Abstract
全球变暖和富营养化使一些水生生态系统的行为触发快速和大规模的蓝藻生长为真生物反应器;这有相关的健康和经济后果。许多蓝藻菌株毒素生产者，只有少数细胞是必要的，以诱导对环境造成不可挽回的损失。因此，水体当局和管理部门需要快速，高效提供了可靠的数据来支持他们的预防或治疗的决定早期预警系统。该原稿通过使用抗体微阵列芯片17的抗体（ABS）与分类的分辨率（CYANOCHIP）报告用于在现场检测毒素的蓝藻菌的实验方案。在这里，多重荧光夹心免疫芯片（FSMI）为17株蓝藻同步监测经常发现在淡水生态系统中脱颖而出，他们中的一些毒素生产者，描述。多微阵列PLE相同重复的CYANOCHIP（最多24）被印刷到单个载玻片同时测试了类似的样本数。液体样品可以通过用抗体（ABS）直接培养或通过1〜3微米的过滤器过滤细胞浓度后进行测试。固体样品，如沉积物和地岩石，首先匀浆并通过在孵育缓冲液中的手持式超声发生器分散。然后，他们将被过滤（5 - 20微米）以除去粗料，并将滤液孵育腹肌。免疫反应是由终培养揭示与17荧光标记腹肌的混合物和由便携式荧光检测器被读出。整个过程大约需要3小时，其中大部分是对应于孵化的两个1小时周期。输出的是一个图像，其中亮点对应蓝藻标志物阳性检出。
Introduction
的检测和在复杂的天然微生物群落的微生物的监测在许多领域，包括生物医学，环境生态，天体生物学至关重要。 蓝藻是公知的用于其以形成细胞的繁殖（过度增殖）在淡水能力的原核微生物。它们是普遍存在的，并且许多物种都能够产生毒素，导致不仅对人类健康的潜在危险，同时也向生态影响。在这方面，它是开发的早期检测蓝藻和/或它们在土壤和水中的毒素的快速和灵敏的方法是至关重要的。为了这个目的，多重荧光夹心免疫芯片（FSMI）已经发展成为一个工具，水管理人员，帮助他们做出决策，因此，在实施适当的水管理方案。
的方法的多元化已经发展到检测和识别青色obacterial细胞和藻毒素在土壤和水，包括光学显微镜，分子生物学，和免疫学技术。这些方法可以在所提供的信息相差很大。显微技术是基于细胞形态和体内荧光从蓝藻颜料，如藻蓝蛋白检测或叶绿素a 1。虽然它们是用于实时和频繁的监测快速和廉价的方法是通知有关的类型和样品中存在的蓝藻数目，它们不给有关的潜在毒性信息。此外，它们需要专门知识的一定水平，考虑到它往往是很困难的密切相关的物种2之间进行区分。为了克服这些限制，光镜必须由生物和生物化学筛选测定法和用于藻毒素的鉴定和定量物理化学方法陪同。
基于分子的方法已经应用于数十年来检测，识别和量化蓝藻和其相应的藻毒素由于发表在基因组数据库的序列信息（ 例如，国家生物技术信息中心，NCBI）。在这些方法是那些基于聚合酶链反应（PCR），它需要的套的用于DNA扩增的引物的设计，并取决于不同蓝藻物种的DNA序列的先前知识。虽然基因检测，如藻蓝蛋白操纵子，导致在属的水平准确识别，一些物种或菌株与未被发现此方法。然而，毒素编码基因，如那些属于微囊操纵子，促进毒素的样品中鉴定，其中生产者稀少5。然而，通过PCR检测毒素标记不一定意味着在环境中的毒性。此外，该组的开发来分析样品中存在的蓝藻和毒素生产者物种的整个范围的引物仍是不完整的，和进一步的研究必须完成识别未知物种。其他分子技术非基于PCR的， 如原位杂交（FISH）和DNA微阵列的荧光。
在过去的二十年中，微阵列技术已经获得了重要性在许多应用领域，尤其是在环境监测。 DNA微阵列允许7物种和分析4之间的歧视，6， SUP>，8，9，10，但它们被认为是非常费力和耗时的涉及多个步骤（ 例如，微阵列性能，DNA提取，PCR扩增，以及杂交）的任务。出于这个原因，基于抗体，如夹层和竞争性免疫微阵列费时测定以下，已成为用于检测多个环境样品11，12，13的一个重要且可靠的高通量方法。抗体的能力特异性地识别其靶化合物，并检测少量分析物和蛋白质，以产生针对几乎任何物质的抗体的可能性沿，使抗体微阵列为环境目的的强大技术。此外，实现了多种的能力分析中作为英格尔测定法中，用检测从ppb至ppm的的限制，是本方法14的主要优点之一。
基于抗体的生物传感器已被证明是用于环境监测15，16，17，18，19，20，21的检测范围广泛的病原体和毒素的敏感和快速的工具。而DNA的方法涉及多个步骤，所述基于抗体的微阵列只要求主要是基于在合适的溶液中缓冲一小段裂解步骤的小样品制备。 Delehanty和Ligler 15报告基于能够检测4 ppb的一个的蛋白质浓度的抗体夹心免疫测定的蛋白质和复杂混合物细菌分析物的同时检测ð10 4 CFU /细胞中的溶液。 Szkola 等。 21已经开发proteotoxins和小毒素，化合物的同时检测可能在生物战中使用的廉价而可靠的多重微阵列。他们检测蓖麻毒素的浓度，以检测3 ppb的，在不到20分钟的上限。最近，CYANOCHIP，一种基于微阵列抗体的生物传感器用于原位检测有毒和无毒的蓝藻 ，已经描述了22。该芯片可为潜在的蓝藻水华的鉴定，主要是在水环境中，这是很难辨别微观。检测微阵列的的限制为10 2 - 10 3个细胞的大多数物种，转动该生物传感器为用于多重检测和蓝藻鉴定具有成本有效的工具，即使在种的水平。所有这些特性使antiboDY微阵列技术，尤其是在这项工作中提出的方法中，更快和更简单的方法相比，上述技术。
