Abstract
Le réchauffement climatique et de l'eutrophisation font certains écosystèmes aquatiques se comportent comme de véritables bioréacteurs qui déclenchent la croissance des cyanobactéries rapide et massive; cela a la santé pertinente et des conséquences économiques. De nombreuses souches de cyanobactéries sont des producteurs de toxines, et seulement quelques cellules sont nécessaires pour induire des dommages irréparables à l'environnement. Par conséquent, les autorités de l'eau du corps et les administrations ont besoin de systèmes d'alerte précoce rapides et efficaces qui fournissent des données fiables pour appuyer leurs décisions préventives ou curatives. Ce manuscrit rapporte un protocole expérimental pour la détection sur le terrain des souches de cyanobactéries produisant des toxines en utilisant une puce de microréseau d'anticorps avec 17 anticorps (ABS) avec résolution taxonomique (de CYANOCHIP). Ici, un fluorescent immunologique sandwich microarray multiplex (FSMI) pour la surveillance simultanée des 17 souches de cyanobactéries trouve fréquemment floraison dans les écosystèmes d'eau douce, certains d'entre eux les producteurs de toxines, est décrite. Un microréseau multiple répétitions identiques (jusqu'à 24) du CYANOCHIP a été imprimé sur une lame de microscope unique pour tester simultanément un nombre similaire d'échantillons. les échantillons liquides peuvent être testés soit par incubation directe avec l'anticorps (Ab) ou après concentration des cellules par filtration à travers un filtre de 1 à 3 pm. Les échantillons solides, comme les sédiments et les roches du sol, sont d'abord homogénéisés et dispersés par un appareil à ultrasons portatif dans un tampon d'incubation. Ils sont ensuite filtrés (5-20 um) pour éliminer la matière grossière, et le filtrat est incubé avec Abs. Immunoréactions sont révélés par une incubation finale avec un mélange de 17 Abs marqué par fluorescence et sont lues par un détecteur de fluorescence portatif. L'ensemble du processus prend environ 3 h, la plupart de celui-ci correspondant à deux périodes d'incubation de 1 h. La sortie est une image, où des points lumineux correspondent à la détection positive des marqueurs de cyanobactéries.
Introduction
La détection et la surveillance des micro-organismes dans les communautés microbiennes naturelles complexes sont cruciales dans de nombreux domaines, y compris la biomédecine, l'écologie de l'environnement, et l'astrobiologie. Les cyanobactéries sont des micro - organismes procaryotes bien connus pour leur capacité à former des fleurs (prolifération excessive) des cellules dans l' eau douce. Ils sont omniprésents, et de nombreuses espèces sont capables de produire des toxines, ce qui conduit non seulement à un risque potentiel pour la santé humaine, mais aussi à un impact écologique. À cet égard, il est essentiel de développer des méthodes rapides et sensibles pour la détection précoce des cyanobactéries et / ou leurs toxines dans le sol et l' eau. A cet effet, un fluorescent immunologique sandwich microarray multiplex (FSMI) a été développé comme un outil pour les gestionnaires de l'eau afin de les aider à prendre des décisions et, par conséquent, la mise en œuvre des programmes de gestion de l'eau.
Un large éventail de méthodes a été développé pour détecter et identifier cyancellules obacterial et cyanotoxines dans le sol et l'eau, y compris la microscopie optique, la biologie moléculaire et des techniques immunologiques. Ces méthodes peuvent varier considérablement dans les informations qu'ils fournissent. Techniques microscopiques sont basés sur la morphologie des cellules et la détection de la fluorescence in vivo à partir de pigments, tels que les cyanobactéries phycocyanine ou la chlorophylle a 1. Bien qu'ils soient des méthodes rapides et bon marché pour en temps réel et une surveillance fréquente qui informent sur le type et le nombre de cyanobactéries présentes dans un échantillon, ils ne donnent pas d' informations sur la toxicité potentielle. En outre, ils ont besoin d' un certain niveau d'expertise, estimant qu'il est souvent très difficile de faire la distinction entre les espèces étroitement apparentées 2. Pour surmonter ces limitations, la microscopie optique doit être accompagnée par les deux essais de criblage biologiques et biochimiques et méthodes physico-chimiques pour l'identification et la quantification des cyanotoxines.
Les méthodes moléculaires à base ont été appliquées depuis des décennies pour détecter, identifier et quantifier les cyanobactéries et cyanotoxines leurs correspondants grâce à l'information de séquence publiée dans les bases de données du génome (par exemple, National Center for Biotechnology Information, NCBI). Parmi ces méthodes sont celles basées sur l'amplification en chaîne par polymérase (PCR), ce qui nécessite la conception d'ensembles d'amorces pour l'amplification de l'ADN et dépendent de la connaissance préalable des séquences d'ADN de différentes espèces de cyanobactéries. Bien que la détection du gène, comme l'opéron phycocyanine, conduit à une identification précise au niveau du genre, certaines espèces ou souches ne sont pas détectés aveccette méthode. Cependant, les gènes codant pour une toxine, tels que ceux appartenant à l'opéron microcystine, faciliter l'identification des toxines dans les échantillons où les producteurs sont rares 5. Néanmoins, la détection de marqueurs de toxine par PCR ne signifie pas nécessairement une toxicité dans l'environnement. En outre, l'ensemble des amorces développées pour analyser l'ensemble des espèces de producteurs de cyanobactéries et de toxines présentes dans un échantillon est encore incomplète, et d' autres études doivent être réalisées pour identifier des espèces inconnues. D' autres techniques de biologie moléculaire sont basées sur la PCR-non, comme l' hybridation fluorescente in situ (FISH) , et des puces à ADN dans.
