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Artículo de método

Un método basado en la flotabilidad de la determinación de los niveles de grasa en

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DOI:

10.3791/54744

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1 de noviembre de 2016

 , 
1Department of Medicine, Division of Endocrinology, Metabolism, and Diabetes, University of Colorado Anschutz Medical Campus

En este artículo

Resumen

Aquí presentamos un método para medir los niveles de grasa organísmicos en el tercer estadio (L3) larvas de Drosophila melanogaster. Este método aprovecha la relativamente baja densidad de tejido graso para diferenciar entre las larvas con las reservas de grasa alterados. análisis basado en la flotabilidad es una herramienta valiosa para la detección rápida, reproducible y económico.

Resumen

Drosophila melanogaster es un sistema experimental clave en el estudio de la regulación de la grasa. Actualmente existen numerosas técnicas para medir los niveles de grasa almacenada en Drosophila, pero la mayoría son costosas y/o laboriosas y tienen claras limitaciones. Aquí, presentamos un método para determinar de manera rápida y económica los niveles de grasa del organismo en larvas de Drosophila L3. La técnica se basa en las diferencias de densidad entre los tejidos magros y grasos y permite la detección rápida de fenotipos magros y grasos. Hemos verificado la precisión de este método mediante la comparación con el porcentaje de grasa corporal determinado por extracción de lípidos neutros y cromatografía de gases junto con espectrometría de masas (GCMS). Además, describimos protocolos detallados para la recolección y sincronización de larvas, así como recetas experimentales relevantes. La técnica que se presenta a continuación supera las principales deficiencias de los métodos de cuantificación de lípidos más utilizados y proporciona una forma eficaz de cribar de forma rápida y sensible las larvas L3 para detectar fenotipos de regulación de la grasa, manteniendo al mismo tiempo la integridad de las larvas. Este ensayo tiene amplias aplicaciones para el estudio del metabolismo y la regulación de la grasa utilizando Drosophila.

Introducción

Drosophila melanogaster se ha utilizado durante más de un siglo en el estudio de la genética y otras cuestiones biológicas básicas. En las últimas décadas, se ha hecho evidente que la Drosophila es una poderosa herramienta en el estudio de muchas enfermedades humanas. Un 70 - 80% de los genes asociados con enfermedades humanas tienen un ortholog identificado mosca de 1 - 4, Drosophila proporciona un sistema simplificado aún traducible en el que estudiar las enfermedades complejas. Metabolismo, en particular, se ha beneficiado de estos estudios. No sólo son la genética del metabolismo bien conservados entre las moscas y los seres humanos, pero los órganos y tipos de células son también muy similares 2,5. Por ejemplo, la grasa corporal de las tiendas de la mosca de ambos triacilglicéridos (TAG) y glucógeno, funciones análogas a las realizadas en el hígado de los mamíferos y el tejido adiposo blanco 6. Uso de Drosophila como modelo para la obesidad humana ha mejorado enormemente nuestro conocimiento de los lípidosmetabolismo y la genética de la obesidad 7. Las larvas de desarrollo es particularmente útil para estudiar la segregación de los nutrientes en el almacenamiento o utilización, ya que está dedicado a la alimentación y el almacenamiento de energía que se utilizará durante pupariation.

Actualmente, hay muchos diferentes métodos cuantitativos de determinación de los niveles de almacenamiento de grasa en Drosophila. El método más ampliamente utilizado es el ensayo colorimétrico acoplado (CCA) 8,9. CCA fue desarrollado para determinar los niveles de TAG en el suero humano y opera en la premisa de que el glicerol liberado de la columna vertebral de los triglicéridos se someterá a varias reacciones, lo que se traduce en una reacción redox acoplado a la generación de un producto coloreado. A continuación se mide la absorbancia de las longitudes de onda específicas de luz para determinar la cantidad inicial de glicerol presente. Sin embargo, el glicerol también puede ser liberada de mono y diacilglicéridos Además de TAG y por lo tanto puede no ser una medida precisa de sgrasa corporal reada 9. Por otra parte, pigmento de los ojos de las moscas adultas trituradas puede interferir con algunas lecturas de absorbancia y complicar los resultados 9,10. Por lo tanto, CCA debe ir acompañada y validado por cromatografía en capa fina (TLC), que permite la separación de la mayoría de las familias de lípidos que se puede cuantificar mediante densitometría 10,11. Sin embargo, algunas clases de lípidos como esteroles no pueden ser analizados y deben cuantificarse de manera diferente 12. Espectrometría de masas (MS) es una forma precisa para cuantificar todas las clases de los principales lípidos celulares 12,13. Sin embargo, los procedimientos de extracción de lípidos necesarias para analizar por MS consumen mucho tiempo (más la toma de casi un día completo) y costoso. Aquí presentamos un método alternativo para determinar rápida y barata niveles de grasa del organismo en las larvas L3 de Drosophila melanogaster.

