Abstract
地球温暖化や富栄養化は、いくつかの水生生態系が急速かつ大規模なシアノバクテリアの成長をトリガとして、真のバイオリアクターを動作させます。これは、関連する健康と経済的な影響を持っています。多くのシアノバクテリア菌株は毒素生産者である、とだけ少数の細胞は、環境に取り返しのつかない損傷を誘発するために必要です。したがって、水体当局との投与は、それらの予防的もしくは治療的な意思決定をサポートするために信頼できるデータを提供する迅速かつ効率的な早期警報システムを必要とします。この原稿は、分類学上の解像度（CYANOCHIP）で17抗体（ABS）を有する抗体マイクロアレイチップを使用して、毒素産生シアノバクテリア株のインフィールド検出のための実験プロトコルを報告します。ここでは、17シアノバクテリア株の同時モニタリングのための多重蛍光サンドイッチマイクロアレイイムノアッセイ（FSMI）が頻繁に淡水生態系に咲く発見、それらのいくつかの毒素生産者は、記載されています。マルチでのマイクロアレイPLE CYANOCHIPの（24まで）同一の複製を同時にサンプルの同様の数をテストするために、単一の顕微鏡スライド上に印刷しました。液体試料は、1〜3ミクロンのフィルターを通して濾過することにより、抗体との直接的インキュベーション（ABS）または細胞濃度後のいずれかで試験することができます。そのような堆積物とグランド石のような固体サンプルを、最初のインキュベーション緩衝液中のハンドヘルド超音波処理によって均質化し、分散しています。粗物質を除去し、ろ液をABSでインキュベートする - それらは、次いで、（20ミクロン5）濾過します。免疫反応は、17蛍光標識Abの混合物で最終インキュベーションによって明らかにされており、可搬型蛍光検出器によって読み取られます。全体のプロセスは、そのほとんどが、インキュベーションの2 1時間の期間に対応し、約3時間かかります。出力は、明るいスポットは、シアノバクテリアマーカーの陽性検出に対応した画像です。
Introduction
複雑な自然の微生物群集中の微生物の検出と監視は生物医学、環境、エコロジー、そして宇宙生物学などの多くの分野で重要です。淡水中の細胞の花（過剰増殖）を形成する能力についてよく知られている原核微生物はシアノバクテリアです。彼らは遍在している、と多くの種は、ヒトの健康に対する潜在的なリスクに、だけでなく、生態系への影響のみならず大手、毒素を産生することができます。この点では、 シアノバクテリアおよび/または土壌及び水中のそれらの毒素の早期検出のための迅速かつ高感度な方法を開発することが不可欠です。水管理者が適切な水管理プログラムを実施する際に、結果的に、決定にそれらを助けるために、この目的のために、多重蛍光サンドイッチマイクロアレイイムノアッセイ（FSMI）のツールとして開発されました。
方法の多様な範囲は、シアンを検出および同定するために開発されています光学顕微鏡、分子生物学、および免疫学的技術を含む土壌や水にobacterial細胞およびシアノトキシン、。これらの方法は、それらが提供する情報に大きく異なります。顕微鏡技術は、細胞の形態や、フィコシアニンやクロロフィル1とシアノバクテリア顔料、からの生体内蛍光の検出に基づいています。彼らは、試料中に存在するシアノバクテリアの種類と数をお知らせリアルタイムおよび頻繁なモニタリングのための迅速かつ安価な方法であるが、それらは潜在的な毒性に関する情報を与えることはありません。さらに、彼らは、しばしば密接に関連した種2を区別することは非常に困難であることを考慮して、専門知識の特定のレベルを必要とします。これらの制限を克服するために、光学顕微鏡は、生物学的および生化学的スクリーニングアッセイおよびシアノトキシンの同定および定量のための物理化学的方法の両方を添付しなければなりません。
分子ベースの方法は、ゲノムデータベースに公開された配列情報のおかげで、検出、同定、およびシアノバクテリアとそれらに対応するシアノトキシンを定量化するために数十年にわたって適用されている（ 例えば、バイオテクノロジー情報、NCBIのための国立センター）。これらの方法の中でDNAの増幅のためのプライマーセットの設計を必要とし、別のシアノバクテリア種のDNA配列の予備知識に依存してポリメラーゼ連鎖反応（PCR）に基づくものです。遺伝子の検出は、フィコシアニンオペロンのように、属レベルでの正確な同定をもたらす一方で、一部の種や菌株がで検出されませんこの方法。しかしながら、このようなミクロオペロンに属するものとして毒素をコードする遺伝子は、プロデューサ5不足しているサンプル中の毒素の同定を容易にします。それにもかかわらず、PCRによる毒素マーカーの検出は、必ずしも環境に毒性を示すものではありません。また、 シアノバクテリアの種と試料中に存在する毒素生産の全範囲を分析するために開発されたプライマーのセットは、まだ不完全であり、更なる研究は、未知の種を同定するために行われなければなりません。他の分子技術は、 蛍光in situハイブリダイゼーション（FISH）およびDNAマイクロアレイなどの非PCRベースです。
過去20年間では、マイクロアレイ技術は、特に環境モニタリングでは、アプリケーションの多くの分野で重要性を増しています。 DNAマイクロアレイは、種との検体4の間の識別、6、7を可能にSUP>、8、9、10、それらは非常に面倒で時間がかかる複数のステップ（ 例えば、マイクロアレイの性能、DNA抽出、PCR増幅、およびハイブリダイゼーション）を伴う作業を考えています。そのため、例えば、サンドイッチおよび競合免疫学的マイクロアレイのような抗体に基づいてより少ない時間のかかるアッセイは、多数の環境の分析物11、12、13の検出のために不可欠で信頼性の高いハイスループット法となっています。抗体の能力は、特に、それらの標的化合物を認識し、ほとんどすべての物質に対する抗体を産生する可能性とともに、検体およびタンパク質の少量を検出するために、抗体マイクロアレイを環境目的のための強力な技術を作ります。また、複数を達成する能力は、として分析しますイングルアッセイは、ppmのppbの範囲の検出限界で、この方法14の主な利点の1つです。
