Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

Forsøksprotokoll for Oppdager Published: February 7, 2017 doi: 10.3791/54994
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Molecular Evolution, Centro de Astrobiología (CAB, INTA-CSIC)

Abstract

Global oppvarming og eutrofiering gjøre noen akvatiske økosystemer oppføre seg som sanne bioreaktorer som utløser rask og massiv cyanobacterial vekst; dette har relevant helse og økonomiske konsekvenser. Mange cyanobakterietoksiner stammer er giftprodusentene, og bare noen få celler er nødvendig for å indusere uopprettelig skade på miljøet. Derfor, vann-body myndigheter og forvaltning krever raske og effektive systemer for tidlig varsling som gir pålitelige data å støtte deres forebyggende eller kurativ beslutninger. Dette manuskriptet rapporterer en forsøksprotokoll for i-feltet påvisning av toksinproduserende cyanobakterietoksiner stammer ved hjelp av et antistoff microarray chip med 17 antistoffer (ABS) med taksonomiske oppløsning (CYANOCHIP). Her, en multiplex fluorescerende sandwich-mikromatriser immunoassay (FSMI) for samtidig overvåking av 17 cyanobakterietoksiner stammer ofte funnet blomstringen i ferskvannssystemer, noen av dem toksin produsenter, er beskrevet. En microarray med flerple identiske gjentak (opp til 24) av CYANOCHIP ble trykt på et enkelt objektglass samtidig teste et tilsvarende antall prøver. Flytende prøver kan testes enten ved direkte inkubasjon med antistoffer (Abs) eller etter cellekonsentrasjonen ved filtrering gjennom et 1- til 3-um filter. Faste stoffer, slik som sedimenter og malte bergarter, blir først homogenisert og dispergert ved en håndholdt ultrasonicator i en inkubasjonsbuffer. De blir deretter filtrert (5 - 20 pm) for å fjerne det grove materiale, og filtratet ble inkubert med Abs. Immunoreaksjoner er avdekket ved en endelig inkubering med en blanding av 17 fluorescens-merkede Abs og blir lest av en bærbar fluorescensdetektor. Hele prosessen tar omtrent 3 timer, det meste av det tilsvarende to-1 h perioder med inkubasjon. Utgangen er et bilde, hvor lyspunkter samsvarer med den positive påvisning av cyanobakterielle markører.

Introduction

Påvisning og overvåking av mikroorganismer i komplekse naturlige mikrobielle samfunn er avgjørende i mange felt, inkludert biomedisin, miljø økologi, og astrobiologi. Cyanobakterier er prokaryote mikroorganismer kjente for sin evne til å danne oppblomstringer (dreven spredning) av celler i ferskvann. De er allestedsnærværende, og mange arter er i stand til å produsere toksiner, fører ikke bare til en potensiell risiko for liv og helse, men også til en miljøpåvirkning. I denne forbindelse er det viktig å utvikle raske og følsomme fremgangsmåter for tidlig påvisning av cyanobakterier og / eller deres toksiner i jord og vann. For dette formålet, har en multiplex fluorescerende sandwich-mikromatriser immunoassay (FSMI) er utviklet som et verktøy for vann ledere for å hjelpe dem i beslutninger, og dermed i å implementere riktig vann lederprogrammer.

Et variert utvalg av metoder har blitt utviklet for å oppdage og identifisere cyanobacterial celler og cyanotoxins i jord og vann, inkludert optisk mikroskopi, molekylær biologi, og immunologiske teknikker. Disse metodene kan variere sterkt i den informasjonen de gir. Mikroskopiske teknikker er basert på cellemorfologi og påvisning av in vivo fluorescens fra cyanobakterielle pigmenter, for eksempel fycocyanin eller klorofyll a en. Selv om de er raske og billige metoder for sanntid og hyppig overvåking som informerer om type og antall cyanobakterier til stede i en prøve, har de ikke gi informasjon om den potensielle toksisitet. I tillegg krever de et visst nivå av ekspertise, tatt i betraktning at det ofte er meget vanskelig å skille mellom nært beslektede arter 2. For å overvinne disse begrensningene, må lysmikroskopi ledsages av både biologiske og biokjemiske screeningsanalyser og fysikalsk-kjemiske fremgangsmåter for identifisering og kvantifisering av cyanotoxins.

tre, fire. Dessuten er disse metoder er tidkrevende; krever kostbart utstyr, rekvisita og prøveopparbeidelse; og må utføres av erfarne og spesialiserte medarbeidere.

Molekylære-baserte metoder har blitt brukt i flere tiår for å oppdage, identifisere og kvantifisere cyanobakterier og tilhørende cyanotoxins takket sekvensen informasjon publisert i genomet databaser (f.eks National Center for Biotechnology Information, NCBI). Blant disse fremgangsmåter er de som er basert på polymerase-kjedereaksjon (PCR), som krever utforming av sett av primere for DNA-amplifisering og er avhengig av tidligere kjennskap til DNA-sekvenser i forskjellige arter cyanobakterielle. Mens genetisk testing, som phycocyanin operon, fører til nøyaktig identifikasjon på slektsnivå, noen arter eller stammer er uoppdaget meddenne metoden. Imidlertid toksin-kodende gener, slik som de som tilhører den mikrocystin-operonet, lette identifiseringen av giftstoffer i prøver hvor produsentene er knappe 5. Ikke desto mindre gjør deteksjon av toksin markører ved hjelp av PCR ikke nødvendigvis toksisitet i miljøet. Videre er det sett av primere som er utviklet for å analysere hele spekteret av arter av cyanobakterier og toxin produsenter tilstede i en prøve fremdeles ufullstendig, og ytterligere studier må gjøres for å identifisere ukjente arter. Andre molekylære teknikker er ikke-PCR-baserte, slik som fluorescens in situ hybridisering (FISH) og DNA-mikromatriser.

I de siste to tiårene, har microarray teknologi fått betydning på mange bruksområder, spesielt i miljøovervåkning. DNA-mikromatriser tillate forskjellsbehandling mellom arter og analytter 4, 6, 7 sup>, 8, 9, 10, men de anses som meget arbeidskrevende og tidkrevende oppgaver som involverer flere trinn (f.eks mikromatriser ytelse, DNA-ekstraksjon, PCR-amplifikasjon, og hybridiserings). Av den grunn mindre tidkrevende analyser basert på antistoffer, så som smørbrød og konkurransedyktige immunologiske mikromatriser, har blitt en viktig og pålitelig high-throughput metode for påvisning av flere analytter miljø 11, 12, 13. Evnen til antistoffer til spesifikt å gjenkjenne sin målforbindelsene og for å detektere små mengder analytter og proteiner, sammen med muligheten for å produsere antistoffer mot nesten hvilken som helst substans, gjør antistoff mikromatriser en kraftfull teknikk for miljøformål. I tillegg har evne til å oppnå multiple analyser på såingle assay, med påvisningsgrenser som strekker seg fra ppb til ppm, er en av de viktigste fordelene med denne metoden 14.

