Abstract
Biofilms एक आत्म स्रावित मैट्रिक्स में encased बैक्टीरिया के समूहों से मिलकर बनता है। वे औद्योगिक संदूषण के साथ ही विकास और कई स्वास्थ्य से संबंधित संक्रमण के हठ करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। मानव रोग में सबसे अच्छी तरह से वर्णित है और अध्ययन किया biofilms के एक सिस्टिक फाइब्रोसिस रोगियों की पुरानी फेफड़े के संक्रमण में होता है। जब मेजबान के संदर्भ में biofilms अध्ययन, कई कारकों biofilm गठन और विकास को प्रभावित कर सकते हैं। आदेश कैसे मेजबान कारकों biofilm गठन और विकास को प्रभावित कर सकता है की पहचान करने के लिए, हम थूक supernatants के रूप में मेजबान व्युत्पन्न कारकों की उपस्थिति में biofilms विकसित करने के लिए एक स्थिर संभाग coverglass विधि का इस्तेमाल किया। जीवाणु कक्षों में वरीयता प्राप्त और थूक filtrates के संपर्क में हैं। विकास के 48 घंटे के बाद, biofilms confocal माइक्रोस्कोपी और विश्लेषण करने से पहले एक वाणिज्यिक व्यवहार्यता biofilm किट के साथ दाग रहे हैं। छवि अधिग्रहण के बाद, biofilm गुण अलग सॉफ्टवेयर प्लेटफार्मों का उपयोग कर मूल्यांकन किया जा सकता है।इस विधि हमें एंटीबायोटिक दवाओं सहित विभिन्न पदार्थों की उपस्थिति में biofilm विकास की कुंजी गुण कल्पना करने के लिए अनुमति देता है।
Introduction
बैक्टीरियल biofilms कि एक दूसरे से जुड़े होते हैं और एक आत्म स्रावित मैट्रिक्स में encased सूक्ष्मजीवों के समूह हैं। 1,2 माइल्ड, वे बैक्टीरिया शारीरिक रूप से एक अजैव या जैविक सतह प्रवाह की शर्तों के तहत गठित करने के लिए संलग्न प्रतिनिधित्व करते हैं। Biofilms भी इस तरह के थर्मल पूल या pellicles टेस्ट ट्यूब में गठित की हवा तरल इंटरफेस के रूप में सतहों से स्थिर शर्तों (प्रवाह के अभाव) और बाहर, में विकसित करने के लिए दिखाया गया है। ये biofilms लंबे, औद्योगिक प्रक्रियाओं के लिए वातावरण में मान्यता प्राप्त किया गया है और कर रहे हैं एक प्रमुख हानि के रूप में वे जलाशयों में या पाइप में फार्म कर सकते हैं, जैव अवरोध, जंग और रुकावटों में जिसके परिणामस्वरूप। 3,4
Biofilms के रूप में वे कैथेटर संबंधित संक्रमण, सिस्टिक फाइब्रोसिस रोगियों में फेफड़े में संक्रमण, साथ ही साथ में कई अन्य संक्रमण में शामिल होना दिखाया गया है, स्वास्थ्य देखभाल स्थितियों में महत्वपूर्ण भी कर रहे हैं। 5,6 biofilm संक्रमण की पहचान की है deएंटीबायोटिक दवाओं के लिए बैक्टीरिया की संवेदनशीलता बढ़ गई और सहज प्रतिरक्षा प्रणाली द्वारा मंजूरी के बिगड़ा। 7-9 सबसे अच्छी तरह से अध्ययन किया, चिकित्सकीय प्रासंगिक biofilm आधारित संक्रमण से जुड़े परिदृश्यों सिस्टिक फाइब्रोसिस (सीएफ), जो लंबे समय से Pseudomonas aeruginosa biofilms से संक्रमित हैं के साथ रोगियों में होता है। पी aeruginosa पुराने संक्रमण है कि यह बहुत मुश्किल के इलाज के लिए बनाने की स्थापना के दौरान परिवर्तन का एक नंबर से गुजरना कर सकते हैं। 10,11 Biofilms विभिन्न जन्मजात प्रतिरोधक क्षमता को सक्रिय करने और ड्राइव सूजन कर सकते हैं। इन संक्रमणों वृद्धि की रुग्णता और सीएफ रोगियों में मृत्यु दर के लिए नेतृत्व 12-14 रूप में, यह कारक है कि इस संदर्भ में biofilm विकास को प्रभावित कर सकते हैं समझने के लिए महत्वपूर्ण है।
