Abstract
지구 온난화와 부영양화는 일부 수생 생태계가 신속하고 대규모 시아 노 박테리아의 성장을 유발 true로 생물 반응기를 작동 할; 이 관련 건강과 경제적 결과가 있습니다. 대부분의 시아 노 박테리아 균주는 독소를 생산하며, 단지 몇 세포는 환경에 치명적인 손상을 유도 할 필요가있다. 따라서, 물 바디 당국과 정부는 예방 또는 치료 의사 결정을 지원하기 위해 신뢰할 수있는 데이터를 제공하는 신속하고 효율적인 조기 경보 시스템이 필요합니다. 이 원고는 분류 학적 해상도 (CYANOCHIP) 17 항체 (ABS)와 항체 마이크로 어레이 칩을 사용하여 독소를 생산하는 시아 노 박테리아 균주의에서 필드 검출을위한 실험 프로토콜을보고합니다. 여기에, 17 시아 노 박테리아 균주의 동시 모니터링을위한 멀티 플렉스 형광 샌드위치 마이크로 어레이 면역 (FSMI)이 자주 담수 생태계에 피는 발견, 그들 중 일부는 독소 생산자는 설명한다. 멀티있는 마이크로 어레이PLE CYANOCHIP의 (24까지) 동일한 복제 동시에 샘플의 비슷한 번호를 테스트하기 위해 하나의 현미경 슬라이드에 인쇄되었다. 액체 샘플은 항체 (ABS)과 직접 배양에 의해 또는 1 내지 3 μm의 필터를 통해 여과하여 세포 농도 이후에 테스트 할 수있다. 이러한 퇴적물 접지 바위 고체 시료는, 제 균질화 인큐베이션 완충액 휴대용 초음파에 의해 분산된다. 거친 물질을 제거하기 위해 - (20 μm의 5), 여과와 ABS 배양 그런 다음 여과된다. 면역 반응은 17 형광 표지 복근의 혼합물 최종 인큐베이션 드러난다 휴대용 형광 검출기에 의해 판독된다. 전체 과정은 대부분의 배양이 1 시간주기에 대응하는 약 3 시간 걸린다. 출력은 밝은 반점이 시아 노 박테리아 마커의 양의 검출에 대응하는 이미지입니다.
Introduction
검출하고 복잡한 자연 미생물 지역 사회의 미생물 모니터링 생물 의약, 환경 생태, 그리고 우주 생물학 등 많은 분야에서 중요하다. 조수의 셀 꽃 (과도 증식)을 형성하는 능력에 대해 공지의 원핵 미생물은 박테리아이다. 그들은 어디에나있다, 많은 종은 인간의 건강에 대한 잠재적 인 위험뿐만 아니라, 생태에 미치는 영향에뿐만 아니라 선도, 독소를 생성 할 수 있습니다. 이 점에서, 박테리아 및 / 또는 토양, 물에서의 독소의 조기 발견을위한 빠르고 민감한 방법을 개발하는 것이 필수적이다. 물 관리자가 적절한 물 관리 프로그램을 구현하는, 그 결과, 의사 결정을 도울 수 있도록이를 위해, 멀티 플렉스 형광 마이크로 어레이 샌드위치 면역 측정법 (FSMI)의 도구로 개발되고있다.
방법의 다양한 범위는 감지 시안 식별하기 위해 개발되었다광학 현미경, 분자 생물학 및 면역 학적 기술을 포함한 토양과 물에 obacterial 세포와 cyanotoxins. 이러한 방법은 그들이 제공하는 정보에 크게 다를 수 있습니다. 현미경 기술은 세포 형태 및 피코시 아닌 색소 등의 시아 노 박테리아로부터 생체 내 형광 감지 또는 1 클로로필에 기초한다. 그들은 유형과 샘플에 존재하는 시아 노 박테리아의 수에 대해 알려 실시간 자주 모니터링을위한 신속하고 저렴한 방법이 있지만, 그들은 잠재적 독성에 대한 정보를 제공하지 않습니다. 또한, 그들은 종종 밀접한 관련 종이 구별하기가 매우 곤란하다는 점을 감안하면, 전문의 특정 수준을 필요로한다. 이러한 한계를 극복하기 위해 광학 현미경은 생물학 및 생화학 검사 분석 및 cyanotoxins의 식별 및 정량 물리 화학적 방법 모두 동반해야합니다.
분자 기반 방법은 게놈 데이터베이스에 게시 된 순서 정보 덕분에, 탐지, 식별 및 시아 노 박테리아와 해당 cyanotoxins을 정량화하기 위해 수십 년 동안 적용되어왔다 (예를 들어, 생명 공학 정보, NCBI을위한 국립 센터). 이들 방법 중에서 DNA 증폭 용 프라이머 세트의 설계를 필요로하고 다른 시아 노 박테리아 종의 DNA 시퀀스의 사전 지식에 의존하는 중합 효소 연쇄 반응 (PCR)에 기초한 것들이다. 유전자 검출은 피코시 아닌 오페론 같은 속 레벨에서의 정확한 식별을 초래하지만, 어떤 종 또는 균주와 들키지있다이 방법. 그러나, 예를 들면 마이크로 시스틴 오페론에 속하는 것과 같은 독소를 코딩하는 유전자, 생산자는 5 부족하다 시료에서 독성 물질의 식별을 용이하게한다. 그럼에도 불구하고, PCR에 의한 독소 마커의 검출은 반드시 환경에 독성을 의미하지는 않습니다. 또한, 시료에 존재하는 박테리아 독소 생산 종의 전체 범위를 분석하기 위해 개발 된 프라이머 세트는 아직 완전하지 않으며, 추가적인 연구가 알려지지 종을 식별하기 위해 수행되어야한다. 다른 분자 기술 등 현장 하이브리드 (FISH) 및 DNA 마이크로 어레이에 형광 같이-PCR 비를 기준으로합니다.
