Abstract
تتكون الأغشية الحيوية من مجموعة من البكتيريا المغطى في مصفوفة يفرز النفس. أنها تلعب دورا هاما في التلوث الصناعي وكذلك في تطوير واستمرار العديد من الأمراض المتصلة بالصحة. تحدث أحد الأغشية الحيوية صفها وصفا جيدا ودرس في الأمراض التي تصيب البشر في عدوى الالتهاب الرئوي المزمن من مرضى التليف الكيسي. عند دراسة الأغشية الحيوية في سياق المضيف، يمكن أن العديد من العوامل تؤثر تشكيل بيوفيلم والتنمية. من أجل تحديد مدى العوامل المضيفة قد تؤثر على تشكيل بيوفيلم والتنمية، استخدمنا طريقة ساترة تشامبيريد ثابت للنمو الأغشية الحيوية في وجود عوامل المستمدة من المضيفة في شكل supernatants البلغم. هي المصنفة البكتيريا في غرف ومعرضة للالرواشح البلغم. وبعد 48 ساعة من النمو، هي ملطخة الأغشية الحيوية مع بيوفيلم مجموعة الجدوى التجارية قبل الفحص المجهري متحد البؤر والتحليل. وبعد الحصول على الصور، والخصائص بيوفيلم يمكن تقييم استخدام منصات البرمجيات المختلفة.هذا الأسلوب يسمح لنا تصور الخصائص الأساسية للنمو بيوفيلم في وجود مواد مختلفة بما في ذلك المضادات الحيوية.
Introduction
الأغشية الحيوية البكتيرية هي مجموعات من الكائنات الحية الدقيقة التي تعلق على بعضها البعض، والمغطى في مصفوفة يفرز النفس. 1،2 كلاسيكي، إلا أنها تمثل البكتيريا تعلق بدنيا لسطح اللاأحيائي أو الحيوية شكلت في ظل ظروف التدفق. وقد تبين أيضا الأغشية الحيوية للنمو في ظروف ثابتة (غياب تدفق) والقاصي من السطوح، مثل في واجهة الهواء السائل من الحمامات الحرارية أو pellicles شكلت في أنابيب الاختبار. منذ فترة طويلة التعرف على هذه الأغشية الحيوية في البيئة وهم اذى رئيسيا في العمليات الصناعية، كما أنها يمكن أن تشكل في خزانات المياه أو في الأنابيب، مما أدى إلى biofouling والتآكل والعقبات. 3،4
الأغشية الحيوية هي أيضا حاسمة في مرافق الرعاية الصحية، كما ثبت أن تشارك في العدوى المرتبطة القسطرة، والالتهابات الرئوية في مرضى التليف الكيسي، وكذلك في التهابات أخرى عديدة. 5،6 واحدة من السمات المميزة لالتهابات بيوفيلم هي ديمجعدة قابلية البكتيريا للمضادات الحيوية وضعاف إزالة من قبل النظام المناعي الفطري. 7-9 درست معظم جيدا، والسيناريوهات ذات الصلة سريريا تنطوي عدوى القائم على بيوفيلم يحدث في المرضى الذين يعانون من التليف الكيسي (CF)، المصابين المزمنين مع الأغشية الحيوية الزنجارية الزائفة. الزائفة الزنجارية يمكن أن يخضع لعدد من التغييرات خلال إنشاء عدوى مزمنة تجعل من الصعب جدا لعلاج. يمكن 10،11 الأغشية الحيوية تفعيل تفاضلي المناعة الفطرية ودفع الالتهاب. 12-14 وهذه الالتهابات تؤدي إلى زيادة معدلات الاعتلال والوفيات في مرضى التليف الكيسي، فمن الأهمية بمكان أن نفهم العوامل التي يمكن أن تؤثر على التنمية بيوفيلم في هذا السياق.