हाल के एक अध्ययन से पता चलता है कि मेजबान कारकों पी aeruginosa biofilm समुच्चय के गठन में महत्वपूर्ण हैं। 15 ये biofilms एंटीबायोटिक दवाओं और मेजबान सुरक्षा तंत्र के लिए कम संवेदनशीलता में योगदान। preseऐसे न्यूट्रोफिल elastase, साथ ही सीएफ फेफड़ों में मौजूद सूक्ष्म जीवाणुओं से स्रावित उत्पादों के रूप में मेजबान व्युत्पन्न कारकों की nce, संभावित बहुत biofilm गठन और विकास व्यवस्थित करना है। 16 इसके अतिरिक्त, biofilms मेजबान के साथ बातचीत के लिए कई रास्ते की अभिव्यक्ति मिलाना और सूजन को आरंभ करने के लिए। इस तरह के मानक क्रिस्टल बैंगनी परख के रूप में उच्च तरीकों, biofilm प्रक्रिया के संबंध के साथ कुछ जानकारी प्रदान कर सकते हैं, इन कारकों के जवाब में biofilm के दृश्य और अधिक में गहराई से जानकारी प्रदान करते हैं।
इस पांडुलिपि में हम सीएफ के साथ रोगियों के बलगम से कारकों का उपयोग कर इन विट्रो में biofilms के विकास का अध्ययन करने के लिए एक विधि का वर्णन है। इस विधि थूक युक्त मेजबान एक वाणिज्यिक व्यवहार्यता biofilm किट का उपयोग कारकों को उजागर biofilms के तेजी से दृश्य के लिए अनुमति देता है। इस तकनीक नेत्रहीन exogeno की उपस्थिति में परिवर्तन biofilm विकास के दौरान होती है कि पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकताहमारे उत्पादों, और एक बेहतर विधि विभिन्न शर्तों के तहत biofilm विकास में परिवर्तन का विश्लेषण करने का प्रतिनिधित्व करता है।
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Protocol
ध्यान दें कि अनुसंधान आचार बोर्ड (REB) इकट्ठा करने और मानव विषयों से थूक के नमूनों को स्टोर करने के लिए आवश्यक है। इन अध्ययनों के लिए बीमार बच्चे REB # 1000019444 अस्पताल द्वारा अनुमोदित किया गया।
1. तैयारी सीएफ थूक के नमूने
- सिस्टिक फाइब्रोसिस क्लिनिक के लिए नियमित दौरे के दौरान मरीजों से थूक का नमूना ले लीजिए और बर्फ पर रहते हैं।
- बर्फ पर थूक का नमूना संग्रह परिवहन के पहले घंटे के भीतर, अनुसंधान प्रयोगशाला के लिए, प्रसंस्करण से गुजरना है।
2. थूक प्रसंस्करण
- प्राप्त थूक नमूने की मात्रा रिकॉर्ड। फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) नमूना (यानी, 2 भागों पीबीएस, 1 भाग नमूना) की मात्रा 2x करने के लिए जोड़ें।
- एक हस्तांतरण विंदुक के साथ अच्छी तरह से नमूना मिक्स। भंवर 1 मिनट पूरी तरह से मिश्रण करने के लिए उच्चतम सेटिंग पर नमूना।
- अशेष उपयुक्त संख्या में 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में ऊपर मिश्रण का 1 मिलीलीटर और के लिए 5000 XG पर नीचे स्पिन4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट।
- Centrifugation के बाद, सतह पर तैरनेवाला हटाने और गोली त्यागें।
- फ़िल्टर 0.22 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से सतह पर तैरनेवाला बाँझ और एक साफ microcentrifuge ट्यूब में इकट्ठा।
नोट: छानना के बाँझपन लेग अगर पर चढ़ाना और तरल मीडिया inoculating द्वारा परीक्षण किया है। - भविष्य में उपयोग के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर थूक सतह पर तैरनेवाला स्टोर।
नोट: थूक से कई रोगियों को भी छानने के बाद जमा किया जा सकता है। - का उपयोग करने के लिए, पतला थूक छानना 1/10 वी / वी वांछित मीडिया में (थूक के 100 μl, मीडिया के 900 μl) पहले।
नोट: यहाँ, मानक Lysogeny शोरबा (पौंड) मीडिया का इस्तेमाल किया गया था।
Biofilm गठन के लिए 3. संभाग coverglass विधि
- मिलाते (200 आरपीएम) के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर वांछित मीडिया में दिलचस्पी रात भर के जीवाणु को अलग हो जाना।