지난 20 년 동안, 마이크로 어레이 기술은 특히 환경 모니터링, 응용 프로그램의 많은 분야에서 중요성을 얻고있다. DNA 마이크로 어레이는 종과 분석 (4) 사이의 차별, 6, 7 허용 SUP>, 8, 9, 10, 그들은 거의 힘들고 시간 소모적 인 다단계 (예를 들어, 마이크로 어레이 성능 DNA 추출, PCR 증폭 및 혼성화) 관련 태스크를 고려한다. 그 때문에, 예컨대 샌드위치 경쟁 면역 마이크로 어레이와 같은 항체를 기반으로 적은 시간을 소모 분석은 여러 환경 분석 11 (12, 13)의 검출을위한 필수적인 안정적인 높은 처리량 방법이되었다. 항체의 기능을 구체적으로 타겟 화합물을 인식하고 거의 모든 물질에 대한 항체를 생산할 수있는 가능성과 함께, 분석 및 단백질의 적은 양을 검출, 항체 마이크로 어레이를 환경 적 용도를위한 강력한 방법을 만든다. 또한, 배수를 달성하는 능력은로 분석화롯불의 분석은, PPM로 PPB에 이르기까지 검출 한계,이 방법 (14)의 주요 장점 중 하나입니다.
항체 기반의 바이오 센서는 환경 모니터링 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 병원균 독소의 넓은 범위의 검출에 민감하고 신속한 도구로 입증되었다. DNA 방법은 여러 단계를 포함하는 반면, 항체 기반의 마이크로 어레이는 주로 적절한 용액 버퍼 짧은 용해 공정을 기반으로 작은 시료 전처리를 필요로한다. Delehanty 및 Ligler 15 4 PPB의의 단백질 농도를 검출 할 수있는 항체 샌드위치 면역 분석에 기초하여 단백질과 복합 혼합물 세균 분석 물의 동시 검출을보고D 10 4 CFU / 세포의 용액. Szkola 등. (21)는 생물학적 전쟁에 사용될 수 proteotoxins 작은 독소, 화합물의 동시 검출을위한 저렴하고 신뢰할 수있는 다중 마이크로 어레이를 개발했다. 그들은보다 20 분에서 3 PPB의 검출 한계로, 리신 독소의 농도를 감지했습니다. 최근 CYANOCHIP 독성 및 독성 박테리아의 시츄 검출, 항체 마이크로 어레이 기반 바이오 센서 (22)를 설명 하였다. 이 마이크로 어레이는 주로 현미경으로 식별하기 어려운 수생 환경에서 잠재적 인 시아 노 박테리아 꽃의 식별이 가능합니다. 심지어 종 레벨에서 다중 검출 및 박테리아의 식별을위한 비용 - 효과적인 수단이 바이오 센서로 선회 가장 종 × 103 세포 - 마이크로 어레이의 검출 한계는 10 2이다. 이러한 모든 속성은 antibo을DY 마이크로 어레이 기술이 연구에서 제시된 방법은 특히,보다 신속하고 간단한 방법은 상기 기술들에 비하여.
이 작업은 토양, 물 샘플에서 박테리아의 존재를 검출하기위한 마이크로 어레이, 항체 기반의 바이오 센서를 사용하는 실험의 두 가지 예를 나타낸다. 매우 작은 샘플 볼륨과 매우 기본적인 시료 전처리를 필요로하는 샌드위치 면역 분석법 포맷에 기초하여 간단하고 신뢰할 수있는 방법이다. 이 방법은 짧은 시간을 필요로하고 현장에서 쉽게 수행 될 수있다.
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Protocol
면역원 1. 준비
- 표 1에 기재된 조건 하에서 해당 배지에서 각각 시아 노 박테리아 균주를 성장한다.
참고 : 각 시아 노 박테리아 균주에 대한 성장 매체와 문화 조건은 표 1에 나열되어 있습니다. 모든 시아 노 박테리아 균주, K17를 제외하고, 자치시 대학 (마드리드, 스페인)에서 안토니오 사다의 그룹에 속한다. Planktothrix의 rubescens에 대한 항체는 Vilasouto 저수지 (북부 스페인)에서이 cyanobacterium의 특이 꽃의 자연 시료에서 생성되었습니다. - 늦은 지수 또는 고정 성장 단계의 배양으로 약 108 세포 / ㎖를 얻기 위해 광학 현미경으로 세포 계수 챔버를 이용하여 세포 수를 정량화.
- 5 분 2,000 XG에 원심 분리하여 문화의 5 ㎖에서 수확 세포.
- 뜨는을 취소하고 10 ML의 욕조에서 세포를 재현 탁1X 인산 완충 생리 식염수 5 ㎖ (1X PBS)와 E는 / ㎖를 약 108 세포를 얻었다.
- 균질화 및 휴대용 핸드 헬드 초음파 처리기를 사용하여, 얼음에 30 내지 60-S, 일시 정지, 5 회, 30 초마다 초음파 처리하여 현탁액의 용균 또는의 수욕에 튜브를 침지하여 최대 진폭 (30 kHz에서)에서 셀 계 장애.
- cyanobacterium의 각 변형 1.5 - 반복 1.3 단계를 반복합니다.
주 : 초음파 처리가 세포 분열 및 세포 콘텐츠 자료를 생산하고 있습니다. 단백질과 다당류는 지질 및 핵산 좋은 면역원, 특정 분자가 있지만, 그들 자신에 의해 체액 성 면역 반응을 유도하지 않습니다. 따라서, 이들은 분자의 복잡성을 증가시키는 등의 다당류 나 단백질 등의 담체에 결합한다. 또한, 초음파 항체 생산을 트리거 할 수 있습니다 세포 내 물질을 해제합니다.
폴리 클로 날 항체 2. 생산
- 첫 번째 IMM 준비완전 프로 인트 보조제 0.5 ㎖의 단계 150에서 얻어진 초음파 파쇄 0.5ml를 혼합하여 투여 unogen. 다중 클론 토끼 항체 생산 용 동물 시설의 오퍼레이터에게 제공한다.
- 불완전 프로 인트 보조제 0.5 ㎖의 단계 150에서 얻어진 동일한 파쇄 / 해물을 0.5 mL로 혼합하여 항체 생산 공정 메모리 부스트로서 더 사용 전과 3 개의 투여 량을 준비한다. 항체의 제조 방법을 수행하기 위해 동물 시설에 보내기.
- 반복 2.1 및 각각의 새로운 항체 생산 공정에 대한 2.2 단계를 반복합니다.
참고 : 적절한 라이선스 및 교육을 동물로 작업해야하기 때문에 일반적으로 항체 생산, 전문 동물 시설이나 회사에 위탁된다. 회사는 혈청 시료 내에 존재하는 항원 - 특이 적 항체의 양의 상대적 효소 면역 분석법 (ELISA) 측정을 공급한다.