这项工作提出的使用的抗体微阵列的生物传感器，以检测土壤和水样中蓝藻的存在下的实验的两个例子。它是基于夹心免疫测定形式的简单和可靠的方法，该方法需要非常小的样品体积和非常基本的样品制备。该方法需要很短的时间，并可以在现场容易地进行。
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Protocol
1.免疫原的制备
- 生长在表1所述条件下在相应的培养基中每蓝藻菌株。
注：生长培养基和培养每个蓝藻应变条件列于表1。所有的蓝藻菌株，用K17外，属于从自治大学（马德里，西班牙）安东尼奥的Quesada的基团。针对Planktothrix冬凌草的抗体从Vilasouto水库（西班牙北部）此蓝藻的单特异性绽放的自然样品产生。 - 量化使用细胞计数室通过光学显微镜从晚指数或静止生长期培养得到约10 8个细胞/ mL的细胞的数量。
- 收获细胞从5毫升培养物离心以2,000×g离心5分钟。
- 弃上清，悬浮细胞在10毫升浴缸e为5毫升1×磷酸盐缓冲盐水的（1×PBS）中，以获得约10 8细胞/ mL。
- 均质化和裂解悬浮液通过超声处理的细胞为5个循环，每个30秒，以在冰上-第60暂停30-到，使用一种便携式，手持型超声波处理器或由管浸入的水浴在最大振幅（30 kHz）的细胞破碎。
- 重复步骤1.3 - 1.5蓝藻的每一株。
注：超声产生细胞分裂和细胞内容发布。而蛋白质和多糖是良好的免疫原，具体分子，例如脂类和核酸，不诱发本身体液免疫原性应答。因此，它们必须结合于载体，如多糖或蛋白质，以增加分子的复杂性。此外，超声处理释放可以触发抗体产生细胞内物质。
2.生产多克隆抗体的
- 准备第一IMM通过混合在步骤1.5用0.5ml完全弗氏佐剂所获得的超声波处理细胞裂解液的0.5毫升unogen剂量。它递送给动物设施为多克隆兔抗体产生的操作员。
- 通过混合在步骤1.5与0.5毫升弗氏不完全佐剂所获得的相同匀浆/裂解物的0.5毫升如前制备三个剂量中的抗体生产过程如存储器提升进一步使用。它们给动物设施满足所述抗体的生产过程。
- 重复步骤2.1和2.2为每个新的抗体的产生过程。
注：通常，抗体的产生是委托专门的动物设施或者公司，因为相应的许可和培训要求与动物一起工作。该公司供应存在于血清样品中的抗原特异性抗体的量的相对酶联免疫吸附测定（ELISA）的测量。
3.抗体PURIFication
- 净化的免疫球蛋白G（IgG）的同时从免疫和通过蛋白质A亲和层析在步骤2中收集的免疫前血清级分。一些商业纯化试剂盒的基础上盒系统，做工精良;按照供应商的说明。
- 当纯化试剂盒不提供脱盐系统，无论是通过透析或通过使用离心过滤装置用100 kDa的（或更低）膜的孔径的纯化的抗体的洗脱到0.1X PBS后更改缓冲器。
- 通过测量280nm处的吸光率或通过使用比色的方法，如布拉德福德23，洛瑞24，或二喹啉甲酸（BCA）25确定抗体浓度。
注：重要的是要避免包括在洗脱缓冲液（ 例如，Tris缓冲液），因为它们与抗体竞争结合与环氧基活化的固体表面胺基。经过PUrification，测试用ELISA中抗体活性是重要的。
4.荧光抗体标记
- 通过将含染料用于标记1mg蛋白质的入100微升二甲基亚砜（DMSO）商业小瓶标签在被荧光（ 例如，远红荧光染料）第3获得的纯化的抗体。以2mg / mL的浓度添加溶解的染料各抗体制备的2微升在50微升的在50mM磷酸盐缓冲盐水（pH 8.5）的最终体积。
- 保持在连续搅拌下的标记反应在环境温度下1小时，1200转的振动平台上。
- 纯化通过尺寸排阻色谱的标记的抗体（ 例如，使用凝胶用捕集到柱1.5和30 kDa的之间的分馏范围），以下供应商的建议。
- 测量在280nm的吸光度和在洗脱液650nm和计算拉贝下面供应商的建议玲效率。
注：最多50×50μL的抗体 - 标记反应可以用荧光染料用于标记1mg蛋白质的单一小瓶完成。建议用铝箔覆盖，或者该管，以使用不透明0.5毫升管，以避免步骤4.3之后淬火处理。对于IgG抗体，最佳标记与3-7摩尔每抗体的摩尔染料而实现的。
5. CYANOCHIP生产
- 抗体和控制打印解决方案