وتشير دراسة حديثة إلى أن العوامل المضيفة هي الحاسمة في تشكيل المجاميع بيوفيلم الزائفة الزنجارية. وتساهم 15 هذه الأغشية الحيوية لتقليل التعرض للمضادات الحيوية وآليات دفاع المضيف. وبريسيالامتحانات التنافسية الوطنية من العوامل المستمدة من المضيفة، كالإيلاستاز العدلة، فضلا عن المنتجات يفرز من الكائنات الدقيقة الموجودة في CF الرئة، لديها القدرة على تعديل إلى حد كبير تشكيل بيوفيلم والتنمية. 16 وبالإضافة إلى ذلك، الأغشية الحيوية تتفاعل مع المضيف لتعديل تعبير عن العديد من الممرات وبدء الالتهاب. في حين أساليب إنتاجية عالية، مثل معيار فحص الكريستال البنفسجي، يمكن أن توفر بعض المعلومات فيما يتعلق بعملية بيوفيلم، والتصور للبيوفيلم ردا على هذه العوامل توفر مزيد من المعلومات المتعمقة.
في هذه المخطوطة وصفنا طريقة لاستخدام عوامل من البلغم من المرضى الذين يعانون من التليف الكيسي لدراسة تطوير الأغشية الحيوية في المختبر. وتسمح هذه الطريقة لتصور السريع الأغشية الحيوية تتعرض لعوامل المضيف البلغم التي تحتوي على استخدام عدة قابلية بيوفيلم التجارية. هذه التقنية يمكن استخدامها لتحديد بصريا التغييرات التي تحدث أثناء نمو بيوفيلم في وجود exogenoلنا المنتجات، ويمثل طريقة تحسين لتحليل التغيرات في التنمية بيوفيلم في ظل ظروف مختلفة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
لاحظ أن بحوث أخلاقيات المجلس (جندي كونفدرالي) مطلوب لجمع وتخزين عينات البلغم من البشر. تمت الموافقة على هذه الدراسات من قبل مستشفى المرضى الأطفال REB # 1000019444.
1. إعداد عينات البلغم CF
- جمع عينة البلغم من المرضى خلال الزيارات الروتينية للعيادة التليف الكيسي والحفاظ على الجليد.
- نقل عينة البلغم على الجليد في غضون الساعة الأولى من جمع، إلى مختبر للأبحاث، إلى الخضوع لمعالجة.
2. معالجة البلغم
- سجل حجم عينة البلغم الحصول عليها. إضافة الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) إلى 2x حجم العينة (أي 2 أجزاء PBS، 1 جزء العينة).
- خلط العينة بشكل جيد مع ماصة نقل. دوامة العينة على أعلى الإعداد لمدة 1 دقيقة لخلط تماما.
- قسامة 1 مل من الخليط المذكور أعلاه في عدد 1.5 مل أنابيب microcentrifuge المناسبة وتدور باستمرار في 5000 x ج ل20 دقيقة على 4 درجات مئوية.
- بعد الطرد المركزي، وإزالة طاف وتجاهل بيليه.
- فلتر تعقيم طاف من خلال مرشح 0.22 ميكرون وجمع في أنبوب microcentrifuge نظيفة.
ملاحظة: يتم اختبار العقم من الترشيح من قبل الطلاء على LB أجار وبتلقيح السائلة وسائل الإعلام. - تخزين طاف البلغم في -80 درجة مئوية لاستخدامها في المستقبل.
ملاحظة: البلغم من يمكن أيضا تجميع المرضى متعددة بعد الترشيح. - قبل استخدامها، وتمييع البلغم الترشيح 1/10 ت / ت (100 ميكرولتر من البلغم، 900 ميكرولتر من وسائل الاعلام) في وسائل الإعلام المرجوة.
ملاحظة: هنا، تم استخدام مرق استذابة القياسية (LB) وسائل الاعلام.
3. غرف الطريقة ساترة لتشكيل بيوفيلم
- تنمو عزل البكتيريا من بين عشية وضحاها الاهتمام في وسائل الإعلام المطلوب عند 37 درجة مئوية مع اهتزاز (200 دورة في الدقيقة).