3. 항체을 정제ication
- 면역 단백질-A 친화도 크로마토 그래피에 의해 2 단계에서 수집 된 예비 면역 혈청 모두에서 면역 글로불린 G (IgG의) 부분을 정제. 일부 상용 정제 키트, 카트리지 시스템을 기반으로, 잘 작동; 공급자의 지침을 따르십시오.
- 정제 키트 탈염 시스템을 제공하지 않는 경우, 투석 또는 100 kDa의 (또는 그 이하) 막 공극 크기 원심 여과 장치를 이용하여 역시 PBS를 0.1X하는 정제 된 항체의 용출 버퍼를 변경.
- 280 nm에서 흡광도를 측정함으로써 또는 브래드 퍼드 (23) 라 24 또는 Bicinchoninic 산 (BCA) 25 비색 방법을 사용하여 항체 농도를 결정한다.
주 : 그들은 에폭시기로 활성화 된 고체 표면에 대한 결합에 대해 항체와 경쟁하기 때문에, 용출 버퍼 (예, 트리스 완충액) 아민기를 포함하지 않도록하는 것이 중요하다. 푸 후rification ELISA로 항체의 활성을 시험하는 것이 중요하다.
4. 형광 항체 라벨링
- 디메틸 술폭 시드 100 μL (DMSO)로 표지 한 단백질 mg의 염료를 함유하는 상업적 바이알을 용해하여 형광 색소 (예를 들어, 원적외선 형광 염료)와 (3)에서 얻어지는 정제 항체를 라벨. 50mM의 인산 완충 식염수 (PH 8.5) 50 μL의 최종 부피에 2 ㎎ / ㎖의 농도에서 각각의 항체 제조에 용해 된 염료의 2 μL를 추가한다.
- 주위 온도에서 1 시간 및 진동 플랫폼에서 1,200 rpm으로 연속 교반하에 라벨 반응을 유지한다.
- 크기 배제 크로마토 그래피에 의해 표지 된 항체를 정제하여 (예를 들어, 컬럼에 포획 1.5 내지 30 kDa의 사이에 분별 범위의 겔을 사용하는) 제조업체 권고 다음.
- 280 nm에서와 용출액에서 650 nm에서의 흡광도를 측정하고 라베를 계산공급 업체의 권장 사항은 다음 링의 효율성.
참고 : 최대 50 × 50가-μL 항체 - 라벨 반응은 단백질의 표지 1 mg을위한 형광 염료의 단일 유리 병으로 수행 할 수 있습니다. 4.3 단계 후 담금질 처리를 피하기 위해 불투명 0.5 ㎖의 튜브를 사용하여, 또는 알루미늄 박이나와 튜브를 덮도록 권장된다. 의 IgG 항체의 경우, 최적의 라벨은 항체의 몰 당 3-7 몰의 염료에 의해 달성된다.
5. CYANOCHIP 생산
- 인쇄 액의 항체 및 컨트롤
- 0.01 % (v / v)의 트윈 20 (비 - 이온 성 세제), 최종 농도로서 모두와 상용 1X 단백질 인쇄 버퍼에 1 ㎎ / ㎖에서 각각의 항체를 혼합하여 인쇄 솔루션의 각 정제 된 항체 30 μL를 준비한다.
주 : 대안 적으로, 항체 용액을 20 % 글리세롤, 1 % 수크로오스 (또는 트레할로스, 보존제 등), 0.01 % (/ V w) (v / v)의 탄산 완충액 트윈 20 (PH 8.5)를 포함 할 수있다. - 30 μL 컨트롤과 같은 프린팅 용액의 준비 : 1 밀리그램 (a) 1X 단백질 인쇄 버퍼 0.01 % (v / v)의 트윈 20, (b) 단백질 정제 된 예비 면역 혈청 / 1X 단백질 인쇄 버퍼와 용액 0.01 % (v / v)의 트윈 20, 1 밀리그램 (c) 소 혈청 알부민 (BSA) / ㎖의 0.01 %와 1X 단백질 인쇄 버퍼 (v / v)의 트윈 20.
- (예를 들어, 1 μg의 / mL의 50 μg의 / ㎖에서) 트윈 (20) 1 배 단백질 인쇄 버퍼, 단계 5.1.1에서와 같이 서로 다른 농도에서 형광 표지, 정제 미리 면역 혈청의 30 μL를 준비합니다. 이 샘플은 형광 프레임 마커로 및 안보 후 상대 형광 정량에 사용됩니다.
- 폴리 프로필렌과 같은 고품질로 384 웰 마이크로 마이크로 어레이 제조 30 단계 5.1.1, 5.1.2에서 제조 한 인쇄 용액 웰 당 μL 및 5.1.3 추가.
주 : 단백질 인쇄 버퍼는 항체의 품질과 안정성을 증가시키고, 트윈 20은 스폿 모 균일화rphology 및 단백질 커플 링까지를 구축합니다. 사용하기 전에 4 ° C에서 384 웰 마이크로 플레이트를 유지하는 것이 좋습니다. 오랜 시간 동안 -20 ° C에서 보관합니다. 폴리 프로필렌은 낮은 DNA, 단백질, 세포 추출물 및 고유 바인딩 작은 분자를 가지고있다.
- 0.01 % (v / v)의 트윈 20 (비 - 이온 성 세제), 최종 농도로서 모두와 상용 1X 단백질 인쇄 버퍼에 1 ㎎ / ㎖에서 각각의 항체를 혼합하여 인쇄 솔루션의 각 정제 된 항체 30 μL를 준비한다.
- 현미경 슬라이드 상에 항체 인쇄
주 : 접촉 분할 바늘 또는 압전 프린터 또는 "잉크 젯"기술로서 비접촉 형 장치와 같이, 서로 다른 배열의 플랫폼을 사용하여 활성화 된 현미경 슬라이드 상에 항체를 출력한다. 이 작품에서, CYANOCHIP는 정기적으로 μm의 규모에 항체의 거리 nL 수량에 얼룩을지게 할 수있는 로봇 시스템 (Arrayer에)를 사용하여 접촉에 의해 인쇄되어 있습니다.- 상대 습도 50 % - 20 ° C, 40 행의 인쇄 실내의 환경 조건을 설정한다.
- 슬라이드 기판을 설정 (예를 들어, 75- × 25-mm 에폭시 활성화 현미경 유리 슬라이드는) 여러 동일한 항체 ARRA을 수행 할 수각 슬라이드에 YS.