Antistoffbaserte biosensorer har vist seg å være sensitive og raske verktøy for påvisning av et bredt spekter av patogener og toksiner i miljøovervåkning 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21. Selv om DNA-metoder involverer flere trinn, de antistoff-baserte mikromatriser krever bare en liten prøvepreparering, som er hovedsakelig basert på en kort lyseringstrinnet i en passende oppløsning buffer. Delehanty og Ligler 15 rapportert samtidig deteksjon av proteiner og bakterielle analytter i komplekse blandinger på basis av et antistoff-sandwich-immunoanalyse stand til å detektere en proteinkonsentrasjon på 4 ppb end 10 4 cfu / ml celler. Szkola et al. 21 har utviklet en billig og pålitelig multiplex microarray for samtidig påvisning av proteotoxins og små giftstoffer, stoffer som kan brukes i biologisk krigføring. De oppdaget konsentrasjoner av ricin toxin, med en deteksjonsgrense på 3 ppb, på mindre enn 20 min. Nylig har CYANOCHIP, et antistoff microarray-baserte biosensor for in situ påvisning av giftige og ikke-toksisk cyanobakterier, blitt beskrevet 22. Dette gjør det mulig microarray for identifisering av potensielle cyanobakterielle blomster, for det meste i akvatiske miljøer, som er vanskelig å identifisere mikroskopisk. Grensen for påvisning av microarray er 10 mars 2 til 10 celler for de fleste arter, snu denne biosensor inn et kostnadseffektivt verktøy for multipleks påvisning og identifikasjon av cyanobakterier, selv på artsnivå. Alle disse egenskapene gjør Antibody microarray teknikk, og særlig fremgangsmåten som presenteres i dette arbeidet, er en raskere og enklere metode sammenliknet med de ovenfor nevnte teknikker.

Dette arbeidet viser to eksempler på eksperimenter som anvender et antistoff microarray-baserte biosensor for å påvise nærvær av cyanobakterier i jord- og vannprøver. Det er en enkel og pålitelig metode basert på en sandwich immunoassay format som krever svært små prøvevolumer og helt grunnleggende prøveopparbeidelse. Metoden krever en kort tid, og kan lett utføres i felten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Utarbeidelse av immunogener

  1. Dyrke hver stamme cyanobacterial i tilsvarende dyrkningsmedium under betingelser som er beskrevet i tabell 1.
    MERK: Vekst mellomstore og dyrkningsforhold for hver cyanobakterier belastningen er oppført i tabell 1. Alle cyanobakterielle stammer, med unntak av K17, tilhører Antonio Quesada gruppe fra Autonoma University (Madrid, Spania). Antistoff mot Planktothrix rubescens ble generert fra en naturlig utvalg av de mono blomst av denne cyanobacterium fra reservoaret Vilasouto (Nord-Spania).
  2. Kvantifisere antallet av celler ved hjelp av en celle-tellekammer ved optisk mikroskopi for å oppnå omtrent 10 8 celler / ml fra en sen eksponensiell eller stasjonær vekstfase kultur.
  3. Høste celler fra 5 ml av kulturen ved sentrifugering ved 2000 xg i 5 min.
  4. Kast supernatanten og resuspender cellene i en 10-ml kare med 5 ml 1 x fosfatbufret saltløsning (1 x PBS) for å oppnå ca. 10 8 celler / ml.
  5. Homogenize og lysere cellene i suspensjonen ved ultralydbehandling i 5 sykluser, 30 hver s, med en 30- til 60-s pause på is, ved hjelp av en bærbar, håndholdt ultralyd prosessor, eller ved å dyppe røret i vannbad av en celle disruptor ved maksimal amplitude (30 kHz).
  6. Gjenta trinn 1.3 til 1.5 for hver stamme av cyanobacterium.
    MERK: Ultralyd produserer celle avbrudd og cellulær innhold utgivelse. Mens proteiner og polysakkarider er gode immunogener, spesifikke molekyler, for eksempel lipider og nukleinsyrer, ikke indusere en humoral immunogen respons av seg selv. Derfor må de binde seg til bærere, slik som polysakkarider eller proteiner, for å øke den molekylære kompleksitet. I tillegg frigjør sonikering intracellulært materiale som kan utløse antistoffproduksjon.

2. Produksjon av polyklonale antistoffer

  1. Klargjør første immunogen dose ved å blande 0,5 ml av ultralyd cellelysat ble oppnådd i trinn 1.5 med 0,5 ml av Freunds fullstendige adjuvans. Lever det til operatøren av et dyr anlegg for polyklonale kanin antistoffproduksjon.
  2. Fremstille tre doser som før for i antistoffproduksjon prosessen videre bruk som minne øker ved å blande 0,5 ml av den samme homogenatet / lysat oppnådd i trinn 1.5 med 0,5 ml av Freunds ufullstendige adjuvans. Gi dem til dyret anlegget for å oppfylle den antistoffproduksjonsprosessen.
  3. Gjenta trinn 2,1 og 2,2 for hver ny antistoffproduksjonsprosessen.
    MERK: Vanligvis er antistoffproduksjon overlatt til spesialiserte dyre anlegg eller selskaper, fordi vedkommende lisens og opplæring er nødvendig for å jobbe med dyr. Selskapene leverer en relativ enzym-bundet immunosorbent assay (ELISA) måling av mengden av antigen-spesifikt antistoff som er tilstede i serumprøven.

3. Antistoff Purification

  1. Rens immunoglobulin G (IgG) fraksjonen fra både den immune og pre-immunserum samlet opp i trinn 2 av protein-A affinitetskromatografi. Noen kommersielle rensing kits, basert på patron systemer fungerer bra; Følg leverandøren instruksjoner.
  2. Når rensesettet ikke gir et avsaltingssystem, endrer bufferen etter elueringen av de rensede antistoffer mot 0,1 X PBS, enten ved dialyse eller ved hjelp av sentrifugal-filteranordninger med et 100-kDa (eller lavere) membran porestørrelse.
  3. Bestemme antistoffkonsentrasjonen ved å måle absorbansen ved 280 nm eller ved hjelp av kolorimetriske metoder, slik som Bradford 23, Lowry 24, eller Bicinchoninic syre (BCA) 25.
    MERK: det er viktig å unngå å få med amingrupper i elueringsbufferen (f.eks, tris-buffere), fordi de konkurrerer med antistoffet for binding til faste overflater aktivert med epoksygrupper. etter purification, er det viktig å teste antistoffet aktivitet med ELISA.