नोट: विभिन्न जीवाणुओं की एक नंबर का इस्तेमाल कर रहे थे, नैदानिक आइसोलेट्स सहित Pseudomonas aeruginosa, स्ताफ्य्लोकोच्चुस,Burkholderia cepacia जटिल और Achromobacter xylosoxidans। मीडिया की च्वाइस तनाव और ब्याज की स्थिति, हालांकि लेग मीडिया प्रारंभिक प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है पर निर्भर करता है। - रातोंरात संस्कृति से, ताजा मीडिया के 4 मिलीलीटर में संस्कृति के 40 μl जगह और मिलाते (200 आरपीएम) लगभग 0.5 के 600 एनएम (600 आयुध डिपो) में एक ऑप्टिकल घनत्व के साथ एक संस्कृति को प्राप्त करने के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 3-4 घंटे के लिए हो जाना -0.6।
- 10% थूक छानना के साथ या (नियंत्रण) के रूप में थूक छानना बिना वांछित मीडिया में 1/5 के लिए 3.2 कदम से संस्कृति पतला। थूक छानना के अन्य एकाग्रता का परीक्षण किया जा सकता है (यानी, 50% या 100%)।
- स्लाइड कक्षों के कुओं बीज के लिए कमजोर पड़ने के 200 μl का प्रयोग करें।
- बैक्टीरिया मिलाते हुए बिना 37 डिग्री सेल्सियस से कम 4 घंटे के लिए संलग्न करने के लिए अनुमति दें।
- 4 घंटे के बाद, मीडिया को हटाने और धीरे 1x ताजा मीडिया के साथ biofilm धो लें। 200 μl ताजा मीडिया के साथ बदलें।
ध्यान दें: fres biofilm पर थूक के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए,ज मीडिया थूक सतह पर तैरनेवाला शामिल करना चाहिए। - biofilms समय के वांछित राशि के लिए माइक्रोस्कोपी के लिए समय तक, मिलाते हुए बिना 37 डिग्री सेल्सियस पर विकसित करने के लिए, कपड़े धोने के बिना मीडिया हर 12 घंटे की जगह की अनुमति दें।
नोट: biofilm एंटीबायोटिक संवेदनशीलता पर थूक supernatants के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए, एंटीबायोटिक दवाओं मीडिया biofilm विकास के 24 घंटा के बाद से जुड़ जाते हैं और धुंधला हो जाना और biofilms के इमेजिंग जब तक मीडिया में रखा जाता है।
4. धुंधला Biofilms और confocal माइक्रोस्कोपी
- वांछित वृद्धि समय (24-48 घंटा सबसे अच्छा काम करता है) के बाद, चैम्बर कुओं से मीडिया को हटाने और धीरे बाँझ पीबीएस के 300 μl के साथ दो बार प्रत्येक कक्ष धो लें।
- समाधान के प्रत्येक मिलीलीटर की जरूरत के लिए (व्यवहार्यता किट में प्रदान की) हर रंग की 1 μl मिश्रण से biofilm के लिए धुंधला मिश्रण तैयार करें। पानी या मीडिया समाधान में डाई बनाओ।
नोट: जल निर्माता से सिफारिश की है। - संभाग covergla के प्रत्येक अच्छी तरह से डाई मिश्रण के 200 μl जोड़ेएस एस और 45 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं, अंधेरे में।
- कक्षों से धुंधला मिश्रण निकालें और बाँझ पीबीएस के 300 μl के साथ अच्छी तरह से प्रत्येक धो लें। पीबीएस निकालें और ताजा पानी या मीडिया के साथ बदलें।
- confocal माइक्रोस्कोपी के माध्यम से biofilms के दृश्य के साथ आगे बढ़ें।
5. confocal माइक्रोस्कोपी के साथ Biofilms Visualizing
- तुरंत (1 घंटा के भीतर) धुंधला के बाद कक्षों में दाग biofilms पढ़ें। एक बार में 2 8 अच्छी तरह से कक्षों को 1 धुंधला द्वारा स्लाइड्स के दृश्य में देरी को कम।
- अधिग्रहण के लिए उत्तेजना और फिल्टर सेट के लिए लेज़रों के साथ confocal खुर्दबीन का उपयोग इमेजिंग प्रदर्शन।