ملاحظة: استخدمت عدد من البكتيريا المختلفة، بما في ذلك السريرية عزلات الزائفة الزنجارية، المكورات العنقودية الذهبية،بيركولديريا مجمع الشرهة وxylosoxidans المنتصلة. اختيار وسائل الاعلام يعتمد على سلالات وشروط الفائدة، ولكن وسائل الاعلام LB يمكن استخدامها لإجراء التجارب الأولية. - من الثقافة بين عشية وضحاها، ضع 40 ميكرولتر من ثقافة إلى 4 مل من وسائل الإعلام الجديدة وتنمو لمدة 3-4 ساعة عند 37 درجة مئوية مع اهتزاز (200 دورة في الدقيقة) للحصول على الثقافة مع الكثافة البصرية في 600 نانومتر (OD 600) ما يقرب من 0.5 -0.6.
- تمييع الثقافة من الخطوة 3.2 إلى 1/5 في وسائل الإعلام المطلوب مع 10٪ البلغم الترشيح أو بدون الترشيح البلغم (كما المراقبة). تركيز الآخرين من الترشيح البلغم يمكن اختبار (أي 50٪ أو 100٪).
- استخدام 200 ميكرولتر من التخفيف البذور آبار غرف الشرائح.
- تسمح للبكتيريا ان نعلق لمدة 4 ساعة على 37 درجة مئوية دون أن تهتز.
- بعد 4 ساعات، وإزالة وسائل الإعلام وبلطف يغسل بيوفيلم مع وسائل الإعلام الجديدة 1X. استبدال 200 ميكرولتر وسائل الإعلام الجديدة.
ملاحظة: لدراسة آثار البلغم على بيوفيلم، وFRESوينبغي أن تتضمن وسائل الاعلام ح البلغم طاف. - تسمح الأغشية الحيوية لتنمو لكمية من الوقت المطلوب عند 37 درجة مئوية دون أن تهتز، لتحل محل وسائل الاعلام كل 12 ساعة، دون غسل حتى الوقت للفحص المجهري.
ملاحظة: لدراسة تأثير supernatants البلغم على القابلية للمضادات الحيوية بيوفيلم، تتم إضافة المضادات الحيوية إلى وسائل الإعلام بعد 24 ساعة من نمو بيوفيلم ويتم الاحتفاظ بها في وسائل الإعلام حتى تلطيخ والتصوير الأغشية الحيوية.
4. تلطيخ الأغشية الحيوية ومتحد البؤر المجهري
- وعقب المطلوب الوقت نمو (24-48 ساعة يعمل بشكل أفضل)، وإزالة وسائل الإعلام من الآبار الغرفة وغسل بلطف كل غرفة مرتين مع 300 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني العقيمة.
- تحضير خليط تلطيخ للبيوفيلم عن طريق خلط 1 ميكرولتر من كل صبغ (المنصوص عليها في عدة الجدوى) لكل مل من محلول الحاجة. جعل الصبغة في محلول مائي أو وسائل الإعلام.
ينصح المياه من قبل الشركة المصنعة: ملاحظة. - إضافة 200 ميكرولتر من خليط الصبغة لكل بئر من covergla غرفSS ويحضن في درجة حرارة الغرفة، في الظلام لمدة 45 دقيقة.
- إزالة خليط تلطيخ من الغرف وغسل كل بئر مع 300 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني العقيمة. إزالة برنامج تلفزيوني واستبدالها مع المياه العذبة أو وسائل الإعلام.
- المضي قدما في التصور الأغشية الحيوية عن طريق الفحص المجهري متحد البؤر.
5. تصور الأغشية الحيوية مع متحد البؤر المجهري
- قراءة الأغشية الحيوية الملون في غرف مباشرة بعد تلطيخ (في حدود 1 ساعة). تقليل التأخير في التصور من الشرائح التي تلطيخ 1-2 غرف 8 جيدا في كل مرة.