抗体ベースのバイオセンサーは、環境モニタリング15、16、17、18、19、20、21中の病原体および毒素の広い範囲を検出するための高感度かつ迅速なツールであることが判明しています。 DNA法は、いくつかのステップを含むが、抗体ベースのマイクロアレイは、主に適切なソリューションバッファ内の短い溶解段階に基づいて、小さなサンプル調製を必要とします。 DelehantyとLigler 15 4 PPBのANのタンパク質濃度を検出することができる抗体サンドイッチ免疫測定法に基づいて、複雑な混合物中のタンパク質および細菌分析物の同時検出を報告しD 10細胞の4 CFU / mLです。 Szkola ら。 21は生物兵器に使用されるかもしれないproteotoxinsと小さな毒素、化合物の同時検出のための安価で信頼性の高いマルチプレックスマイクロアレイを開発しました。彼らは20分未満で、3 ppbでの検出限界で、リシン毒素の濃度を検出しました。最近、CYANOCHIP、毒性および非毒性のシアノバクテリアのin situ検出のための抗体マイクロアレイベースのバイオセンサーは、22に記載されています。このマイクロアレイは、主に顕微鏡的に識別することが困難である水生環境で、潜在的なシアノバクテリアブルームの同定を可能にします。でも、種レベルで、多重検出およびシアノバクテリアの同定のための費用対効果の高いツールにこのバイオセンサーを回すほとんどの種のために10 3細胞、 -マイクロアレイの検出限界は10 2です。これらのプロパティはすべてantiboを作りますDYマイクロアレイ技術、およびこの仕事で提示特に方法、前述の技術に比べて迅速かつ簡単な方法。
この作品は、土壌と水のサンプル中のシアノバクテリアの存在を検出するために抗体マイクロアレイベースのバイオセンサーを使用した実験の2つの例を示します。これは、非常に少量の試料と非常に基本的なサンプル調製を必要とするサンドイッチイムノアッセイフォーマットに基づいて簡単かつ信頼できる方法です。この方法は、短い時間を必要とし、容易フィールドで行うことができます。
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Protocol
免疫原の調製
- 表1に記載の条件下で、対応する培養液中の各シアノバクテリア菌株の増殖。
注：各シアノバクテリア株の成長培地と培養条件を表1に記載されています。すべてのシアノバクテリア株は、K17を除いて、自治大学（マドリード、スペイン）からアントニオ・ケサダのグループに属しています。 Planktothrixのrubescensに対する抗体はVilasoutoリザーバ（スペイン北部）からこのシアノバクテリアの単一特異満開の天然試料から生成されました。 - 指数後期または定常増殖期の培養物からの約10 8細胞/ mLを得るために、光学顕微鏡で細胞計数チャンバーを用いて細胞数を定量化します。
- 5分間2000×gで遠心分離により培養5 mLのから細胞を回収。
- 上清を捨て、10-mLの浴槽に細胞を再懸濁/ mLの約10 8個の細胞を得るための1×リン酸緩衝生理食塩水（1×PBS）5mLで、E。
- 均質化およびポータブル、手持ちの超音波プロセッサを使用して、氷上で30〜60-sのポーズで、5サイクル、30秒ごとに超音波処理による懸濁液の細胞を溶解させるかの水浴にチューブを浸漬することにより、最大振幅（30 kHzの）での細胞破壊。
- シアノバクテリアの各株について1.5 - を繰り返して、1.3を繰り返します。
注：超音波処理は、細胞を破砕した携帯コンテンツのリリースを生成します。タンパク質や多糖類が良い免疫原であるが、このような脂質や核酸などの特定の分子は、それ自体で体液性免疫原性応答を誘発しません。したがって、それらは、分子の複雑さを増大させるために、多糖類やタンパク質などの担体に結合しなければなりません。また、超音波処理は、抗体産生を誘発することができる細胞内物質を放出します。
ポリクローナル抗体の2生産
- 最初のIMMを準備完全フロイントアジュバントの0.5 mLでステップ1.5で得られた超音波処理細胞溶解物の0.5 mLで混合することによりunogen用量。ポリクローナルウサギ抗体産生のために動物施設のオペレータに配信。
- 不完全フロイントアジュバントの0.5 mLでステップ1.5で得られた同じホモジネート/溶解液を0.5mLを混合することにより、抗体産生プロセスでメモリブーストとしてさらに使用するために以前のように3回以上の投与を準備します。抗体産生プロセスを満たすために動物施設にそれらを与えます。
- 繰り返しますが、それぞれの新しい抗体生産プロセスのために2.1と2.2を繰り返します。
注：適切なライセンスとトレーニングが動物と連携する必要があるため、通常は、抗体産生は、専門の動物施設や企業に委託されています。企業は、血清試料中に存在する抗原特異的抗体の量の相対的な酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）測定を提供します。
3.抗体Purification
- 免疫およびプロテインAアフィニティークロマトグラフィーによって、ステップ2で収集した免疫前血清の両方から免疫グロブリンG（IgG）画分を精製します。いくつかの市販の精製キットは、カートリッジシステムに基づいて、うまく動作します。プロバイダの指示に従ってください。
- 時精製キットは、透析により、又は100-kDaの（またはより低い）で遠心分離フィルター装置を使用することによってのいずれか、PBSを0.1Xする精製抗体の溶出後にバッファーを変更し、膜の孔径を脱塩システムを提供していません。
- 280 nmの吸光度を測定することによって、またはそのようなブラッドフォード23、ローリー24、またはビシンコニン酸（BCA）25として比色法を用いて抗体濃度を決定します。
注：これらはエポキシ基で活性化された固体表面に結合するための抗体と競合するので、溶出緩衝液中のアミン基（ 例えば、トリス緩衝液）を含む、回避することが重要です。 PU後rificationは、ELISAで抗体の活性を試験することが重要です。
4.蛍光抗体ラベリング
