Abstract
Os biofilmes consistem de grupos de bactérias embebidas em uma matriz auto-secretado. Eles desempenham um papel importante na contaminação industrial, bem como no desenvolvimento e persistência de muitas infecções relacionadas com a saúde. Um dos biofilmes mais bem descrita e estudada em doenças humanas ocorre na infecção pulmonar crónica de pacientes com fibrose cística. Ao estudar biofilmes no contexto do hospedeiro, muitos factores que podem influenciar a formação e desenvolvimento de biofilme. A fim de identificar como factores do hospedeiro pode afetar a formação de biofilme e desenvolvimento, foi utilizado um método lamela chambered estática para crescer biofilmes na presença de fatores derivados do hospedeiro na forma de sobrenadantes de escarro. As bactérias são semeadas em câmaras e expostos a filtrados de expectoração. Na sequência de 48 horas de crescimento, os biofilmes estão manchadas com um kit de viabilidade de biofilme comercial antes da microscopia confocal e análise. Após a aquisição das imagens, as propriedades do biofilme pode ser avaliada através de diferentes plataformas de software.Este método nos permite visualizar as propriedades fundamentais do crescimento do biofilme na presença de diferentes substâncias, incluindo antibióticos.
Introduction
biofilmes bacterianas são grupos de microrganismos que estão ligados uns aos outros e incorporados numa matriz auto-secretado. 1,2 Classicamente, eles representam bactérias fisicamente ligados a uma superfície abiótica ou biótico formado sob condições de fluxo. Os biofilmes também têm sido mostrados para crescer em condições estáticas (ausência de fluxo) e distal de superfícies, tais como na interface ar-líquido de piscinas termais ou películas formadas nos tubos de ensaio. Estes biofilmes têm sido reconhecidos no meio ambiente e são um grande prejuízo para processos industriais, como eles podem se formar em reservatórios de água ou em tubos, resultando em biofouling, corrosão e entupimentos. 3,4
Os biofilmes também são críticas em ambientes de cuidados de saúde, como têm sido mostrado estar envolvidas em infecções relacionadas com cateteres, infecções pulmonares em doentes com fibrose cística, bem como em numerosas outras infecções. 5,6 Uma das marcas de infecções biofilme é a devincado susceptibilidade das bactérias aos antibióticos e auditivos depuração pelo sistema imune inato. 7-9 O mais bem estudadas, cenários clinicamente relevantes envolvendo infecção baseada biofilme ocorre em pacientes com fibrose cística (FC), que estão cronicamente infectados com biofilmes de Pseudomonas aeruginosa. P. aeruginosa podem ser submetidos a uma série de alterações durante o estabelecimento da infecção crónica que tornam muito difíceis de tratar. 10,11 biofilmes pode diferencialmente ativar a imunidade inata e conduzir a inflamação. 12-14 Como estas infecções levar ao aumento da morbidade e mortalidade em pacientes com FC, é crucial para entender fatores que podem afetar o desenvolvimento do biofilme neste contexto.
Um estudo recente sugere que hospedeiras-factores são importantes na formação de agregados de biofilme de P. aeruginosa. 15 Estes biofilmes contribuir para a redução da susceptibilidade aos antibióticos e os mecanismos de defesa do hospedeiro. o preseNCE de factores derivados do hospedeiro, tais como a elastase de neutrófilos, assim como produtos secretados a partir de microrganismos presentes no pulmão CF, tem o potencial de modular significativamente a formação de biofilme e de desenvolvimento. 16 Além disso, os biofilmes interagir com o hospedeiro para modular a expressão de numerosos caminhos e iniciar a inflamação. Enquanto os métodos de alto rendimento, tal como o ensaio de violeta de cristal padrão, podem fornecer alguma informação no que diz respeito ao processo de biofilme, a visualização do biofilme em resposta a estes factores proporcionam mais informação em profundidade.
Nesse artigo, nós descrevemos um método para a utilização de factores de expectoração de pacientes com FC para estudar o desenvolvimento de biofilmes in vitro. Este método permite a rápida visualização de biofilme expostos a expectoração contendo factores do hospedeiro, utilizando um kit comercial viabilidade do biofilme. Esta técnica pode ser usada para identificar visualmente as alterações que ocorrem durante o crescimento de biofilme, na presença de exógenonos produtos, e representa um método melhorado para analisar as alterações no desenvolvimento de biofilme sob várias condições.