- أداء التصوير باستخدام متحد البؤر المجهر مع الليزر لالإثارة وتصفية مجموعات لاقتناء.
ملاحظة: هنا، والغزل نظام القرص متحد مع ليزر بورياليس الطيفية استخدمت لإثارة (الأخضر: 561 نانومتر: 491nm، الأحمر). واستخدمت الانبعاثات تصفية مجموعات من 515/40 و624/40 لتصور البقع من عدة قابلية بيوفيلم. - التقاط صور باستخدام الهدف المياه 25X على المجهر متحد البؤر مع الكاميرا.
- يستغرق 3-5 صور من كل جانب.
ملاحظة: وهكذا لمدة 8 ساترة غرف جيدا، سيتم إنشاء 24-40 الصور. - حفظ الصور للتحليل.
ملاحظة: يجب حفظ الصور كملفات OME-TIFF ليتم تحليلها باستخدام COMSTAT 18،19. تعليمات لتحليل الصور بيوفيلم يمكن العثور عليها في http://www.comstat.dk/. مرة واحدة يتم استيراد الصور والمعلمات مثل سمك متوسط والكتلة الحيوية وتغطية السطح لكل قناة (الأحمر والأخضر) يمكن تحليلها.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويمثل التصميم الشامل للتجربة في الشكل 1. استخدام هذا البروتوكول يوفر طريقة مريحة لتصور التغيرات في الأغشية الحيوية نمت لفترات زمنية مختلفة (على سبيل المثال، 24، 48 أو 72 ساعة). الأهم من ذلك، إشارات خارجية، مثل البلغم الرواشح، ويمكن أن يضاف إلى تصور التغييرات في تطوير بيوفيلم. كما رأينا في الشكل 2، وجود 10٪ الرواشح البلغم يمكن تغيير بنية بيوفيلم (الشكل 2A، لوحات أقل). ويمكن تحليل 16 هذه الصور باستخدام برنامج COMSTAT للحصول على المصفوفات بيوفيلم الرئيسية، بما في ذلك سمك متوسط بيوفيلم، إجمالي الكتلة الحيوية وتغطية السطح. وينعكس هذا في زيادة إجمالية في سمك بيوفيلم (الأرقام 2B، و 3). وأظهرت 16 تأثيرات المضادات الحيوية على الأغشية الحيوية في البلغم وجود في الشكل (3). بواسطة visuali زينغ التغييرات في تطوير بيوفيلم، يمكن للمرء أن نقدر أفضل لكيفية عوامل مختلفة يمكن أن يؤثر على نمو بيوفيلم، إلى حد أفضل بكثير من المقايسات بيوفيلم التقليدية، مثل تلطيخ الكريستال البنفسجي.
الشكل 1: عموما تصميم التجربة. تدفق الرسم البياني من البروتوكول الأساسي. غير المخفف ل(O / N) الثقافة بين عشية وضحاها 1/1000، وسمح لتنمو إلى OD النهائي 600 من 0.5. ومما يخفف هذا 1/1000 و 200 ميكرولتر من المصنف في بئر ساترة تشامبيريد وسمح لنعلق لمدة 3-4 ساعة. وبعد ذلك، تتم إزالة وسائل الإعلام واستبدالها مع وسائل الإعلام الجديدة. يسمح الأغشية الحيوية لتنمو لمدة زمنية محددة. ، يمكن إضافة وسائل الإعلام المنتجات الخارجية أو المضادات الحيوية لالأغشية الحيوية. في أعقاب النمو، تتم إزالة وسائل الإعلام، ملطخة الأغشية الحيوية وأن يتم التصوير متحد البؤر.ge.jpg مرحبا "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: صور الممثل للتنمية بيوفيلم بعد التعرض لالرواشح البلغم. (A) صور الممثل بيركولديريا مجمع الشرهة (BCC) العزلات السريرية التالية 48 ساعة من النمو في ساترة تشامبيريد مع وسائل الإعلام وحدها (لوحات أعلى) أو في وجود 10 الرواشح٪ البلغم (لوحات أقل) تليها تلطيخ مع مجموعة الجدوى بيوفيلم. 