Abstract
Биопленки состоят из групп бактерий, заключенная в самостоятельной секретируется матрице. Они играют важную роль в промышленном загрязнении, а также в развитии и настойчивости многих инфекций, связанных со здоровьем. Одним из наиболее хорошо изученных и описанных биопленок болезни человека происходит при хронической легочной инфекции у больных муковисцидозом. При изучении биопленки в контексте хозяина, многие факторы могут воздействовать на образование биопленки и развитие. Для того, чтобы определить, как факторы хозяина могут влиять на формирование и развитие биологической пленки, мы использовали статический метод камерные покровного стекла расти биопленки в присутствии факторов хозяина, полученных в виде мокроте супернатантов. Бактерии высевали в камеры и подвергаются мокроте фильтратов. После 48 ч роста, биопленки окрашивали коммерческой жизнеспособности биопленки комплекта до конфокальной микроскопии и анализа. После получения изображения, биопленки свойства могут быть оценены с использованием различных программных платформ.Этот метод позволяет визуализировать ключевые свойства роста биопленки в присутствии различных веществ, в том числе антибиотиков.
Introduction
Бактериальные биопленки группы микроорганизмов, которые прикреплены друг к другу и вписанные в себя секретируемый матрице. 1,2 Классически, они представляют собой бактерии , физически прикрепленные к абиотической или биотической поверхности , образованной в условиях потока. Биопленки, также было показано, чтобы расти в статических условиях (отсутствие потока) и дистально от поверхности, например, на границе раздела воздух-жидкость из термальных бассейнов или Плёночные образующихся в пробирках. Эти биопленки уже давно признаны в окружающей среде и являются одним из основных ущерба для промышленных процессов, так как они могут образовывать в водоемах или в трубах, в результате обрастания, коррозии и засорений. 3,4
Биоплёнки также имеют важное значение в медицинских учреждениях, так как они были показаны быть вовлечены в связанных с катетером инфекций, легочных инфекций у больных муковисцидозом, а также во многих других инфекций. 5,6 Один из признаков биопленки инфекции является деувеличилась восприимчивость бактерий к антибиотикам и нарушение клиренс врожденной иммунной системы. 7-9 Наиболее хорошо изучены, клинически значимых сценариев с участием биопленки на основе инфекции происходит у пациентов с кистозным фиброзом (CF), которые хронически инфицированы синегнойной биопленок. П. палочки может пройти ряд изменений во время установления хронической инфекции , которые делают его очень трудно поддается лечению. 10,11 биопленки может дифференцированно активировать врожденный иммунитет и привод воспаление. 12-14 Поскольку эти инфекции приводят к повышению заболеваемости и смертности у пациентов с МВ, крайне важно , чтобы понять факторы , которые могут повлиять на развитие биопленки в этом контексте.
Недавнее исследование предполагает , что хозяин-факторы имеют решающее значение в формировании агрегатов биопленки синегнойной. 15 Эти биопленки способствуют снижению восприимчивости к антибиотикам и механизмов защиты хозяина. Preseсть вмещающих полученных факторов, таких как эластазы нейтрофилов, а также секретируемых продуктов из микроорганизмов, присутствующих в легких при МВ, имеют потенциал, чтобы в значительной степени модулировать образование и развитие биопленки. 16 Кроме того, биопленки взаимодействовать с хозяином , чтобы модулировать экспрессию многочисленных путей и инициировать воспаление. В то время как высокие методы пропускной способности, такие как стандартного анализа кристаллического фиолетового, может предоставить некоторую информацию в отношении процесса биопленки, визуализация биопленки в ответ на эти факторы предоставляют больше информации в глубину.
В этой рукописи мы опишем метод с использованием коэффициентов из мокроты больных с МВ для изучения развития биопленок в пробирке. Этот метод позволяет быстро визуализации биопленки, подверженных мокроте, содержащей факторов хозяина с использованием коммерческого набора жизнеспособности биопленки. Этот метод может быть использован для визуального определения изменений, которые происходят во время роста биопленки в присутствии exogenoнам продукты, и представляет собой усовершенствованный метод для анализа изменений в развитии биопленки в различных условиях.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Обратите внимание, что Совет по этике исследований (РЭП) требуется для сбора и хранения образцов мокроты из человеческих субъектов. Эти исследования были одобрены больницы для больных детей РЭП # 1000019444.