Au cours des deux dernières décennies, la technologie des microréseaux a gagné en importance dans de nombreux domaines d'application, en particulier dans la surveillance environnementale. Les puces à ADN permettent une distinction entre les espèces et les analytes 4, 6, 7 sup>, 8, 9, 10, mais elles sont considérées comme très laborieuse et prend du temps des tâches qui impliquent plusieurs étapes (par exemple, les performances des puces à ADN, l' extraction de l' ADN, amplification par PCR et d' hybridation). Pour cette raison, les dosages moins consommatrices de temps basées sur des anticorps, tels que les biopuces immunologiques sandwich et compétitives, sont devenus une méthode à haut débit essentiel et fiable pour la détection d'analytes multiples de l' environnement 11, 12, 13. La capacité des anticorps à reconnaître spécifiquement les composés cibles et de détecter de petites quantités d'analytes et de protéines, ainsi que la possibilité de produire des anticorps contre pratiquement toute substance, faire microréseaux d'anticorps une technique puissante pour des fins environnementales. En outre, la possibilité de réaliser des analyses multiples en tant quedosage Ingle, avec des limites de détection variant de ppb à ppm, est l' un des principaux avantages de cette méthode 14.
Biocapteurs à base d' anticorps se sont révélés être des outils sensibles et rapides pour la détection d'une large gamme d'agents pathogènes et de toxines dans la surveillance environnementale 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21. Bien que les méthodes d'ADN impliquent plusieurs étapes, les microréseaux à base d'anticorps ne nécessitent qu'une petite préparation de l'échantillon qui est principalement basée sur une étape de lyse courte dans un tampon de solution appropriée. Ligler Delehanty et 15 ont rapporté la détection simultanée des protéines bactériennes et des analytes dans des mélanges complexes à base d'un dosage immunologique sandwich d' anticorps capable de détecter une concentration en protéine de 4 parties par milliard d'j 10 4 ufc / ml de cellules. Szkola et al. 21 ont développé un microréseau multiplex fiable et pas cher pour la détection simultanée de proteotoxins et de petites toxines, des composés qui pourraient être utilisés dans la guerre biologique. Ils ont détecté des concentrations de toxine ricine, avec une limite de détection de 3 parties par milliard, en moins de 20 min. Récemment, le CYANOCHIP, un biocapteur basé sur un microréseau d'anticorps pour la détection in situ de cyanobactéries toxiques et non toxiques, a été décrite 22. Cette microarray permet l'identification des cyanobactéries blooms potentiels, surtout dans les milieux aquatiques, qui sont difficiles à identifier au microscope. La limite de détection de la puce est de 10 mars 2 à 10 cellules pour la plupart des espèces, en tournant ce biocapteur dans un outil rentable pour la détection multiplex et l' identification des cyanobactéries, même au niveau de l' espèce. Toutes ces propriétés font l'Antibotechnique de microarray dy, et en particulier la méthode présentée dans ce travail, une méthode plus rapide et plus simple par rapport aux techniques mentionnées ci-dessus.
Ce travail présente deux exemples d'expériences qui utilisent un biocapteur à base de puces à ADN-anticorps pour détecter la présence de cyanobactéries dans des échantillons de sol et d' eau. Il est une méthode simple et fiable basé sur un format de dosage immunologique en sandwich qui nécessite des volumes d'échantillons très petits et la préparation des échantillons très basique. La méthode nécessite un court laps de temps et peut facilement être effectuée sur le terrain.
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Protocol
1. Préparation des agents immunogènes
- Cultivez chaque souche de cyanobactérie dans le milieu de culture correspondante dans les conditions décrites dans le tableau 1.
NOTE: Le milieu de croissance et de conditions de culture pour chaque souche de cyanobactérie sont énumérés dans le tableau 1. Toutes les souches de cyanobactéries, à l'exception de K17, appartiennent au groupe de Antonio Quesada de l'Université Autonoma (Madrid, Espagne). L'anticorps contre rubescens Planktothrix a été généré à partir d' un échantillon naturel de la fleur monospécifiques de cette cyanobactérie du réservoir Vilasouto (nord de l' Espagne). - Quantifier le nombre de cellules en utilisant une chambre de comptage de cellules par microscopie optique pour obtenir environ 10 8 cellules / ml provenant d' une culture en phase de croissance exponentielle tardive ou stationnaire.
- cellules de récolte à partir de 5 ml de la culture par centrifugation à 2000 xg pendant 5 min.
- Jeter le surnageant et remettre en suspension les cellules dans un bain de 10 ml,e avec 5 ml de 1 x solution saline tamponnée au phosphate (PBS 1x) pour obtenir environ 10 8 cellules / ml.
- Homogénéiser et lyser les cellules de la suspension par sonication pendant 5 cycles, 30 s chacune, avec 30 à 60 s pause sur la glace, en utilisant un processeur à ultrasons portatif portable ou en plongeant le tube dans le bain de l'eau disrupteur cellulaire à amplitude maximale (30 kHz).
- Répétez les étapes 1.3 à 1.5 pour chaque souche de cyanobactérie.
NOTE: La sonication produit la rupture des cellules et la libération du contenu cellulaire. Tandis que les protéines et les polysaccharides sont de bons immunogènes, des molécules spécifiques, telles que des lipides et des acides nucléiques, ne pas induire une réponse immunogène humoral par eux-mêmes. Par conséquent, elles doivent se lier à des supports, tels que des polysaccharides ou des protéines, afin d'augmenter la complexité moléculaire. En outre, la sonication libère matériel intracellulaire qui peut déclencher la production d'anticorps.
2. Production d'anticorps polyclonaux
- Préparer la première immdose unogen en mélangeant 0,5 ml du lysat cellulaire obtenu à l'étape ultrasonication 1,5 avec 0,5 ml d'adjuvant complet de Freund. Livrer à l'exploitant d'une installation d'animaux pour la production d'anticorps polyclonaux de lapin.
- Préparer trois plusieurs doses comme précédemment pour une utilisation ultérieure en tant que rappels de mémoire dans le processus de production d'anticorps en mélangeant 0,5 ml de la même homogénat / lysat obtenu à l'étape 1.5 avec 0,5 ml d'adjuvant de Freund incomplet. Donnez-leur à l'animalerie pour accomplir le processus de production d'anticorps.
- Répétez les étapes 2.1 et 2.2 pour chaque nouveau procédé de production d'anticorps.