- 중으로 스폿 패턴 제어 및 기준 프레임을 포함하여 각각의 정제 된 항체를 스폿; 직경이 200㎛ - 이러한 조건에서, 스폿 (180)이다.
- 인쇄 후, 4 ℃에서 보관 한 후이를 건조 수 있도록 주변 온도에서 적어도 30 분 동안 슬라이드를두고; 현장에서의 작업에 대한 상기 슬라이드를 반송 할 수 있고, 몇 달 동안 주위 온도에서 저장된다.
주 : CYANOCHIP는 슬라이드 당 3 × 8 동일한 마이크로 어레이 또는 1 × 9 마이크로 어레이 형식으로 9 동일한 배열을 가진 세중 자리 마이크로 어레이 형식으로 인쇄됩니다. 각 배열의 크기는 24 웰 개스킷 (3 × 8 혼성화 챔버 내에서 일반적으로 7.5 X 6.5 mm)에 대한 반응 챔버의 크기보다 클 수 없습니다해야합니다. - 환경 시료를 분석하는 마이크로 어레이를 사용하기 전에 적정 곡선의 각 항체 작용 희석액을 결정 FSMI를 사용한다. 각 항체에 대해 해당 IMM 표준 농도를 사용하여unogen (3월 10일에서 4월 10일까지 세포 / ㎖) 및 형광 항체의 연속 희석 (1 내지 500 및 1 : 32,000). 최적의 항체 농도는 적정 곡선에서 얻어진 최대 신호 강도의 50 %에 상당한다. 블란 등의 알에 기재된 바와 같이 또한, 각 항체에 대한 민감도와 특이도가 결정되어야한다. 22.
형광 샌드위치 마이크로 어레이의 면역을위한 환경 다중 동시 추출 6. 준비 (FSMI)
- 액체 샘플에서 다중 동시 추출
- (물이 저수지의 해안에서, 예를 들어 물) 멸균 주사기로 액체 시료 100 mL에 - 1을 시료의 양이 대상의 전위 농도에 따라 크게 좌우된다.
- 3 ㎛의 기공 크기, 47 mm 직경의 폴리 카보네이트 필터를 통해 물이 샘플을 통과시켜 세포를 농축; 휴대 농도(3) 10 내지 - 108 세포 / ㎖의 양성 검출하는 것이 바람직하지만, 실제 농도는 알려져 있지 않다.
- 그것을 긁어; 변형 TBS 버퍼 1 ㎖, 트윈 20 보강 완충액 (0.4 M 트리스 -HCl (pH를 8), 0.3 M의 NaCl, 0.1 % 트윈 20 TBSTRR)와 필터에 수집 된 매스를 복구 15 ML의 튜브에 주걱.
- 균질화 또는 바로 아래로 여러 번을 피펫 팅에 의해 단계 1.5에 기재된 바와 같이, 휴대용 초음파 처리를 이용하여 해리하는; 이는 마이크로 어레이 분석을 위해 샘플을 준비한다.
- 고체 시료에서 다중 동시 추출
- 10 ㎖의 튜브에 고체 시료 0.5 g (예를 들면, 바위, 토양 또는 퇴적물)까지 달아 TBSTRR 2 용액을 추가 할 수 있습니다.
- 강력한 초음파 처리 혼 수조로 튜브를 침지함으로써, 또는 휴대용 초음파 처리기를 사용하여, 상기 튜브에 소니 케이 터 프로브를 침지시켜 초음파 처리. 적어도 5 × 30의를 수행얼음 동안 30 초 동안 정지 30 kHz의에서 사이클.
- 10 - 12 mm 직경에 연결된 10 mL의 주사기 -5- 20 μm의 공경 나일론 필터 홀더 모래, 점토, 기타 거친 물질을 제거하는 필터. 1.5 mL의 튜브에 필터를 통해 샘플을 누릅니다. 필터가 포화되면, 주사기의 현탁액을 교반하고 새에 가지고; 이 면역 분석 (단계 7)에 여과 재료를 준비한다.
주 : TBSTRR의 완충 능력은 시료의 종류에 따라 다릅니다. 이는 분석 물질의 효소 분해의 영향을 피하기 위해 환경 추출물의 제조 직후 면역 측정법을 수행하는 것이 중요하다. 대안으로, 다음 단계까지 -80 ℃에서 환경 추출물 및 동결로 프로테아제 억제제를 추가한다.
7. 형광 샌드위치 마이크로 어레이 면역 (FSMI)
- CYANOCHIP 차단
참고 : 즉시 사용하기 전에 페이지를 처리rinted 슬라이드 모든 자유 에폭시기를 차단 및 비 - 공유 결합 된 항체의 잉여를 제거하는 슬라이드.- 5 %와 0.5 M 트리스 - 염산 (pH를 9)에 마이크로 어레이를 담가 5 분 로커 플랫폼에서 온화한 교반과 함께 깨끗한 표면에 BSA 용액 (예를 들어, 페트리 접시 또는 50 mL의 관) (/ V w). 또는, 직면하고있는 마이크로 어레이의 관광 명소와 상기 용액의 100 ~ 200 μL에 드롭에 아래로 슬라이드를 배치합니다. 3 남겨 - 5 분 후 진행합니다.
- 조심스럽게 플라스틱 스쳐 집게를 사용하여 슬라이드를 선택; 감동 마이크로 어레이 영역을 피하려고. 부드럽게 종이 타월에 슬라이드를 노크하여 액체의 초과를 제거합니다. 2 %와 0.5 M 트리스 - 염산 (pH를 8) 로커 플랫폼에서 온화한 교반과 함께 30 분 동안 (w / v)의 BSA 용액에 담가.
- 현미경 슬라이드에 적합한 시판의 microcentrifuge 사용 - (1 분 동안 300 XG 200) 짧은 원심 분리를 수행하여 슬라이드를 건조. 또한, 부드럽게 ONT 노크하여 슬라이드를 건조OA 종이 수건.
- 마이크로 어레이와 다중 동시 샘플 추출물의 배양
- 다수의 마이크로 어레이 24 우물과 상업 마이크로 어레이 혼성화 카세트에서 슬라이드를 설정; 공급자의 지침을 따르십시오.
- 슬라이드와 카세트 조립 후, 시료 추출물 또는 카세트의 각 웰에 TBSTRR에서의 희석액 50 μL까지 피펫.