El método presentado a continuación explota la diferencia de densidad entre el tejido de grasa y tejido magro. fa mamíferost tejido tiene una densidad de aproximadamente 0,9 g / ml 14 mientras que el músculo esquelético como una densidad de 1,06 g / ml 15. Esta diferencia significa que los animales con las tiendas más altos de grasa tienen menor densidad que los animales con las tiendas más bajos de grasa, que les permitan una mejor flotan en una solución de densidad fija. Esta propiedad permite la detección extremadamente rápida de un gran número de animales, mientras que ser barato y no invasivo. Análisis basado en la flotabilidad se ha utilizado tanto para confirmar los fenotipos de la alteración de los reguladores conocidos de los niveles de grasa, así como para identificar nuevos reguladores genéticos y neurológicos de la obesidad 16,17.

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Protocolo

1. recoger huevos de moscas con genotipos de interés

NOTA: cruces Ideal constan de 150 moscas vírgenes y al menos 75 varones. colecciones de archivo debe consistir de por lo menos 200 moscas.

  1. Preparar placas de uva.
    1. Añadir 37,5 g de agar a 1,5 L de agua destilada en un matraz de 4 L.
    2. Autoclave mezcla de agua / agar durante 50 minutos a 121 ºC (250 ºF).
    3. Mientras que el agua / mezcla de agar es el tratamiento en autoclave, añadir 50 g de sacarosa al jugo de uva 500 ml y se agita con una barra de agitación en una placa de agitación se calienta hasta que se disuelve la sacarosa.
    4. Apagar el fuego y seguir removiendo para enfriar la mezcla de jugo de uva / sacarosa hasta por debajo de 70 ºC. Pruebe la temperatura interna con un termómetro de alcohol.
    5. Añadir 3 g Drosophila agente antifúngico (por ejemplo, Tegosept) para calentar el jugo de uva mezcla / sacarosa y se agita para disolver.
    6. Cuando el agua se mezcla / agar está fuera del autoclave, deje enfriar el matraz al tacto de remolinos de vez en cuando.
    7. Combinar la mezcla de agua / agar y mezcla de jugo de uva / sacarosa y revuelva hasta que esté bien mezclado.
    8. Utilizar una pipeta serológica para agregar 8 - 10 ml de la mezcla de uva a la tapa de una pequeña placa de petri (estilo 35 x 10 mm). Dejar que la mezcla a la corona más alta que la altura de las paredes de la tapa para formar una forma convexa.
    9. Permita que las placas de uva que se enfríe durante 2 horas a temperatura ambiente y luego se almacenan en un recipiente hermético a 4 ºC.
  2. Preparar la pasta de levadura.
    1. Añadir 6 ml de solución tampón de fosfato (PBS) a 4 g en vivo levadura seca activa en un tubo cónico de 50 ml y se mezcla con una espátula hasta que esté suave.
    2. levadura tienda pegar a 4 ºC.
  3. Añadir una pequeña porción (aproximadamente 1/8 de cucharadita) de la pasta de levadura en el medio de una placa de uva. Suavizar los bordes ásperos con una espátula.
  4. Colocar las placas de uva en una incubadora hasta que hayan alcanzado la temperatura ambiente.
  5. Transferir las moscas de interés en una placa de cámara de la recolección de huevos y el lugar de uva wITH pasta de levadura hacia el interior en la parte superior. placa de uva cinta a la cámara de recogida de huevos de evitar que la placa se caiga. Asegúrese de escribir la información importante genotipo y fecha en la parte inferior de la placa de uva.
  6. Poner de cabeza la cámara de recolección de huevos para permitir que las moscas ponen sus huevos en la placa de uva.
  7. Coloque una caja o cubierta sobre las cámaras de recogida de huevos y colocarlos en una incubadora a 25 ºC.
  8. Permitir que las moscas ponen huevos a 4 - 6 horas.
  9. Extremo de recogida mediante la adopción de la placa de uva de la cámara de recolección de huevos y la transferencia de las moscas de nuevo en su botella de alimentos. Use una espátula para limpiar cualquier exceso de pasta de levadura de la placa de uva. Tienda placa de uva en una placa de Petri más grande en un incubador humidificado a 25 ° C durante ~ 24 horas.