नोट: यहाँ, वर्णक्रमीय बोरेलिस लेज़रों के साथ कताई डिस्क confocal प्रणाली (ग्रीन: 491nm, लाल: 561 एनएम) उत्तेजना के लिए इस्तेमाल किया गया। उत्सर्जन फिल्टर 515/40 और 624/40 के सेट biofilm व्यवहार्यता किट से दाग कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया गया। - कैमरा के साथ confocal खुर्दबीन पर एक 25x पानी उद्देश्य का उपयोग कर छवियों ले लो।
- प्रत्येक अच्छी तरह से 3-5 छवियों ले लो।
नोट: इस प्रकार एक 8 अच्छी तरह से संभाग coverglass के लिए, 24-40 छवियों उत्पन्न हो जाएगा। - विश्लेषण के लिए छवियों को बचाओ।
नोट: छवियों के रूप में OME-झगड़ा फ़ाइलें COMSTAT 18,19 का उपयोग कर विश्लेषण किया जा बचाया जाना चाहिए। biofilm छवि विश्लेषण के लिए निर्देश http://www.comstat.dk/ पर पाया जा सकता है। एक बार छवियों को आयात कर रहे हैं, इस तरह की औसत मोटाई, बायोमास और प्रत्येक चैनल (लाल और हरा) के लिए सतह कवरेज के रूप में मानकों का विश्लेषण किया जा सकता है।
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Representative Results
प्रयोग के समग्र डिजाइन चित्र 1 में प्रतिनिधित्व किया है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग समय के विभिन्न अवधियों (जैसे, 24, 48 या 72 घंटा) के लिए हो biofilms में परिवर्तन कल्पना करने के लिए एक सुविधाजनक तरीका प्रदान करता है। महत्वपूर्ण बात है, इस तरह के थूक filtrates रूप बहिर्जात संकेतों, biofilm विकास में परिवर्तन कल्पना करने के लिए जोड़ा जा सकता है। चित्रा 2 में देखा जाता है, 10% थूक filtrates की उपस्थिति biofilm की वास्तुकला (2A चित्रा, कम पैनल) को बदल सकते हैं। 16 इन छवियों COMSTAT सॉफ्टवेयर का उपयोग कर biofilm की औसत मोटाई, कुल बायोमास और सतह कवरेज सहित प्रमुख biofilm matrices, प्राप्त करने के लिए विश्लेषण किया जा सकता है। यह (3 आंकड़े 2 बी, और) biofilm मोटाई में एक समग्र वृद्धि में परिलक्षित होता है। 16 मौजूदगी थूक में biofilms पर एंटीबायोटिक दवाओं के प्रभाव में 3 चित्र में दिखाया गया है। द्वारा visuali biofilm विकास में परिवर्तन Zing, एक बेहतर कैसे विभिन्न कारकों जैसे क्रिस्टल बैंगनी धुंधला के रूप में पारंपरिक biofilm assays, की तुलना में काफी बेहतर हद तक, biofilm विकास को प्रभावित कर सकते हैं सराहना कर सकते हैं।
चित्रा 1: प्रयोग के समग्र डिजाइन। बुनियादी प्रोटोकॉल का आरेख प्रवाह। एक रात में (ओ / एन) संस्कृति 1 / 1,000 पतला और एक अंतिम आयुध डिपो के 600 0.5 करने के लिए विकसित करने के लिए अनुमति दी है। संभाग coverglass के कुएं में वरीयता प्राप्त और 3-4 घंटे के लिए संलग्न करने के लिए अनुमति दी है यह आगे 1/1000 और 200 μl पतला है। इस के बाद, मीडिया हटा दिया है और ताजा मीडिया के साथ बदल दिया है। Biofilms वांछित समय के लिए विकसित करने के लिए अनुमति दी जाती है। मीडिया, बहिर्जात उत्पादों या एंटीबायोटिक दवाओं biofilms करने के लिए जोड़ा जा सकता है। वृद्धि के बाद, मीडिया निकाल दिया जाता है, biofilms दाग रहे हैं और confocal इमेजिंग किया जाता है।ge.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2: थूक filtrates को प्रदर्शन के बाद biofilm विकास की छवियों प्रतिनिधि। (ए) 10% थूक filtrates (कम पैनल) biofilm व्यवहार्यता किट के साथ धुंधला द्वारा पीछा की उपस्थिति में Burkholderia cepacia परिसर के प्रतिनिधि छवियाँ (बीसीसी) लड़का (शीर्ष पैनल) मीडिया के साथ संभाग coverglass में विकास की 48 घंटा निम्न नैदानिक वियोजन या। 