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Protocol
Note-se que Conselho de Ética em Pesquisa (REB) é necessário para coletar e armazenar amostras de escarro de seres humanos. Esses estudos foram aprovados pelo Hospital para Crianças Doentes REB # 1000019444.
1. preparação de amostras de expectoração CF
- Recolher amostra de escarro de pacientes durante as visitas de rotina à clínica fibrose cística e manter em gelo.
- Transporte de amostra de escarro no gelo dentro da primeira hora da coleta, para o laboratório de pesquisa, submeter-se a tratamento.
2. escarro Processing
- Registrar o volume da amostra de expectoração obtidos. Adicionar salina tamponada com fosfato (PBS) para 2x o volume da amostra (isto é, 2 partes de PBS, uma parte de amostra).
- Misturar a amostra bem com uma pipeta de transferência. Vortex da amostra na potência máxima por 1 min para misturar completamente.
- Aliquota de 1 ml da mistura acima referida sobre o número 1,5 ml tubos de microcentrífuga adequadas e girar a 5000 xg durante20 min a 4 ° C.
- A seguir à centrifugação, o sobrenadante remover e descartar o sedimento.
- Filtrar esterilizar o sobrenadante através de um filtro de 0,22? M e recolher num tubo de microcentrífuga limpo.
NOTA: A esterilidade do filtrado é testado por plaqueamento em LB agar e inocular meio líquido. - Armazenar o sobrenadante expectoração a -80 ° C para uso futuro.
NOTA: O escarro de vários pacientes também podem ser agrupados seguindo filtração. - Antes de utilizar, dilui-se expectoração filtrado 10/1 v / v (100 ul de expectoração, a 900 ul de meio), em meio desejado.
NOTA: Aqui, foi utilizado caldo lysogeny padrão (LB) de mídia.
3. Chambered Método lamela para formação de biofilme
- Cresça isolado bacteriano de interesse durante a noite em meio desejado a 37 ° C com agitação (200 rpm).
Nota: Um número de bactérias diferentes foram usados, incluindo isolados clínicos Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus,Complexo Burkholderia cepacia e Achromobacter xylosoxidans. Escolha dos meios depende tensões e condições de interesse, no entanto meio LB podem ser utilizados em experiências iniciais. - A partir da cultura durante a noite, colocar 40 mL de cultura em 4 ml de meio fresco e crescer durante 3-4 horas a 37 ° C com agitação (200 rpm) para se obter uma cultura com uma densidade óptica a 600 nm (OD600) de cerca de 0,5 -0.6.
- Dilui-se a cultura a partir do passo 3.2 a 1/5 na mídia desejada com 10% filtrado escarro ou sem filtrado escarro (como controle). Outros concentração do filtrado expectoração pode ser testado (isto é, 50% ou 100%).
- Utilizar 200 ul da diluição para semear poços das câmaras de deslizamento.
- Permitir que as bactérias aderir durante 4 h a 37 ° C sem agitação.
- Após 4 horas, remova a mídia e lavar cuidadosamente o biofilme por meio fresco 1x. Substitua por 200 mL de mídia fresco.
NOTA: Para estudar os efeitos do escarro no biofilme, os fresh mídia deve conter escarro sobrenadante. - Permitir biofilmes a crescer para a quantidade desejada de tempo a 37 ° C sem agitação, substituindo todos os meios de comunicação 12 horas, sem a lavagem até que o tempo para microscopia.
NOTA: Para estudar o efeito de sobrenadantes de escarro na susceptibilidade aos antibióticos biofilme, os antibióticos são adicionados à mídia após 24 horas de crescimento do biofilme e são mantidos nos meios de comunicação até a coloração e imagens de biofilmes.
4. Os biofilmes de coloração e microscopia confocal
- Seguindo tempo de crescimento desejado (24-48 h, funciona melhor), remova a mídia de poços de câmara e lavar cuidadosamente cada câmara duas vezes com 300 ul de PBS estéril.
- Prepare a mistura de coloração de biofilme por mistura de 1 mL de cada corante (fornecido no kit de viabilidade) por cada ml de solução necessário. Fazer a tintura em água ou meios solução.
NOTA: A água é recomendado pelo fabricante. - Adicionar 200 ul de mistura de corante a cada cavidade de covergla septadasSS e incubar à temperatura ambiente, no escuro, durante 45 min.