- 각 샘플 단계를 반복 7.2.2 분석한다.
- 빈 대조군으로 TBSTRR 피펫 50 μL 카세트 중 적어도 두 개의 분리 된 웰로 버퍼.
- 매 15 분 또는 피펫 온화한 진탕을 남겨 혼합하면서 주위 온도에서 1 시간 동안 인큐베이션. 또한, 4 ℃에서 12 시간 동안 배양.
주 : 마이크로 어레이 패턴의 함수로 다른 배양 가스켓을 사용합니다. 시간 단계 7.2.5의 배양 온도는 통상의 친 화성 및 결합 KI에 의존 경험적 파라미터들이다각각의 동력학은 항원 - 항체를 쌍.
- 세탁
- 아래 카세트를 넣고 조심스럽게 깨끗하고 흡수성 종이에 그것을 노크하여 샘플을 제거합니다.
- 위와 같이, 각 사람에게 TBSTRR 150 μL를 추가하여 우물을 세척하고, 버퍼를 제거한다.
- 단계를 반복 7.3.2 세 번 이상.
- 형광 검출기 항체 배양
- 17 항 시아 노 박테리아 - 변형 항체를 포함하는 항체 혼합물의 50 μL를 추가, 각각 1 % (w / v)의 BSA와 TBSTRR의 형광 색소로 표지. (0.7 μg의 2 / ㎖로) 혼합물을 각 형광 항체의 농도를 측정 각 항원 / 항체 쌍 (22)의 적정 실험을 수행하여.
- 단계 7.2.5에서 설명하는, 4 ℃에서 12 시간에 관해서는, 주위 온도에서 1 시간 동안 배양.
- 형광 항체를 세척 <> / 강해
- 단계 7.3에서와 같이, 형광 언 바운드 항체를 제거합니다.
- 카세트를 분해하고 빠른 헹굼 용 (50 ㎖의 튜브 예) 0.1X PBS로 슬라이드를 담가.
- 단계 7.1.3에서와 같이 슬라이드를 건조시킵니다.
형광 8. 검색
- 형광을위한 스캐너에서 멀리 붉은 형광 염료의 최대 발광 형광 피크에서 형광의 슬라이드를 스캔합니다. 일반적으로, 레이저 이득 값을 낮춤으로써, 다른 주사 파라미터의 마이크로 어레이의 여러 이미지를 가라.
참고 : 피 포화 반점 (> 65,000 형광 카운트) - 그들은 규모에서하고 정량화 오류가 발생할 수 있습니다.
9. 이미지 프로세싱 및 데이터 분석
- 이미지 분석 및 정량화를위한 상용 소프트웨어를 사용; E의 (하나의 지점에서 모든 픽셀의 평균 또는 중앙값 FI) 소프트웨어는 형광 강도의 측정을 제공한다전체 마이크로 어레이의 ACH 지점. - FI 지역 배경 FI = FI의 자리 : 스팟 주변 지역의 배경을 뺍니다.
- FI 데이터를 저장하고 스프레드 시트 프로그램을 사용하여 엽니 다.
- 거짓 탐지를 확인하고 폐기하는 음성 대조군으로 빈 배열에 대해 얻은 값을 사용합니다. 각 항체 지점에 대한 FI 계산하려면 다음 방정식을 적용 : - FI 샘플 = FI 지점 - 마이크로 어레이에서 FI 지역 배경 샘플 추출 및 빈 FI = FI 지점 실행 - FI = (FI 빈 FI 샘플) FI 지역 배경 빈 마이크로 어레이한다.
- 2-에 추가적인 차단 임계 적용 위양성의 가능성을 최소화하기 위해 마이크로 어레이 전체의 FI의 평균을 3 배; 이는 열악한 품질의 마이크로 어레이 이미지 및 낮은 신호대 잡음비에 특히 적합하다.
- 플롯을 생성 및 / 또는 필요에 따라 추가 분석을 수행합니다.
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Representative Results
이 작품은 CYANOCHIP 항체 마이크로 어레이를 사용하여 가장 관련성이 담수 시아 노 박테리아 종의 동시 식별 (표 1)에 대한 다중 면역 테스트를 설명합니다. 마이크로 어레이는 현미경 슬라이드에 인쇄 된 3 × 8 마이크로 어레이 형식이 될 수 있습니다. 각각의 마이크로 어레이는 음성 대조군으로 A A 세중 자리 패턴 인쇄 (17) 항체의 설정, 해당 사전 면역 항체 및 BSA로 구성되어 있습니다. 마이크로 어레이는 마이크로 어레이 쉽게 패턴 (22) (도 1)를 현지화하는 형광 표지 미리 면역 항체를 이용하여 형광 프레임을 포함한다.
마이크로 어레이는 마드리드의 도시를 공급하는 담수 Lozoya 저수지의 해안에서 수집 물 샘플의 현장에서 분석을 위해 현장에서 테스트되었습니다. 샘플은 전술 한 바와 같이 처리하고 있었다메인 긍정적 인 면역 반응은 Microcystis 종으로 플랑크톤 시아 노 박테리아, 항체에 맞습니다. (K4 및 K5) 및 Leptolyngbya 종으로 Oscillatoriales을, 저서하기. (K10과 K15). 낮은 형광 신호는 Nostocales (K6과 K12,이 플랑크톤 아파 니조 종.), 저서 Rivularia 특검팀에서 얻었다. (K8), Anabaena 특검팀. (K1), 및 플랑크톤 Microcystis 플로 - 아쿠아 특검팀. (K3). 광학 현미경 관찰 (도시 생략) 해안에서 풍부한 terrigenous 파편 내의 다양한 커뮤니티 시아 노 박테리아를 나타내었다. Anabaena의 몇몇 종은 지역 사회,하지만 Microcystis 종을 지배했다. 및 Pseudanabaena 종. 또한 참석했다.