REMARQUE: Normalement, la production d'anticorps est confiée à des animaleries spécialisées ou des entreprises, parce que les licences et la formation appropriée sont nécessaires pour travailler avec les animaux. Les sociétés fournissent une analyse par immunosorbant lié à une enzyme (ELISA) pour la mesure relative de la quantité d'anticorps spécifiques d'antigènes présents dans l'échantillon de sérum.
3. Anticorps Purification
- Purifier l'immunoglobuline G (IgG) à la fois la fraction provenant immun et le sérum pré-immun ont été recueillies à l'étape 2 par une protéine Chromatographie d'affinité. Certains kits de purification commerciale, basée sur des systèmes de cartouches, fonctionnent bien; suivez les instructions du fournisseur.
- Lorsque le kit de purification ne fournit pas un système de dessalage, de changer le tampon après l'élution des anticorps purifiés à 0,1x PBS, soit par dialyse, soit en utilisant des dispositifs de filtration centrifuge avec 100 kDa (ou moins) la taille des pores de la membrane.
- Déterminer la concentration d'anticorps en mesurant l'absorbance à 280 nm , ou en utilisant des méthodes colorimétriques, tels que 23 Bradford, Lowry 24 ou de l' acide bicinchoninique (BCA) 25.
Remarque: il est important d'éviter d' inclure des groupes amine dans le tampon d'élution (par exemple, des tampons Tris) , car ils sont en concurrence avec l'anticorps pour la liaison à des surfaces solides activés par des groupes époxy. Après purification, il est important de tester l'activité d'anticorps par ELISA.
4. Fluorescence Anticorps Étiquetage
- Marquer les anticorps purifiés obtenus dans la section 3 par un fluorochrome (par exemple, un colorant fluorescent rouge lointain) par dissolution d' un flacon contenant un colorant du commerce pour le marquage de 1 mg de protéine dans 100 pl de diméthylsulfoxyde (DMSO). Ajouter 2 ul du colorant dissous à chaque préparation d'anticorps à une concentration de 2 mg / mL dans un volume final de 50 ul en mM tampon phosphate salin 50 (pH 8,5).
- Maintenir les réactions de marquage sous agitation continue pendant 1 h à température ambiante et 1200 tours par minute sur une plate-forme vibrante.
- Purifier les anticorps marqués par chromatographie d'exclusion de taille (par exemple, en utilisant un gel avec une gamme de fractionnement entre 1,5 et 30 kDa piégés dans une colonne), à la suite des recommandations du fournisseur.
- Mesurer l'absorbance à 280 nm et à 650 nm dans les éluats et calculer le labeefficacités ling suivantes recommandations du fournisseur.
REMARQUE: Jusqu'à 50 x 50 pi réactions anticorps-étiquetage peut être fait avec un seul flacon du colorant fluorescent pour le marquage 1 mg de protéine. Il est recommandé de couvrir les tubes avec du papier d'aluminium ou, en variante, d'utiliser des tubes opaques 0,5 mL pour éviter les processus de trempe après l'étape 4.3. Pour les anticorps IgG, l'étiquetage optimale est obtenue avec 3-7 moles de colorant par mole d'anticorps.
5. CYANOCHIP production
- Les anticorps et les contrôles en solution d'impression
- Préparer 30 pi de chaque anticorps purifié dans une solution d'impression par mélange de chaque anticorps à 1 mg / ml dans un tampon d'impression protéine 1x commerciale avec 0,01% (v / v) de Tween 20 (un détergent non ionique), tout en concentrations finales.
NOTE: En variante, une solution d'anticorps peut contenir 20% de glycerol, 1% (p / v) de saccharose (ou le tréhalose, en tant que conservateur) et 0,01% (v / v) de Tween 20 dans du tampon carbonate (pH 8,5). - Préparer 30 pi de la solution d'impression en tant que contrôles: (a) un tampon d'impression 1x protéique avec 0,01% (v / v) de Tween 20, (b) la protéine A du sérum pré-immun purifié à 1 mg / ml dans un tampon d'impression en protéines 1x avec 0,01% (v / v) de Tween 20, et (c) de la sérum albumine bovine (BSA) à 1 mg / ml dans 1 x tampon d'impression de protéine avec 0,01% (v / v) de Tween 20.
- Préparer 30 pi d'un marquage fluorescent, du sérum pré-immun purifié à différentes concentrations (par exemple, de 50 pg / ml à 1 pg / ml) dans 1 x tampon d'impression de la protéine avec du Tween 20, comme à l' étape 5.1.1. Ces échantillons seront utilisés comme marqueurs de cadre fluorescents et par rapport fluorescence quantification après avoir repéré.
- Ajouter 30 ul par puits des solutions d'impression préparées dans les étapes 5.1.1, 5.1.2, et 5.1.3 de la plus haute qualité à 384 puits des microplaques pour la fabrication de puces à ADN, tel que le polypropylène.
NOTE: tampon d'impression en protéines augmente la qualité et la stabilité des anticorps, et Tween 20 homogénéise place morphology et construit le couplage des protéines vers le haut. Il est recommandé de maintenir la microplaque 384 puits à 4 ° C avant utilisation. Entreposer à -20 ° C pendant de longues périodes de temps. Polypropylène a une faible ADN, protéines, extrait de cellules, et à petite molécule intrinsèque de liaison.
- Préparer 30 pi de chaque anticorps purifié dans une solution d'impression par mélange de chaque anticorps à 1 mg / ml dans un tampon d'impression protéine 1x commerciale avec 0,01% (v / v) de Tween 20 (un détergent non ionique), tout en concentrations finales.
- Anticorps impression sur une lame de microscope
NOTE: Imprimer les anticorps sur des lames de microscope activées à l'aide de différentes plates-formes de réseau, comme le contact, split-aiguille, ou des dispositifs sans contact, tels que les imprimantes piézoélectriques ou technologies "jet d'encre". Dans ce travail, l'CYANOCHIP a été régulièrement imprimé par contact à l'aide d'un système robotisé (de arrayer) capable de repérer des quantités nL des anticorps à l'échelle um.- Définir les conditions environnementales de la salle d'impression à 20 ° C et 40 - 50% d'humidité relative.