- ジメチルスルホキシド（DMSO）の100μLにタンパク質を標識1mgのための染料を含有する市販のバイアルを溶解することにより、蛍光色素（ 例えば、遠赤色蛍光色素）とセクション3で得られた精製抗体にラベルを付けます。 50mMのリン酸緩衝生理食塩水（pH8.5）中、50μLの最終容量での2mg / mLの濃度の各抗体調製物に溶解した染料の2μLを加えます。
- 周囲温度で1時間と振動プラットフォーム上で1200 rpmでの継続的攪拌下で標識反応を維持します。
- サイズ排除クロマトグラフィーによって標識された抗体を精製（ 例えば、カラムに捕捉された1.5と30kDaの間の分別範囲でゲルを使用して）供給者の推奨に従って、。
- 280nmでの溶出液で650 nmの吸光度を測定し、ラベを計算サプライヤーの推奨に従って玲効率。
注：最大50×50-μL抗体 - 標識反応は、タンパク質の標識の1 mgのための蛍光色素の単一バイアルで行うことができます。ステップ4.3の後に焼入れプロセスを回避するために、不透明な0.5 mLのチューブを使用すること、あるいは、アルミホイルでチューブを覆ったりすることをお勧めします。 IgG抗体の場合、最適な標識は、抗体のモルあたりの色素の3~7モルで達成されます。
5. CYANOCHIP生産
- 印刷溶液中の抗体とコントロール
- 0.01％（v / v）のトゥイーン20（非イオン性界面活性剤）、最終濃度としてすべてで商業1Xタンパク質印刷バッファ中1mg / mLの各抗体を混合することにより、印刷溶液中の各精製抗体の30μLを準備します。
炭酸塩緩衝液（pH 8.5）中で代替的に、抗体溶液は、（防腐剤として、またはトレハロース）、20％グリセロール、1％（w / v）のスクロースを含有していてもよい、および0.01％（v / v）のツイーン20：注意。 - 0.01％と、（A）1×タンパク質印刷バッファ（v / v）のトゥイーン20、を有する1×タンパク質印刷バッファ中1mg / mLの（b）のタンパク質精製免疫前血清：対照として印刷液30μLを準備0.01％（v / v）のTween 20で1×タンパク質印刷バッファ中1mg / mLの0.01（v / v）のトゥイーン20％、及び（c）ウシ血清アルブミン（BSA）。
- （ 例えば、1μgの/ mLまでの50μg/ mLのから）のTween 20で1×タンパク質印刷バッファ、ステップ5.1.1のように異なる濃度で蛍光標識された、精製された免疫前血清の30μLを準備します。これらのサンプルをスポットした後、蛍光フレームマーカーとして、相対蛍光定量のために使用されます。
- ポリプロピレンのような、マイクロアレイの製造のための最高品質の384ウェルマイクロプレートに30のステップ5.1.1で製造した印刷ソリューションのウェル当たりμL、5.1.2、および5.1.3を追加します。
注記：タンパク質印刷バッファは、抗体の品質と安定性を高める、およびTween 20は、スポットMOを均一化rphology最大結合タンパク質を構築します。使用前に4℃で384ウェルマイクロプレートを維持することをお勧めします。長時間-20℃で保管してください。ポリプロピレンは、バインディング固有の低いDNA、タンパク質、細胞抽出物、および小分子を有します。
- 0.01％（v / v）のトゥイーン20（非イオン性界面活性剤）、最終濃度としてすべてで商業1Xタンパク質印刷バッファ中1mg / mLの各抗体を混合することにより、印刷溶液中の各精製抗体の30μLを準備します。
- 顕微鏡スライド上に印刷する抗体
注：連絡先、スプリット針、またはそのような圧電プリンタや「インクジェット」技術などの非接触デバイス、のように、異なるアレイプラットフォームを使用することによって活性化された顕微鏡スライド上に抗体を印刷します。この作業では、CYANOCHIPは日常ミクロンスケールでの抗体のnLの量をスポッティングすることが可能なロボットシステム（アレイヤー）を使用して連絡先によって印刷されています。- 相対湿度50％ - 20°Cおよび40に印刷室の環境条件を設定します。
- スライド基板を設定する（ 例えば、75〜×25 mmのエポキシ活性化顕微鏡ガラススライド）いくつかの同一の抗体ARRAを実行します各スライド上のYS。
- スポットコントロールと三重スポットパターン内の参照フレームを含むそれぞれの精製された抗体は、直径200μmの - これらの条件下で、スポットは180です。
- 印刷後、それらを乾燥させ、周囲温度で少なくとも30分間、スライドを残し、その後、4℃で保管してください。フィールドでの作業のために、スライドは、数ヶ月間、周囲温度で輸送および保存することができます。
注：CYANOCHIPはスライド当たり3×8の同一のマイクロアレイまたは1×9マイクロアレイフォーマットで9同一のアレイと三重スポットマイクロアレイフォーマットで印刷されます。各配列のサイズは、24ウェルのガスケット（3×8ハイブリダイゼーションチャンバー中に通常7.5×6.5ミリメートル）のための反応室の寸法よりも高くすることはできません。 - 環境試料を分析するためにマイクロアレイを使用する前に、滴定曲線の各抗体の作業希釈率を決定するためにFSMIを使用しています。各抗体について、対応するIMMの標準濃度を使用unogen（10 3 - 10 4細胞/ mL）及び蛍光抗体の連続希釈（1：500および1：32,000）。最適な抗体濃度は、滴定曲線で得られた最大シグナル強度の50％に相当します。ブランコらに記載されているように、また、それぞれの抗体についての感度および特異性は、決定されなければなりません。 22。
蛍光サンドイッチマイクロアレイイムノアッセイのための環境多検体抽出物の6準備（FSMI）
- 液体試料から多検体の抽出物
- ;滅菌シリンジ（ 例えば、水溜りの海岸からの水）と液体試料の100ミリリットル- 1を取ります試料の量は、ターゲットの潜在的な濃度に大きく依存します。
- 3ミクロンの孔サイズ、47 mmの直径のポリカーボネートフィルターを通して水サンプルを通過させることにより細胞を濃縮します。細胞内濃度3から 10の間-細胞10 8 / mLの正の検出のために望ましいが、実際の濃度は不明です。