또한, 마이크로 어레이는 시아 노 박테리아 엄마의 존재를 테스트하기 위해 남극의 맥머도 빙붕에서 수집 건조, 거의 1,000 년 된 미생물 매트을 분석에 의해 검증되었다rkers. 그림 1은 Anabaena 특검팀 포함한 다른 남극 매트, 분리 시아 노 박테리아를 저서에 생성 된 항체의 높은 형광등, 긍정적 인 반응을 보여줍니다. 및 Leptolyngbya 종. (각각 K14 및 K15). 추가 긍정적 인 면역 반응은 Microcystis 종으로 플랑크톤 시아 노 박테리아, 항체 검출되었다. (K4 및 K5), 아파 니조 종. (K6과 K12), 그리고 Planktothrix는 SP는 rubescens. (K17). 낮은 신호는 Tolypothrix SP에 포함 남극 매트에 고립 된 다른 저서 종에 대한 항체로부터 얻었다. (K16)와 Anabaena 특검팀. (K1). 형광 광학 현미경 박테리아 및 녹조류 구조적으로 유사 세포의 존재를 밝혀 (도시하지 않음). 어떤 사상 시아 노 박테리아가 확인되지 않았다. 그럼에도 불구하고, 약 1 μm의 크기와 풍부한 확산 형광의 여러 비정질 형광 구조가 검출되었다, WHI채널은 각각 셀 유적의 존재 (부서지고 죽은 세포) 및 세포 외 고분자 물질 (EPS)에 기인 할 수있다. 따라서, 생화학 적 분석은 매트 생체 고분자 및 마이크로 어레이에서 항체의 대상이 될 수 세포 유적 (복잡한 생물학적 물질)의 넘치 양의 구성 것으로 나타났다.
그림 1 : 감지 시아 노 박테리아에 대한 신속하고 신뢰할 수있는 멀티 플렉스 마이크로 어레이 면역. A) 방식은 CYANOCHIP 다중 대상 시료의 분석을위한 FSMI의 주요 단계를 도시. B) 중으로 의해 인쇄 패턴 레이아웃의 도식 () 항 박테리아 항체 컬렉션 (0) BSA 소 혈청 알부민; 전용 버퍼를 인쇄 (X); (1-17)에 대한 항체를 각각 B 표 1에LANCO 등. 2015 년 (K17에 K1). P1에서 P17에 대응하는 사전 면역 항체 제어 역할을합니다. 노란색 사각형 프레임 기준으로 형광 자리 구배에 해당합니다. 맥머도 빙붕 (남극) 각각이 매트에 시아 노 박테리아 검출 CYANOCHIP 이미지에서 1,000 년 된 건조 미생물 매트의 상단 부분을 나타내는 C와 D) 그림. E)를 Lozoya 저수지 샘플링시 눈에 보이는 녹색 입자와 투명 한 물을 도시의 전경. F) 물 샘플의 현장에서 분석 한 후 마이크로 어레이 이미지 () 참조 (22)에서 수정했습니다.
| AB 코드 | 면역원 (주) | 주문 | 서식지 | | 배양 조건 | |
| K1 | Anabaena 특검팀. | Nostocales | 알 수 없는 | BG11 및 질산 | 30 ºC, 지속광 |
| K2 | Anabaena 특검팀. | Nostocales | 알 수 없는 | BG11o | 30 ºC, 지속광 |
| K3 | Microcystis 플로 - 아쿠아 | Chroococcales | 플랑크톤 | BG11 | 28 ºC, 지속광 |
| K4 | Microcystis의 novacekii | Chroococcales | 플랑크톤 | BG11 | 28 ºC, 지속광 |
| K5 | Microcystis aeruginosa의 | Chroococcales | 플랑크톤 | BG11 | 28 ºC, 지속광 |
| K6 | 아파 니조 ovalisporum | Nostocales | 플랑크톤 | BG11o | 28 ºC, 지속광 |
| K7 | Phormidium 특검팀. | Oscillatoriales | 저서 | BG11 | 18 ºC, 16-8 광주 |
| K8 | Rivularia 특검팀. | Nostocales | 저서 | CHU-D | 18 ºC, 16-8 광주 |
| K9 | Chamaesiphon 특검팀. | Chroococcales | 저서 | BG11 | 18 ºC, 16-8 광주 |
| K10 | Leptolyngbya의 boryana | Oscillatoriales | 저서 | BG11 | 18 ºC, 16-8 광주 |
| K11 | Tolypothrix의 distorta | Nostocales | 저서 | BG11o | 18 ºC, 16-8 광주 |
| K12 | 아파 니조 aphanizomenoides | Nostocales | 플랑크톤 | BG11o | 28 ºC, 지속광 |
| K13 | Nostoc 특검팀. (남극) | Nostocales | 저서 | BG11o | 13 ºC, 16-8 광주 |
| K14 | Anabaena 특검팀. | Nostocales | 저서 | BG11o | 13 ºC, 16-8 광주 |
| K15 | Leptolyngbya 특검팀. | Oscillatoriales | 저서 | BG11 | 13 ºC, 16-8 광주 |
| K16 | Tolypothrix 특검팀. | Nostocales | 저서 | BG11 | 13 ºC, 16-8 광주 |
| K17 | Planktothrix의 rubescens | Oscillatoriales | planktoNIC | 없음 | 없음 |
표 1. 항체 (ABS)과 CYANOCHIP (22)를 생성하는 데 사용되는 시아 노 박테리아 균주의 목록입니다.
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Discussion
여기서, CYANOCHIP, 시아 노 박테리아 장군의 넓은 범위의 검출 및 식별을 위해 17 항체 마이크로 어레이를 이용하여 멀티 플렉스 형광 샌드위치 면역 검정은 22를 설명한다. 이 시아 노 박테리아는 담수 서식지에서 그들 중 일부있는 독소 생산을 가장 많이 저서 및 플랑크톤 장군을 나타냅니다. 최근, 형광 면역 샌드위치 형식 애플리케이션 환경 (26, 27, 28)를 미생물 및 / 또는 bioanalytes를 식별하는 데 사용되어왔다. 프로토콜은 주로 두 단계에 기초한다 : (I) 특히 시료로부터 분석 대상 물질에 결합하는 항체를 고정화하거나 캡처 (II)의 형광 표지 된 항체 (탐침 또는 검출 항체)를 사용하여 분석 물질 - 항체 쌍을 검출. 샌드위치 분석은 대한 분석에 적어도 두 개의 액세스 항체 결합 부위 (항원)이 필요하기 때문에반응은 임의의 양의 형광 신호는 동일하거나 포획 항체를 생성하는데 사용 된 것과 매우 유사하다 비교적 크고 복잡한 다량 체 올리고 또는 분석 물의 존재를 나타낸다 일어나야한다.