- Remover mistura de coloração das câmaras e lavagem de cada poço com 300 ul de PBS estéril. Remover PBS e substituir com água doce ou de mídia.
- Proceda com visualização de biofilme através de microscopia confocal.
5. Visualizando biofilmes com microscopia confocal
- Leia biofilmes manchado em câmaras imediatamente após a coloração (dentro de 1 hora). Minimizar atraso na visualização das lâminas por coloração de 1 a 2 câmaras de 8 poços de cada vez.
- Realizar imagem usando microscópio confocal com lasers para excitação e filtros de conjuntos para a aquisição.
NOTA: Aqui, o sistema confocal disco giratório com lasers borealis espectrais (verde: 491nm, Vermelho: 561 nm) foram utilizados para a excitação. conjuntos de filtros de emissão de 515/40 e 624/40 foram usadas para visualizar as manchas do kit de viabilidade do biofilme. - Captar imagens utilizando uma objectiva de água 25X no microscópio confocal com câmera.
- Tome 3-5 imagens de cada poço.
NOTA: Assim, para um 8 lamela bem câmaras, serão gerados 24-40 imagens. - Salvar imagens para análise.
NOTA: As imagens devem ser salvas como arquivos OME-TIFF a ser analisado usando COMSTAT 18,19. Instruções para a análise de imagem do biofilme pode ser encontrada em http://www.comstat.dk/. Uma vez que as imagens são importadas, parâmetros como a espessura média, biomassa e cobertura de superfície para cada canal (vermelho e verde) podem ser analisados.
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Representative Results
A concepção geral da experiência está representada na Figura 1. A utilização deste protocolo fornece um método conveniente para visualizar as alterações em biofilmes cultivadas por diferentes períodos de tempo (por exemplo, 24, 48 ou 72 horas). Importante, sinais exógenos, tais como expectoração filtrados, pode ser adicionado para visualizar as alterações no desenvolvimento de biofilme. Como pode ser visto na Figura 2, a presença de 10% filtrados expectoração pode alterar a arquitetura do biofilme (Figura 2A, painéis inferiores). 16 Estas imagens podem ser analisados usando o software COMSTAT obter matrizes de biofilme chave, incluindo a espessura média do biofilme, da biomassa total e a cobertura de superfície. Isso se reflete em um aumento global da espessura do biofilme (Figuras 2B e 3). 16 Os efeitos dos antibióticos sobre os biofilmes na presença de expectoração é mostrado na Figura 3. por visuali zing as alterações no desenvolvimento de biofilme, uma pode melhor apreciar como os diferentes factores que podem afectar o crescimento do biofilme, a uma extensão muito melhor do que os ensaios de biofilme tradicionais, tais como a coloração com violeta de cristal.
Figura 1: Concepção global do experimento. Diagrama de fluxo de protocolo básico. Um (S / N) durante a noite a cultura é diluída 1 / 1.000 e deixadas a crescer até uma OD final de 600 de 0,5. Isto é ainda mais diluída a 1 / 1.000 e 200 ul é semeadas em poço de lamela septadas e deixadas a aderir durante 3-4 h. Seguindo este, o meio é removido e substituído com meio fresco. Os biofilmes são deixadas a crescer durante tempo desejado. Meios, os produtos exógenos ou os antibióticos podem ser adicionados aos biofilmes. Após o crescimento, o meio é removido, os biofilmes são coradas e imagem confocal é realizada.ge.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Imagens representativas do desenvolvimento de biofilme após a exposição a filtrados de escarro. (A) Imagens representativas de complexo Burkholderia cepacia (BCC) isolados clínicos seguintes 48 h de crescimento em lamela septadas com meio sozinho (painéis superiores) ou na presença de 10 filtrados% expectoração (painéis inferiores), seguido por coloração com kit de viabilidade do biofilme. 1 unidade de escala representam 19,68 m. (B - C) Espessura média de isolados (B) e mortos: razão ao vivo (C) de múltiplas imagens de BCC isolados cultivada por 48 horas em câmaras de slides na ausência (barras brancas) ou na presença (barras pretas) do escarro filtrados. Cada barra representa a média de 45 imagens traçadascom o erro padrão da média. ** P <0,001 em relação ao controle (media só) por meio do teste de Kruskal-Wallis. Figura adaptada de Kennedy et ai. 16 Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Imagens representativas de tratamento antibiótico em biofilmes expostos ao filtrado expectoração. (A) Imagens de isolados clínicos de Burkholderia vietnamiensis seguinte de 48 horas de crescimento em lamela septadas com meio sozinho (esquerda) ou na presença de 10% de expectoração filtrados (direito) com ou sem 1000 ug / m de tobramicina. Os biofilmes foram cultivadas durante 24 horas em meio sozinho ou meio suplementado com 10% (v / v) de expectoração filtrados. Após 24 h, o meio foi removido e substituído com Medium (expectoração +/-) contendo antibióticos. 