- 由每种抗体以1mg / mL的在商业1×蛋白质印刷缓冲器含0.01％（体积/体积）吐温20（一种非离子型清洁剂），所有这些最终浓度混合制备印刷溶液各纯化抗体的30微升。
注意：可替换地，抗体溶液可以含有20％甘油，1％（重量/体积）蔗糖（或海藻糖，作为防腐剂），和0.01％（体积/体积）Tween 20的碳酸盐缓冲液（pH 8.5）。 - 制备印刷溶液作为对照的30微升：（一）1×蛋白质打印缓冲器含0.01％（体积/体积）吐温20，（B）蛋白A纯化的免疫前血清在1毫克/毫升在1×蛋白质打印缓冲器与0.01％（体积/体积）吐温20，和（c）的牛血清白蛋白/（BSA）以1mg含0.01％毫升在1×蛋白印刷缓冲液（v / v）吐温20。
- 制备不同浓度（ 例如，从50微克/毫升至1微克/毫升）在用吐温20 1×蛋白打印缓冲器，如在步骤5.1.1荧光标记的，纯化的免疫前血清的30微升。这些样品将用作荧光帧标记物和用于点样后的相对荧光定量。
- 添加每步骤5.1.1，5.1.2制备的打印解决方案的井30微升，和5.1.3的最高品质的384孔微孔板用于微阵列的制造，如聚丙烯。
注：蛋白质打印缓冲区增加抗体的质量和稳定性，吐温20均质现货月rphology并建立蛋白偶联起来。建议保持在使用前4℃下的384孔微量。在-20℃保存以备长时间。聚丙烯具有低的DNA，蛋白质，细胞提取物，和小分子的内在结合。
- 由每种抗体以1mg / mL的在商业1×蛋白质印刷缓冲器含0.01％（体积/体积）吐温20（一种非离子型清洁剂），所有这些最终浓度混合制备印刷溶液各纯化抗体的30微升。
- 抗体印刷到载玻片
注意：通过使用不同的阵列平台，像接触，分针，或非接触设备，诸如压电打印机或“喷墨”技术的打印抗体上激活的显微镜载玻片。在这项工作中，CYANOCHIP已经常规地接触使用机器人系统（点样仪）能够在微米尺度点样抗体的NL量的打印。- 设置印刷室的环境条件下，以20℃，40 - 50％的相对湿度。
- 设置幻灯片基板（ 例如，75〜×25毫米环氧活化显微镜载玻片）执行几个相同的抗体ARRA每张幻灯片YS。
- 发现每种纯化抗体，包括对照和参照帧，在一个一式三份点图案;在这些条件下，将斑点180 - 200微米的直径。
- 打印后，留下的幻灯片至少30分钟在室温下让他们干，然后将它们保存在4℃;用于现场工作时，幻灯片可以被运输和储存在环境温度下数月。
注：CYANOCHIP在每张幻灯片3×8个相同的芯片或一个1×9格式的芯片完全相同9一个数组一式三份点的微阵列格式打印。每个数组的大小不能大于反应室尺寸24孔密封垫（通常是7.5×6.5毫米，3×8的杂交室）更高。 - 使用微阵列分析环境样品之前，使用FSMI确定在滴定曲线的每个抗体工作稀释度。对于每个抗体，使用相应的IMM的标准浓度unogen（3月10日至4月10日细胞/ mL）和荧光抗体的系列稀释液（1之间：和1 500：32,000）。最佳抗体浓度对应于在滴定曲线获得的最大信号强度的50％。此外，对于每种抗体的敏感性和特异性必须确定，如在布兰科等人所述。 22。
6.准备环境多分析提取物的荧光夹心免疫芯片的（FSMI）
- 从液体样品多分析提取
- 取1 - 100毫升的液体试样的用无菌注射器（ 例如，水从储水器的岸）;样品的量很大程度上取决于靶的潜在浓度。
- 通过使水样通过3微米孔径，47毫米直径的聚碳酸酯过滤器集中的细胞;一个细胞浓度10之间3 -细胞10 8 / mL的期望正检测，但实际的浓度是未知的。
- 通过用刮它;恢复收集在过滤用1mL一个改良的Tris缓冲盐水，吐温20增强缓冲液（0.4M的Tris-盐酸（pH值8），0.3M NaCl和0.1％吐温20 TBSTRR）所述生物质刮铲入15mL的管中。
- 均质化，并通过使用一个手持型超声波处理器分解，如，或者仅仅通过多次上下吹打在步骤1.5中所述;这个准备由微阵列分析样品。
- 从固体样品多分析提取物
- 重达0.5克固体样品（ 例如，岩石，土壤，或沉淀物）成10毫升的管中，加入高达2毫升TBSTRR的。
- 通过在管浸入超声波仪探头，由管浸入强大超声波仪喇叭的水浴，或通过使用一个手持式超声发生器声处理。执行至少5×30秒周期在30 kHz时，停在冰冷30秒。
- 过滤除去砂，粘土和其它粗物料用10毫升的注射器联接到一个直径10到12毫米，5至20微米的孔尺寸的尼龙过滤器保持器。通过过滤器推样品到1.5毫升管中。如果过滤器饱和，搅拌在注射器中的悬浮液，并把它一个新的;此准备滤液材料用于免疫测定（步骤7）。
注：TBSTRR的缓冲能力取决于样品的类型。它的环境提取物的制备后立即进行的免疫测定法，以避免酶降解的分析物的效果是很重要的。可替代地，在-80℃添加蛋白酶抑制剂进入环境提取并冷冻，直到下一个步骤。