1 وحدة على نطاق وتمثل 19.68 ميكرون. (B - C) متوسط سمك العزلات (ب) والميتة: نسبة الحية (ج) من صور متعددة من BCC العزلات نمت لمدة 48 ساعة في غرف الشرائح في غياب (أشرطة بيضاء) أو وجود (أشرطة سوداء) من البلغم الرواشح. يمثل كل شريط يعني من 45 صور تآمرمع الخطأ المعياري للمتوسط. ** ف <0.001 مقارنة مع الشاهد (وسائل الإعلام وحدها) باستخدام اختبار كروسكال واليس. شخصية مقتبسة من كينيدي وآخرون. 16 الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: صور الممثل العلاج بالمضادات الحيوية على الأغشية الحيوية تتعرض لالترشيح البلغم. (A) صور من العزلات السريرية بيركولديريا vietnamiensis عقب 48 ساعة من النمو في ساترة تشامبيريد مع وسائل الإعلام وحدها (يسار) أو في وجود 10 الرواشح٪ البلغم (يمين) مع أو بدون 1000 ميكروغرام / م التوبراميسين. وقد نمت الأغشية الحيوية لمدة 24 ساعة في وسائل الإعلام وحدها أو وسائل الإعلام تستكمل مع 10٪ (ت / ت) البلغم الرواشح. بعد 24 ساعة، تمت إزالة وسائل الإعلام واستبدالها مع ميديو(+/- البلغم) التي تحتوي على المضادات الحيوية. 1 وحدة على نطاق وتمثل 19.68 ميكرون. (B - C) متوسط سمك العزلات (ب) والميتة: نسبة الحية (ج) من صور متعددة (ن = 9) من B. vietnamiensis العزلات نمت لمدة 48 ساعة في غرف الشرائح في غياب أو وجود الرواشح البلغم. يمثل كل شريط يعني من 45 صور تآمر مع الخطأ المعياري للمتوسط. ** ف <0.001 مقارنة مع الشاهد (0 ميكروغرام / مل) باستخدام اختبار كروسكال واليس. شخصية مقتبسة من كينيدي وآخرون. 16 الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الطرق الموضحة في هذه الوثيقة تسمح لتصور الأغشية الحيوية البكتيرية التي تزرع في وجود المنتجات الخارجية. ليس من المستغرب أن إنتاج exoproducts له أهمية عند استخدام هذا النوع من النظام. على سبيل المثال، Dithiothreitol (DTT)، وغالبا ما تستخدم على عينات البلغم الإنسان لمساعدة تسييل العينات. ومع ذلك، فإن تأثير التلفزيون الرقمي الأرضي وحدها يمكن أن تقلل تنمية بيوفيلم وقدرتها على البقاء (لا تظهر البيانات). وهكذا، والضوابط المناسبة لجميع الشروط اللازمة. وعلاوة على ذلك، إضافة منتجات البلغم الإنسان يخلق التنوع الكامن في التجربة يرجع ذلك إلى حقيقة أن البلغم كل مريض لديه microbiome فريدة من نوعها. لضبط هذا، وقد استخدمنا عينات البلغم المجمعة لتجنب نتائج محددة للمرضى. بالإضافة إلى ذلك، فإن اختيار الوسائط المناسبة مهم عند استخدام أي نظام نموذجي. ينصح وسائل الاعلام القياسية للنمو بيوفيلم الكائن الحي المقصود من أجل الإعداد الأولي للنظام. إذا كان الهدف من التجربة هو الرمزify كيفية منتجات خارجية تؤثر على تشكيل بيوفيلم، والوسائط الغنية المغذية التي توفر تشكيل بيوفيلم الكافي اقترح. وهذا سوف يسمح التغذية الكافية للنمو بينما تحديد كيفية عوامل خارجية قد تؤثر على بيوفيلم. وسائل الإعلام الأخرى، مثل وسائل الإعلام الحد الأدنى أو محددة، ويمكن استخدامها لشروط معينة أفضل تقليد. وقد استخدمت وسائل الإعلام الأخرى مع نتائج جيدة في هذا النظام (لا تظهر البيانات). الحجز على الأغشية الحيوية إلى ساترة غرف قوي، يجب توخي الحذر لكن كبيرة عند إزالة / إضافة وسائل الإعلام أو أثناء غسل خطوات من الأغشية الحيوية لمنع تعطيل الأغشية الحيوية.