4. Fluorescens antistoff merking

  1. Merke de rensede antistoffene, erholdt i del 3 med et fluorokrom (for eksempel en langt-rødt fluorescerende fargestoff) ved oppløsning av et kommersielt hetteglass inneholdende fargestoff for merking 1 mg protein i 100 ul dimetylsulfoksid (DMSO). Tilsett 2 mL av det oppløste fargestoff til hver antistoff-preparat ved en konsentrasjon på 2 mg / ml i et sluttvolum på 50 pl i 50 mM fosfat-bufret saltløsning (pH 8,5).
  2. Opprettmerke reaksjonene under stadig omrøring i 1 time ved omgivelsestemperatur og 1200 opm på en vibrerende plattform.
  3. Rense merkede antistoffer ved størrelse-utelukkelses-kromatografi (for eksempel ved anvendelse av en gel med et fraksjoneringsområde mellom 1,5 og 30 kDa som er fanget inn i en kolonne), etter leverandørens anbefalinger.
  4. Mål absorbansen ved 280 nm og ved 650 nm i eluater og beregne Labeling effektivitet følgende leverandør anbefalinger.
    MERK: Opp til 50 x 50 mL antistoff-merking reaksjoner som kan gjøres med et enkelt hetteglass med fluorescerende fargestoff for merking 1 mg protein. Det anbefales å dekke rørene med aluminiumsfolie, eller alternativt å bruke ugjennomsiktig 0,5-ml rør for å unngå slukke prosesser etter trinn 4.3. For IgG-antistoffer, er optimal merking oppnås med 3-7 mol av fargestoffet per mol antistoff.

5. CYANOCHIP Produksjon

  1. Antistoffer og kontroller i utskriftsløsning
    1. Forbered 30 ul av hver renset antistoff i trykking oppløsning ved å blande hvert antistoff ved 1 mg / ml i en kommersiell 1x protein trykking buffer med 0,01% (v / v) Tween 20 (et ikke-ionisk detergent), alle som endelige konsentrasjoner.
      MERK: Alternativt kan et antistoff oppløsning inneholder 20% glycerol, 1% (w / v) sukrose (eller trehalose som et konserveringsmiddel), og 0,01% (v / v) Tween 20 i karbonatbuffer (pH 8,5).
    2. Forbered 30 ul av trykk løsning som kontroller: (a) 1x protein trykking buffer med 0,01% (v / v) Tween 20, (b) protein-A renset pre-immunserum ved 1 mg / ml i 1x protein trykking buffer med 0,01% (v / v) Tween 20, og (c) bovint serumalbumin (BSA) ved 1 mg / ml i 1x protein trykking buffer med 0,01% (v / v) Tween 20.
    3. Forbered 30 ul av en fluorescensmerket, renset pre-immunserum ved forskjellige konsentrasjoner (for eksempel fra 50 ug / ml til 1 mg / ml) i 1 x protein trykking buffer med Tween 20, som i trinn 5.1.1. Disse prøvene vil bli brukt som fluorescerende ramme markører og for relativ fluorescens kvantifisering etter å fange.
    4. Legg 30 mL per brønn av utskriftsløsninger utarbeidet i trinn 5.1.1, 5.1.2 og 5.1.3 til den høyeste kvalitet 384-brønners mikroplater for microarray produksjon, som for eksempel polypropylen.
      MERK: Protein utskrift buffer øker kvaliteten og stabiliteten av antistoffene, og Tween 20 homogeniserer sted morphology og bygger opp protein kobling opp. Det anbefales å opprettholde den 384-brønners mikroplate ved 4 ° C før bruk. Lagre det ved -20 ° C i lange perioder av gangen. Polypropylen har lav DNA, proteiner, celleekstrakt, og små-molekyl indre binding.
  2. Antistoff utskrift på et objektglass
    MERK: Skriv antistoffer bort på aktiverte objektglass ved hjelp av ulike array-plattformer, som kontakt, split-nål, eller ikke-kontakt enheter, for eksempel piezoelektriske skrivere eller "ink jet" teknologier. I dette arbeidet har CYANOCHIP blitt rutinemessig skrevet ut av kontakten ved hjelp av et robotsystem (arrayer) i stand til å fange opp NL mengder av antistoffer i mikrometer skala.
    1. Sett de miljømessige forholdene i trykke plass til 20 ° C og 40 - 50% relativ fuktighet.
    2. Sett opp glide underlag (for eksempel 75- x 25 mm epoxy-aktivert mikroskop glass) til å utføre flere identiske antistoff arrays på hvert lysbilde.
    3. Spot hver renset antistoff, inkludert kontroller og referanseramme, i et tre eksemplarer flekk mønster; under disse betingelser, flekkene er 180 - 200 pm i diameter.
    4. Etter utskrift lar lysbildene i minst 30 minutter ved romtemperatur for å la dem tørke, og deretter lagre dem ved 4 ° C; for arbeid i felten, kan lysbildene transporteres og lagres ved romtemperatur i flere måneder.
      MERK: CYANOCHIP er trykt i et tre eksemplarer sted microarray-format med 3 x 8 identiske mikromatriser per side eller 9 identiske arrays i en 1 x 9 microarray format. Hver matrise størrelse må ikke være høyere enn reaksjonskammeret dimensjoner for et 24-brønns pakning (vanligvis 7,5 x 6,5 mm i en 3 x 8 hybridisering kammer).
    5. Før du bruker microarray for å analysere miljøprøver, bruker FSMI å bestemme arbeids fortynning for hvert antistoff i en titrering kurve. For hvert antistoff ved å bruke en standard konsentrasjon av det tilsvarende immunogen (10 april 3 til 10 celler / ml), og serielle fortynninger av fluorescerende antistoff (mellom 1: 500 og 1: 32000). Den optimale antistoffkonsentrasjonen svarer til 50% av den maksimale signalintensiteten oppnådd i titreringskurven. Dessuten må sensitivitet og spesifisitet for hvert antistoff bli bestemt, som beskrevet i Blanco et al. 22.