1 पैमाने इकाई 19.68 माइक्रोन प्रतिनिधित्व करते हैं। (बी - सी) वियोजन (बी) और मृतकों की औसत मोटाई: बीसीसी के कई चित्र का जीना अनुपात (सी) के अभाव में स्लाइड कक्षों में 48 घंटा (सफेद सलाखों) या उपस्थिति (काली सलाखों) के थूक filtrates के लिए हो आइसोलेट्स। प्रत्येक बार साजिश रची 45 छवियों का मतलब का प्रतिनिधित्व करता हैमतलब की मानक त्रुटि के साथ। ** पी <0.001 नियंत्रण (मीडिया अकेले) Kruskal वालिस परीक्षण का उपयोग करने के लिए की तुलना में। कैनेडी एट अल से अनुकूलित चित्रा। 16 यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 3: थूक छानना से अवगत कराया biofilms पर एंटीबायोटिक उपचार के प्रतिनिधि छवियाँ। (ए) Burkholderia vietnamiensis नैदानिक वियोजन की छवियाँ अकेले मीडिया (बाएं) के साथ संभाग coverglass में या के साथ या बिना tobramycin के 1000 माइक्रोग्राम / एम 10% थूक filtrates (दाएं) की उपस्थिति में विकास के 48 घंटे के बाद। Biofilms अकेले मीडिया में 24 घंटे के लिए बड़े हो रहे थे या मीडिया 10% (वी / वी) थूक filtrates के साथ पूरक। 24 घंटे के बाद, मीडिया हटा दिया गया था और दवा के साथ प्रतिस्थापितएक (+/- थूक) एंटीबायोटिक दवाओं युक्त। 1 पैमाने इकाई 19.68 माइक्रोन प्रतिनिधित्व करते हैं। (बी - सी) वियोजन (बी) और मृतकों की औसत मोटाई: एकाधिक छवियों का जीना अनुपात (सी) (एन = 9) बी vietnamiensis के अभाव या थूक filtrates की उपस्थिति में स्लाइड कक्षों में 48 घंटे के लिए उगाया आइसोलेट्स। प्रत्येक बार 45 छवियों मतलब की मानक त्रुटि के साथ साजिश रची का मतलब प्रतिनिधित्व करता है। ** पी <0.001 नियंत्रण (0 माइक्रोग्राम / एमएल) Kruskal वालिस परीक्षण का उपयोग करने के लिए की तुलना में। कैनेडी एट अल से अनुकूलित चित्रा। 16 यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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Discussion
तरीकों यहाँ बताया बहिर्जात उत्पादों की उपस्थिति में हो बैक्टीरियल biofilms के दृश्य के लिए अनुमति देते हैं। आश्चर्य नहीं कि exoproducts का उत्पादन जब इस प्रकार की प्रणाली का उपयोग करते हुए महत्व का है। उदाहरण के लिए, dithiothreitol (डीटीटी), अक्सर मानव थूक के नमूने पर नमूने दव्र मदद करने के लिए प्रयोग किया जाता है। हालांकि, अकेले डीटीटी का असर biofilm विकास और व्यवहार्यता कम कर सकते हैं (डेटा) नहीं दिखाया। इस प्रकार, सभी स्थितियों के लिए उचित नियंत्रण जरूरी हैं। इसके अलावा, मानव थूक उत्पादों के अलावा तथ्य यह प्रत्येक रोगी के बलगम एक अनूठा Microbiome है की वजह से प्रयोग पर निहित परिवर्तनशीलता बनाता है। इस के लिए समायोजित करने के लिए, हम जमा बलगम के नमूने का इस्तेमाल किया है रोगी विशिष्ट परिणामों से बचने के लिए। इसके अतिरिक्त, उचित मीडिया के चुनाव महत्वपूर्ण है जब किसी भी मॉडल प्रणाली का उपयोग कर रहा है। इरादा जीव की biofilm विकास के लिए मानक मीडिया प्रणाली के प्रारंभिक सेटअप के लिए सिफारिश कर रहे हैं। प्रयोग के लक्ष्य के अध्यक्ष के लिए हैify कैसे बहिर्जात उत्पादों biofilm गठन को प्रभावित कर रहे हैं, एक पोषक तत्व अमीर मीडिया है कि पर्याप्त biofilm गठन प्रदान करता है सुझाव दिया है। जबकि निर्धारण कैसे बहिर्जात कारकों biofilm प्रभावित कर सकता है इस विकास के लिए पर्याप्त पोषण की अनुमति देगा। इस तरह के कम से कम या परिभाषित मीडिया के रूप में अन्य मीडिया, बेहतर नकल कुछ शर्तों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। अन्य मीडिया इस प्रणाली में अच्छे परिणाम के साथ इस्तेमाल किया गया है (डेटा) नहीं दिखाया। संभाग coverglass को biofilms की कुर्की मजबूत जब हटाने / मीडिया जोड़ने या biofilms के कदम धोने biofilms में खलल न डालें रोकने के दौरान होता है, लेकिन महान ध्यान रखा जाना चाहिए।
निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार जीवित मृत दाग का उपयोग प्रणाली का वर्णन के लिए अच्छे परिणाम प्राप्त हुए है। कारकों की एक संख्या छवियों के प्रतिदीप्ति अनुपात, हालांकि, इस पद्धति क्या छवि में मनाया जाता है से संबंधित होना चाहिए (बैक्टीरिया की डाई तेज, biofilm और डिटेक्टर लाभ सेटिंग्स के सापेक्ष घनत्व सहित) को प्रभावित कर सकतेएस। अन्य उपायों में इस तरह के biofilm में कुल बायोमास वर्तमान (COMSTAT से निकाली गई के रूप में) के अनुपात के रूप में मृत कोशिकाओं से बायोमास के रूप में मृत / लाइव biofilm, के रिश्तेदार राशि का प्रतिनिधित्व करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। बैक्टीरियल गिनती का उपयोग दोहराया प्रयोगों में biofilm व्यवहार्यता पुष्टि करने के लिए इस मॉडल का दृश्य टिप्पणियों पुष्टि करने के लिए सिफारिश की है। biofilms के निहित विविधता के कारण, प्रत्येक कक्ष और कई कक्षों से एकाधिक छवियों को एक प्रयोग में हर हालत के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए। यह लागत और इन प्रयोगों की अवधि के लिए कहते हैं।
छवियों के अधिग्रहण के इन प्रयोगों से डेटा का विश्लेषण करने से पहले जरूरी है। देखभाल पर छवियों तर नहीं लिया जाना चाहिए और जब माइक्रोस्कोप सेटअप का निर्धारण। आवश्यक विस्तार के स्तर और माइक्रोस्कोप उपलब्ध के आधार पर, विभिन्न उद्देश्यों (10X, 25X, 40X और 63X) के एक नंबर, छवियों को प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, हालांकि हम पाते हैं कि 25X उद्देश्य बेहतर छवियों देता है। टी की मोटाईवह जेड ढेर भी समग्र छवि गुणवत्ता और विस्तार के स्तर को प्रभावित कर सकते हैं। हर 0.5-1 माइक्रोन लिया छवियों होने 25X उद्देश्य पर स्पष्ट छवियों प्रदान करने के लिए, एक आकार है कि मानक कंप्यूटर सिस्टम पर COMSTAT द्वारा विश्लेषण किया जा सकता है पर जेड ढेर छवियों रखते हुए लगता है।
इन प्रयोगों और अधिक महंगा है और समय अन्य लगाव assays की तुलना में काफ़ी हैं, और एक उच्च throughput ढंग से नहीं किया जा सकता है। इस प्रक्रिया में, बैक्टीरिया एक borosilicate सतह है, जो एक विवो हालत को प्रतिबिंबित नहीं है और biofilm गठन और विकास को प्रभावित कर सकता को देते हैं। हालांकि, वे अतिरिक्त जानकारी प्रदान और एंटीबायोटिक प्रतिरोध और exogenous संकेत करने के लिए शारीरिक प्रतिक्रिया biofilm से संबंधित तंत्र के लिए परिकल्पना उत्पन्न कर सकते हैं। प्रयोग के लक्ष्य को समझने के लिए कैसे biofilms, विभिन्न कारकों के जवाब में बदलने के बजाय उदाहरण के लिए उच्च throughput तरीकों का उपयोग कर विरोधी biofilm यौगिकों की पहचान की तुलना में है, तो अतिरिक्त जानकारी टी का उपयोग कर प्राप्त कीउनकी तकनीक विधि सार्थक बनाता है। इस प्रकार वर्तमान पद्धति ऐसे क्रिस्टल बैंगनी परख, जो सबसे अधिक biofilms अध्ययन करने के लिए प्रयोग किया जाता है के रूप में पिछले सीमित लगाव assays पर एक महत्वपूर्ण प्रगति है।