1. Подготовка образцов CF мокроте
- Соберите образец мокроты от пациентов во время плановых визитов в клинику муковисцидоза и держать на льду.
- Транспорт образец мокроты на льду в течение первого часа сбора, в научно-исследовательской лаборатории, пройти обработку.
2. Обработка Мокроту
- Регистрируют объем образца мокроты, полученной. Добавить забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS) , в 2 раза больше объема образца (то есть, 2 части PBS, 1 часть образца).
- Смешайте образец хорошо с пипетки передачи. Vortex образец на самое большое значение для 1 мин до полного смешивания.
- Алиготе 1 мл указанной выше смеси в соответствующее число 1,5 мл микропробирок и спином вниз при 5000 мкг в течение20 мин при температуре 4 ° С.
- После центрифугирования, удалить супернатант и отбросить осадок.
- Фильтр стерилизовать супернатант через фильтр 0,22 мкм и собирают в чистую центрифужную пробирку.
Примечание: стерильность фильтрата проверяется путем высева на LB агар и модифицирования жидких сред. - Хранить в мокроте супернатанта при -80 ° С для дальнейшего использования.
Примечание: мокрота из нескольких пациентов также могут быть объединены после фильтрации. - Перед использованием разбавить фильтрат мокроте 1/10 V / V (100 мкл мокроты, 900 мкл среды) в желаемом СМИ.
Примечание: Здесь был использован стандартный лизогении бульон (LB) средств массовой информации.
3. Chambered покровного стекла Метод биопленки
- Grow бактериальный изолят интереса в течение ночи в желаемой среде при температуре 37 ° C при встряхивании (200 оборотов в минуту).
Примечание: были использованы ряд различных бактерий, в том числе клинических изолятов синегнойной, золотистый стафилококк,Burkholderia cepacia комплекса и Achromobacter xylosoxidans. Выбор носителя зависит от деформаций и условий, представляющих интерес, однако LB СМИ могут быть использованы для начальных экспериментов. - С в течение ночи культуры, место 40 мкл культуры в 4 мл свежей среды , и расти в течение 3-4 ч при 37 ° C при встряхивании (200 оборотов в минуту) , чтобы получить культуру с оптической плотностью при 600 нм (OD 600) приблизительно 0,5 -0,6.
- Развести культуру со стадии 3.2 до 1/5 в нужной среде с 10% фильтрата мокротой или без мокроты фильтрата (в качестве контроля). Другие концентрации фильтрата мокроте может быть протестирована (то есть, 50% или 100%).
- Используйте 200 мкл разведения семян в лунки камер скольжения.
- Позволяют бактериям прикрепляться в течение 4 ч при 37 ° С без встряхивания.
- Через 4 часа, удалите носитель и аккуратно мыть биопленки с 1x свежей средой. Заменить 200 мкл свежей средой.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для изучения влияния мокроте на биопленки, в Фресч носитель должен содержать супернатант мокроту. - Разрешить биопленки не расти в течение желаемого периода времени при 37 ° С без встряхивания, заменяя среды каждые 12 ч, без промывки до времени для микроскопии.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для изучения влияния мокроте супернатантов на биопленки чувствительности к антибиотикам, антибиотики добавляют к прессе после 24 ч роста биопленки и не поддерживаются в средствах массовой информации до окрашивания и визуализации биопленки.
4. Окрашивание биопленки и конфокальной микроскопии
- После желаемого времени роста (24-48 ч лучше всего работает), удалите материал из камеры колодцев и осторожно промойте каждую камеру дважды 300 мкл стерильной PBS.
- Подготовка окрашивания смесь для биопленки путем смешивания 1 мкл каждого красителя (можно найти в комплекте жизнеспособности) для каждого мл раствора необходимо. Сделать краситель в воде или растворе носителя.
Примечание: Воду рекомендовано производителем. - Добавить 200 мкл смеси красителя в каждую лунку камерно coverglaсс и инкубировать при комнатной температуре, в темноте в течение 45 мин.
- Удалить окрашивающий смесь из камеры и мыть каждую лунку по 300 мкл стерильной PBS. Удалить PBS и заменить свежей водой или СМИ.