وقد أسفر استخدام وصمة عار الحية القتلى حسب بروتوكول الشركة المصنعة نتائج جيدة للنظام وصفه. هناك عدد من العوامل يمكن أن تؤثر على نسبة مضان من الصور (بما في ذلك امتصاص الصبغة من البكتيريا، والكثافة النسبية للإعدادات بيوفيلم وزيادة كاشف)، ومع ذلك، ينبغي أن تتصل هذه الطريقة إلى ما لوحظ في الصورةالصورة. ويمكن استخدام تدابير أخرى لتمثيل القيمة النسبية للميت بيوفيلم / الحية، مثل الكتلة الحيوية من الخلايا الميتة كنسبة من إجمالي الكتلة الحيوية موجودة في بيوفيلم (على النحو المستمد من COMSTAT). باستخدام بكتيريا لتأكيد جدوى بيوفيلم في التجارب المتكررة ينصح لتأكيد الملاحظات البصرية لهذا النموذج. نظرا لعدم التجانس المتأصل في الأغشية الحيوية، صور متعددة من كل غرفة وغرف متعددة وينبغي أن تستخدم في كل حالة في تجربة. وهذا يضيف إلى تكلفة ومدة هذه التجارب.
الحصول على الصور مهم قبل لتحليل البيانات من هذه التجارب. يجب الحرص على لم تنته تشبع الصور وعند تحديد الإعداد المجهر. اعتمادا على مستوى التفاصيل المطلوبة والمجهر المتاحة، وعدد من الأهداف المختلفة (10X، 25X، 40X 63X و) يمكن استخدامها للحصول على الصور، على الرغم من أننا نجد أن الهدف 25X يعطي أفضل الصور. سمك رانه Z كومة يمكن أن تؤثر أيضا على جودة الصورة الشاملة ومستوى التفاصيل. بعد الصور التي التقطت كل 0.5-1 ميكرون يبدو لتقديم صور واضحة في 25X الهدف، مع الحفاظ على الصور Z-المكدس في حجم والتي يمكن تحليلها بواسطة COMSTAT على أنظمة الكمبيوتر القياسية.
هذه التجارب هي أكثر تكلفة وتستغرق وقتا طويلا من المقايسات المرفقات الأخرى، ولا يمكن أن يتم ذلك بطريقة إنتاجية عالية. في هذا الإجراء، والبكتيريا تلتصق على سطح البورسليكات، والذي لا يعكس وجود حالة في الجسم الحي وقد تؤثر على تشكيل بيوفيلم والتنمية. ومع ذلك، لأنها توفر معلومات إضافية ويمكن أن تولد فرضيات لآلية تتعلق بيوفيلم المقاومة للمضادات الحيوية والاستجابة الفسيولوجية للإشارة الخارجية. إذا كان الهدف من هذه التجربة هو أن نفهم كيف تتغير الأغشية الحيوية استجابة لعوامل مختلفة، بدلا من تحديد المركبات المضادة للبيوفيلم باستخدام الأساليب الإنتاجية العالية على سبيل المثال، المعلومات الإضافية المكتسبة باستخدام رأسلوبه يجعل طريقة جديرة بالاهتمام. وهكذا فإن الطريقة الحالية هو تقدم كبير على المقايسات مرفق محدودة السابقة مثل فحص الكريستال البنفسجي، الذي هو الأكثر شيوعا لدراسة الأغشية الحيوية.