- とそれをこすることによって、修正されたトリス緩衝食塩水、トゥイーン20強化緩衝液（0.4 Mトリス塩酸（pH8）、0.3MのNaCl、および0.1％のTween 20 TBSTRR）1mlでフィルターに集めバイオマスを回復15 mLチューブにへら。
- 均質化および脱凝集手持ちの超音波プロセッサを使用することにより、ステップ1.5で説明したように、あるいは単に複数回ピペッティングすることにより、これは、マイクロアレイによる分析のためのサンプルを準備します。
- 固体試料から多検体の抽出物
- 10 mLチューブに固体試料（ 例えば、岩石、土壌、または堆積物）の0.5グラムまで計量しTBSTRRの2ミリリットルまで追加。
- チューブ内の、強力な超音波処理ホーンの水浴にチューブを浸漬することにより、またはハンドヘルド超音波処理器を用いて超音波処理器プローブを浸漬し超音波処理。少なくとも5×30-Sを実行します氷の上ながら、30秒間停止30 kHzでサイクル。
- 、10〜12 mmの直径に結合された10-mLシリンジで5〜20μmの細孔サイズのナイロンフィルターホルダーを砂、粘土、および他の粗物質を除去するためのフィルタ。 1.5 mLチューブにフィルターを通してサンプルを押してください。フィルタが飽和する場合は、シリンジ中の懸濁液を攪拌し、新しいものにそれを取ります。これは、免疫測定法（ステップ7）のためのろ液の材料を準備します。
注：TBSTRRの緩衝能は、試料の種類によって異なります。分析物の酵素的分解の影響を回避するために、環境の抽出物の調製直後のイムノアッセイを行うことが重要です。また、環境エキスにプロテアーゼ阻害剤を追加し、次のステップまで-80℃で凍結します。
7.蛍光サンドイッチマイクロアレイイムノアッセイ（FSMI）
- CYANOCHIPをブロック
注：使用直前に、pを扱いますrintedは、スライド上のすべての遊離のエポキシ基をブロックするために非共有結合した抗体の過剰量を除去するためにスライド。- 5分間ロッカープラットフォームから穏やかに撹拌しながら5％の清浄表面上（w / v）のBSA溶液（ 例えば、ペトリ皿または50 mLチューブ）と、0.5MのTris-HCl（pHが9）にマイクロアレイを浸し。また、それに直面してマイクロアレイスポットを有する上記溶液の100〜200μLのドロップの上にダウンスライドを置きます。 3のために残す - 5分、次に進みます。
- 慎重た先端がプラスチックのピンセットを用いてスライドを拾います。感動マイクロアレイゾーンを避けるようにしてください。そっとペーパータオルの上にスライドをノックすることにより過剰の液体を排除します。 2％0.5 Mトリス-HCl（pHは8）ロッカープラットフォームから穏やかに撹拌しながら30分間（w / v）のBSA溶液中に浸します。
- 顕微鏡スライドのために適合商業微量を使用して - （1分間300×gで200）短い遠心分離を行うことにより、スライドを乾燥させます。代わりに、そっとONTノッキングにスライドを乾燥OA用紙タオル。
- マイクロアレイと多検体試料抽出物のインキュベーション
- 複数のマイクロアレイのための24ウェルを有する商業用マイクロアレイハイブリダイゼーションカセット内のスライドを設定します。プロバイダの指示に従ってください。
- スライドおよびカセットアセンブリの後、サンプルの抽出物またはカセットの各ウェルにTBSTRRにおけるそれの希釈液50μLまでピペット。
- 分析すべき各サンプルの手順を繰り返し7.2.2。
- ブランク対照として、TBSTRRのピペット50μL、カセットの少なくとも二つの別々のウェルにバッファー。
- 15分ごとにピペッティングすることによって、または軽度の振とう下でそれを残すことによって混合しながら周囲温度で1時間インキュベートします。代替的に、4℃で12時間インキュベートします。
注：マイクロアレイパターンの関数として他のインキュベーションのガスケットを使用してください。時間とステップ7.2.5でのインキュベーションの温度は、通常、親和性及び結合気に依存する経験的なパラメータでありますそれぞれのneticsは、抗原 - 抗体対になりました。
- 洗浄
- クリーン、吸収紙の上にそれをノックダウンし、慎重にカセットを入れてサンプルを削除してください。
- それぞれにTBSTRRの150μLを添加することによってウェルを洗浄し、上記のように、バッファをなくします。
- 手順を繰り返し7.3.2 3回以上。
- 蛍光検出抗体とのインキュベーション
- 17抗シアノバクテリア株の抗体を含む抗体混合物50μLを追加、それぞれ1％（w / v）のBSAでTBSTRRにおける蛍光色素で標識しました。 （0.7〜2μgの/ mLの）混合物中の各蛍光抗体の濃度を決定 各抗原/抗体対22の滴定実験を行うことによって。
- ステップ7.2.5で説明したように、周囲温度で1時間インキュベートするか、4℃で12時間インキュベートしました。
- 蛍光抗体を洗浄</強いです>
- ステップ7.3のように、蛍光未結合抗体を除去します。
- カセットを分解し、迅速なすすぎ（50 mLチューブで例えば、）0.1×PBSにスライドを浸します。
- ステップ7.1.3のようにスライドを乾燥させます。
蛍光8.スキャン
- 蛍光スキャナで遠赤色蛍光色素のために最大発光蛍光ピークの蛍光用のスライドをスキャンします。一般に、レーザ利得値を低下させることにより、異なる走査パラメータでマイクロアレイの複数の画像を取ります。
注：-theyは規模の外にあり、定量化エラーを導入する可能性が飽和スポット（> 65,000蛍光カウント数を）避けてください。
9.画像処理とデータ解析
- 画像解析および定量化のための商用ソフトウェアを使用します。 Eの;（中央値または単一のスポットからのすべての画素の平均FI）ソフトウェアは、蛍光強度の測定値を提供します全体マイクロアレイのACHスポット。 - FI ローカルバックグラウンド FI = FI スポット ：スポット周辺の局所バックグラウンドを減算します。
- FIデータを保存し、スプレッドシートプログラムを使用して、それらを開きます。