- Продолжить визуализации биопленки с помощью конфокальной микроскопии.
5. Визуальное биопленок с конфокальной микроскопией
- Прочитайте запятнанные биопленки в камерах сразу после окрашивания (в течение 1 ч). Сведение к минимуму задержки в визуализации слайдов с помощью окрашивания с 1 по 2 8-луночных камер одновременно.
- Выполните визуализацию с помощью конфокальной микроскопии с использованием лазеров для возбуждения и наборов фильтров для приобретения.
Примечание: Здесь, вращающийся диск конфокальной системы со спектральными Borealis лазеров (Зеленый: 491nm, красный цвет: 561 нм) были использованы для возбуждения. Эмиссионные фильтр наборы 515/40 и 624/40 были использованы для визуализации пятна от комплекта жизнеспособности биопленки. - Возьмите изображения с использованием объектива 25X воды на конфокальной микроскопии с камерой.
- Возьмите 3-5 изображений из каждой лунки.
Примечание: Таким образом, для 8 хорошо камерных покровного стекла, 24-40 изображения будут генерироваться. - Сохранение изображений для анализа.
Примечание: Изображения должны быть сохранены как OME TIFF-файлы , которые будут проанализированы с помощью КОМСТАТ 18,19. Инструкции для анализа биопленки изображения можно найти на сайте http://www.comstat.dk/. После того, как изображения импортируются такие параметры, как средняя толщина, биомасса и покрытия поверхности для каждого канала (красный и зеленый) могут быть проанализированы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Общий дизайн эксперимента представлена на рисунке 1. Использование этого протокола обеспечивает удобный способ для визуализации изменений в биопленок , выращенных в течение различных периодов времени (например, 24, 48 или 72 ч). Важно отметить, что экзогенные сигналы, такие как мокрота фильтратов, могут быть добавлены для визуализации изменений в развитии биопленки. Как видно на фиг.2, наличие 10% фильтратов мокроте может изменить архитектуру биопленки (фиг.2А, нижние панели). 16 Эти изображения могут быть проанализированы с помощью программного обеспечения КОМСТАТ для получения ключевых матриц биопленки, в том числе средней толщины биопленки, общей биомассы и покрытия поверхности. Это отражено в общем увеличении толщины биопленки (рис 2B и 3). 16 Влияние антибиотиков на биопленки в присутствии мокротой показано на рисунке 3. По visuali Зин изменения в развитии биопленки, можно лучше оценить, как различные факторы могут повлиять на рост биопленки, в гораздо лучшей степени, чем традиционные биопленки анализы, такие как кристаллического фиолетового окрашивания.
Рисунок 1: Общий дизайн эксперимента. Структурная схема базового протокола. В течение ночи (O / N) , культура разбавляют 1/1000 и позволяли расти до конечной OD 600 0,5. Это дополнительно разводили в соотношении 1/1000 и 200 мкл высевают в лунку камерно покровного стекла и позволяли закрепляться в течение 3-4 ч. После этого носитель удаляют и заменяют свежей средой. Биопленки могут расти в течение требуемого времени. Средства массовой информации, экзогенные продукты или антибиотики могут быть добавлены в биопленки. После роста, среду удаляют, биопленки окрашивали и обработки изображений конфокальной выполняется.ge.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2: Типичные изображения развития биопленки после воздействия мокроте фильтратов. (A) Типичные изображения Burkholderia cepacia комплекса (BCC) клинических изолятов следующие 48 ч роста в камерно покровного стекла с одними (верхние панели) средства массовой информации или в присутствии 10 фильтратов% мокроте (нижние панели) с последующим окрашиванием с комплектом жизнеспособности биопленки. 1 шкала единицы представляют 19,68 мкм. (B - C) Средняя толщина изолятов (B) и мертвых: жить соотношение (C) нескольких изображений БЦК изоляты выращивали в течение 48 ч в камерах скольжения в отсутствие (белые столбики) или в присутствии (черные полосы) из мокрота фильтратов. Каждый столбик представляет собой среднюю из 45 изображений нанесеносо стандартной ошибки среднего. ** Р <0,001 по сравнению с контрольной (только медиа) с использованием теста Крускала-Уоллиса. Рисунок адаптирован из Кеннеди и др. 16 Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3: Типичные изображения лечения антибиотиками на биопленки , подвергающихся мокротой фильтрата. (A) Изображения Burkholderia vietnamiensis клинических изолятов следующие 48 ч роста в камерно покровного стекла с использованием только средств массовой информации (слева) или в присутствии 10% фильтратов мокроты (справа) с или без 1000 мкг / м тобрамицина. Биопленки выращивали в течение 24 часов в среде, в одиночку или дополненной 10% (об / об) мокрота фильтратов. Через 24 часа среду удаляли и заменяли Mediа (+/- мокрота), содержащие антибиотики. 