2. Transferencia de larvas Experimental de Alimentos

  1. Preparar la comida experimental.
    NOTA: Esta receta de comida se basa en la Bloomington Stock receta central 18. cambios importantesque incluyen una mayor cantidad de levadura para optimizar el valor nutritivo de los alimentos según la evaluación de la sincronización de fase errante (altos de 112 - 120 horas después de la recolección de huevos a 25 ºC). Si bien hemos encontrado esta receta ideal para la salud y el desarrollo de nuestra larvas experimental, cualquier receta de comida es aceptable dada la calibración con los controles positivos y negativos, ejemplos de los cuales aparecen en el paso 3.10.
    1. Mide 1.600 ml de agua destilada.
    2. Mezclar 134 g de harina de maíz, 10,6 g Agar Drosophila Tipo II, y una parte del agua (~ 500 ml) en un vaso de precipitados de 1 L. Mezclar durante 2 minutos con una batidora de mano motorizada.
    3. Mezclar 70 g de levadura seca activa en vivo, 18,4 g de harina de soja, 84,8 g de extracto de malta, y una parte del agua (~ 500 ml) en otro vaso de precipitados de 1 l. Mezclar durante 2 minutos con una batidora de mano motorizada.
    4. Agitar cada vaso y se vierte en un matraz de 4 l. Use agua restante para enjuagar los vasos de precipitados y agregar en el matraz.
    5. Medir jarabe de maíz ligero de 140 ml y añadir al matraz, se mezcla por agitación.
    6. Autoclave durante 50 minutos a 121 ºC (250 ºF) en el entorno líquido.
    7. Después del autoclave, se vierte la comida en un vaso de precipitados de 4 litros y se deja enfriar. Ayudar al proceso de enfriamiento mediante la mezcla con una batidora de mano motorizada.
    8. Una vez enfriado el frasco suficiente como para tocar, añadir 8,8 ml de ácido propiónico y 16,8 ml de solución de agente / etanol anti-hongos Drosophila. Mezclar bien. (Agrega Drosophila solución de agente anti-hongos mediante la adición de 380 g de Drosophila agente antifúngico a 1 L de etanol de prueba 200 y agitación, sobre una placa caliente hasta que se disolvió, asegurándose de que la solución no sea superior a 70 ºC.)
    9. Verter la comida en viales hasta que la comida es de aproximadamente 1 pulgada de profundidad y se deja enfriar a temperatura ambiente durante 2 - 3 horas. Enchufe viales y almacenar en una incubadora a 25 ºC. Usar dentro de una semana.
  2. Sumérgete una espátula varias veces en la capa superior del vial de comida para puntuación que. Esto ayudará a las larvas de la madriguera y alimentarse.
  3. 22 - 24 horas después de la recolección de huevos tienecomposición, utilizar un pincel pequeño para recoger 50 primer estadio (L1) larvas del mismo tamaño aproximado. Coloque larvas en el alimento experimental. Limpiar la brocha en un laboratorio toallita y asegurar que no hay larvas que queda en el pincel antes de continuar a otro genotipo.
  4. Colocar el vial de larvas en una incubadora a 25 ° C y permitirá desarrollar.