6. Utarbeidelse av miljø Multianalyte Ekstrakter til den Fluorescent Sandwich Microarray Immunoassay (FSMI)

  1. Multianalyte ekstrakt fra en væskeprøve
    1. Ta 1 - 100 ml av den flytende prøve med en steril sprøyte (for eksempel vann fra bredden av et vannreservoar); mengden av prøven er sterkt avhengig av potensialet konsentrasjonen av målene.
    2. Konsentrer cellene ved å lede vannprøven gjennom en tre-um porestørrelse, 47-mm diameter polykarbonatfilter; cellekonsentrasjonmellom mars 10 til august 10 celler / ml er ønskelig for positiv deteksjon, men den virkelige konsentrasjonen er ukjent.
    3. Gjenopprette biomassen oppsamlet i filteret sammen med 1 ml av en modifisert Tris-bufret saltvann, Tween 20 armert buffer (TBSTRR; 0,4 M Tris-HCl (pH 8), 0,3 M NaCl, og 0,1% Tween 20) ved skraping uten en spatel inn i et 15 ml rør.
    4. Homogeniseres og disaggregert ved hjelp av et håndholdt ultralyd prosessor, som beskrevet i trinn 1.5, eller bare ved å pipettere opp og ned flere ganger; Dette forbereder prøve for analyse av microarray.
  2. Multianalyte ekstrakt fra en fast prøve
    1. Veie opp til 0,5 g av den faste prøven (f.eks berg, jord, sedimenter eller) inn i en 10 ml rør og legge opp til 2 ml TBSTRR.
    2. Sonikere ved neddykking av ultralydsonden i røret, ved å dyppe røret ned i vannbadet av en kraftig ultralydhorn, eller ved hjelp av et håndholdt ultralydapparat. Utføre minst 5 x 30-ssykluser ved 30 kHz, stopper i 30 s mens på is.
    3. Filtrer for å fjerne sand, leire og annet grovt materiale med en 10-ml sprøyte koblet til en diameter på 10 til 12 mm, 5- til 20-um porestørrelse nylonfilterholderen. Presse prøven gjennom filteret inn i en 1,5 ml rør. Hvis filter mettet fett, agitere suspensjonen i sprøyten og ta den med til en ny en; Dette klargjør filtratet materiale for immunoanalyse (trinn 7).
      MERK: bufferkapasiteten til TBSTRR avhenger av typen av prøven. Det er viktig å gjennomføre immunoanalysen umiddelbart etter fremstillingen av miljø ekstrakt for å unngå effekten av enzymatisk nedbrytning på analyttene. Alternativt kan legge proteaseinhibitorer inn mot miljø ekstrakt og fryse ved -80 ° C inntil det neste trinn.

7. Fluorescent Sandwich Microarray Immunoassay (FSMI)

  1. Blokkering av CYANOCHIP
    MERK: Umiddelbart før bruk, behandle pRYKT glir for å blokkere alle frie epoksygrupper på lysbildet og for å fjerne overskuddet av ikke-kovalent bundne antistoffer.
    1. Dyppes microarray inn i 0,5 M Tris-HCl (pH 9) med 5% (w / v) BSA-oppløsning på en ren overflate (f.eks petriskål eller et 50-ml tube) med mild agitering fra en vippeplattform i 5 minutter. Alternativt, legg sklie ned på et 100- til 200-mL dråpe av ovennevnte løsning med microarray flekker overfor den. Permisjon for 3-5 minutter og deretter fortsette.
    2. Nøye plukke opp raset ved hjelp av plasttupp tang; prøv å unngå å berøre microarray soner. Eliminere overskuddet av væske ved å banke forsiktig sleiden på et papirhåndkle. Dyppe den i 0,5 M Tris-HCl (pH 8) med 2% (w / v) BSA-oppløsning i 30 minutter med svak omrøring fra en vippeplattform.
    3. Tørk lysbildet ved å utføre en kort sentrifugering (200-300 xg i 1 min) ved hjelp av en kommersiell mikro tilrettelagt for objektglass. Alternativt, tørke raset ved sakte banke ontoa papirhåndkle.
  2. Inkubasjon av de multianalyte prøven ekstraktet med microarray
    1. Sett opp raset i en kommersiell microarray hybridisering kassett med 24 brønner for flere mikromatriser; Følg leverandøren instruksjoner.
    2. Etter lysbilde og kassettmodulen, pipette opp til 50 ul av prøven ekstrakt eller en fortynning av det i TBSTRR inn i hver brønn av kassetten.
    3. Gjenta trinn 7.2.2 for hver prøve som skal analyseres.
    4. Som en blank kontroll, pipette 50 ul TBSTRR buffer i minst to separate brønner i kassetten.
    5. Inkuber ved romtemperatur i 1 time med blanding ved å pipettere hvert 15 min eller ved å la det under mild risting. Alternativt kan inkuberes i 12 timer ved 4 ° C.
      MERK: Bruk andre ruge pakninger som en funksjon av mikromatrisemønster. Tiden og temperaturen for inkuberingen i trinn 7.2.5 er empiriske parametre som normalt er avhengig av affiniteten og bindende kinetics av ​​hver forbundet antigen-antistoff.
  3. Vaske
    1. Ta prøvene ved å sette kassetten ned og forsiktig banke det på en ren, absorberende papir.
    2. Vask brønnene ved tilsetning av 150 ul av TBSTRR til hver enkelt, og eliminere den buffer som ovenfor.
    3. Gjenta trinn 7.3.2 tre ganger.
  4. Inkubasjon med fluorescerende detektor antistoffer
    1. Tilsett 50 pl av en antistoffblanding inneholdende de 17 anti-cyanobacterial-strain-antistoffer, hver merket med fluorokrom i TBSTRR med 1% (w / v) BSA. Bestemme konsentrasjonen av hver fluorescerende antistoff i blandingen (0,7 til 2 ug / ml) ved å utføre titrering eksperimenter for hvert antigen / antistoff-par 22.
    2. Inkuber i 1 time ved omgivelsestemperatur, som beskrevet i trinn 7.2.5, eller i 12 timer ved 4 ° C.
  5. Vaske ut fluorescerende antistoffer </ Strong>
    1. Fjern de fluorescerende ubundne antistoffer, som i trinn 7.3.
    2. Demontere kassetten og fordype raset i 0.1x PBS (for eksempel i en 50-ml tube) for en rask skylling.
    3. Tørk lysbildet som i trinn 7.1.3.

8. Skanning for Fluorescence

  1. Skann lysbildet for fluorescens ved maksimal emisjon fluorescens topp for langt-rød fluorescerende fargestoff i en skanner for fluorescens. Ta flere bilder av mikromatriser på forskjellige skanneparametere, vanligvis ved å senke laseren få verdi.
    MERK: Unngå mettede flekker (> 65.000 fluorescens teller) -de er ute av skala og kan innføre kvantifisering feil.