- 偽陽性を識別し、廃棄する陰性対照として空白の配列について得られた値を使用してください。各抗体スポットについてFIを計算するために以下の式を適用します：FI =（FI サンプル - FI ブランク ）FI サンプルは = FI スポット 、 -マイクロアレイにおけるFI 地元の背景には 、サンプルを抽出し、FIのブランク = FI スポットで実行- FI 地元の背景ブランクマイクロアレイインチ
- 2位に偽陽性の確率を最小限にするために、全マイクロアレイのFIの平均を3倍の追加のカットオフ閾値を適用します。これは、低品質のマイクロアレイ画像と低い信号対雑音比のために特に適切です。
- プロットを作成し、および/または必要に応じてさらなる分析を行います。
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Representative Results
この作品はCYANOCHIP抗体マイクロアレイを用いて、最も関連性の高い淡水シアノバクテリア種の同時同定（ 表1）のためのマルチプレックスイムノアッセイテストを説明します。マイクロアレイは、顕微鏡スライド上に印刷された3×8マイクロアレイフォーマットすることができます。各マイクロアレイは、陰性対照としてトリプリケートスポットパターンで印刷17抗体のセット、それらの対応する免疫前抗体およびBSAから構成されています。マイクロアレイはまた、簡単にマイクロアレイパターン22（ 図1）をローカライズするために、蛍光標識された免疫前抗体を用いて、蛍光のフレームが含まれます。
マイクロアレイはマドリードの街を供給する淡水ロソヤ貯水池の海岸で採取した水試料のその場での分析のためのフィールドで試験しました。サンプルは、上記のように処理し、し主正免疫反応は、 アオコ属などの浮遊性シアノバクテリア 、に対する抗体に対応します。 （K4及びK5）、およびそのようなLeptolyngbya属としてユレモ目を、底生します。 （K10およびK15）。低い蛍光シグナルは、ネンジュモ目（K6およびK12二浮遊アファニゾメノン属 ）、底生Rivularia属から得ました。 （K8）、 アナベナ属 。 （K1）、およびプランクトンアオコフロス- aquaの複数形・エスピー。 （K3）。光学顕微鏡観察（図示せず）海岸から豊富な陸源デブリ内の多様なシアノバクテリアコミュニティを示しました。 アナベナのいくつかの種は、コミュニティが、 アオコ属を支配しました。そして、Pseudanabaena属 。存在しました。
さらに、マイクロアレイはまた、シアノバクテリアミリアンペアの存在をテストするために南極マクマード棚氷に集め、乾燥、約1000年の歴史微生物マットをアッセイすることによって検証されましたrkers。 図1は、 アナベナ属を含む他の南極マットから単離されたシアノバクテリアを底生するために産生された抗体で高度に蛍光性、陽性反応を示しています。そして、Leptolyngbya属 。 （それぞれ、K14およびK15、）。追加の正の免疫反応は、 アオコ属などの浮遊性シアノバクテリア 、に対する抗体を用いて検出しました。 （K4及びK5）、 アファニゾメノン属 。 （K6およびK12）、およびPlanktothrixは、SPをrubescens。 （K17）。低信号はTolypothrix属を含む南極マットに単離された他の底生生物種に対する抗体から得ました。 （K16）及びアナベナ属 。 （K1）。蛍光光学顕微鏡は、 シアノバクテリア及び緑藻類（図示せず）に構造的に類似した細胞の存在を明らかにしました。いいえ糸状シアノバクテリアは同定されませんでした。それにもかかわらず、約1μmのサイズと豊富な拡散蛍光の複数の非晶質蛍光構造が検出された、WHIchがそれぞれの細胞が残る（壊れて死んだ細胞）および細胞外高分子物質（EPS）の存在に起因する可能性があります。したがって、生化学的解析は、マットが生体高分子とマイクロアレイにおいて抗体の標的となり得る細胞残骸（複雑な生物学的物質）のおびただしい量から成っていることを示しました。
図1： 検出 シアノバクテリア のための迅速かつ信頼性の高いマルチプレックスマイクロアレイイムノアッセイ 。 A）スキームCYANOCHIP有するマルチターゲット試料の分析のためにFSMIの主要な工程を示します。 B）三重による印刷パターンレイアウトの概略（）抗シアノバクテリア抗体コレクション（0）BSA、ウシ血清アルブミン。緩衝液のみを印刷する（X）; （1-17）の各抗体B表1のように、ランコら。 2015（K17へK1）。 P1からP17に、対応する前免疫抗体は、コントロールとして機能します。黄色の長方形は、フレーム基準などの蛍光スポット勾配に対応しています。 CおよびD）マクマード棚氷（南極）から千歳乾燥微生物マットは、それぞれ、このマットにシアノバクテリアを検出CYANOCHIP画像の上部を示す写真。 E）ロソヤ貯水池は、サンプリング時に目に見える緑色の粒子と透明な水を示すのパノラマビュー。 F）水試料のin situ分析後のマイクロアレイ画像（）参照22から変更されました。
| アブコード | 免疫原（株） | 注文 | 生息地 | | 培養条件 | |
| K1 | アナベナ属。 | ネンジュモ目 | 未知の | BG11と硝酸 | 30ºC、連続光 |
| K2 | アナベナ属。 | ネンジュモ目 | 未知の | BG11o | 30ºC、連続光 |
| K3 | アオコのフロス- aquaの複数形 | クロオコッカス目 | プランクトン様の | BG11 | 28ºC、連続光 |
| K4 | アオコのnovacekii | クロオコッカス目 | プランクトン様の | BG11 | 28ºC、連続光 |
| K5 | アオコ緑膿菌 | クロオコッカス目 | プランクトン様の | BG11 | 28ºC、連続光 |
| K6 | アファニゾメノンovalisporum | ネンジュモ目 | プランクトン様の | BG11o | 28ºC、連続光 |
| K7 | フォルミディウム属。 | ユレモ目 | 深海底の | BG11 | 18ºC、16-8日長 |
| K8 | Rivularia属。 | ネンジュモ目 | 深海底の | CHU-D | 18ºC、16-8日長 |
| K9 | Chamaesiphon属。 | クロオコッカス目 | 深海底の | BG11 | 18ºC、16-8日長 |