1 шкала единицы представляют 19,68 мкм. (B - C) Средняя толщина изолятов (B) и мертвых: жить соотношение (C) нескольких изображений (п = 9) B. vietnamiensis изоляты выращивали в течение 48 ч в камерах скольжения в отсутствие или в присутствии мокрота фильтратов. Каждый столбик представляет собой среднюю из 45 изображений, снятых со стандартной ошибки среднего. ** Р <0,001 по сравнению с контрольной (0 мкг / мл) с использованием тест Крускала-Уоллиса. Рисунок адаптирован из Кеннеди и др. 16 Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Методы, описанные здесь, позволяют для визуализации бактериальных биопленок, выращенных в присутствии экзогенных продуктов. Не удивительно, что производство exoproducts имеет важное значение при использовании этого типа системы. Например, дитиотреитола (ДТТ), часто используется на образцах мокроты человека, чтобы помочь разжижают образцы. Тем не менее, влияние ДТТ в одиночку может уменьшить развитие биопленки и жизнеспособность (данные не показаны). Таким образом, надлежащий контроль для всех условий необходимы. Кроме того, добавление продуктов человеческих мокроте создает значение вариативности на эксперимента из-за того, что мокрота каждого пациента имеет уникальный микробиомом. Для того, чтобы настроить для этого, мы использовали объединенные образцы мокроты пациента, чтобы избежать конкретных результатов. Кроме того, выбор соответствующих средств массовой информации имеет важное значение при использовании любой модели системы. Стандартные носители для роста биопленки намечаемого организма рекомендуются для начальной настройки системы. Если цель эксперимента заключается в IDentкак экзогенные выполняется проверка, продукты влияют на образование биопленки, питательная СМИ, что обеспечивает формирование адекватной биопленки предлагается. Это позволит обеспечить достаточное питание для роста при определении того, как экзогенные факторы могут повлиять на биопленку. Другие носители, такие как минимальная или определенных средах, могут быть использованы, чтобы лучше имитируют определенных условиях. Другие средства были использованы с хорошими результатами в этой системе (данные не показаны). Присоединение биопленок к патроннике покровного стекла является устойчивым, однако большое внимание должно быть принято при удалении / добавлении носителя или во время мытья шагов биопленки, чтобы предотвратить срыв биопленки.
Использование живого мертвого пятна в соответствии с протоколом производителя дало хорошие результаты для описанной системы. Ряд факторов может повлиять на отношение флуоресценции изображений (включая поглощение красителя бактерий, относительной плотности биопленки и усиления детектора настроек), тем не менее, этот метод должен относиться к тому, что наблюдается в изображенииs. Другие меры могут быть использованы для обозначения относительного количества мертвой / живая биопленки, таких как биомасса из мертвых клеток, как отношение общей биомассы в настоящее время биопленки (как производное от КОМСТАТ). Используя количество бактерий, чтобы подтвердить жизнеспособность биопленки в повторных экспериментах рекомендуется, чтобы подтвердить визуальные наблюдения этой модели. Из-за присущей неоднородности биопленок, несколько изображений из каждой камеры и нескольких камер следует использовать для каждого условия в эксперименте. Это увеличивает стоимость и продолжительность этих экспериментов.
Приобретение изображений является важным до анализа данных, полученных в этих экспериментах. Необходимо соблюдать осторожность, чтобы не более насыщают изображения и при определении настройки микроскопа. В зависимости от уровня требуемой детализации и микроскопа доступны, целый ряд различных целей (10X, 25X, 40X и 63X) могут быть использованы для получения изображений, хотя мы видим, что 25X цель дает лучшие изображения. Толщина Тон Z-стек может также повлиять на общее качество изображения и уровень детализации. Имея изображения, полученные через каждые 0,5-1 мкм, кажется, обеспечивает четкие изображения на 25X цели, сохраняя при этом Z-Stack изображений в размере, который может быть проанализирован с помощью КОМСТАТ на стандартных компьютерных системах.