- Mettre en place les supports coulissants (par exemple, 75- x 25 mm de lames de verre de microscope époxy-activé) pour effectuer plusieurs arra d'anticorps identiquesys sur chaque diapositive.
- Repérez chaque anticorps purifié, y compris les contrôles et le cadre de référence, dans un motif de tache triple; dans ces conditions, les taches sont de 180 - 200 pm de diamètre.
- Après l'impression, laissez les lames pendant au moins 30 min à température ambiante pour les laisser sécher, puis les stocker à 4 ° C; pour travailler dans le domaine, les lames peuvent être transportés et stockés à température ambiante pendant plusieurs mois.
NOTE: Le CYANOCHIP est imprimé dans un format de microréseau spot triple avec 3 x 8 microréseaux identiques par diapositive ou 9 tableaux identiques dans un format de microréseau 1 x 9. Chaque dimension de la matrice ne doit pas être supérieure à la dimension de la chambre de réaction pour un joint d'étanchéité 24 puits (habituellement 7,5 x 6,5 mm dans une chambre d'hybridation 3 x 8). - Avant d'utiliser la puce à ADN pour analyser des échantillons environnementaux, FSMI utiliser afin de déterminer la dilution de travail pour chaque anticorps dans une courbe de titrage. Pour chaque anticorps, utiliser une concentration standard de l'imm correspondantunogen (10 avril 3 à 10 cellules / ml) et des dilutions en série de l'anticorps fluorescent (entre 1: 500 et 1: 32000). La concentration optimale en anticorps correspond à 50% de l'intensité maximale du signal obtenu dans la courbe de titrage. En outre, la sensibilité et la spécificité de chaque anticorps doit être déterminée, comme décrit dans Blanco et al. 22.
6. Préparation de l'environnement multianalyte Extraits pour le Immunoassay Fluorescent Sandwich Microarray (FSMI)
- Extrait multianalyte à partir d' un échantillon liquide
- Prendre 1 - 100 mL de l'échantillon liquide avec une seringue stérile (par exemple, l' eau de la rive d'un réservoir d'eau); la quantité d'échantillon est fortement dépendante de la concentration potentielle des cibles.
- Concentrer les cellules en faisant passer l'échantillon d'eau par une taille de pores de 3 um, 47 mm de diamètre filtre de polycarbonate; une concentration cellulaireentre mars 10 à août 10 cellules / ml est souhaitable pour la détection positive, mais la concentration réelle est inconnue.
- Récupérer la biomasse collectée dans le filtre avec 1 ml d'une solution saline tamponnée au Tris modifié, un tampon Tween 20 renforcé (TBSTRR; 0,4 M de Tris-HCl (pH 8), 0,3 M de NaCl et 0,1% de Tween 20), en grattant avec une spatule dans un tube de 15 ml.
- Homogénéiser et désagréger en utilisant un processeur à ultrasons portatif, tel que décrit dans l'étape 1.5, ou tout simplement par pipetage de haut en bas plusieurs fois; ce prépare l'échantillon pour analyse par microarray.
- Extrait multianalyte à partir d' un échantillon solide
- Peser à 0,5 g de l'échantillon solide (par exemple, la roche, le sol ou les sédiments) dans un tube de 10 ml et ajouter jusqu'à 2 ml de TBSTRR.
- Soniquez par immersion de la sonde sonicateur dans le tube, en plongeant le tube dans le bain d'une corne de sonication puissante de l'eau, ou en utilisant un sonicateur à main. Effectuer au moins 5 x 30 scycles à 30 kHz, l'arrêt pendant 30 s tandis que sur la glace.
- Un filtre pour enlever le sable, l'argile et d'autres matériaux grossiers avec une seringue de 10 ml, couplé à un diamètre de 10 à 12 mm, de 5 à 20 um porte-filtre en nylon de taille des pores. Poussez l'échantillon à travers le filtre dans un tube de 1,5 ml. Si les saturent filtre, agiter la suspension dans la seringue et le prendre à une nouvelle; ceci prépare le matériau de filtrat pour le dosage immunologique (étape 7).
REMARQUE: La capacité tampon de TBSTRR dépend du type d'échantillon. Il est important d'effectuer le dosage immunologique immédiatement après la préparation de l'extrait de l'environnement afin d'éviter les effets de la dégradation enzymatique des analytes. En variante, ajouter des inhibiteurs de la protéase dans l'extrait de l'environnement et de congélation à -80 ° C jusqu'à l'étape suivante.
7. Fluorescent Sandwich Microarray Immunoassay (FSMI)
- Blocage de la CYANOCHIP
REMARQUE: Immédiatement avant utilisation, traiter le pMPRIMÉ coulisse pour bloquer tous les groupes époxy libres sur la diapositive et pour éliminer l'excès d'anticorps non liés de manière covalente.- Immerger la puce à ADN dans 0,5 M de Tris-HCl (pH 9) avec 5% (p / v) de BSA sur une surface propre (par exemple, boîte de Petri ou un tube de 50 ml) sous agitation douce à partir d' une plate - forme à bascule pendant 5 min. Vous pouvez également jeter les glisser vers le bas sur un 100 à 200 pi goutte de la solution ci-dessus avec les points de biopuces auxquels elle est confrontée. Laisser pendant 3 - 5 min, puis continuez.
- Prenez soigneusement la diapositive à l'aide des pinces en plastique à bout; essayez d'éviter les zones de microréseaux toucher. Éliminer l'excès de liquide en frappant doucement la lame sur une serviette en papier. Immerger dans 0,5 M de Tris-HCl (pH 8) avec 2% (p / v) d'une solution de BSA pendant 30 minutes avec agitation douce à partir d'une plate-forme à bascule.
- Sécher la lame en effectuant une courte centrifugation (200-300 g pendant 1 min) en utilisant une microcentrifugeuse commerciale adaptée pour des lames de microscope. Alternativement, sécher la lame par doucement frapper Ontariooa serviette en papier.