7.荧光夹心免疫芯片（FSMI）
- 阻断CYANOCHIP
注：立即使用前，治疗为Printed滑动到方框上滑动的所有自由环氧基团和以除去过量的非共价结合的抗体组成。- 浸入该微阵列成的0.5M的Tris-HCl（pH为9），用5％（重量/体积）在一个干净的表面适度搅拌5分钟BSA溶液（ 例如，培养皿或者一个50毫升管）从摇臂平台。另外，躺下滑动到100到200μL下降与面临的芯片斑点上述溶液中。请假3 - 5分钟，然后继续。
- 用塑料尖镊子小心地拿起滑板;尽量避免接触芯片区域。通过轻轻敲击滑动到纸巾去除多余的液体。沉浸它在0.5M的Tris-HCl（pH8）中，用2％（重量/体积），用于与从一个摇杆平台温和搅拌30分钟BSA溶液。
- 使用适用于显微镜载玻片商业离心 - （300 XG 1分钟200）通过执行一个短暂离心干燥的幻灯片。可替代地，通过轻轻敲击ONT干燥该滑动OA纸巾。
- 与微阵列的多分析样品提取液的培养
- 设置在与24孔为多个微阵列市售微阵列杂交盒中滑动;按照供应商的说明。
- 滑动和盒式组件后，吸移管到样本提取物或它在TBSTRR稀释到盒的各孔的50μL的。
- 对每个样品重复步骤7.2.2至进行分析。
- 作为空白对照，吸管50 TBSTRRμL的缓冲到盒中的至少两个分开的井。
- 孵育在室温下1小时以吹打每15分钟或通过在温和摇动离开它混合。可替代地，孵育在4℃下12小时。
注意：使用其他孵育垫片作为微阵列图案的功能。的时间和步骤7.2.5孵化温度是通常取决于亲和力和结合き经验参数每个代动力学成对抗原抗体。
- 洗涤
- 通过将带盒向下，并仔细敲它放到一个干净的，吸收纸取出样品。
- 通过加入TBSTRR 150μL到每一个洗井，并消除缓冲器，如上述。
- 重复步骤7.3.2三次。
- 孵化与荧光检测抗体
- 添加含有17抗蓝藻应变抗体的抗体混合物的50微升，每个标记在TBSTRR荧光染料用1％（重量/体积）BSA中。确定每个荧光抗体的浓度在混合物中（从0.7至2微克/毫升） 通过执行每种抗原/抗体对22的滴定实验。
- 孵育在室温下1小时后，如在步骤7.2.5所述，或为在4℃下12小时。
- 洗出的荧光抗体</ STRONG>
- 除去荧光未结合的抗体，如在步骤7.3。
- 拆开纸盒，沉浸于快速冲洗滑入0.1X PBS（ 例如，在一个50毫升管）。
- 干滑如步骤7.1.3。
8.扫描荧光
- 扫描荧光滑动在荧光扫描仪对远红荧光染料的最大发射荧光峰。就拿芯片的多个图像在不同的扫描参数，一般通过降低激光增益值。
注：避免饱和点（> 65000荧光计数） - 他们是从规模，并可能引入量化误差。
9.图像处理和数据分析
- 使用图像分析和定量的商业软件;该软件提供的荧光强度的测量（FI;从单个点的所有像素的中值或平均值）为电子整个芯片的现货阿赫。减去周围的景点当地背景：FI = FI 现货 - FI 本地背景 。
- 保存Fi数据，并使用电子表格程序打开。
- 使用的空白阵列作为阴性对照以识别并丢弃误报获得的值。应用下面的公式来计算每个抗体现场FI：FI =（FI 样本 - FI 空白 ），其中FI 样品 = Fi 热点 -在芯片FI 当地背景 ，样品提取物和FI 空白 = FI 点运行- FI 本地背景在空白微阵列。
- 适用的2-到附加截止阈整个微阵列的FI误报的概率最小化的平均3倍;这是为劣质微阵列的图像和低信号对噪声的比率尤其相关。
- 创建图和/或在必要时进行进一步的分析。
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Representative Results
这个工作介绍使用CYANOCHIP抗体微阵列的最相关淡水蓝藻物种的同时鉴定（ 表1）一个多重免疫测定试验。微阵列可以是印刷到显微镜载玻片上一个3×8微阵列格式。每个微阵列是由一组中一个一式三份点图案印刷17的抗体，其相应的免疫前抗体和BSA作为阴性对照。所述微阵列还包含一种荧光帧，使用荧光标记的免疫前抗体容易地定位微阵列图案22（ 图1）。
该芯片是在现场测试在淡水洛索亚水库，供应马德里市的岸边采集水样的原位分析。样品如上述处理，并且主要积极免疫反应相当于抗体浮游蓝藻 ，如微囊藻。 （K4和K5），以及底栖Oscillatoriales，如Leptolyngbya属。 （K10 K15和）。较低的荧光信号从Nostocales（K6和K12，二浮游束丝菌属），底栖胶须藻属藻获得。 （K8）， 鱼腥藻 。 （K1），以及浮游微囊FLOS藻藻。 （K3）。光学显微镜观察结果（未显示）显示，从岸上丰富的陆源碎屑内的多元化社区蓝藻。 鱼腥的几个品种为主的社会，但微囊藻。 假鱼腥和属。也出席了会议。