이 방법은 특별한 전문 기술이나 지식 없이도 작은 볼륨 및 기본 샘플 준비가 필요하더라도, 몇 가지 단점 분석을 망칠 수 있습니다. 낮은 형광 신호 또는 완전한 부족은 그 가난한 항체 정제 또는 불량 라벨 효율성에 기인 할 수있다. 그것은 특히 면역 글로불린의 Fc 영역을 고효율로 결합하기 때문에 토끼의 IgG의 분리를 들어, 단백질 A는 최선의 선택이다. (4)에 나타낸 바와 같이, 항체의 몰 당 3-7 몰의 염료와 표지 범위의 형광 항체를 이용해야한다. 또한, 형광 반점의 부족이 검출 한도 미만 누워 분석 물의 농도에 의해 설명 될 수있다. 이 경우, 샘플은 진한 될 수entrated 마이크로 어레이 또는 더 많은 양으로 배양 전에 새로운 추출을 위해 사용될 수있다. 높은 형광 배경이 비효율적 칩 차단 및 / 또는 세정 단계의 상기 칩에 부착 미네랄 복잡한 유기 물질로 이루어진 샘플로부터 추출의 결과이다. 복소 샘플은 분석 물로서 사용하면, 피 분석 항체 쌍 간의 특이 적 상호 작용을 선호하는 염 및 / 또는 세제 농도를 증가시키는 것이 바람직하다.
최근, 항체 마이크로 어레이 기술은 환경 응용을 위해 개발되었다. 그럼에도 불구하고,이 기술의 사용은 몇 가지 제한 사항을 포함 않습니다. 폴리 클로 날 항체를 생산하고, 더 중요한 것은, 가능성이 복잡한 환경 샘플에서 어떤 대상 항원을 결합하는 빠르고 저렴하면 단일 클론 항체보다 이론적으로 더 높다. 그러나, 서로 다른 에피토프를 인식 할 수 있다는 사실은 FSM의 가교 반응의 수를 증가I. 예를 들어, 매우 바람직하고, 컨벌루션 방법 26, 27를 사용하여 실제 동족 항원 - 항체 반응에서 이러한 교차 - 반응성 이벤트를 풀기 위해, 방법의 사용을 높은 특이성을 획득. 기본적으로, 마이크로 어레이는 여러 탐지 및 시아 노 박테리아의 분류를위한 질적 바이오 센서 간주됩니다. 이와 관련하여, 각각의 항체 하나씩 분석에서 최적의 작업 농도를 사용하기위한 검출 한계를 결정하기 위해 필수적이다. 이러한 마이크로 어레이는 함께 FSMI 함께 정량 방법으로서 생각되지 않지만 CYANOCHIP (22)에 포함 된 대부분의 항체의 낮은 검출 한계는 10 2 3 10 세포 / ㎖로되기 때문에, 바이오 센서는 고감도를 의미한다.
이러한 한계에도 불구하고,이 방법은 환경 m에 사용되는 다른 기술에 대한 몇 가지 장점이 있습니다onitoring. 항체 - 바이오 센서는 단일 분석, 분석 물질의 저농도를 검출 할 가능성이 동시에 다른 분자를 인식 할 가능성이 거의 모든 물질에 대한 항체 생산의 가능성을 허용한다. 24 10 2 세포 / ㎖에서 검출 한계, 하나의 분석에서 분석에 또한, 마이크로 어레이는 최대 달성 할 수있다. 다른 방법과 비교하여, 항체는 생활 또는 죽은 세포, 세포 외 물질 및 세포 파편을 검출 할 수있다. 그것은 전체 시험을 완성하기 위해 적어도 4 시간이 소요되지만, 환경 모니터링에 적용될 다른 분석 방법보다 빠르다. CYANOCHIP는 원래 시아 노 박테리아 균주의 식별을 위해 생각되었다. 그것은 잠재적 인 독소 생산을 식별하고 새로운 균주의 넓은 범위에 대한 항체를 첨가하여 미래에 개선 될 수 있도록이 바이오 센서는 공식적으로 그 목적을 위해 설계되지 않았다. 이러한 ELISA, PPIA 및 신경 화학적으로 생화학 분석,마우스 테스트는 cyanotoxins의 식별을 할 수 있지만 몇 가지 독소로 제한하고 오탐 (false positive)을 제공 할 수 있습니다. 또한, CYANOCHIP를 사용하여 광학 현미경 및 마우스 생물 검정은 훈련받은 사람 또는 살아있는 동물과 노동 집약적 인 작업이 필요하지만, 특별한 교육을 필요로하지 않습니다, 그들은 샘플에 존재하는 독소의 종류에 대한 정보를 제공하지 않습니다. Cyanotoxins도 식별 및 HPLC, GC-MS, MALDI-TOF 또는 다른 분석 방법으로 정량화 될 수있다. 이러한 방법에서, 상기 샘플은 정제해야하며, 표준품의 부족 cyanotoxins의 식별을 제한한다. 또한, 분석 방법은 비용이 많이 드는 장비 및 소모품 및 전문 교육을 필요로한다. FSMI는 시아 노 박테리아의 정제없이 매우 간단한 단계의 몇 제조 환경 추출물을 필요로하는 동안 분자 방법, 샘플에서 DNA 추출을 기반으로합니다.
CYANOCHIP의 높은 성능을담수 저수지에서 시아 노 박테리아의 현장에서 검출는 물 관리자의 조기 경보를위한 새로운 도구가 있습니다. 또한, 마이크로 어레이는 특히 수명의 증거로서 미생물 마커를 검색하기위한, 또한 우주 생물학의 분야에 대한 흥미 롭다. 우리를 도울 수있는 극한의 연구는 지구 생명의 기원을 이해하고 생활은 우리의 태양계 너머 존재하는 극한적인 환경에서 어떻게 살아남을 수 있습니다. 지구상의 여러 환경은 화성과 같은 다른 행성에 장소와 매우 유사, 멸종 삶의 증거로 광합성 원핵 생물의 유해를 찾을 수있을 수 있습니다. 마이크로 어레이는 생활 또는 셀을 무생물에서 시아 노 박테리아 마커를 식별 할 수 있었다; 인구가 계속로부터 및 / 또는 오래된 미생물 매트 (그림 1)에서 세포 외 물질; 와 같은 남극 대륙, 아타 카마, 안데스 호수, 높은 북극, 또는 극단적 인 환경에서 수집 된 물, 토양, 바위에서스페인 리오 틴토 지역 (도시하지 않음). 그 시아 노 박테리아는 지구상에서 가장 원시적 인 미생물이되어 고려, 그들은 한 번 다른 행성에 살고있는 수 있다고 생각하는 이유가있다.