- Incubation de l'extrait d'échantillon multianalyte avec le microréseau
- Mettre en place la glissière dans une cassette d'hybridation microarray commerciale avec 24 puits pour plusieurs microarrays; suivez les instructions du fournisseur.
- Après l'assemblage coulissant et la cassette, une pipette jusqu'à 50 pi de l'extrait d'échantillon ou d'une dilution de celui-ci dans TBSTRR dans chaque puits de la cassette.
- Répétez l'étape 7.2.2 pour chaque échantillon à analyser.
- En tant que témoin à blanc, la pipette 50 ul de tampon dans TBSTRR au moins deux puits séparés de la cassette.
- Incuber à température ambiante pendant 1 h sous agitation par pipetage toutes les 15 min ou en laissant sous agitation douce. Alternativement, incuber pendant 12 h à 4 ° C.
REMARQUE: Utilisez d'autres joints d'incubation en fonction du motif de microréseau. Le temps et la température de l'incubation de l'étape 7.2.5 sont des paramètres empiriques qui dépendent normalement de l'affinité de liaison et kinétique de chaque paire antigène-anticorps.
- La lessive
- Retirer les échantillons en plaçant la cassette vers le bas et soigneusement cognant sur un papier absorbant propre.
- Laver les puits en ajoutant 150 pi de TBSTRR à chacun, et d'éliminer le tampon, comme ci-dessus.
- Répétez l'étape 7.3.2 trois fois plus.
- Incubation avec des anticorps de détection fluorescents
- Ajouter 50 ul d'un mélange d'anticorps contenant les anticorps 17 anti-déformation des cyanobactéries, chacun marqué avec le fluorochrome dans TBSTRR avec 1% (p / v) de BSA. Déterminer la concentration de chaque anticorps fluorescent dans le mélange (0,7 à 2 ng / ml) en réalisant des expériences de titrage de chaque paire antigène / anticorps 22.
- Incuber pendant 1 h à température ambiante, comme décrit dans l'étape 7.2.5 ou pendant 12 heures à 4 ° C.
- Laver les anticorps fluorescents </ Strong>
- Retirez les anticorps non fluorescents, comme dans l'étape 7.3.
- Démonter la cassette et immerger la lame dans 0,1x PBS (par exemple, dans un tube de 50 ml) pour un rinçage rapide.
- Sécher la lame comme à l'étape 7.1.3.
8. Recherche de Fluorescence
- Balayer la lame pour la fluorescence au pic de fluorescence d'émission maximale pour le colorant fluorescent rouge lointain dans un scanner à fluorescence. Prendre plusieurs images des micropuces à différents paramètres de balayage, généralement en diminuant la valeur de gain de laser.
NOTE: Éviter les points saturés (> 65.000 comptages de fluorescence) -Ils sont hors d'échelle et peuvent introduire des erreurs de quantification.
9. Traitement de l'image et de l'analyse des données
- Utilisez un logiciel commercial pour l'analyse de l'image et la quantification; le logiciel fournit des mesures de l'intensité de fluorescence (FI; médiane ou moyenne de tous les pixels d'un seul point) pour espot ach de l'ensemble microréseau. Soustraire le fond local autour des spots: FI = spot FI - FI fond local.
- Sauvegarder les données de FI et les ouvrir à l'aide d'un tableur.
- Utilisez les valeurs obtenues pour les tableaux blancs que le contrôle négatif pour identifier et éliminer les faux positifs. Appliquer l'équation suivante pour calculer la FI pour chaque tache d'anticorps: FI = (échantillon FI - FI blanc), où FI échantillon = spot FI - FI fond local dans les microarrays exécuté avec des extraits d'échantillons et FI vide = spot FI - FI fond local dans les microréseaux vides.
- Appliquer un seuil supplémentaire de coupure de 2 à 3 fois la moyenne de la FI de l'ensemble microréseau pour minimiser la probabilité de faux positifs; Ceci est particulièrement pertinent pour les images de microréseaux de mauvaise qualité et de faibles rapports signal sur bruit.
- Créer des parcelles et / ou d'effectuer une analyse plus approfondie que nécessaire.
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Representative Results
Ce travail décrit un test de dosage immunologique multiplex pour l'identification simultanée des espèces d' eau douce de cyanobactéries les plus pertinentes (tableau 1) en utilisant le microréseau d'anticorps CYANOCHIP. La puce peut être un format 3 x 8 microarray imprimée sur des lames de microscope. Chaque microréseau est constitué d'un ensemble de 17 anticorps imprimés dans un motif de tache triple, leurs anticorps pré-immunitaires correspondants et BSA comme témoins négatifs. Les biopuces comprennent un cadre fluorescent, en utilisant un anticorps pré-immun marqué par fluorescence pour localiser facilement le motif de puces à ADN 22 (figure 1).
La puce a été testé dans le domaine de l'analyse in situ des échantillons d'eau prélevés au bord de l'eau douce Lozoya réservoir qui alimente la ville de Madrid. Les échantillons ont été traités comme décrit ci-dessus, etprincipales réactions immunologiques positives correspondaient à des anticorps dirigés contre les cyanobactéries planctoniques, comme Microcystis spp. (K4 et K5) et benthique Oscillatoriales, comme Leptolyngbya spp. (K10 et K15). Des signaux plus faibles de fluorescence ont été obtenus à partir de Nostocales (K6 et K12, deux planctoniques Aphanizomenon spp.), Benthiques Rivularia sp. (K8), Anabaena sp. (K1), et planctoniques Microcystis flos-aquae sp. (K3). observations au microscope optique (non représenté) a montré une communauté de cyanobactéries diversifiée au sein des débris terrigènes abondante du rivage. Plusieurs espèces de Anabaena ont dominé la communauté, mais Microcystis spp. et Pseudanabaena spp. étaient également présents.
