Un método basado en la flotabilidad de la determinación de los niveles de grasa en<em&gt; Drosophila</em

Resumen

Aquí presentamos un método para medir los niveles de grasa organísmicos en el tercer estadio (L3) larvas de Drosophila melanogaster. Este método aprovecha la relativamente baja densidad de tejido graso para diferenciar entre las larvas con las reservas de grasa alterados. análisis basado en la flotabilidad es una herramienta valiosa para la detección rápida, reproducible y económico.

Resumen

Drosophila melanogaster es un sistema experimental clave en el estudio de la regulación de la grasa. Actualmente existen numerosas técnicas para medir los niveles de grasa almacenada en Drosophila, pero la mayoría son costosas y/o laboriosas y tienen claras limitaciones. Aquí, presentamos un método para determinar de manera rápida y económica los niveles de grasa del organismo en larvas de Drosophila L3. La técnica se basa en las diferencias de densidad entre los tejidos magros y grasos y permite la detección rápida de fenotipos magros y grasos. Hemos verificado la precisión de este método mediante la comparación con el porcentaje de grasa corporal determinado por extracción de lípidos neutros y cromatografía de gases junto con espectrometría de masas (GCMS). Además, describimos protocolos detallados para la recolección y sincronización de larvas, así como recetas experimentales relevantes. La técnica que se presenta a continuación supera las principales deficiencias de los métodos de cuantificación de lípidos más utilizados y proporciona una forma eficaz de cribar de forma rápida y sensible las larvas L3 para detectar fenotipos de regulación de la grasa, manteniendo al mismo tiempo la integridad de las larvas. Este ensayo tiene amplias aplicaciones para el estudio del metabolismo y la regulación de la grasa utilizando Drosophila.

Introducción

Drosophila melanogaster se ha utilizado durante más de un siglo en el estudio de la genética y otras cuestiones biológicas básicas. En las últimas décadas, se ha hecho evidente que la Drosophila es una poderosa herramienta en el estudio de muchas enfermedades humanas. Un 70 - 80% de los genes asociados con enfermedades humanas tienen un ortholog identificado mosca ^{de 1 - 4,} Drosophila proporciona un sistema simplificado aún traducible en el que estudiar las enfermedades complejas. Metabolismo, en particular, se ha beneficiado de estos estudios. No sólo son la genética del metabolismo bi....

Protocolo

1. recoger huevos de moscas con genotipos de interés

NOTA: cruces Ideal constan de 150 moscas vírgenes y al menos 75 varones. colecciones de archivo debe consistir de por lo menos 200 moscas.

1. Preparar placas de uva.
   1. Añadir 37,5 g de agar a 1,5 L de agua destilada en un matraz de 4 L.
   2. Autoclave mezcla de agua / agar durante 50 minutos a 121 ºC (250 ºF).
   3. Mientras que el agua / mezcla de agar es el tratamiento en autoclave, añadir 50 g de sacarosa al jugo de uva 500 ml y se agita con una barra de agitación en una placa de agitación se calienta hasta que se disuelve la sacarosa.
   4. Apagar el fuego y seguir removiendo....

Resultados

La figura 1 representa un ejemplo de cómo el ensayo basado en la flotabilidad se puede detectar tanto las reservas de grasa más altos y más bajos en las larvas manipulado genéticamente. La Figura 1A muestra que la excitación o el silenciamiento de un cierto subconjunto de neuronas (E347) en el cerebro de las larvas induce grasa inferior y superior tiendas respectivamente. El mismo control antecedentes genéticos se utilizó en ambos casos. La Figur.......

Discusión

Hay una multitud de técnicas que se han desarrollado para medir los niveles de lípidos ^8-10. Sin embargo, cada uno de estos métodos viene con algunas desventajas importantes que ya están contemplados en el ensayo basado en la flotabilidad se describe anteriormente. En primer lugar, este ensayo es extremadamente rápido. Prueba de un gradiente de concentración completa tarda no más de 30 - 60 min. Esta es una gran mejora en la mayoría de las técnicas actualmente en uso. Por ejemplo, la cua.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Bacto Agar	VWR	214030
Welch's Original 100% Jugo de Uva
Sacarosa	Fisher	S512
Tegosept	Genesee Scientific	20-259
Etanol			200 prueba
Levadura de panadería	Fleichmann's
Amarillo Harina de maíz	Quaker		Agar Drosophila desgerminado enriquecido
Tipo II	Apex	66-104
Harina de soja	ADM Ingredientes especiales	062-100
Extracto de malta	Breiss	5748
Jarabe de maíz ligero	Karo
propiónico	VWR	U330-09
Cloruro de sodio	Fisher	50147491
Fosfato de potasio monobásico	Sigma	P5655-100G
Fosfato de sodio anhidro	Fisher	S3933
Cloruro de potasio	Fisher	P330-500
35 x 10 mm placa de Petri	Fisher	08-757-100A
50 ml	Cónica Fisher	50-869-569

Ácido