Эти эксперименты являются более дорогостоящим и трудоемким, чем у других анализов крепежными времени, и не может быть сделано в высокой пропускной способности способом. В этой процедуре, бактерии прикрепляются к поверхности боросиликатного, который не отражает условие в естественных условиях , и могут влиять на образование биопленки и развитие. Тем не менее, они обеспечивают дополнительную информацию и может генерировать гипотезы для механизма, связанного с устойчивостью к антибиотикам биопленку и физиологический ответ на экзогенный сигнал. Если цель эксперимента, чтобы понять, как биопленки изменяются в ответ на различные факторы, а не выявления анти-биопленки соединений с использованием способов с высокой пропускной способностью, например, дополнительная информация, полученная с помощью тего метод делает метод стоит. Таким образом, в настоящее время метод является значительным усовершенствованием по сравнению с предыдущими ограниченных анализов вложений, таких как анализа кристаллического фиолетового, который наиболее часто используется для изучения биопленки.
Критические шаги к этой процедуре являются: 1) обеспечение своевременной обработки образцов мокроты, чтобы избежать деградации; 2) Быть нежным с изменениями в СМИ о биопленки, чтобы избежать нарушения биопленки и 3) Выполнение повторных измерений визуализации биопленки, чтобы обеспечить точное представление толщины биопленки из-за неоднородности образования биопленки.
После того как система установлена вверх для данного вида бактерий, можно проверить ряд различных условий, включая влияние экзогенных факторов на нескольких клинических изолятов. Эта система была использована для изучения влияния антибиотиков на биопленок воздействию человеческой мокроте 16 и сравнить высокоустойчивые и промежуточно резистентные клинических изолятов, 17 Изменения в патроннике покровного стекла, такие как нанесение на дно с муцина или коллагена микро-строительных лесов (например, puracol), может дополнительно расширить диапазон возможных экспериментов. Может быть возможно адаптировать эту систему для изучения прямых взаимодействий, такие, как те, между эпителиальными клетками и бактериями, так и между разными видами бактерий. Это расширение модели , описанной Jurcisek и др. 20 Метод использует рост камеры слайд , аналогичной описанной здесь , и использует формалин для фиксации биопленки перед визуализацией. В качестве альтернативы, в этом методе мы визуализировать биопленки сразу после окрашивания и не используют закрепитель. Кроме того, мы добавим экзогенные факторы, чтобы проверить действие антибиотика на биопленки. Таким образом, эта модель имеет потенциал, чтобы значительно углубить наше понимание бактериальных биопленок в человеческой болезни.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Никто.
Acknowledgments
ТБ признает исследовательскую стипендию от муковисцидоза Канады.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lab-Tek II Chambered coverglass, #1.5 borosilicate, 8-well | Thermo Sicher Scientific | 155409 | |
| Filmtracer Live/Dead Biofilm Viabilty Kit | Thermo Fisher Scientific | L10316 | |
| Blood agar plates | Thermo Fisher Scientific | R10215 | Confirming viability via CFU counts or selecting colonies for innoculation |
| COMSTAT | Availble software online | COMSTAT is software to analyze biofilm images. Available www.comstat.dk | |
| Millers LB Broth | Thermo Fisher Scientific | 12780-052 | Standard media for overnight gowth/biofilm growth |
| Millex-GV Syringe Filters | Millipore | SLGV013SL | Filtering of sputum supernants |
| Phosphate Buffered Saline (Dulbecco A) | Oxoid | BR0014G | Washing of biofilm chambers after media removal |
| Zeiss AxioVert 200M | Carl Zeiss | ||
| Hamamatsu C9100-13 EM-CCD | QS Technologies Inc. | ||
| Spectral Borealis | Qs Technologies Inc. | ||
| Perkin Elmer Volocity | QS Technologies Inc. | Instructions for this software can be found at: http://cellularimaging.perkinelmer.com/pdfs/manuals/VolocityuserGuide.pdf |
References
- Beaudoin, T., Waters, V. Infections with biofilm formation: selection of antimicrobials and role of prolonged antibiotic therapy. Pediatr.Infect.Dis.J. , (2016).
