Tween-20 BioRad 170-6531
Nitrocellulose Membrane (0.2 μm) BioRad 162-0112
Western Lightning Plus-ECL PerkinElmer NEL104001EA
BioRad DC Protein Assay BioRad 500-0116
Sodium dodecyl sulfate (SDS) BioRad 161-0302
Sodium deoxycholate monohydrate (DOC) Sigma D5670
IGEPAL CA-630 (NP40) Sigma I8896
30% Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1 BioRad 161-0158

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References

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Domogauer, J. D., de Toledo, S. M., Azzam, E. I. A Mimic of the Tumor Microenvironment: A Simple Method for Generating Enriched Cell Populations and Investigating Intercellular Communication. J. Vis. Exp. (115), e54429, doi:10.3791/54429 (2016).

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