| K10 | Leptolyngbya boryana | ユレモ目 | 深海底の | BG11 | 18ºC、16-8日長 |
| K11 | Tolypothrix distorta | ネンジュモ目 | 深海底の | BG11o | 18ºC、16-8日長 |
| K12 | アファニゾメノンaphanizomenoides | ネンジュモ目 | プランクトン様の | BG11o | 28ºC、連続光 |
| K13 | ノストク属。 （南極大陸） | ネンジュモ目 | 深海底の | BG11o | 13ºC、16-8日長 |
| K14 | アナベナ属。 | ネンジュモ目 | 深海底の | BG11o | 13ºC、16-8日長 |
| K15 | Leptolyngbya属。 | ユレモ目 | 深海底の | BG11 | 13ºC、16-8日長 |
| K16 | Tolypothrix属。 | ネンジュモ目 | 深海底の | BG11 | 13ºC、16-8日長 |
| K17 | Planktothrixのrubescens | ユレモ目 | planktoNIC | なし | なし |
表1。 抗体（ABS）とCYANOCHIP 22を 生成するために使用されるシアノバクテリア株のリスト 。
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Discussion
ここでは、CYANOCHIP、シアノバクテリア属の広い範囲の検出および同定のための17-抗体マイクロアレイを用いて、多重蛍光サンドイッチ免疫測定法は、22に記載されています。これらのシアノバクテリアは、そのうちのいくつかは毒素生産され、淡水生息地の中で最も頻繁に底生やプランクトンの属を表します。最近、蛍光サンドイッチイムノアッセイ形式が、環境のアプリケーション26、27、28中の微生物および/またはbioanalytesを識別するために使用されています。 （I）固定化または捕捉抗体を特異的に試験試料から分析物を結合することと、（ii）蛍光標識された抗体（トレーサーまたは検出抗体）を用いて分析物 - 抗体ペアを検出：プロトコルは、主に次の2つのステップに基づいています。サンドイッチアッセイは、のために、検体中に少なくとも2個のアクセス抗体の結合部位（エピトープ）を必要とするので反応は、任意の正の蛍光シグナルは、同一または捕捉抗体を産生するために使用されるものと非常に類似しており、比較的大型で複雑なオリゴまたは多量体の分析物の存在を示す、場所を取ります。
この方法は、小さなボリュームと基本的なサンプル調製を必要とするにもかかわらず、特別な専門知識や知識を必要とせずに、いくつかの欠点は、アッセイを台無しにする可能性があります。低蛍光信号または完全な欠如は、その貧弱な抗体精製や貧弱な標識効率に起因する可能性があります。それは具体的に、免疫グロブリンのFc領域に高効率で結合するため、ウサギIgGの単離のために、プロテインAは、最良の選択です。セクション4に示されるように、抗体のモルあたりの色素の3~7モルの間の標識の範囲で蛍光抗体を使用しなければなりません。また、蛍光スポットの欠如は、検出限界の下に横たわっている分析物の濃度によって説明することができます。この場合、サンプルを濃することができentratedマイクロアレイ、またはより多い量でそれをインキュベートする前に、新たな抽出のために使用することができます。高蛍光背景は非効率的なチップのブロッキングおよび/または洗浄工程のチップ上に固執ミネラルや複雑な有機物で構成されるサンプルからの抽出物の結果です。複雑なサンプルを分析物として使用する場合には、検体 - 抗体ペア間の特異的相互作用に有利に塩および/または界面活性剤の濃度を増加させることが望ましいです。
近年では、抗体マイクロアレイ技術は、環境用途のために開発されてきました。それにもかかわらず、この技術の使用は、いくつかの制限を伴うありません。ポリクローナル抗体は、より速く、より安価生成するためであり、より重要なことには、複雑な環境サンプル中の任意の標的エピトープに結合する可能性は、モノクローナル抗体と比べて、理論的に高いです。しかし、それらは異なるエピトープを認識することができるという事実は、FSMに交差反応の数を増加させます高い特異性を得るためにI.は、デコンボリューション方法26,27を用いて真の同種抗原抗体反応から、これらの交差反応性イベントを解きほぐすための方法の使用は、例えば、非常に望ましいです。基本的には、マイクロアレイは、複数の検出およびシアノバクテリアの分類のための定性的なバイオセンサーであると考えられます。これに関して、各抗体一つずつアッセイにおけるそれらの最適な作業用濃度を使用するための検出限界を決定することが不可欠です。このマイクロアレイは、一緒にFSMIと、定量的な方法として考えられていないがCYANOCHIP 22に含まれる抗体のほとんどの検出下限は、10 2〜10細胞/ mlであるので、バイオセンサは、高い感度を意味します。
これらの制限にもかかわらず、この方法は、環境Mで使用される他の技術に対していくつかの利点を有していますonitoring。抗体 - バイオセンサーは、1回の分析で同時に低い分析物の濃度、およびほとんどすべての物質に対する抗体を産生する可能性を検出する可能性を別の分子を認識する可能性を可能にします。さらに、マイクロアレイは24まで達成することができます10 2細胞/ mLから検出限界で、単一のアッセイで分析します。他の方法と比較して、抗体は、生きているまたは死んだ細胞、細胞外物質、および細胞破片を検出することができます。それは全体のアッセイを完了するために少なくとも4時間を要するが、環境モニタリングに適用され、他の分析方法よりも高速です。 CYANOCHIPはもともとシアノバクテリア株の同定のために考案されました。このバイオセンサーは、正式にその目的のために設計されていないので、潜在的な毒素の生産を識別することができ、新しい株の広い範囲に対する抗体を添加することにより、将来的に改善することができます。例えば、ELISA、PPIA、および神経化学などの生化学的アッセイ、マウスでのテストは、シアノトキシンの同定を可能にするが、彼らはいくつかの既知の毒素に制限され、偽陽性を与えることができます。光学顕微鏡とマウスバイオアッセイは、生きた動物で訓練を受けた人員または労働集約的な作業を必要とし、試料中に存在する毒素の種類についての情報を与えることはありませんがまた、CYANOCHIPを使用すると、特別な訓練を必要としません。シアノトキシンはまた、HPLC、GC-MS、またはMALDI-TOFのような他の分析方法によって同定および定量することができます。これらの方法では、試料を精製する必要があり、参照標準の欠如は、シアノトキシンの同定を制限します。また、分析方法は、高価な機器および消耗品や専門的なトレーニングを必要とします。 FSMIだけシアノバクテリアの精製を行うことなく、非常に簡単な手順のカップルで製造した環境の抽出物を必要とする分子的方法は、試料からのDNA抽出に基づいています。