결론적으로, CYANOCHIP-FSMI은 현장 시아 노 박테리아 마커의 사실을 확인할 수 있고 심지어 다른 phylotypes 또는 그룹에 연결할 수 있고, 마이크로 어레이는, 플랑크톤, 저서 생물 및 endoliths의 포함 서식지의 넓은 범위를 커버이 있음을 입증하는지 환경 모니터링을위한 도구를 기술 할 수 있었다. 마이크로 어레이에 대한 미래 개선 관련 계통 군이 여전히 포함되어 보류되도록 새로운 균주에 대한 항체의 수가 증가 될 수있다. 또한, 칩은 이러한 독소 또는 cyanophicin 중합체 시아 노 박테리아와 같은 특정 화합물에 대한 항체로 구현 될 수있다. 이것은 인간의 시설에서 담수 저수지, 파이프, 설비 모니터링에 특히 적합하다. 현재 MICRoarray 및 이후 버전의 삶 감지 또는 인간의 공간 시설 (예를 들어, 모니터링 저수지 또는 생명 지원 시스템)을 모니터링하거나, 우주 생물학의 분야에서 매우 유용 할 것이다. 사실, 우리는 일상적 삶의 "현장"감지 유지하기위한 방법으로 극한 환경에 필드 캠페인의 마이크로 어레이를 사용합니다. 마이크로 어레이는 소위 생활 감지기 칩 (LDChip), 행성 탐사 임무 29, 30에서의 생활에 대한 검색을위한 300 개 이상의 항체 마이크로 어레이의 일부입니다. 마이크로 어레이 단독으로 또는 LDChip의 일환으로 지상파 유사체 여러 필드 캠페인의 행성 탐사에 대한 SOLID-LDChip 개념의 유효성을 검사 생활 감지기 (SOLID) 악기 (29)의 징후로 구현됩니다. 마이크로 어레이는 식별 시아 노 박테리아 및 / 또는 그 독소에 의해 유용한 정보를 제공 할 것입니다. 균주를 결정함으로써, GI 것환경과 그들이 개발하는 서식지에 대한 정보를했습니다.
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Acknowledgments
우리는 시아 노 박테리아 균주를 제공하기 위해 대학교 자치시 마드리드에서 박사 안토니오 Quesada에 감사합니다. 이 작품은 스페인 Ministerio 드 Economía y를 Competitividad의 Subdirección 일반 드 Proyectos 드 Investigación (MINECO)에 의해 투자되었다, 더를 부여하지 않습니다. AYA2011-24803 및 ESP2014-58494-R.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 mm pore diameter filters | Millipore | GSWP04700 | For preparation of immunogens |
| Eppendorf 5424R microcentrifuge | Fisher Scientific | For preparation of immunogens | |
| Phosphate buffer saline (PBS) pH 7.4 (10x) | Thermo Fisher Scientific | 70011036 | 50 mM potassium phosphate, 150 mM NaCl, pH 7.4 |
| Ultrasonic processor UP50H | Hielscher | For preparation of immunogens | |
| Complete Freund's adjuvant | Sigma-Aldrich | F5881 | Immunopotentiator |
| Incomplete Freud's adjuvant | Sigma-Aldrich | F5506 | For boost injections |
| Protein A antibody purification kit | Sigma-Aldrich | PURE1A | For isolation of IgG |
| Centrifugal filter devices MWCO<100 kDa | Millipore | UFC510096-96K | For isolation of IgG |
| Dialysis tubings, benzoylated | Sigma-Aldrich | D7884-10FT | For isolation of IgG |
| Illustra Microspin G-50 columns | GE-HealthCare | GE27-5330-02 | For isolation of IgG |
| Bradford reagent | Sigma-Aldrich | B6916-500 mL | To quantify the antibody concentration |
| MicroBCA protein assay kit | Thermo Scientific | 23235 | To quantify the antibody concentration |
| Protein arraying buffer 2x | Whatman (Sigma Aldrich) | S00537 | Printing buffer; 30 - 40% glycerol in 1x PBS with 0.01% Tween 20 |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | Non-ionic detergent |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9418 | Control for printing; blocking reagent |
| 384-wells microplate | Genetix | X6004 | For antibody printing |
| Robot arrayer for multiple slides | MicroGrid II TAS arrayer from Digilab | For antibody printing | |
| Epoxy substrate glass slides | Arrayit corporation | VEPO25C | Solid support for antibody printing |
| Alexa Fluor-647 Succinimidyl-ester | Molecular probes | A20006 | Fluorochrome |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | Fluorochrome dissolvent |
| Heidolph Titramax vibrating platform shaker | Fisher Scientific | For antibody labeling | |
| Illustra Microspin G-50 columns | Healthcare | 27-5330-01 | For purification of labeled antibodies |
| Safe seal brown 0.5 mL tubes | Sarstedt | 72,704,001 | For labeled antibodies storage |
| Nanodrop 1000 spectrophotometer | Thermo Scientific | To quantify antibody concentration and labeling efficiency | |
| 3 µm pore size polycarbonate 47 mm diameter filter | Millipore | TMTP04700 | To concentrate cells |
| 1 M Trizma hydrochloride solution pH 8 | Sigma-Aldrich | T3038 | For TBSTRR preparation; to block slides |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | For TBSTRR preparation |
| 20 µm nylon filters | Millipore | NY2004700 | For environmental extract preparation |
| 10 - 12 mm filter holders | Millipore | SX0001300 | For environmental extract preparation |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8340 | For environmental extract storage |
| 1 M Trizma hydrochloride solution pH 9 | Sigma-Aldrich | T2819 | To block slides |
| Heidolph Duomax 1030 rocking platform shaker | VWR | To block slides; for incubation processes | |
| VWR Galaxy miniarray microcentrifuge | VWR | C1403-VWR | To dry slides |
| Multi-Well microarray hybridization cassette | Arrayit corporation | AHC1X24 | Cassette for 24 assays per slide |
| GenePix 4100A microarray scanner | Molecular Devices | Scanner for fluorescence | |
| GenePix Pro Software | Molecular Devices | Software for image analysis and quantification |
References
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