En outre, la puce a également été validé par le dosage d'un, près de 1000 ans, tapis microbien sèche recueillie dans le plateau de glace McMurdo en Antarctique pour tester la présence de cyanobactérie markers. La figure 1 montre des réactions fortement fluorescentes, positives dans des anticorps produits benthiques cyanobactérie isolé des autres tapis antarctiques, y compris Anabaena sp. et Leptolyngbya spp. (K14 et K15, respectivement). Immunologiques positifs supplémentaires ont été détectés avec des anticorps dirigés contre les cyanobactéries planctoniques, comme Microcystis spp. (K4 et K5), Aphanizomenon spp. (K6 et K12), et Planktothrix rubescens sp. (K17). Les signaux faibles ont été obtenus à partir d' anticorps à d' autres espèces benthiques isolées dans un tapis, y compris l' Antarctique Tolypothrix sp. (K16) et Anabaena sp. (K1). La microscopie optique fluorescente a révélé la présence de cellules structurellement similaires aux cyanobactéries et les algues vertes (non représenté). Aucun cyanobactérie filamenteuse ont été identifiés. Néanmoins, de multiples structures fluorescentes amorphes d'environ 1 um en taille et une fluorescence diffuse copieuses ont été détectés, WHIch pourrait être attribuée à la présence de restes de cellules (cassé et les cellules mortes) et des substances polymères extracellulaires (EPS), respectivement. Par conséquent, l'analyse biochimique a montré que le tapis se composait de quantités abondantes de biopolymères et des restes de cellules (matière biologique complexe) qui pourraient être des cibles pour les anticorps dans le microréseau.
Figure 1: rapide et fiable Multiplex Microarray Immunoassay pour détecter Cyanobactéries. A) Schéma montrant les principales étapes de la FSMI pour l'analyse des échantillons multi-cibles avec un CYANOCHIP. B) Représentation schématique d'un schéma de motif d'impression (en triple exemplaire) de la collecte des anticorps anti-cyanobactéries: (0) de BSA, l' albumine de sérum bovin; (X) que l'impression tampon; (17/01), chacun des anticorps comme dans le tableau 1 en Blanco et al. 2015 (K1 à K17). De p1 à p17, les anticorps pré-immunitaires correspondants agissent comme témoins. Les rectangles jaunes correspondent à un gradient de tache fluorescente comme une référence de trame. C et D) Image montrant la partie supérieure d'un mille ans tapis microbien sec de la l'image de CYANOCHIP détecter les cyanobactéries dans ce tapis, respectivement McMurdo Ice Shelf (Antarctique) et. E) Vue panoramique de la Lozoya Reservoir montrant l' eau transparente sans particules vertes visibles au moment de l' échantillonnage. Image microarray après l'analyse in situ de l'échantillon d'eau F) (modifié à partir de la référence 22).
| Code Ab | Immunogène (souche) | Commande | Habitat | | Les conditions de culture | |
| K1 | Anabaena sp. | Nostocales | inconnu | BG11 et de nitrate | 30 ºC, la lumière continue |
| K2 | Anabaena sp. | Nostocales | inconnu | BG11o | 30 ºC, la lumière continue |
| K3 | Microcystis flos-aquae | Chroococcales | planctonique | BG11 | 28 ºC, la lumière continue |
| K4 | Microcystis novacekii | Chroococcales | planctonique | BG11 | 28 ºC, la lumière continue |
| K5 | Microcystis aeruginosa | Chroococcales | planctonique | BG11 | 28 ºC, la lumière continue |
| K6 | Aphanizomenon ovalisporum | Nostocales | planctonique | BG11o | 28 ºC, la lumière continue |
| K7 | Phormidium sp. | Oscillatoriales | benthique | BG11 | 18 ºC, 16-8 photopériode |
| K8 | Sp Rivularia. | Nostocales | benthique | CHU-D | 18 ºC, 16-8 photopériode |
| K9 | Sp Chamaesiphon. | Chroococcales | benthique | BG11 | 18 ºC, 16-8 photopériode |
| K10 | Leptolyngbya boryana | Oscillatoriales | benthique | BG11 | 18 ºC, 16-8 photopériode |
| K11 | Tolypothrix distorta | Nostocales | benthique | BG11o | 18 ºC, 16-8 photopériode |
| K12 | aphanizomenoides aphanizomenon | Nostocales | planctonique | BG11o | 28 ºC, la lumière continue |
| K13 | Nostoc sp. (Antarctique) | Nostocales | benthique | BG11o | 13 ºC, 16-8 photopériode |
| K14 | Anabaena sp. | Nostocales | benthique | BG11o | 13 ºC, 16-8 photopériode |
| K15 | Sp Leptolyngbya. | Oscillatoriales | benthique | BG11 | 13 ºC, 16-8 photopériode |
| K16 | Tolypothrix sp. | Nostocales | benthique | BG11 | 13 ºC, 16-8 photopériode |
| K17 | rubescens Planktothrix | Oscillatoriales | planktonic | aucun | aucun |
Tableau 1. Liste des anticorps (ABS) et les souches de cyanobactéries utilisées pour produire les CYANOCHIP 22.
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Discussion
Ici, un dosage immunologique en sandwich en utilisant le multiplex fluorescent CYANOCHIP, un micro - réseau 17-anticorps pour la détection et l' identification d'une grande variété de genres de cyanobactéries, est décrite 22. Ces cyanobactéries représentent les genres benthiques et planctoniques les plus fréquents dans les habitats d'eau douce, certains d'entre eux étant des producteurs de toxines. Récemment, le format de dosage immunologique en sandwich fluorescent a été utilisé pour identifier des micro - organismes et / ou dans des applications environnementales bioanalytes 26, 27, 28. Le protocole est principalement basée sur deux étapes: (i) d'immobilisation ou la capture d'anticorps pour se lier spécifiquement à analyser à partir d'un échantillon de test et (ii) la détection de paires analyte-anticorps en utilisant des anticorps marqués par fluorescence (anticorps traceurs ou détecteur). Étant donné que le dosage de type sandwich nécessite au moins deux sites de liaison d'anticorps accessibles (épitopes) dans l'analyte pourla réaction ait lieu, tout signal fluorescent positif indique la présence d'oligo- ou multimériques analytes relativement importantes et complexes qui sont identiques ou très similaires à celles utilisées pour produire les anticorps de capture.