CYANOCHIPの高性能化淡水貯水池におけるシアノバクテリアのその場での検出は、その水の管理者を早期に警告するための新しいツールになります。また、マイクロアレイは、特に生命の証拠として微生物マーカーを探索するため、また、宇宙生物学の分野のための興味深いです。極限の研究は、地球上の生命の起源を理解するために、どのように人生は私たちの太陽系で以降存在過酷な環境下で生き残る可能性が私たちを助けることができます。地球上のいくつかの環境では、火星など他の惑星、上の場所に非常に類似しているとして、絶滅生命の証拠として、光合成原核生物の残骸を見つけることが可能かもしれません。マイクロアレイは、生細胞または無生物からシアノバクテリアのマーカーを同定することができました。集団から古いバイオマット（ 図1）に残り、および/または細胞外物質;そして、このような南極、アタカマ、アンデスの湖、北極圏、またはのような極端な環境で集められた水、土壌、岩からスペインのリオ・ティントエリア（図示せず）。 シアノバクテリアは、地球上の原生微生物であることを考えると、彼らはかつて他の惑星に住んでいたかもしれないと信じる理由があります。
結論として、CYANOCHIP-FSMIはその場シアノバクテリアマーカーで識別することができ、さらには異なるphylotypesまたはグループに関連付けることができ、およびマイクロアレイはプランクトン、底生生物、およびendolithsのものを含め生息地の広い範囲を、カバーするという事実は、このことを実証しています環境モニタリングのためのツールは、技術可能性があります。マイクロアレイへの将来の改善はまだ保留中の関連する系統発生群が含まれているように、新しい株に対する抗体の数を増加させることができました。さらに、チップは、毒素またはcyanophicinポリマーとして特定のシアノバクテリア化合物に対する抗体を用いて実施することができます。これは、人間の施設で、新鮮な水の貯水池、パイプ、およびインストールを監視するために特に適切です。現在のMICRoarrayと将来のバージョンでは、寿命検知または有人宇宙施設（ 例えば、監視貯水池または生命維持システム）を監視するためのいずれか、宇宙生物学の分野で非常に有用であろう。実際には、我々が日常生活の「オンサイト」検出のままのための方法として、極限環境へのフィールドキャンペーンのマイクロアレイを使用します。マイクロアレイは、いわゆるライフ検出器チップ（LDChip）、惑星探査ミッション29、30での生活のための検索のための300以上の抗体を用いたマイクロアレイの一部です。マイクロアレイ単独で、またはLDChipの一部としては、地上アナログに複数のフィールドキャンペーンの惑星探査のためのSOLID-LDChipの概念を検証するためにライフ検出器（SOLID）、機器29のサインで実装されます。マイクロアレイは、 シアノバクテリアおよび/またはそれらの毒素を同定することによって、有用な情報を提供します。株を決定することにより、それがGIます環境と彼らが開発されている生息地についての情報がまし。
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Acknowledgments
私たちは、シアノバクテリア菌株を提供するために大学自治・デ・マドリードから博士アントニオ・ケサダに感謝します。この作品は、スペイン語MINISTERIOデエコノミアのy Competitividad（MINECO）のSubdirección一般デProyectosデInvestigaciónによって資金を供給された、無許可します。 AYA2011-24803とESP2014-58494-R。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 mm pore diameter filters | Millipore | GSWP04700 | For preparation of immunogens |
| Eppendorf 5424R microcentrifuge | Fisher Scientific | For preparation of immunogens | |
| Phosphate buffer saline (PBS) pH 7.4 (10x) | Thermo Fisher Scientific | 70011036 | 50 mM potassium phosphate, 150 mM NaCl, pH 7.4 |
| Ultrasonic processor UP50H | Hielscher | For preparation of immunogens | |
| Complete Freund's adjuvant | Sigma-Aldrich | F5881 | Immunopotentiator |
| Incomplete Freud's adjuvant | Sigma-Aldrich | F5506 | For boost injections |
| Protein A antibody purification kit | Sigma-Aldrich | PURE1A | For isolation of IgG |
| Centrifugal filter devices MWCO<100 kDa | Millipore | UFC510096-96K | For isolation of IgG |