1 unidade de escala representam 19,68 m. (B - C) Espessura média dos isolados (B) e mortas: relação ao vivo (C) de várias imagens (n = 9) de B. vietnamiensis isolados cultivadas durante 48 h em câmaras de deslizamento na ausência ou na presença de expectoração filtrados. Cada barra representa a média de 45 imagens traçadas com o erro padrão da média. ** P <0,001 comparado com o controlo (0 ng / ml) utilizando o teste de Kruskal-Wallis. Figura adaptada de Kennedy et ai. 16 Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Os métodos aqui descritos permitem a visualização de biofilmes bacterianas cultivadas na presença de produtos exógenos. Não surpreendentemente, a produção dos exoproducts é de importância quando se utiliza este tipo de sistema. Por exemplo, ditiotreitol (DTT), é frequentemente utilizado em amostras de saliva humana para ajudar a liquefazer as amostras. No entanto, o efeito do DTT sozinho pode diminuir o desenvolvimento do biofilme e a viabilidade (dados não mostrados). Assim, controles adequados para todas as condições são necessárias. Além disso, a adição dos produtos da saliva humana cria variabilidade inerente na experiência devido ao fato de que a expectoração de cada doente tem uma microbiota original. Para ajustar para isso, temos usado amostras de escarro em pool para evitar resultados específicos de pacientes. Além disso, a escolha de meios de comunicação apropriada é importante quando se utiliza qualquer sistema modelo. meios convencionais para o crescimento do biofilme do organismo a que se destinam são recomendados para a configuração inicial do sistema. Se o objetivo do experimento é identverificam como os produtos exógenos estão afetando a formação de biofilme, um nutriente rich media que proporciona a formação de biofilme adequada é sugerido. Isto irá permitir que a nutrição suficientes para crescimento, enquanto a determinação como factores exógenos pode afectar o biofilme. Outros meios de comunicação, tais como meios mínimos ou definidos, pode ser usado para certos melhores condições de imitar. Outros meios de comunicação têm sido utilizados com bons resultados neste sistema (dados não mostrados). A fixação dos biofilmes à lamela câmaras é robusto, porém muito cuidado deve ser tomado ao remover / acrescentar mídia ou durante as etapas de lavagem dos biofilmes para evitar perturbar os biofilmes.
O uso do corante directo-mortos de acordo com o protocolo do fabricante tem dado bons resultados para o sistema descrito. Um certo número de factores que podem afectar a taxa de fluorescência das imagens (incluindo a absorção do corante das bactérias, a densidade relativa de configurações de biofilme e ganho do detector), no entanto, este método deve relacionar com o que é observado na imagems. Outras medidas podem ser utilizadas para representar a quantidade relativa de biofilme mortos / ao vivo, tais como a biomassa das células mortas como uma proporção da biomassa total presente no biofilme (como derivado a partir de COMSTAT). Usando as contagens bacterianas para confirmar a viabilidade do biofilme em experiências repetidas é recomendada para confirmar as observações visuais desse modelo. Devido à heterogeneidade inerente de biofilmes, várias imagens de cada uma das câmaras e múltiplas câmaras devem ser usadas para cada condição numa experiência. Isso aumenta o custo ea duração desses experimentos.
A aquisição de imagens é importante, antes da análise dos dados destas experiências. Deve ser tomado cuidado para não saturar imagens e quando a determinação da configuração do microscópio. Dependendo do nível de pormenor exigido e o microscópio disponível, um número de diferentes objectivos (10X, 25X, 40X e 63X) pode ser usada para adquirir imagens, no entanto, descobrimos que objectiva 25X dá melhores imagens. A espessura tele Z-stack também pode afetar a qualidade da imagem global eo nível de detalhe. Tendo em imagens tiradas a cada 0,5-1 mm parece fornecer imagens nítidas em 25X objetivo, mantendo as imagens Z-stack em um tamanho que pode ser analisado por COMSTAT em sistemas de computador padrão.