Même si cette méthode nécessite de petits volumes et la préparation des échantillons de base, sans la nécessité d'une expertise ou des connaissances particulières, plusieurs inconvénients pourraient ruiner le dosage. signaux fluorescents faible ou une absence totale de celui-ci peut être due à la purification d'anticorps pauvres ou mauvaise efficacité de l'étiquetage. Pour l'isolement de l'IgG de lapin, la protéine A est le meilleur choix car il se lie spécifiquement avec un haut rendement à la région Fc des immunoglobulines. Comme indiqué dans la section 4, des anticorps fluorescents avec une gamme d'étiquetage entre 3-7 mole de colorant par mole d'anticorps doivent être utilisés. En outre, l'absence de taches fluorescentes peut être expliquée par la concentration des analytes se trouvant sous la limite de détection. Dans ce cas, l'échantillon peut être concentrated avant l'incubation avec la puce à ADN, ou de plus grandes quantités peuvent être utilisées pour une nouvelle extraction. milieux élevés fluorescents sont le résultat d'un blocage de la puce inefficace et / ou des étapes de lavage et d'extraits d'échantillons composés de minéraux et de matières organiques complexes qui collent sur la puce. Lorsque des échantillons complexes sont utilisés en tant que substances à analyser, il est souhaitable d'augmenter le sel et / ou la concentration de détergent pour favoriser l'interaction spécifique entre les paires d'analyte-anticorps.
Au cours des dernières années, la technologie des microréseaux d'anticorps a été développé pour des applications environnementales. Néanmoins, l'utilisation de cette technique ne comporte certaines limites. Les anticorps polyclonaux sont plus rapides et moins coûteux à produire et, plus important encore, la possibilité de lier tout épitope cible dans un échantillon environnemental complexe sont théoriquement plus élevé qu'avec des anticorps monoclonaux. Cependant, le fait qu'ils peuvent reconnaître des epitopes différents augmente le nombre de réactions croisées dans EFMI. Pour gagner une grande spécificité, l'utilisation de méthodes de démêler ces événements de réactivité croisée des véritables réactions antigène-anticorps parentes en utilisant des méthodes de déconvolution 26, 27, par exemple, est hautement souhaitable. Fondamentalement, le microréseau est considéré comme un biocapteur qualitative pour la détection multiple et la classification des cyanobactéries. À cet égard, il est essentiel de déterminer la limite de détection pour chaque anticorps une par une pour utiliser leurs concentrations optimales de travail dans le dosage. Bien que cette puce à ADN, ainsi que FSMI, n'a pas été conçue comme une méthode quantitative, le biocapteur implique une sensibilité élevée, parce que la limite inférieure de détection de la plupart des anticorps contenus dans le CYANOCHIP 22 est comprise entre 10 2 et 10 3 cellules / mL.
Malgré ces limites, cette méthode présente plusieurs avantages contre d'autres techniques utilisées dans l'environnement mURVEILLANCE. Un anticorps biocapteurs permettent la possibilité de reconnaître des molécules différentes en même temps dans une analyse unique, la possibilité de détecter une faible concentration d'analytes, et la possibilité de produire des anticorps contre pratiquement toute substance. En outre, le micro - réseau peut atteindre jusqu'à 24 analyses dans un seul dosage, avec une limite de détection de 2 à 10 cellules / mL. En comparaison avec d'autres méthodes, des anticorps capables de détecter des cellules vivantes ou mortes, de matériel extracellulaire, et les débris cellulaires. Même si cela prend au moins 4 h pour compléter l'ensemble test, il est plus rapide que les autres méthodes analytiques appliquées à la surveillance environnementale. Le CYANOCHIP a été conçu à l'origine pour l'identification des souches de cyanobactéries. Ce biocapteur n'a pas été officiellement conçu à cette fin, il peut donc identifier les producteurs de toxines potentielles et pourrait être améliorée à l'avenir par l'ajout d'anticorps contre un large éventail de nouvelles souches. dosages biochimiques, tels que ELISA, PPIA et neurochimiqueessais chez la souris, permettent l'identification des cyanotoxines, mais ils sont limités à quelques toxines connues et peuvent donner des faux positifs. En outre, en utilisant la CYANOCHIP ne nécessite pas de formation spéciale, tandis que la microscopie et la souris bioessais optiques nécessitent un personnel qualifié ou le travail de main-d'œuvre avec des animaux vivants, et ils ne donnent pas d'informations sur le type de toxines présentes dans un échantillon. Cyanotoxines peuvent également être identifiés et quantifiés par d'autres méthodes d'analyse, telles que HPLC, GC-MS ou MALDI-TOF. Dans ces méthodes, l'échantillon doit être purifié, et l'absence de normes de référence limite l'identification des cyanotoxines. En outre, les méthodes d'analyse nécessitent des équipements et des fournitures coûteuses et une formation spécialisée. Les méthodes moléculaires sont basées sur l' extraction d'ADN à partir des échantillons, tandis que FSMI exige seulement un extrait environnementale préparé en quelques étapes très simples, sans purification de cyanobactéries.
La haute performance de l'CYANOCHIP pourla détection in situ de cyanobactéries dans les réservoirs d'eau douce, il est un nouvel outil pour l'alerte précoce des administrateurs d'eau. En outre, la puce est aussi intéressant pour le domaine de l'astrobiologie, en particulier pour la recherche de marqueurs microbiens comme preuve de vie. L'étude des extrêmophiles peut nous aider à comprendre l'origine de la vie sur Terre et comment la vie pourrait survivre dans les environnements extrêmes présents dans notre système solaire et au-delà. Comme plusieurs environnements sur la Terre sont très semblables à des endroits sur d'autres planètes, comme Mars, il pourrait être possible de trouver des restes de procaryotes photosynthétiques comme preuves de vie éteintes. La puce a été en mesure d'identifier des marqueurs de cyanobactéries de vivre ou inanimés cellules; de la population demeure et / ou d'un matériau extracellulaire dans les vieux tapis microbiens (figure 1); et de l'eau, le sol et les roches recueillies dans des environnements extrêmes, comme l'Antarctique, Atacama, les lacs andins, l'Extrême-Arctique, ourégion de Rio Tinto en Espagne (non représenté). Considérant que les cyanobactéries sont des micro - organismes primitifs sur Terre, il y a des raisons de croire qu'ils pourraient avoir vécu une fois sur d' autres planètes.