| Dialysis tubings, benzoylated | Sigma-Aldrich | D7884-10FT | For isolation of IgG |
| Illustra Microspin G-50 columns | GE-HealthCare | GE27-5330-02 | For isolation of IgG |
| Bradford reagent | Sigma-Aldrich | B6916-500 mL | To quantify the antibody concentration |
| MicroBCA protein assay kit | Thermo Scientific | 23235 | To quantify the antibody concentration |
| Protein arraying buffer 2x | Whatman (Sigma Aldrich) | S00537 | Printing buffer; 30 - 40% glycerol in 1x PBS with 0.01% Tween 20 |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | Non-ionic detergent |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9418 | Control for printing; blocking reagent |
| 384-wells microplate | Genetix | X6004 | For antibody printing |
| Robot arrayer for multiple slides | MicroGrid II TAS arrayer from Digilab | For antibody printing | |
| Epoxy substrate glass slides | Arrayit corporation | VEPO25C | Solid support for antibody printing |
| Alexa Fluor-647 Succinimidyl-ester | Molecular probes | A20006 | Fluorochrome |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | Fluorochrome dissolvent |
| Heidolph Titramax vibrating platform shaker | Fisher Scientific | For antibody labeling | |
| Illustra Microspin G-50 columns | Healthcare | 27-5330-01 | For purification of labeled antibodies |
| Safe seal brown 0.5 mL tubes | Sarstedt | 72,704,001 | For labeled antibodies storage |
| Nanodrop 1000 spectrophotometer | Thermo Scientific | To quantify antibody concentration and labeling efficiency | |
| 3 µm pore size polycarbonate 47 mm diameter filter | Millipore | TMTP04700 | To concentrate cells |
| 1 M Trizma hydrochloride solution pH 8 | Sigma-Aldrich | T3038 | For TBSTRR preparation; to block slides |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | For TBSTRR preparation |
| 20 µm nylon filters | Millipore | NY2004700 | For environmental extract preparation |
| 10 - 12 mm filter holders | Millipore | SX0001300 | For environmental extract preparation |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8340 | For environmental extract storage |
| 1 M Trizma hydrochloride solution pH 9 | Sigma-Aldrich | T2819 | To block slides |
| Heidolph Duomax 1030 rocking platform shaker | VWR | To block slides; for incubation processes | |
| VWR Galaxy miniarray microcentrifuge | VWR | C1403-VWR | To dry slides |
| Multi-Well microarray hybridization cassette | Arrayit corporation | AHC1X24 | Cassette for 24 assays per slide |
| GenePix 4100A microarray scanner | Molecular Devices | Scanner for fluorescence | |
| GenePix Pro Software | Molecular Devices | Software for image analysis and quantification |
References
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