此外，该芯片还通过分析在麦克默多冰架在南极采集的干，近1000年历史的微生物垫测试蓝藻马的存在验证rkers。 图1显示了在生产对底栖蓝藻从其他南极垫，包括鱼腥藻中分离的抗体高度荧光的，积极的反应。和Leptolyngbya属。 （K14和K15，分别）。与抗体浮游蓝藻 ，如微囊藻检测到更多的积极免疫反应。 （K4和K5）， 束丝菌属。 （K6和K12），和Planktothrix冬凌草藻。 （K17）。低信号从抗体在南极垫隔离等底栖生物物种，包括Tolypothrix SP获得。 （K16）和鱼腥藻 。 （K1）。荧光光学显微镜显示细胞结构上类似于蓝藻和绿藻的存在（未示出）。无丝状蓝藻进行鉴定。然而，检测的规模和丰富的弥漫性荧光约1微米多个非晶荧光结构，WHICH可能是由于细胞遗体分别存在（碎和死细胞）和胞外聚合物（EPS）。因此，生化分析表明，该垫包括了丰富的量生物聚合物和细胞残骸（复杂生物物质），可能是在目标中的微阵列的抗体。
图1： 快速和可靠的多重芯片免疫，检测 蓝藻 。 A）的方案表示FSMI的用于多目标样品与CYANOCHIP分析中的主要步骤。 B）的印刷图案布局的示意图（一式三份）的抗蓝藻抗体集合：（0）BSA，牛血清白蛋白; （X）只有打印缓冲区; （1-17）各自的抗体的，如表1 B中LANCO 等。 2015年（K1至K17）。从P1到P17，相应的免疫前抗体作为对照。黄色矩形对应于荧光斑点梯度作为帧参考。 C和D）图片显示从麦克默多冰架（南极）和CYANOCHIP图像分别在该垫检测蓝藻 ，一个1000岁的干微生物席的上半部分。 E）的洛索亚水库出与采样时间没有明显的绿色颗粒透明的水尽收眼底。 F）的水样的原位分析后的微阵列图像（从基准22修改）。
| AB码 | 免疫原（株） | 订购 | 栖息地 | | 培养条件 | |
| K1 | 鱼腥藻。 | Nostocales | 未知 | BG11和硝酸盐 | 30°C，连续光 |
| K2 | 鱼腥藻。 | Nostocales | 未知 | BG11o | 30°C，连续光 |
| K3 | 微囊FLOS藻 | Chroococcales | 浮游 | BG11 | 28°C，连续光 |
| K4 | 微囊novacekii | Chroococcales | 浮游 | BG11 | 28°C，连续光 |
| K5 | 铜绿微囊藻 | Chroococcales | 浮游 | BG11 | 28°C，连续光 |
| K6 | 束丝ovalisporum | Nostocales | 浮游 | BG11o | 28°C，连续光 |
| K7 | 藻席藻。 | Oscillatoriales | 底栖 | BG11 | 18ºC，16-8光照 |
| K8 | 胶须藻属藻。 | Nostocales | 底栖 | CHU-D | 18ºC，16-8光照 |
| K9 | Chamaesiphon藻。 | Chroococcales | 底栖 | BG11 | 18ºC，16-8光照 |
| K10 | Leptolyngbya boryana | Oscillatoriales | 底栖 | BG11 | 18ºC，16-8光照 |
| K11 | Tolypothrix distorta | Nostocales | 底栖 | BG11o | 18ºC，16-8光照 |
| K12 | 束丝aphanizomenoides | Nostocales | 浮游 | BG11o | 28°C，连续光 |
| K13 | 发菜藻。 （南极洲） | Nostocales | 底栖 | BG11o | 13ºC，16-8光照 |
| K14 | 鱼腥藻。 | Nostocales | 底栖 | BG11o | 13ºC，16-8光照 |
| K15 | Leptolyngbya藻。 | Oscillatoriales | 底栖 | BG11 | 13ºC，16-8光照 |
| K16 | Tolypothrix藻。 | Nostocales | 底栖 | BG11 | 13ºC，16-8光照 |
| K17 | Planktothrix冬凌草 | Oscillatoriales | planktoNIC | 没有 | 没有 |
表1。 的抗体（Ab）和所述蓝藻菌株用于产生CYANOCHIP 22 的列表 。
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Discussion