9. Bildebehandling og dataanalyse

  1. Bruk en kommersiell programvare for bildeanalyse og kvantifisering; programvaren gir målinger av fluorescens intensitet (FI, median eller gjennomsnitt av alle piksler fra en enkelt flekk) for each flekk av hele microarray. Trekk den lokale bakgrunnen rundt stedene: FI = FI spot - FI lokal bakgrunn.
  2. Lagre FI data og åpne dem i et regnearkprogram.
  3. Bruk verdiene oppnådd for de tomme arrays som negativ kontroll for å identifisere og forkaste falske positiver. Bruk følgende formel for å beregne FI for hvert antistoff stedet: FI = (FI sample - FI blank), hvor FI sample = FI spot - FI lokal bakgrunn i mikromatriser kjøre med prøve ekstrakter og FI blank = FI spot - FI lokal bakgrunn i tomme mikromatriser.
  4. Påfør et ekstra cut-off terskelen av 2- til 3 ganger gjennomsnittet av FI av hele microarray for å minimere sannsynligheten for falske positiver; Dette er spesielt relevant for dårlig kvalitet microarray bilder og lavt signal-til-støy-forhold.
  5. Lag plott og / eller utføre ytterligere analyser etter behov.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Dette arbeidet beskriver en multipleks immunoassay test for samtidig identifisering av de mest relevante ferskvann cyanobakterietoksiner arter (tabell 1) med CYANOCHIP antistoff microarray. Den microarray kan være en 3 x 8 microarray format trykt på objektglass. Hver mikroarray består av et sett av 17 antistoffer trykt i en triplikat sted mønster, i de tilsvarende pre-immun antistoffer og BSA som negative kontroller. De mikromatriser omfatter også en fluoriserende ramme, ved hjelp av et fluorescensmerket pre-immun-antistoff for enkelt å lokalisere mikromatrisemønsteret 22 (figur 1).

Den microarray ble testet i felten for in situ analyser av vannprøver tatt ved kysten av ferskvann Lozoya Reservoir, som forsyner byen Madrid. Prøvene ble bearbeidet som beskrevet ovenfor, og denHoved positive immunoreaksjoner samsvarer med antistoffer mot planktoniske cyanobakterier, slik som Microcystis sp. (K4 og K5), og til bentiske Oscillatoriales, for eksempel Leptolyngbya spp. (K10 og K15). Lavere fluorescens signaler ble oppnådd fra Nostocales (K6 og K12, to planktoniske Aphanizomenon spp.), Bentiske Rivularia sp. (K8), Anabaena sp. (K1), og planktoniske Microcystis flos-Aquae sp. (K3). Optisk mikroskop observasjoner (ikke vist) viste et mangfoldig cyanobacterial fellesskapet innen rikelig terri rusk fra land. Flere arter av Anabaena dominerte samfunnet, men Microcystis spp. og Pseudanabaena spp. var også tilstede.

I tillegg microarray ble også validert ved å analysere en tørr, nesten 1000 år gamle mikrobiell matte samlet inn i McMurdo Ice Shelf i Antarktis for å teste for tilstedeværelse av cyanobacterial markers. Figur 1 viser sterkt fluorescerende, positive reaksjoner i antistoffer som produseres til bunndyr cyanobakterier isolert fra andre antarktiske matter, inkludert Anabaena sp. og Leptolyngbya spp. (K14 og K15, henholdsvis). Andre positive immunreaksjoner ble detektert med antistoffer mot planktoniske cyanobakterier, som for eksempel Microcystis spp. (K4 og K5), Aphanizomenon spp. (K6 og K12), og Planktothrix rubescens sp. (K17). Lave signaler ble oppnådd fra antistoffer mot andre bunndyrarter isolert i en Antarktis matte, inkludert Tolypothrix sp. (K16) og Anabaena sp. (K1). Fluoriserende optisk mikroskopi viste tilstedeværelsen av celler som strukturelt ligner på cyanobakterier og grønnalger (ikke vist). Ingen trådformede cyanobakterier ble identifisert. Likevel ble flere amorfe fluorescerende strukturer i ca 1 mikrometer i størrelse og innholdsrik diffuse fluorescens oppdaget, WHIch kunne tilskrives tilstedeværelse av cellerester (brutt og døde celler) og ekstracellulære polymere stoffer (EPS), henholdsvis. Følgelig den biokjemiske analysen viste at matten besto av rikelig mengder biopolymerer og cellerester (kompleks biologisk materiale) som kan være mål for antistoffer i microarray.

Figur 1
Figur 1: Rask og pålitelig Multiplex Microarray immunanalysen for Oppdager Cyanobakterier. A) Reaksjonsskjema som viser hovedtrinnene i den FSMI for analyse av fler target prøver med en CYANOCHIP. B) Skjematisk fremstilling av en trykkemønster layout (ved triplo) av det anti-cyanobakterier antistoff samling: (0) BSA, bovint serum albumin; (X) bare utskrift buffer; (1-17) hver av antistoffene som i tabell 1 i BLanco et al. 2015 (K1 til K17). Fra P1 til P17, de tilsvarende pre-immun-antistoffer virker som kontroller. De gule rektangler tilsvarer en fluorescerende flekk gradient som en ramme referanse. C og D) Bilde som viser den øverste delen av en 1000 år gammel tørr mikrobiell matten fra McMurdo Ice Shelf (Antarktis) og CYANOCHIP bilde påvise cyanobakterier i denne matten, henholdsvis. E) Panoramautsikt over Lozoya Reservoir viser gjennomsiktig vann uten synlige grønne partikler på tidspunktet for prøvetaking. F) microarray bilde etter in situ-analysen av vannprøven (modifisert fra referanse 22).

Ab-kode Immunogen (stamme) Rekkefølge habitat dyrkningsforhold
K1 Anabaena sp. Nostocales ukjent BG11 og nitrat 30 ºC, kontinuerlig lys
K2 Anabaena sp. Nostocales ukjent BG11o 30 ºC, kontinuerlig lys
K3 Microcystis Flos-Aquae Chroococcales planktoniske BG11 28 ºC, kontinuerlig lys
K4 Microcystis novacekii Chroococcales planktoniske BG11 28 ºC, kontinuerlig lys
K5 Microcystis aeruginosa Chroococcales planktoniske BG11 28 ºC, kontinuerlig lys
K6 Aphanizomenon ovalisporum Nostocales planktoniske BG11o 28 ºC, kontinuerlig lys
K7 Phormidium sp. Oscillatoriales bentisk BG11 18 ºC, 16-8 fotoperiode
K8 Rivularia sp. Nostocales bentisk Chu-D 18 ºC, 16-8 fotoperiode
K9 Chamaesiphon sp. Chroococcales bentisk BG11 18 ºC, 16-8 fotoperiode
K10 Leptolyngbya Boryana Oscillatoriales bentisk BG11 18 ºC, 16-8 fotoperiode
K11 Tolypothrix distorta Nostocales bentisk BG11o 18 ºC, 16-8 fotoperiode
K12 Aphanizomenon aphanizomenoides Nostocales planktoniske BG11o 28 ºC, kontinuerlig lys
K13 Nostoc sp. (Antarktis) Nostocales bentisk BG11o 13 ºC, 16-8 fotoperiode
K14 Anabaena sp. Nostocales bentisk BG11o 13 ºC, 16-8 fotoperiode
K15 Leptolyngbya sp. Oscillatoriales bentisk BG11 13 ºC, 16-8 fotoperiode
K16 Tolypothrix sp. Nostocales bentisk BG11 13 ºC, 16-8 fotoperiode
K17 Planktothrix rubescens Oscillatoriales planktonic ingen ingen