इस प्रक्रिया के लिए महत्वपूर्ण कदम शामिल हैं: 1) गिरावट से बचने के थूक के नमूनों की समय पर प्रसंस्करण सुनिश्चित करना; 2) biofilms पर मीडिया में परिवर्तन के साथ कोमल biofilm के व्यवधान से बचने के लिए किया जा रहा है और 3) biofilm गठन की विविधता के कारण biofilm इमेजिंग के दोहराया माप कर रही biofilm मोटाई का सही प्रतिनिधित्व सुनिश्चित करने के लिए।
एक बार इस प्रणाली सेट अप है एक दिया बैक्टीरियल प्रजातियों के लिए, एक कई नैदानिक वियोजन पर बहिर्जात कारकों के प्रभाव सहित विभिन्न शर्तों के एक नंबर का परीक्षण कर सकते हैं। इस प्रणाली मानव थूक 16 से अवगत कराया biofilms पर एंटीबायोटिक दवाओं के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए और उच्च प्रतिरोधी और intermediately प्रतिरोधी नैदानिक वियोजन तुलना करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। ऐसे mucin या कोलेजन सूक्ष्म पाड़ (जैसे, puracol) के साथ नीचे कोटिंग के रूप में संभाग coverglass करने के लिए 17 संशोधन,, आगे संभव प्रयोगों की रेंज का विस्तार कर सकते हैं। यह इस तरह के उपकला कोशिकाओं और बैक्टीरिया, या अलग अलग प्रजातियों के जीवाणु के बीच के बीच उन लोगों के रूप में प्रत्यक्ष बातचीत, अध्ययन करने के लिए इस प्रणाली के अनुकूल करने के लिए संभव हो सकता है। यह मॉडल Jurcisek एट अल द्वारा वर्णित का एक विस्तार है। 20 विधि स्लाइड चैम्बर वृद्धि की है कि यहाँ वर्णित और दृश्य करने से पहले biofilms ठीक करने के लिए formalin का उपयोग करता है के लिए इसी तरह का उपयोग करता है। वैकल्पिक रूप से, इस विधि में हम तुरंत धुंधला के बाद biofilms कल्पना और एक लगानेवाला का उपयोग नहीं करते। इसके अलावा, हम बहिर्जात कारकों biofilms पर एंटीबायोटिक के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए जोड़ें। यह मॉडल इस प्रकार संभावित काफी मानव रोग में बैक्टीरिया biofilms के बारे में हमारी समझ को आगे बढ़ाने के लिए किया है।
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Disclosures
कोई नहीं।
Acknowledgments
टीबी सिस्टिक फाइब्रोसिस कनाडा से एक रिसर्च फैलोशिप मानता है।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lab-Tek II Chambered coverglass, #1.5 borosilicate, 8-well | Thermo Sicher Scientific | 155409 | |
| Filmtracer Live/Dead Biofilm Viabilty Kit | Thermo Fisher Scientific | L10316 | |
| Blood agar plates | Thermo Fisher Scientific | R10215 | Confirming viability via CFU counts or selecting colonies for innoculation |
| COMSTAT | Availble software online | COMSTAT is software to analyze biofilm images. Available www.comstat.dk | |
| Millers LB Broth | Thermo Fisher Scientific | 12780-052 | Standard media for overnight gowth/biofilm growth |
| Millex-GV Syringe Filters | Millipore | SLGV013SL | Filtering of sputum supernants |
| Phosphate Buffered Saline (Dulbecco A) | Oxoid | BR0014G | Washing of biofilm chambers after media removal |
| Zeiss AxioVert 200M | Carl Zeiss | ||
| Hamamatsu C9100-13 EM-CCD | QS Technologies Inc. | ||
| Spectral Borealis | Qs Technologies Inc. | ||
| Perkin Elmer Volocity | QS Technologies Inc. | Instructions for this software can be found at: http://cellularimaging.perkinelmer.com/pdfs/manuals/VolocityuserGuide.pdf |
References
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