这里，使用CYANOCHIP，17抗体微阵列为广泛蓝藻属的检测和鉴定，多路复用荧光夹心免疫测定中描述22。这些蓝藻代表最频繁的海底和浮游属淡水栖息地，其中一些是毒素生产者。最近，荧光夹心免疫测定格式已被用来鉴别在环境应用26，27，28的微生物和/或bioanalytes。该协议主要是基于两个步骤：（i）固定或捕获抗体专门从一个测试样品和结合分析物（ⅱ）通过使用荧光标记的抗体（示踪或检测抗体）检测分析物 - 抗体对。因为夹心测定要求中的分析物对于至少两个访问抗体结合位点（表位）反应发生，任何阳性的荧光信号表明相对大的和复杂的寡糖或聚体分析物是相同或高度相似用于产生捕获抗体的那些的存在。
尽管这种方法需要小体积和基本的样品制备，而不需要特殊的专业知识或知识，若干缺点可能毁掉测定。低荧光信号或其完全缺乏可能是由于抗体纯化差或标记效率不佳。对于兔IgG的分离，A蛋白是最好的选择，因为它专门以高效率的免疫球蛋白Fc区结合。如在第4所示，则必须使用与3-7摩尔每摩尔抗体染料之间的标记范围的荧光抗体。此外，缺乏荧光斑点可以通过分析物躺下检测限的浓度进行说明。在这种情况下，样品可以是浓entrated与微阵列，或更大量的孵育之前，可用于新的提取。高荧光背景是从矿物和复杂的有机物质是粘到芯片组成的样品提取物的低效芯片阻挡和/或洗涤步骤的和的结果。当复杂的样品被用作分析物，理想的是增加的盐和/或洗涤剂浓度有利于分析物 - 抗体对之间的特异性相互作用。
近年来，抗体微阵列技术已经被开发用于环境应用。然而，使用这种技术确实涉及一些限制。多克隆抗体是更快和更便宜，以产生和，更重要的是，有可能对任何靶表位的复杂环境样品中结合在理论上比用单克隆抗体更高。然而，事实上，它们可以识别不同表位的增加FSM交叉反应的数目一，为了获得高的特异性，使用方法，通过使用反卷积方法26，27，例如，非常需要解开从真同源抗原抗体反应，这些交叉反应性的事件。基本上，微阵列被认为是多种检测和蓝藻的分类的定性的生物传感器。在这方面，有必要确定检测限为每抗体的一个接一个使用它们的最佳工作浓度在测定。虽然这个微阵列，用FSMI一起时，不认为是一个定量的方法中，生物传感器意味着高灵敏度，因为大部分包含在CYANOCHIP 22的抗体的检测下限是从二月 10日至3月10日细胞/ mL。
尽管有这些限制，这种方法具有抗环境米，用来其它技术几个优点onitoring。抗体 - 生物传感器允许在单个分析中，检测被分析物的浓度低的可能性同时识别不同的分子的可能性，并产生针对几乎任何物质的抗体的可能性。此外，该微阵列可以实现高达24分析在单个测定中，与来自10 2个细胞/ mL检测限。与其他方法相比，抗体可以检测活的或死亡的细胞，胞外物质和细胞碎片。虽然它需要至少4小时，以完成整个测定法，它是比施加到环境监测其它分析方法更快。该CYANOCHIP最初被设想为蓝藻菌株的鉴定。该生物传感器没有正式为该目的设计的，所以它可以识别潜在的毒素生产商和可以在将来通过加入抗体对大范围的新菌株得到改善。生化测定法，诸如酶联免疫吸附，PPIA，和神经化学试验在小鼠中，允许藻毒素的识别，但它们仅限于少数已知的毒素和能够给误报。另外，在使用该CYANOCHIP不需要特殊的训练，而光学显微镜和鼠标生物测定法需要受过训练的人员或与活的动物的劳动密集型工作，并且它们不给有关的样品中存在的毒素的类型的信息。藻毒素也可以被确定并通过其它分析方法，如HPLC，GC-MS，或MALDI-TOF进行定量。在这些方法中，必须将样品纯化，缺乏参考标准限制藻毒素的识别。此外，分析方法需要昂贵的设备和用品，并专门培训。分子的方法是基于从样品中提取DNA，而FSMI只需要在几个非常简单的步骤来制备一种环境提取物，未经蓝藻纯化。
该CYANOCHIP的高性能为在淡水蓄水池中原位检测蓝藻使其成为水管理员的预警的新工具。另外，微阵列也是天体生物学领域有兴趣，尤其是用于检索微生物标记作为生命的证据。极端微生物的研究可以帮助我们理解地球上生命的起源和生命可能如何存在于我们太阳系之外的极端环境下生存。作为地球上的一些环境是非常相似的其他行星上，如火星的地方，就有可能找到光合作用的原核生物的生命灭绝的证据遗体。该芯片能够从生活或无生命的细胞识别蓝藻标记;从人口保持和/或旧的微生物席（ 图1）外物质;从水，土壤，在极端的环境中，如南极洲，阿塔卡马，安第斯湖，北极高，或收集的岩石（未显示），力拓方面在西班牙。考虑到蓝藻是地球上的原始微生物，有理由相信，他们可能曾经居住在其他行星上。