3. Determinar los niveles de grasa en las larvas

  1. Preparar soluciones.
    1. Preparar 1 litro de PBS 10x de valores.
      1. Añadir 80 g de NaCl, 2 g de KCl, 14,4 g de Na 2 HPO 4, y 2,4 g KH 2 PO 4 a 800 ml de agua en un vaso de precipitados de 2 l que contenía una barra de agitación. Se agita sin calor hasta que todas las sales se incorporan. Llevar el pH a 7,4. Aumentar el volumen a 1 L con agua.
    2. Preparar 2 L 1x PBS. Añadir 200 ml de solución PBS 10x acciones a 1.800 ml de agua.
    3. Utilice esta población de PBS 1x para hacer el 20% w / v de sacarosa.
  2. Retire el vial de las larvas de laincubadora una vez allí son 20 - 40 larvas de vagar por los lados del vial (por lo general en el quinto día después de colecciones de huevo). Registrar la fecha y hora del ensayo, así como el número de larvas errante.
  3. Preparar la solución experimental mediante la adición de 11,5 ml de PBS y 9 ml 20% de sacarosa a un tubo cónico de 50 ml.
  4. Añadir 20% de sacarosa en el vial hasta que es 0,5 a 1 pulgada de la parte superior del vial.
  5. Use una espátula para agitar suavemente la capa superior de alimento para las larvas libres que todavía están excavando en el alimento. Todas las larvas se elevará a la superficie de la solución de sacarosa.
  6. El uso de fórceps para transferir suavemente las larvas en la concentración inicial de sacarosa desde el paso 3.3.
  7. Use una espátula para remover suavemente las larvas en esta solución.
  8. Se tapa el tubo cónico y poner de cabeza varias veces para mezclar a fondo la solución.
  9. Destape el tubo cónico y agitar para crear un vórtice suave.
  10. Permitir que las larvas se asiente, ya sea flotante a la parte superior de la solución o siNKing a la parte inferior. Espere de 2 - 5 min para las larvas se asiente.
    NOTA: Si todavía hay larvas que no son, sin duda, ya sea flote o de fondo, elegir una línea a utilizar como punto de corte para etiquetar las larvas, ya sea como un flotador o un plomo. Aplicar este mismo criterio para todos los genotipos. Utilizamos el ángulo en la parte inferior del tubo cónico como nuestro límite. Adp o sir2 17 larvas mutante se puede utilizar como un control positivo y Isd2 19 mutantes se pueden utilizar como un control negativo para la calibración del ensayo.
  11. Registrar el número de larvas flotante y la concentración específica de la prueba.
  12. Añadir 1 ml 20% de sacarosa a la solución experimental para aumentar su densidad.
  13. Repita los pasos 3.7 a 3.10. Registrar el número de larvas flotantes y esta nueva concentración.
  14. Continuar pasos 3.12 y 3.13 hasta por lo menos 95% de las larvas están flotando.
  15. El uso de fórceps para recoger todas las larvas en un plato lleno de disección con PBS.
  16. Observarán larvas bajo un microscopio y se nota si hay alguna pequeña larvas, pre-pupas, ninfas, o cualesquiera otras diferencias entre los genotipos.
    NOTA: Idealmente, todas las larvas debe aparecer homogénea y en la misma etapa de desarrollo. Sólo hemos observado mediciones de grasa consistentes en estas condiciones.
  17. Anote el número total de larvas.
  18. Con unas pinzas, transferir 10 larvas a un laboratorio limpie secar. Etiquetar un tubo de microcentrífuga y el lugar 10 larvas en el tubo.
  19. Flash congelar las larvas en nitrógeno líquido. Almacenar el tubo a -20 ºC.

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Resultados

La figura 1 representa un ejemplo de cómo el ensayo basado en la flotabilidad se puede detectar tanto las reservas de grasa más altos y más bajos en las larvas manipulado genéticamente. La Figura 1A muestra que la excitación o el silenciamiento de un cierto subconjunto de neuronas (E347) en el cerebro de las larvas induce grasa inferior y superior tiendas respectivamente. El mismo control antecedentes genéticos se utilizó en ambos casos. La Figur...

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Discusión

Hay una multitud de técnicas que se han desarrollado para medir los niveles de lípidos 8-10. Sin embargo, cada uno de estos métodos viene con algunas desventajas importantes que ya están contemplados en el ensayo basado en la flotabilidad se describe anteriormente. En primer lugar, este ensayo es extremadamente rápido. Prueba de un gradiente de concentración completa tarda no más de 30 - 60 min. Esta es una gran mejora en la mayoría de las técnicas actualmente en uso. Por ejemplo, la cua...

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Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Agradecimientos

K.E.H. fue apoyada por la Beca de Formación en Biología Molecular NIH-T32-GM08730. Este trabajo fue apoyado por los NIH, la subvención NIDDK 5K01DK095932 y el premio AHA 12BGIA11930014 a T.R.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Bacto AgarVWR214030
Welch's Original 100% Jugo de Uva
SacarosaFisherS512
TegoseptGenesee Scientific20-259
Etanol200 prueba
Levadura de panaderíaFleichmann's
Amarillo Harina de maízQuakerAgar Drosophila desgerminado enriquecido
Tipo IIApex66-104
Harina de sojaADM Ingredientes especiales062-100
Extracto de maltaBreiss5748
Jarabe de maíz ligeroKaro
propiónicoVWRU330-09
Cloruro de sodioFisher50147491
Fosfato de potasio monobásicoSigmaP5655-100G
Fosfato de sodio anhidroFisherS3933
Cloruro de potasioFisherP330-500
35 x 10 mm placa de PetriFisher08-757-100A
50 mlCónica Fisher50-869-569
Ácido