الخطوات الحاسمة لهذا الإجراء ما يلي: 1) ضمان تجهيزها في الوقت المناسب من عينات البلغم لتجنب تدهورها؛ 2) أن تكون لطيف مع التغييرات وسائل الإعلام على الأغشية الحيوية لتجنب تعطل بيوفيلم و 3) القيام القياسات المتكررة التصوير بيوفيلم لضمان تمثيل دقيق لسمك بيوفيلم نظرا لعدم تجانس تشكيل بيوفيلم.
بمجرد انشاء نظام الأنواع البكتيرية معينة، يمكن للمرء أن اختبار عدد من الظروف المختلفة، بما في ذلك آثار العوامل الخارجية على العزلات السريرية متعددة. وقد استخدم هذا النظام لدراسة تأثير المضادات الحيوية على الأغشية الحيوية تتعرض لالبلغم البشري 16 ومقارنة العزلات السريرية شديدة المقاومة ومقاومة انتقالية تربط بين. 17 تعديلات على ساترة غرف، مثل طلاء أسفل مع الميوسين أو الكولاجين الصغيرة سقالة (على سبيل المثال، puracol)، يمكن أن تزيد من توسيع نطاق التجارب الممكنة. قد يكون من الممكن للتكيف مع هذا النظام لدراسة التفاعلات المباشرة، مثل تلك التي بين الخلايا الظهارية والبكتيريا، أو بين الأنواع البكتيرية المختلفة. هذا هو توسيع نموذج صفها Jurcisek وآخرون. 20 يستخدم أسلوب النمو غرفة شريحة مماثلة لتلك التي وصفها هنا ويستخدم الفورمالين لإصلاح الأغشية الحيوية قبل التصور. بدلا من ذلك، في هذه الطريقة نحن تصور الأغشية الحيوية على الفور بعد تلطيخ وعدم استخدام مثبت. وبالإضافة إلى ذلك، ونضيف إلى عوامل خارجية لاختبار تأثير المضادات الحيوية على الأغشية الحيوية. وبالتالي هذا النموذج لديه القدرة على زيادة فهمنا من الأغشية الحيوية البكتيرية في الأمراض التي تصيب البشر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
لا شيء.
Acknowledgments
السل يعترف زمالة بحثية من التليف الكيسي كندا.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lab-Tek II Chambered coverglass, #1.5 borosilicate, 8-well | Thermo Sicher Scientific | 155409 | |
| Filmtracer Live/Dead Biofilm Viabilty Kit | Thermo Fisher Scientific | L10316 | |
| Blood agar plates | Thermo Fisher Scientific | R10215 | Confirming viability via CFU counts or selecting colonies for innoculation |
| COMSTAT | Availble software online | COMSTAT is software to analyze biofilm images. Available www.comstat.dk | |
| Millers LB Broth | Thermo Fisher Scientific | 12780-052 | Standard media for overnight gowth/biofilm growth |
| Millex-GV Syringe Filters | Millipore | SLGV013SL | Filtering of sputum supernants |
| Phosphate Buffered Saline (Dulbecco A) | Oxoid | BR0014G | Washing of biofilm chambers after media removal |
| Zeiss AxioVert 200M | Carl Zeiss | ||
| Hamamatsu C9100-13 EM-CCD | QS Technologies Inc. | ||
| Spectral Borealis | Qs Technologies Inc. | ||
| Perkin Elmer Volocity | QS Technologies Inc. | Instructions for this software can be found at: http://cellularimaging.perkinelmer.com/pdfs/manuals/VolocityuserGuide.pdf |
References
- Beaudoin, T., Waters, V. Infections with biofilm formation: selection of antimicrobials and role of prolonged antibiotic therapy. Pediatr.Infect.Dis.J. , (2016).
- Donlan, R. M. Biofilms: microbial life on surfaces. Emerg.Infect.Dis. 8 (9), 881-890 (2002).
- Hobley, L., Harkins, C., MacPhee, C. E., Stanley-Wall, N. R. Giving structure to the biofilm matrix: an overview of individual strategies and emerging common themes. FEMS Microbiol.Rev. 39 (5), 649-669 (2015).