总之，这一事实CYANOCHIP-FSMI可以识别原位蓝藻标记，并且可以甚至它们关联到不同种系型或基团，并且该微阵列涵盖范围广泛的栖息地，其中包括那些浮游生物，底栖生物，和endoliths的，表明这技术可以用于环境监测的工具。与微阵列未来改进可能是增加抗体的数目来新菌株，使得相关的系统进化群体仍待都包括在内。此外，该芯片可以与抗体特异性蓝藻化合物，毒素或cyanophicin聚合物这样来实现。这是用于监测淡水蓄水池，管道和设备在人类设施尤其相关。目前的MICRoarray和未来的版本将在天体生物学领域非常有用的，无论是对生命检测或监测人类太空设施（ 如监测水库或生命支持系统）。事实上，我们经常使用的现场活动，以极端环境的芯片作为“现场”检测的生活仍然是一个方法。该芯片是所谓的生命探测仪芯片（LDChip），有超过300抗体行星探索任务29,30寻找生活的微阵列的一部分。单独或作为LDChip的一部分，该芯片将在生命探测仪（固体）仪29的标志来实现，以验证在多个领域的活动，以地面类似物行星探测固体LDChip概念。微阵列将通过识别蓝藻和/或它们的毒素提供有用的信息。通过确定菌株，将GI已经对环境以及他们开发的栖息地的信息。
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Acknowledgments
我们感谢来自马德里自治大学安东尼·克萨达博士提供蓝藻菌。这项工作是由西班牙部：EconomíaŸCompetitividad的Subdirección一般德PROYECTOS德Investigación（MINECO）资助，授予没有。 AYA2011-24803和ESP2014-58494-R。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 mm pore diameter filters | Millipore | GSWP04700 | For preparation of immunogens |
| Eppendorf 5424R microcentrifuge | Fisher Scientific | For preparation of immunogens | |
| Phosphate buffer saline (PBS) pH 7.4 (10x) | Thermo Fisher Scientific | 70011036 | 50 mM potassium phosphate, 150 mM NaCl, pH 7.4 |
| Ultrasonic processor UP50H | Hielscher | For preparation of immunogens | |
| Complete Freund's adjuvant | Sigma-Aldrich | F5881 | Immunopotentiator |
| Incomplete Freud's adjuvant | Sigma-Aldrich | F5506 | For boost injections |
| Protein A antibody purification kit | Sigma-Aldrich | PURE1A | For isolation of IgG |
| Centrifugal filter devices MWCO<100 kDa | Millipore | UFC510096-96K | For isolation of IgG |
| Dialysis tubings, benzoylated | Sigma-Aldrich | D7884-10FT | For isolation of IgG |
| Illustra Microspin G-50 columns | GE-HealthCare | GE27-5330-02 | For isolation of IgG |
| Bradford reagent | Sigma-Aldrich | B6916-500 mL | To quantify the antibody concentration |
| MicroBCA protein assay kit | Thermo Scientific | 23235 | To quantify the antibody concentration |
| Protein arraying buffer 2x | Whatman (Sigma Aldrich) | S00537 | Printing buffer; 30 - 40% glycerol in 1x PBS with 0.01% Tween 20 |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | Non-ionic detergent |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9418 | Control for printing; blocking reagent |