Referencias

  1. Bier, E. Drosophila, the golden bug, emerges as a tool for human genetics. Nat Rev Genet. 6, 9-23 (2005).
  2. Liu, Z., Huang, X. Lipid metabolism in Drosophila development and disease Using Drosophila System to Study Lipid Metabolism Lipids Function in Drosophila Early Development. Acta Biochim Biophys Sin. 45 (1), 44-50 (2013).
  3. Ruden, D. M., Lu, X. Evolutionary conservation of metabolism explains howDrosophila nutrigenomics can help us understand human nutrigenomics. Genes Nutr. 1 (2), 75-84 (2006).
  4. Wolf, M. J., Rockman, H. A. Drosophila, genetic screens, and cardiac function. Circ. Res. 109, 794-806 (2011).
  5. Trinh, I., Boulianne, G. L. Modeling obesity and its associated disorders in Drosophila. Physiology (Bethesda). 28 (2), 117-124 (2013).
  6. Azeez, O. I., Meintjes, R., Chamunorwa, J. P. Fat body, fat pad and adipose tissues in invertebrates and vertebrates: the nexus. Lipids Health Dis. 13, 71(2014).
  7. Dourlen, P., Sujkowski, A., Wessells, R., Mollereau, B. Fatty acid transport proteins in disease: New insights from invertebrate models. Prog. Lipid Res. 60, 30-40 (2015).
  8. Hildebrandt, A., Bickmeyer, I., Kühnlein, R. P. Reliable Drosophila body fat quantification by a coupled colorimetric assay. PLoS One. 6 (9), e23796(2011).
  9. Tennessen, J. M., Barry, W. E., Cox, J., Thummel, C. S. Methods for studying metabolism in Drosophila. Methods. 68, 105-115 (2014).
  10. Al-Anzi, B., Zinn, K. Colorimetric measurement of triglycerides cannot provide an accurate measure of stored fat content in Drosophila. PLoS One. 5 (8), e12353(2010).
  11. Thanh, N. T. K., Stevenson, G., Obatoml, D., Bach, P. Determination of Lipids in Animal Tissues by High-Performance Thin-Layer Chromatography with Densitometry. J. Planar Chromatogr. 13, 375-381 (2000).
  12. Borrull, A., Lopez-Martinez, G., Poblet, M., Cordero-Otero, R., Rozes, N. A simple method for the separation and quantification of neutral lipid species using GC-MS. Eur. J. Lipid Sci. Technol. 117, 274-280 (2015).
  13. Shui, G., et al. Toward one step analysis of cellular lipidomes using liquid chromatography coupled with mass spectrometry: application to Saccharomyces cerevisiae and Schizosaccharomyces pombe lipidomics. Mol. Biosyst. 6, 1008-1017 (2010).
  14. Farvid, M. S., Ng, T. W. K., Chan, D. C., Barrett, P. H. R., Watts, G. F. Association of adiponectin and resistin with adipose tissue compartments, insulin resistance and dyslipidaemia. Diabetes. Obes. Metab. 7 (4), 406-413 (2005).
  15. Urbanchek, M. G., Picken, E. B., Kalliainen, L. K., Kuzon, W. M. Specific force deficit in skeletal muscles of old rats is partially explained by the existence of denervated muscle fibers. J. Gerontol. A. Biol. Sci. Med. Sci. 56A (5), B191-B197 (2001).
  16. Mosher, J., et al. Coordination between Drosophila Arc1 and a specific population of brain neurons regulates organismal fat. Dev. Biol. 405 (2), 280-290 (2015).
  17. Reis, T., van Gilst, M. R., Hariharan, I. K. A buoyancy-based screen of drosophila larvae for fat- storage mutants reveals a role for Sir2 in coupling fat Storage to Nutrient Availability. PLoS Genet. 6 (11), e1001206(2010).
  18. Current Bloomington Recipe for Drosophila Medium. , Bloomington Drosophila Stock Center at Indiana University. Available from: http://flystocks.bio.indiana.edu/Fly_Work/media-recipes/bloomfood.htm (2014).
  19. Teixeira, L., Rabouille, C., Rørth, P., Ephrussi, A., Vanzo, N. F. Drosophila Perilipin/ADRP homologue Lsd2 regulates lipid metabolism. Mech. Dev. 120 (9), 1071-1081 (2003).
  20. Perez, C. L., Van Gilst, M. R. A 13C Isotope Labeling Strategy Reveals the Influence of Insulin Signaling on Lipogenesis in C. elegans. Cell Metab. 8, 266-274 (2008).

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