Estas experiências são mais caros e demorados do que outros ensaios de ligação, e não pode ser feito de um modo de elevado rendimento. Neste procedimento, as bactérias aderem a uma superfície de borossilicato, que não é o reflexo de uma condição in vivo e que podem afectar a formação e desenvolvimento de biofilme. No entanto, eles fornecem informações adicionais e podem gerar hipóteses para mecanismo relacionado com biofilme resistência aos antibióticos e resposta fisiológica ao sinal exógeno. Se o objectivo da experiência é a de compreender como biofilmes mudar em resposta a diferentes factores, em vez de identificar compostos anti-biofilme usando métodos de alto rendimento, por exemplo, a informação adicional obtida usando tsua técnica torna o método de valor. Assim, o método actual é um avanço significativo em relação ensaios de fixação limitados anteriores, tais como o ensaio de violeta de cristal, que é mais vulgarmente utilizado para estudar biofilmes.
As etapas críticas a este procedimento incluem: 1) Assegurar o processamento atempado de amostras de escarro para evitar a degradação; 2) Ser gentil com alterações na mídia sobre os biofilmes para evitar a interrupção do biofilme e 3) Fazer medições repetidas da imagem biofilme para garantir uma representação precisa da espessura do biofilme devido à heterogeneidade da formação de biofilme.
Uma vez que o sistema é configurado para uma determinada espécie bacteriana, pode-se testar uma série de condições diferentes, incluindo os efeitos de factores exógenos em vários isolados clínicos. Este sistema tem sido usado para estudar o efeito dos antibióticos em biofilmes exposto a saliva humana 16 e para comparar os isolados clínicos altamente resistentes e resistentes intermediariamente. 17 Modificações na lamela câmaras, tal como o revestimento da parte inferior com mucina ou colágeno micro-andaime (por exemplo, Puracol), pode estender-se ainda mais a gama de possíveis experiências. Pode ser possível adaptar este sistema para estudar interacções directas, tais como aquelas entre as células epiteliais e bactérias, ou entre diferentes espécies bacterianas. Esta é uma ampliação do modelo descrito por Jurcisek et ai. 20 O método utiliza crescimento câmara de corrediça semelhante ao descrito aqui e utiliza formalina para fixar biofilmes antes de visualização. Alternativamente, neste método visualizamos biofilmes imediatamente após a coloração e não usar um fixador. Além disso, nós adicionamos fatores exógenos para testar o efeito do antibiótico em biofilmes. Este modelo tem assim o potencial para promover consideravelmente a nossa compreensão dos biofilmes bacterianas em doença humana.
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Disclosures
Nenhum.
Acknowledgments
TB reconhece uma bolsa de pesquisa da Fibrose Cística no Canadá.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lab-Tek II Chambered coverglass, #1.5 borosilicate, 8-well | Thermo Sicher Scientific | 155409 | |
| Filmtracer Live/Dead Biofilm Viabilty Kit | Thermo Fisher Scientific | L10316 | |
| Blood agar plates | Thermo Fisher Scientific | R10215 | Confirming viability via CFU counts or selecting colonies for innoculation |
| COMSTAT | Availble software online | COMSTAT is software to analyze biofilm images. Available www.comstat.dk | |
| Millers LB Broth | Thermo Fisher Scientific | 12780-052 | Standard media for overnight gowth/biofilm growth |
| Millex-GV Syringe Filters | Millipore | SLGV013SL | Filtering of sputum supernants |
| Phosphate Buffered Saline (Dulbecco A) | Oxoid | BR0014G | Washing of biofilm chambers after media removal |
| Zeiss AxioVert 200M | Carl Zeiss | ||
| Hamamatsu C9100-13 EM-CCD | QS Technologies Inc. | ||
| Spectral Borealis | Qs Technologies Inc. | ||
| Perkin Elmer Volocity | QS Technologies Inc. | Instructions for this software can be found at: http://cellularimaging.perkinelmer.com/pdfs/manuals/VolocityuserGuide.pdf |
References
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