Tabell 1. Liste over de antistoffer (ABS) og cyanobacterial Stammer brukes til å produsere CYANOCHIP 22.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Her er en multiplex fluorescerende sandwich-immunoassay ved hjelp av CYANOCHIP, en 17-antistoff microarray for påvisning og identifikasjon av et bredt spekter av cyanobacterial slekter, beskrev 22. Disse cyanobakterier representerer den hyppigste bentiske og planktoniske slekter i ferskvann, noen av dem er giftprodusenter. Nylig har det fluorescerende sandwich-immunoassay-format blitt brukt for å identifisere mikroorganismer og / eller bioanalytes i miljøprogrammer 26, 27, 28. Protokollen er hovedsakelig basert på to trinn: (i) å immobilisere eller fange antistoffer til spesifikt å binde analytten fra en forsøksprøve og (ii) detektering av analytt-antistoff-par ved hjelp av fluorescensmerkede antistoffer (tracer eller detektor-antistoffer). På grunn av at sandwich-assay krever minst to tilgjengelige antistoffbindingsseter (epitoper) i analytten forreaksjonen skal finne sted, noen positiv fluorescerende signal indikerer tilstedeværelse av relativt store og komplekse oligonucleo eller multimere analytter som er identisk med eller ligner på de som brukes til å produsere de fange antistoffer.

Selv om denne metoden krever små volum og grunnleggende prøvepreparering, uten behov for spesiell ekspertise eller kunnskap, kan flere ulemper ødelegge analysen. Lave fluorescerende signaler eller en fullstendig mangel kan skyldes dårlig antistoffrensing eller dårlig merking effektivitet. For isolering av kanin IgG, er protein A det beste valg, fordi det bindes spesifikt med høy effektivitet til Fc-regionen av immunglobuliner. Som angitt i § 4 må fluorescerende antistoffer med en merkeserien mellom 3-7 mol av fargestoff pr mol antistoff brukes. Videre kan manglende fluorescerende flekker forklares ved konsentrasjonen av analytter som ligger under påvisningsgrensene. I dette tilfellet, kan prøven være konsentrated før inkubasjon den med microarray, eller større mengder kan brukes til en ny utvinning. Høye fluorescerende bakgrunn er det skyldes ineffektiv chip blokkering og / eller vasketrinn og i ekstrakter fra prøver sammensatt av mineraler og komplekst organisk materiale som stikker ut på brikken. Når komplekse prøver anvendes som analytter, er det ønskelig å øke salt og / eller vaskemiddelkonsentrasjonen for å favorisere den spesifikke interaksjonen mellom analytt-antistoff-par.

I de senere årene har antistoff microarray-teknologi er utviklet for miljøprodukter. Likevel gjør bruk av denne teknikken innebærer noen begrensninger. Polyklonale antistoffer er hurtigere og billigere å fremstille, og, enda viktigere, muligheten for å binde mål-epitop i et kompleks miljøprøve er teoretisk høyere enn med monoklonale antistoffer. Men det faktum at de kan gjenkjenne forskjellige epitoper øker antallet av kryssreaksjoner i FSMI. For å oppnå høy spesifisitet, bruk av fremgangsmåter for å skille disse kryss-reaktivitet hendelser fra de sanne beslektede antigen-antistoff-reaksjoner ved hjelp av dekonvolvering fremgangsmåter 26, 27, for eksempel, er meget ønskelig. I utgangspunktet er microarray betraktet som en kvalitativ biosensor for flere deteksjon og klassifisering av cyanobakterier. I denne forbindelse er det viktig å bestemme påvisningsgrensen for hvert antistoff en-til-en til å bruke sine optimale arbeids-konsentrasjoner i analysen. Selv om denne microarray, sammen med FSMI, er ikke tenkt som en kvantitativ metode innebærer biosensor høy følsomhet, fordi den nedre påvisningsgrensen for de fleste av antistoffene inneholdt i CYANOCHIP 22 er fra 10 2 til 10 3 celler / ml.

Til tross for disse begrensninger, har denne metoden flere fordeler overfor andre teknikker som brukes i miljø monitoring. Antistoff-biosensorer tillate muligheten for å gjenkjenne forskjellige molekyler samtidig i en enkelt analyse, muligheten for påvisning av lave konsentrasjoner av analytter, og muligheten for å produsere antistoffer mot nesten hvilken som helst substans. Videre kan mikroarray oppnå opptil 24 analyser i et enkelt assay, med påvisningsgrenser fra 10 2 celler / ml. I sammenligning med andre metoder, kan antistoffer detektere levende eller døde celler, ekstracellulært materiale, og cellerester. Selv om det tar minst 4 timer å fullføre hele analysen, er det raskere enn andre analytiske metoder som anvendes til miljøovervåking. Den CYANOCHIP var opprinnelig tenkt for identifisering av cyanobakterietoksiner stammer. Dette biosensor ble ikke formelt utformet for dette formålet, slik at den kan identifisere potensielle giftprodusenter og kan forbedres i fremtiden ved å legge antistoffer mot et bredt spekter av nye stammer. Biokjemiske analyser, slik som ELISA, PPIA, og nevrokjemisketester i mus, tillater identifisering av cyanotoxins, men de er begrenset til noen få kjente toksiner og kan gi falske positive. I tillegg bruker den CYANOCHIP ikke krever spesiell opplæring, mens optisk mikroskopi og mus bioassay krever trenet personell eller arbeidskrevende arbeid med levende dyr, og de gir ikke informasjon om hvilken type giftstoffer finnes i en prøve. Cyanotoxins kan også bli identifisert og kvantifisert ved andre analytiske metoder, for eksempel HPLC, GC-MS, eller MALDI-TOF. Ved disse fremgangsmåter må prøven renset, og mangelen på referansestandarder begrenser identifikasjon av cyanotoxins. Videre analytiske metoder krever kostbart utstyr og spesialisert trening. Molekylære metoder er basert på DNA-ekstraksjon fra prøvene, mens FSMI bare krever en miljø ekstrakt fremstilt i et par veldig enkle trinn, uten cyanobakterier rensing.