| 384-wells microplate | Genetix | X6004 | For antibody printing |
| Robot arrayer for multiple slides | MicroGrid II TAS arrayer from Digilab | For antibody printing | |
| Epoxy substrate glass slides | Arrayit corporation | VEPO25C | Solid support for antibody printing |
| Alexa Fluor-647 Succinimidyl-ester | Molecular probes | A20006 | Fluorochrome |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | Fluorochrome dissolvent |
| Heidolph Titramax vibrating platform shaker | Fisher Scientific | For antibody labeling | |
| Illustra Microspin G-50 columns | Healthcare | 27-5330-01 | For purification of labeled antibodies |
| Safe seal brown 0.5 mL tubes | Sarstedt | 72,704,001 | For labeled antibodies storage |
| Nanodrop 1000 spectrophotometer | Thermo Scientific | To quantify antibody concentration and labeling efficiency | |
| 3 µm pore size polycarbonate 47 mm diameter filter | Millipore | TMTP04700 | To concentrate cells |
| 1 M Trizma hydrochloride solution pH 8 | Sigma-Aldrich | T3038 | For TBSTRR preparation; to block slides |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | For TBSTRR preparation |
| 20 µm nylon filters | Millipore | NY2004700 | For environmental extract preparation |
| 10 - 12 mm filter holders | Millipore | SX0001300 | For environmental extract preparation |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8340 | For environmental extract storage |
| 1 M Trizma hydrochloride solution pH 9 | Sigma-Aldrich | T2819 | To block slides |
| Heidolph Duomax 1030 rocking platform shaker | VWR | To block slides; for incubation processes | |
| VWR Galaxy miniarray microcentrifuge | VWR | C1403-VWR | To dry slides |
| Multi-Well microarray hybridization cassette | Arrayit corporation | AHC1X24 | Cassette for 24 assays per slide |
| GenePix 4100A microarray scanner | Molecular Devices | Scanner for fluorescence | |
| GenePix Pro Software | Molecular Devices | Software for image analysis and quantification |
References
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