- Katharios-Lanwermeyer, S., Xi, C., Jakubovics, N. S., Rickard, A. H. Mini-review: Microbial coaggregation: ubiquity and implications for biofilm development. Biofouling. 30 (10), 1235-1251 (2014).
- Donlan, R. M. Biofilm formation: a clinically relevant microbiological process. Clin.Infect.Dis. 33 (8), 1387-1392 (2001).
- Bjarnsholt, T., et al. The in vivo biofilm. Trends Microbiol. 21 (9), 466-474 (2013).
- Mah, T. F., Pitts, B., Pellock, B., Walker, G. C., Stewart, P. S., O'Toole, G. A. A genetic basis for Pseudomonas aeruginosa biofilm antibiotic resistance. Nature. 426 (6964), 306-310 (2003).
- Mah, T. F. Biofilm-specific antibiotic resistance. Future Microbiol. 7 (9), 1061-1072 (2012).
- Beaudoin, T., Zhang, L., Hinz, A. J., Parr, C. J., Mah, T. F. The biofilm-specific antibiotic resistance gene ndvB is important for expression of ethanol oxidation genes in Pseudomonas aeruginosa biofilms. J. Bacteriol. 194 (12), 3128-3136 (2012).
- Beaudoin, T., Aaron, S. D., Giesbrecht-Lewis, T., Vandemheen, K., Mah, T. F. Characterization of clonal strains of Pseudomonas aeruginosa isolated from cystic fibrosis patients in Ontario, Canada. Can. J. Microbiol. 56 (7), 548-557 (2010).
- Vidya, P., et al. Chronic infection phenotypes of Pseudomonas aeruginosa are associated with failure of eradication in children with cystic fibrosis. Eur.J.Clin.Microbiol.Infect.Dis. , (2015).
- Beaudoin, T., Lafayette, S., Nguyen, D., Rousseau, S. Mucoid Pseudomonas aeruginosa caused by mucA mutations result in activation of TLR2 in addition to TLR5 in airway epithelial cells. Biochem.Biophys.Res.Commun. 428 (1), 150-154 (2012).
- Beaudoin, T., et al. The level of p38alpha mitogen-activated protein kinase activation in airway epithelial cells determines the onset of innate immune responses to planktonic and biofilm Pseudomonas aeruginosa. J.Infect.Dis. 207 (10), 1544-1555 (2013).
- LaFayette, S. L., et al. Cystic fibrosis-adapted quorum sensing mutants cause hyperinflammatory responses. Sci.Adv. 1 (6), e1500199 (2015).
- Staudinger, B. J., et al. Conditions associated with the cystic fibrosis defect promote chronic Pseudomonas aeruginosa infection. Am.J.Respir.Crit.Care Med. 189 (7), 812-824 (2014).
- Kennedy, S., et al. Activity of Tobramycin against Cystic Fibrosis Isolates of Burkholderia cepacia Complex Grown as Biofilms. Antimicrob.Agents Chemother. 60 (1), 348-355 (2015).
- Tom, S. K., Yau, Y. C., Beaudoin, T., LiPuma, J. J., Waters, V. Effect of High-Dose Antimicrobials on Biofilm Growth of Achromobacter Species Isolated from Cystic Fibrosis Patients. Antimicrob.Agents Chemother. 60 (1), 650-652 (2015).
- Heydorn, A., et al. Quantification of biofilm structures by the novel computer program COMSTAT. Microbiology. 146 (Pt 10), 2395-2407 (2000).
- Vorregaard, M. Comstat2 - a modern 3D image analysis environment for biofilms . Informatics and Mathematical Modelling. , Technical University of Denmark. Kongens Lyngby, Denmark. (2008).
- Jurcisek, J. A., Dickson, A. C., Bruggeman, M. E., Bakaletz, L. O. In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide. J. Vis. Exp. (47), e2481 (2011).