- Donlan, R. M. Biofilms: microbial life on surfaces. Emerg.Infect.Dis. 8 (9), 881-890 (2002).
- Hobley, L., Harkins, C., MacPhee, C. E., Stanley-Wall, N. R. Giving structure to the biofilm matrix: an overview of individual strategies and emerging common themes. FEMS Microbiol.Rev. 39 (5), 649-669 (2015).
- Katharios-Lanwermeyer, S., Xi, C., Jakubovics, N. S., Rickard, A. H. Mini-review: Microbial coaggregation: ubiquity and implications for biofilm development. Biofouling. 30 (10), 1235-1251 (2014).
- Donlan, R. M. Biofilm formation: a clinically relevant microbiological process. Clin.Infect.Dis. 33 (8), 1387-1392 (2001).
- Bjarnsholt, T., et al.
- Mah, T. F., Pitts, B., Pellock, B., Walker, G. C., Stewart, P. S., O'Toole, G. A. A genetic basis for Pseudomonas aeruginosa biofilm antibiotic resistance. Nature. 426 (6964), 306-310 (2003).
- Mah, T. F.
- Beaudoin, T., Zhang, L., Hinz, A. J., Parr, C. J., Mah, T. F. The biofilm-specific antibiotic resistance gene ndvB is important for expression of ethanol oxidation genes in Pseudomonas aeruginosa biofilms. J. Bacteriol. 194 (12), 3128-3136 (2012).
- Beaudoin, T., Aaron, S. D., Giesbrecht-Lewis, T., Vandemheen, K., Mah, T. F. Characterization of clonal strains of Pseudomonas aeruginosa isolated from cystic fibrosis patients in Ontario, Canada. Can. J. Microbiol. 56 (7), 548-557 (2010).
- Vidya, P., et al. Chronic infection phenotypes of Pseudomonas aeruginosa are associated with failure of eradication in children with cystic fibrosis. Eur.J.Clin.Microbiol.Infect.Dis. , (2015).
- Beaudoin, T., Lafayette, S., Nguyen, D., Rousseau, S. Mucoid Pseudomonas aeruginosa caused by mucA mutations result in activation of TLR2 in addition to TLR5 in airway epithelial cells. Biochem.Biophys.Res.Commun. 428 (1), 150-154 (2012).
- Beaudoin, T., et al. The level of p38alpha mitogen-activated protein kinase activation in airway epithelial cells determines the onset of innate immune responses to planktonic and biofilm Pseudomonas aeruginosa. J.Infect.Dis. 207 (10), 1544-1555 (2013).
- LaFayette, S. L., et al. Cystic fibrosis-adapted quorum sensing mutants cause hyperinflammatory responses. Sci.Adv. 1 (6), e1500199 (2015).
- Staudinger, B. J., et al. Conditions associated with the cystic fibrosis defect promote chronic Pseudomonas aeruginosa infection. Am.J.Respir.Crit.Care Med. 189 (7), 812-824 (2014).
- Kennedy, S., et al. Activity of Tobramycin against Cystic Fibrosis Isolates of Burkholderia cepacia Complex Grown as Biofilms. Antimicrob.Agents Chemother. 60 (1), 348-355 (2015).
- Tom, S. K., Yau, Y. C., Beaudoin, T., LiPuma, J. J., Waters, V. Effect of High-Dose Antimicrobials on Biofilm Growth of Achromobacter Species Isolated from Cystic Fibrosis Patients. Antimicrob.Agents Chemother. 60 (1), 650-652 (2015).
- Heydorn, A., et al. Quantification of biofilm structures by the novel computer program COMSTAT. Microbiology. 146 (Pt 10), 2395-2407 (2000).
- Vorregaard, M. Comstat2 - a modern 3D image analysis environment for biofilms . Informatics and Mathematical Modelling. , Technical University of Denmark. Kongens Lyngby, Denmark. (2008).
- Jurcisek, J. A., Dickson, A. C., Bruggeman, M. E., Bakaletz, L. O. In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide. J. Vis. Exp. (47), e2481 (2011).