Den høye ytelsen til CYANOCHIP forin situ-påvisning av cyanobakterier i ferskvannsreservoarer gjør det til et nytt verktøy for tidlig varsling av vann administratorer. I tillegg er microarray også interessant for feltet av astrobiologi, spesielt for å søke etter mikrobielle markører som bevis på liv. Studiet av extremophiles kan hjelpe oss til å forstå livets opprinnelse på jorden og hvordan livet kunne overleve i ekstreme miljøer som finnes i vårt solsystem og utover. Som flere miljøer på jorda er svært lik steder på andre planeter som Mars, kan det være mulig å finne rester av foto prokaryoter som beviser på utdødd liv. Den microarray var i stand til å identifisere cyanobakterietoksiner markører fra levende eller ikke-levende celler; fra populasjon forblir og / eller ekstracellulært materiale i gamle mikrobielle matter (figur 1); og fra vann, jord og steiner samlet i ekstreme miljøer, slik som Antarktis, Atacama, Andes innsjøer, et høyarktisk område, ellerRio Tinto-området i Spania (ikke vist). Tatt i betraktning at cyanobakterier er de forhistoriske mikroorganismer på jorden, er det grunn til å tro at de kanskje en gang har levd på andre planeter.

I konklusjonen, at CYANOCHIP-FSMI kan identifisere in situ cyanobakterietoksiner markører og kan også knytte dem til ulike phylotypes eller grupper, og at microarray dekker et bredt spekter av habitater, inkludert de av plankton, bunndyr og endoliths, viser at dette teknikken kan et verktøy for miljøovervåking. Fremtidige forbedringer av microarray kan være å øke antall antistoffer mot nye stammer, slik at relevante fylogenetiske grupper fortsatt til vurdering er inkludert. I tillegg kan den brikken bli implementert med antistoffer mot spesifikke cyanobakterielle forbindelser, slik som toksiner eller cyanophicin polymer. Dette er spesielt relevant for overvåking av ferskvannsreservoarer, rør og installasjoner i menneskelige anlegg. Den nåværende microarray og fremtidige versjoner vil være svært nyttig innen astrobiologi, enten for livet påvisning eller for å overvåke menneske plass fasiliteter (f.eks overvåking vannmagasiner eller livets støtte). Faktisk, vi rutinemessig bruker microarray i feltkampanjer for ekstreme miljøer som en metode for "on-site" påvisning av levetid. Den microarray er en del av den såkalte Livet Detector Chip (LDChip), en microarray med mer enn 300 antistoffer for leting etter liv i planetutforskningsferder 29, 30. Den microarray alene eller som en del av LDChip vil bli implementert i tegn til liv Detector (SOLID) instrument 29 for å validere SOLID-LDChip konsept for planet leting i flere feltkampanjer til terrestriske analoger. Den microarray vil gi nyttig informasjon ved å identifisere cyanobakterier og / eller deres toksiner. Ved å bestemme stammene, det vil GIhar informasjon om miljøer og leveområder der de utviklet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Vi takker Dr. Antonio Quesada fra Universidad Autónoma de Madrid for å gi cyanobakterietoksiner stammer. Dette arbeidet ble finansiert av Subdirección General de Proyectos de INVESTIGACION av den spanske Ministerio de Economía y Competitividad (MINECO), gir ingen. AYA2011-24803 og ESP2014-58494-R.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22 mm pore diameter filters Millipore GSWP04700 For preparation of immunogens
Eppendorf  5424R microcentrifuge Fisher Scientific For preparation of immunogens
Phosphate buffer saline (PBS) pH 7.4 (10x) Thermo Fisher Scientific 70011036 50 mM potassium phosphate, 150 mM NaCl, pH 7.4
Ultrasonic processor UP50H Hielscher For preparation of immunogens
Complete Freund's adjuvant  Sigma-Aldrich F5881 Immunopotentiator
Incomplete Freud's adjuvant Sigma-Aldrich  F5506 For boost injections
Protein A antibody purification kit   Sigma-Aldrich PURE1A  For isolation of IgG
Centrifugal filter devices MWCO<100 kDa Millipore UFC510096-96K For isolation of IgG
Dialysis tubings, benzoylated Sigma-Aldrich D7884-10FT For isolation of IgG
Illustra Microspin G-50 columns  GE-HealthCare GE27-5330-02 For isolation of IgG
Bradford reagent Sigma-Aldrich B6916-500 mL To quantify the antibody concentration
MicroBCA protein assay kit  Thermo Scientific 23235 To quantify the antibody concentration
Protein arraying buffer 2x Whatman (Sigma Aldrich)  S00537 Printing buffer; 30 - 40% glycerol in 1x PBS with 0.01% Tween 20
Tween 20  Sigma-Aldrich  P9416 Non-ionic detergent
Bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich  A9418 Control  for printing; blocking reagent
384-wells microplate Genetix X6004 For antibody printing
Robot arrayer for multiple slides MicroGrid II TAS arrayer from Digilab For antibody printing
Epoxy substrate glass slides Arrayit corporation VEPO25C Solid support for antibody printing
Alexa Fluor-647 Succinimidyl-ester  Molecular probes A20006 Fluorochrome
DMSO  Sigma-Aldrich  D8418 Fluorochrome dissolvent
Heidolph Titramax vibrating platform shaker Fisher Scientific For antibody labeling 
Illustra Microspin G-50 columns  Healthcare 27-5330-01 For purification of labeled antibodies
Safe seal brown 0.5 mL tubes Sarstedt 72,704,001 For labeled antibodies storage 
Nanodrop 1000 spectrophotometer Thermo Scientific To quantify antibody concentration and labeling efficiency
3 µm pore size polycarbonate 47 mm diameter filter Millipore TMTP04700 To concentrate cells
1 M Trizma hydrochloride solution pH 8 Sigma-Aldrich  T3038 For TBSTRR preparation; to block slides
Sodium chloride Sigma-Aldrich  S7653 For TBSTRR preparation
20 µm nylon filters  Millipore NY2004700 For environmental extract preparation
10 - 12 mm filter holders Millipore SX0001300 For environmental extract preparation
Protease inhibitor cocktail Sigma-Aldrich  P8340 For environmental extract storage
1 M Trizma hydrochloride solution pH 9 Sigma-Aldrich  T2819 To block slides
Heidolph Duomax 1030 rocking platform shaker VWR To block slides; for incubation processes 
VWR Galaxy miniarray microcentrifuge VWR C1403-VWR To dry slides
Multi-Well microarray hybridization cassette Arrayit corporation AHC1X24 Cassette for 24 assays per slide
GenePix 4100A microarray scanner  Molecular Devices Scanner for fluorescence
GenePix Pro Software Molecular Devices Software for image analysis and quantification