En conclusion, le fait que CYANOCHIP-FSMI peut identifier des marqueurs cyanobactériens in situ et peut même les associer à différents phylotypes ou groupes, et que le microréseau couvre un large éventail d'habitats, y compris ceux de plancton, le benthos, et endolithes, démontre que cette technique pourrait un outil de surveillance de l'environnement. Les améliorations futures à la puce pourrait être d'augmenter le nombre d'anticorps dirigés contre de nouvelles souches afin que les groupes phylogénétiques pertinents encore en attente sont inclus. En outre, la puce peut être mise en oeuvre avec des anticorps dirigés contre des composés de cyanobactéries spécifiques, telles que des toxines ou des polymères cyanophicin. Ceci est particulièrement pertinent pour la surveillance des réservoirs d'eau douce, des tuyaux et des installations dans les établissements humains. Le micr courantoarray et les versions futures seront très utiles dans le domaine de l' astrobiologie, soit pour la détection de la vie ou de la surveillance des installations spatiales humaines (par exemple, la surveillance des réservoirs d'eau ou les systèmes de soutien de la vie). En fait, nous utilisons systématiquement le microréseau dans les campagnes sur le terrain pour les environnements extrêmes, une méthode pour la détection "sur place" de la vie reste. La puce fait partie de la soi-disant vie Detector Chip (LDChip), un microréseau avec plus de 300 anticorps pour la recherche de la vie dans les missions d'exploration planétaires 29, 30. Le microréseau seul ou dans le cadre du LDChip sera mis en œuvre dans les signes de détecteur de vie (SOLIDE) instrument 29 pour valider le concept SOLID-LDChip pour l' exploration planétaire dans les campagnes multiples sur le terrain à des analogues terrestres. Le microréseau fournira des informations utiles en identifiant les cyanobactéries et / ou leurs toxines. En déterminant les souches, il give informations sur les environnements et les habitats dans lesquels ils ont développé.
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Acknowledgments
Nous remercions le Dr Antonio Quesada de l'Universidad Autónoma de Madrid pour fournir des souches de cyanobactéries. Ce travail a été financé par le Subdirección général de Proyectos de Investigación de l'espagnol Ministerio de Economía y Competitividad (MINECO), accorde pas. AYA2011-24803 et ESP2014-58494-R.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 mm pore diameter filters | Millipore | GSWP04700 | For preparation of immunogens |
| Eppendorf 5424R microcentrifuge | Fisher Scientific | For preparation of immunogens | |
| Phosphate buffer saline (PBS) pH 7.4 (10x) | Thermo Fisher Scientific | 70011036 | 50 mM potassium phosphate, 150 mM NaCl, pH 7.4 |
| Ultrasonic processor UP50H | Hielscher | For preparation of immunogens | |
| Complete Freund's adjuvant | Sigma-Aldrich | F5881 | Immunopotentiator |
| Incomplete Freud's adjuvant | Sigma-Aldrich | F5506 | For boost injections |
| Protein A antibody purification kit | Sigma-Aldrich | PURE1A | For isolation of IgG |
| Centrifugal filter devices MWCO<100 kDa | Millipore | UFC510096-96K | For isolation of IgG |
| Dialysis tubings, benzoylated | Sigma-Aldrich | D7884-10FT | For isolation of IgG |
| Illustra Microspin G-50 columns | GE-HealthCare | GE27-5330-02 | For isolation of IgG |
| Bradford reagent | Sigma-Aldrich | B6916-500 mL | To quantify the antibody concentration |
| MicroBCA protein assay kit | Thermo Scientific | 23235 | To quantify the antibody concentration |
| Protein arraying buffer 2x | Whatman (Sigma Aldrich) | S00537 | Printing buffer; 30 - 40% glycerol in 1x PBS with 0.01% Tween 20 |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | Non-ionic detergent |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9418 | Control for printing; blocking reagent |
| 384-wells microplate | Genetix | X6004 | For antibody printing |
| Robot arrayer for multiple slides | MicroGrid II TAS arrayer from Digilab | For antibody printing | |
| Epoxy substrate glass slides | Arrayit corporation | VEPO25C | Solid support for antibody printing |
| Alexa Fluor-647 Succinimidyl-ester | Molecular probes | A20006 | Fluorochrome |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | Fluorochrome dissolvent |
| Heidolph Titramax vibrating platform shaker | Fisher Scientific | For antibody labeling | |
| Illustra Microspin G-50 columns | Healthcare | 27-5330-01 | For purification of labeled antibodies |
| Safe seal brown 0.5 mL tubes | Sarstedt | 72,704,001 | For labeled antibodies storage |
| Nanodrop 1000 spectrophotometer | Thermo Scientific | To quantify antibody concentration and labeling efficiency | |
| 3 µm pore size polycarbonate 47 mm diameter filter | Millipore | TMTP04700 | To concentrate cells |
| 1 M Trizma hydrochloride solution pH 8 | Sigma-Aldrich | T3038 | For TBSTRR preparation; to block slides |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | For TBSTRR preparation |
| 20 µm nylon filters | Millipore | NY2004700 | For environmental extract preparation |
| 10 - 12 mm filter holders | Millipore | SX0001300 | For environmental extract preparation |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8340 | For environmental extract storage |
| 1 M Trizma hydrochloride solution pH 9 | Sigma-Aldrich | T2819 | To block slides |
| Heidolph Duomax 1030 rocking platform shaker | VWR | To block slides; for incubation processes | |
| VWR Galaxy miniarray microcentrifuge | VWR | C1403-VWR | To dry slides |
| Multi-Well microarray hybridization cassette | Arrayit corporation | AHC1X24 | Cassette for 24 assays per slide |
| GenePix 4100A microarray scanner | Molecular Devices | Scanner for fluorescence | |
| GenePix Pro Software | Molecular Devices | Software for image analysis and quantification |
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