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Simis, S. G. H., Peters, S. W. M., Gons, H. J. Remote sensing of the cyanobacterial pigment phycocianin in turbid inland water. Limnol. Oceanogr. 50 (1), 237-245 (2005).
  2. Zamyadi, A., McQuaid, N., Prevost, M., Dorner, S. Monitoring of potentially toxic cyanobacteria using an online multi-probe in drinking water sources. J. Environ. Monit. 14, 579-588 (2012).
  3. Msagati, T. A. M., Siame, B. A., Shushu, D. D. Evaluation of methods for the isolation, detection and quantification of cyanobacterial hepatotoxins. Aquat. Toxicol. 78 (4), 382-397 (2006).
  4. Weller, M. G. Immunoassays and biosensors for the detection of cyanobacterial toxins in water. Sensors. 13 (11), 15085-15112 (2013).
  5. Baker, J. A., Neilan, B. A., Entsch, B., McKay, D. B. Identification of cyanobacteria and their toxigenicity in environmental samples by rapid molecular analysis. Environ. Toxicol. 16 (6), 472-482 (2001).
  6. Li, H., Singh, A. K., McIntyre, L. M., Sherman, L. A. Differential gene expression in response to hydrogen peroxide and the putative PerR regulon of Synechocystis sp. Strain PCC 6803. J. Bacteriol. 186 (11), 3331-3345 (2004).
  7. Anderson, D. M., Cembella, A. D., Hallegraeff, G. M. Progress in understanding harmful algal blooms: paradigm shifts and new technologies for research, monitoring, and management. Ann. Rev. Mar. Sci. 4, 143-176 (2012).
  8. Dittami, S. M., Pazos, Y., Laspra, M., Medlin, L. K. Microarray testing for the presence of toxic algae monitoring programme in Galicia (NW Spain). Environ. Sci. Pollut. Res. Int. 20, 6778-6793 (2013).
  9. Kegel, J. U., Del Amo,, Medlin, Y., K, L. Introduction to Project MIDTAL: its methods and samples from Arcachon Bay, France. Environ. Sci. Pollut. Res. Int. 20 (10), 6690-6704 (2013).
  10. Marcheggiani, S., et al. Detection of emerging and re-emerging pathogens in surface waters close to an urban area. Int. J. Environ. Res. Public Health. 12 (5), 5505-5527 (2015).
  11. Fernández-Calvo, P., Näke, C., Rivas, L. A., García-Villadangos, M., Gómez-Elvira, J., Parro, V. A multi-array competitive immunoassay for the detection of broad-range molecular size organic compounds relevant for astrobiology. Planet. Space Sci. 54 (815), 1612-1621 (2006).
  12. Parro, V. Antibody microarrays for environmental monitoring. Handbook of Hydrocarbon and Lipid Microbiology. , Springer-Verlag. Berlin Heidelberg, Germany. 2699-2710 (2010).
  13. Fan, Z., Keum, Y. S., Li, Q. X., Shelver, W. L., Guo, L. H. Sensitive immunoassay detection of multiple environmental chemicals on protein microarrays using DNA/dye conjugate as a fluorescent label. J. Environ. Monit. 14 (5), 1345-1352 (2012).
  14. Rivas, L. A., García-Villadangos, M., Moreno-Paz, M., Patricia Cruz-Gil, P., Gómez-Elvira, J., Parro, V. A 200-Antibody microarray biochip for environmental monitoring: Searching for universal microbial biomarkers through immunoprofiling. Anal. Chem. 80 (21), 7970-7979 (2008).
  15. Delehanty, J. B., Ligler, F. S. A microarray immunoassay for simultaneous detection of proteins and bacteria. Anal. Chem. 74 (21), 5681-5687 (2002).
  16. Ligler, F. S., Taitt, C. R., Shriver-Lake, L. C., Sapsford, K. E., Shubin, Y., Golden, J. P. Array biosensor for detection of toxins. Anal. Bioanal. Chem. 377 (3), 469-477 (2003).
  17. Rucker, V. C., Havenstrite, K. L., Herr, A. E. Antibody microarrays for native toxin detection. Anal. Biochem. 339 (2), 262-270 (2005).
  18. Kang, J., Kim, S., Kwon, Y. Antibody-based biosensors for environmental monitoring. Toxicol. Environ. Health. Sci. 1 (3), 145-150 (2009).
  19. Herranz, S., Marazuela, M. D., Moreno-Bondi, M. C. Automated portable array biosensor for multisample microcystin analysis in freshwater samples. Biosens. Bioelectron. 33 (1), 50-55 (2012).
  20. Shlyapnikov, Y., et al. Rapid simultaneous ultrasensitive immunodetection of five bacterial toxins. Anal. Chem. 84 (13), 5596-5603 (2012).
  21. Szkola, A., et al. Rapid and simultaneous detection of ricin, staphylococcal enterotoxin B and saxitoxin by chemiluminescence-based microarray immunoassay. Analyst. 139, 5885-5892 (2014).
  22. Blanco, Y., Quesada, A., Gallardo-Carreño, I., Jacobo Aguirre,, Parro, J., V, CYANOCHIP: An antibody microarray for high-taxonomical-resolution cyanobacterial monitoring. Environ. Sci. Technol. 49 (3), 1611-1620 (2015).
  23. Bradford, M. M. A Rapid and Sensitive Method for the Quantitation of Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding. Anal. Chem. 72, 248-254 (1976).
  24. Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 193 (1), 265-275 (1951).
  25. Smith, P. K., et al. Measurement of protein using Bicinchoninic acid. Anal. Biochem. 150 (1), 76-85 (1985).
  26. Rivas, L. A., Aguirre, J., Blanco, Y., González-Toril, E., Parro, V. Graph-based deconvolution analysis of multiplex sandwich microarray immunoassays: applications for environmental monitoring. Environ. Microbiol. 13 (6), 1421-1432 (2011).
  27. Blanco, Y., et al. Deciphering the prokaryotic community and metabolisms in south african deep-mine biofilms through antibody microarrays and graph theory. PloS One. 9 (2), e114180 (2014).
  28. Gas, F., Baus, B., Queré, J., Chapelle, A., Dreanno, C. Rapid detection and quantification of the marine toxic algae, Alexandrium minutum, using a super-paramagnetic immunochromatographic strip test. Talanta. 147, 581-589 (2016).
  29. Parro, V., et al. SOLID3: a multiplex antibody microarray-based optical sensor instrument for in situ life detection in planetary exploration. Astrobiology. 11, 15-28 (2011).
  30. McKay, C. P., et al. The Icebreaker Life Mission to Mars: a search for biomolecular evidence for life. Astrobiology. 13, 334-353 (2013).

Tags

Environmental Sciences cyanobakterier CYANOCHIP miljøovervåking antistoff microarray bærbar fluorescerende immunoassay ferskvannsreservoarovervåking
Forsøksprotokoll for Oppdager<em&gt; Cyanobakterier</em&gt; I flytende og fast Prøver med et antistoff microarray Chip
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Blanco, Y., Moreno-Paz, M., Parro,… More

Blanco, Y., Moreno-Paz, M., Parro, V. Experimental Protocol for Detecting Cyanobacteria in Liquid and Solid Samples with an Antibody Microarray Chip. J. Vis. Exp. (120), e54994, doi:10.3791/54994 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter