Waiting
Procesando inicio de sesión ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

氟 TrFE 导管内许旺细胞移植桥断大鼠脊髓残肢促进轴突再生跨越间隙

Published: November 3, 2017 doi: 10.3791/56077
Automatic Translation
1, 2, 3, 1,4,5
1The Miami Project to Cure Paralysis, University of Miami Miller School of Medicine, 2Department of Materials Science and Engineering, New Jersey Institute of Technology, 3Department of Biomedical Engineering, New Jersey Institute of Technology, 4Department of Cell Biology, University of Miami Miller School of Medicine, 5Department of Neurological Surgery, University of Miami Miller School of Medicine

Summary

本文介绍了一项技术, 插入一个中空导管之间的脊髓残肢完全横断面和填充雪旺细胞 (SCs) 和可注射基底膜基质, 以桥梁和促进轴突再生跨越的差距。

Abstract

在大鼠脊髓损伤的各种模型中, 钝挫伤模型是最常用的, 因为它是最常见的类型的人脊髓损伤。完整的横断面模型, 虽然与钝挫伤模型没有临床相关性, 但却是评价轴突再生最严格的方法。在钝挫伤模型中, 由于存在残余的组织损伤, 很难区分再生与发芽或幸免的轴突。在完整的横断面模型中, 需要一个桥接方法来填补间隙, 并从侧到尾端以建立连续性, 以评估治疗效果。一个可靠的搭桥手术是必要的测试结果的措施, 减少因手术方法的变异性。此处所述的协议用于在移植前制备雪旺细胞 (scs) 和导管, 在胸椎8级 (T8) 上完全横断脊髓, 插入导管, 并将 SCs 移植到导管中。这种方法也使用原位胶凝剂基底膜基质与 SC 移植, 允许改善轴突生长横跨侧和骶管接口与宿主组织。

Introduction

脊髓损伤修复是一个复杂而富有挑战性的问题, 需要一个组合治疗策略, 例如, 使用细胞和生物材料为移植细胞功能和轴突提供有利的微环境损伤部位再生。半 1,2,3,4,,5,6,7,8 和完全横断9 ,11,12,131415161718 、20、21、22模型经常用于评估 biomaterial-based 桥接疗法的效果。使用半模型的优点是它为桥接结构提供了更稳定的比完全横断面。然而, 在半模型中, 由于无组织的存在, 很难证明轴突再生是应用治疗方法的结果。完全横断面模型是显示轴突再生的最严格的方法。

各种天然和合成材料已被研究用于注射凝胶, 预先凝胶放置在挫伤或半模型, 或作为一个结构的管道到半或完整的横断面模型 (详细的审查23,24,25).原位可注射基质/sc 合剂的凝胶性在移植物和轴突交叉的主绳之间创建一个更宽松的接口26,27与 pre-gelled 基质/sc 种植体相比5,18,19,28.原位胶凝允许矩阵在不规则的主机接口周围进行轮廓, 而更刚性和结构化的导管或较不模压的预先凝胶不能。与注射基质相比, 结构化导管通常提供接触引导和植入稳定性。这里介绍的协议描述了一个手术过程, 既利用了可注射基底膜基质的优势 (例如,基质, 参见材料表,称为可注射基质), 以及结构化管道评价轴突再生的最严格的脊髓损伤模型。

纺聚 vinylidenedifluoride-乙烯 (PVDF-TrFE) 对齐的纤维空心导管用于我们的实验方法。PVDF-TrFE 是一种压电聚合物, 它在机械变形时产生瞬态电荷, 并被证明可以促进突起扩展和轴突再生,无论是体外29、30还是在体内31. 静电纺丝是一种常用的脚手架制作方法, 可以使用各种可控性能的聚合物快速生成可靠的纤维支架, 如纤维对齐、纤维直径和脚手架的厚度神经和其他应用程序32,33,34。

大量研究大鼠 SCs 移植到脊髓损伤部位已显示治疗效果5,9,18,19,20,,21 ,26。这些移植是神经保护的组织周围的病变, 减少病变腔大小, 并促进轴突再生到病变/移植部位和鞘再生轴突。人体 SCs 可以 autologously 移植, 比其他大多数神经相关细胞24的优势。经外周神经活检, SCs 可以分离和纯化, 并将激增到预期的数量, 移植到人类。自体 SC 移植治疗脊髓损伤患者已被证明是安全的在伊朗35,36,37,38, 中国39,40, 以及美国41,42。众所周知, SCs 分泌大量的神经营养因子和胞外基质蛋白对轴突生长起重要作用, 并在周围神经损伤后的轴突再生中起着必不可少的功能。我们的目标是描述一种方法, 可以研究导管设计, 以改善大鼠脊髓横断模型中 SC 移植的结果。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

根据 NIH 和美国农业部的指导原则,

女性成年休鼠 (180-200 和 #160; g 体重) 被安置。迈阿密大学机构动物保育和使用委员会 (IACUC) 批准了所有的动物程序.

1. 移植前准备

  1. 导管准备。
    1. 在解剖显微镜下使用 #10 刀片将管道长度削减到5毫米.
      注: 导管内径介于 2.4-2.7 毫米之间;外径介于 2.5-2.8 mm 之间.
    2. 沿纵向侧轻轻折叠导管 ( 图 1A )。切开四小切口大约0.4 毫米长和至少1毫米从导管的开头和大约1毫米分开使用平直的边缘 Vannas 剪刀 ( 图 1B )。
      1. 展开管道 ( 图 1C ), 并沿同一一侧的两个切口之间切开, 从而并排创建两个窗口 ( 图 1D )。确保窗口可以沿未切割的一侧正确打开和关闭.
    3. 在10厘米的培养皿中对75% 乙醇中的导管进行25分钟的消毒。用1x 磷酸缓冲盐 (PBS) 冲洗导管一次, 用无菌钳将导管转移到新的 10 cm 培养皿中。用 1x PBS 冲洗导管两次, 每次25分钟.
    4. 将导管存储在 1x PBS 中直到手术.
      注: 许多导管可以立即灭菌。将导管存放在单独的无菌1.5 毫升离心管中, 以保持它们不育.
  2. 绿色荧光蛋白 (GFP)-雪旺细胞 (SC) 制备
    1. 从成年雌性费希尔鼠的胫骨神经制备纯化的 SC 培养物, 如先前所描述的 43 。在完成这一步, 板的多聚 l-赖氨酸 (PLL) 涂层 10 cm 培养皿和维护在 D10/3M 介质;这些 SCs 定义为段落 0.
      注: D10/3M 介质由以下内容组成: 10% 胎牛血清 (FBS)、1% 青霉素-链霉素 (笔/链球菌)、20和 #181; heregulin 佛司可林、2和 #181; Dulbecco 和 #39 的改良鹰和 #39 培养基 (DMEM).
    2. 每3至4天补充新鲜 D10/3M 培养基 (7 mL/10-cm 培养皿).
    3. 将 SC 文化分离到70-80% 汇合处。
      1. 卸下介质, 然后用汉克和 #39 的平衡盐溶液 (HBSS) 冲洗两次, 不含钙或镁.
      2. 将5毫升0.25% 胰蛋白酶/EDTA 添加到每 10 cm 培养皿中, 并在室温下孵育5分钟 (RT).
      3. 在 DMEM 中添加5毫升 D10 培养基 (10% FBS 和1% 支笔/链球菌链球菌) 到50毫升离心管中, 以中和胰蛋白酶.
      4. 将胰蛋白酶/EDTA 溶液轻轻吸管到培养皿中数次, 以分离 SCs. 从碟中取出电池悬浮液, 并将其放入前一步制备的离心管中。用5毫升的 D10 介质冲洗盘子, 并将其放入离心管中, 使细胞获得最大的收获.
      5. 离心 370 x g 的单元格为5分钟, 在 4 o c. 将上清液和重的细胞在4毫升 D10/3M 培养基中为每个培养皿分裂.
      6. 将1毫升的 SC 悬浮液和6毫升的 D10/3M 培养基放入10厘米的培养皿中; 每个培养皿分裂后会产生4种培养皿。这些 SCs 定义为段落 1.
      7. 电镀后每3-4 天用新鲜 D10/3M 培养基补充.
      8. 一旦 SCs 达到70-80% 汇合, 重复步骤1.2.3.1 到1.2.3.6。公务员事务局局长现正通过2条.
    4. 传感器的 SCs 曾经达到50% 汇合, 慢矢量编码 GFP 在 D10/3M 介质过夜在30感染的多样性, 如前所述 44 , 45 .
    5. 第二天和电镀后每3-4 天补充新鲜 D10/3M 培养基.
    6. 一旦 gfp-scs 达到70-80% 汇合, 重复步骤1.2.3.1 到 1.2.3.5, 但重的 gfp-scs 在6毫升 D10 培养基代替。将 GFP-SC 悬浮液的15和 #181; 1.5 毫升离心管, 加入15和 #181; 0.4% 台盼蓝溶液。轻轻轻拍离心管, 并将10和 #181; L 混合成细胞计数滑动的腔室。
      1. 将幻灯片放置到自动单元格计数器中, 并确定单元格的密度.
    7. 将 370 x g 的单元格分离为5分钟, 在 4 o c. 将上清液, 重与1.5 毫升的冷冻培养基, 每 3x10^-7 6 gfp-SCs. 向低温小瓶中分配1.5 毫升的 gfp-SC 悬浮液, 冻结在-80 o C 在移动到液态氮气进行贮存之前至少24小时.
      注: 冷冻培养基: 25% FBS 和8% 二甲基亚砜在 DMEM.
    8. 在手术前一周解冻 GFP-SCs。
      1. 将10毫升 D10 介质添加到50毫升离心管中.
      2. 将冷冻的 GFP-SCs 在水浴中解冻小瓶 37 o C 直到部分解冻.
      3. 将 GFP-SC 悬浮液从低温小瓶中取出, 放入1.2.8.1 的50毫升离心管中。反复地吸管解决方案.
      4. 离心 370 x g 的单元格为5分钟, 在 4 o c. 将上清液和重的细胞在4毫升 D10/3M 培养基中为每瓶解冻.
      5. 将2毫升的 GFP-SC 悬浮液和5毫升的 D10/3M 培养基放入10厘米的培养皿中; 每个小瓶应产生2种培养皿。GFP-SCs 定义为通道 3.
        注意: 一个10厘米的培养皿通常在一周后 8x10 6 GFP-SCs 附近生成.
    9. 在手术当天, 重复步骤1.2.6。使用步骤1.2.10 中计算的单元格密度.
    10. 免除等分 3x10^-7 6 GFP-SCs 到无菌1.5 毫升离心管的基础上的细胞密度计算从步骤1.2.9。离心 GFP-SC 等分在 370 x g 为5分钟在 4 o C 和去除上清。添加1毫升的 DMEM/F12 介质到每个分和离心机在 370 x g.
      注意: 每只动物接受3x10^-7 的 6 gfp-scs. 培养基与血清与 gfp-scs 一起使用直到这一步.
    11. 将 GFP-SCs 保持在冰上直到移植时间.

2。完全横断面在胸部8级 (T8)

  1. 动物准备手术
    1. 麻醉一个雌性 Fischer 鼠 (180-200 和 #160; g) 腹腔注射氯胺酮 (60 毫克/千克和 #160; 体重) 和嗪 (5毫克/千克和 #160; 体重)。检查麻醉深度, 然后再进行下一步骤, 通过观察脚趾的捏和眼睛闪烁的反应.
    2. 用电动剪刀刮掉老鼠的背部, 用70% 的乙醇擦拭皮肤。将眼部润滑剂应用于双眼。将动物转移到加热垫上的手术台上, 以保持体温在大约 37 o c. 将动物放在一卷上, 这样椎骨就很容易进入.
      注: 该卷可由纸巾或2在 x2 的纱布, 可以消毒。当 T7-T9 需要平放在轧辊的顶部时, 建议使用较大的卷.
  2. T7 到 T9 椎板切除
    1. 定位 T9-T11 棘突的地标.
      注意: 与其他段相比, T9、T10 和 T11 之间的间隙较小该地区。在把老鼠放在卷上后, T9-T11 棘的过程会感觉像一个小的三角形肿块通过皮肤.
    2. 使用 #10 刀片从 T4 到 T11, 使皮肤的中线切口为4到5厘米。用钝端的弯曲剪刀在表面脂肪层做一个小切口解剖脂肪.
      注: 其他类型的仪器可以用来分离脂肪, 但弯曲的剪刀与钝端, 使脂肪分离最有效和最不侵入的方法.
    3. 使用 #10 刀片的背面定位 T7 T9 棘突。用钝钳夹住 T4 的肌肉, 在椎骨两侧的肌肉上做一个切口, 从 T6-T10。使切口尽可能靠近椎骨, 以使伤口干净, 对动物造成最小的伤害.
    4. 通过切割 T6 和 T7、T7 和 T8、T8 和 T9、T9 和 T10 的肌肉和韧带, 将每个棘突从 T7 分离到 T9.
    5. 使用钳将叶片上的任何肌肉和韧带从 T7 移到 T9。尽可能地移除肌肉和韧带, 直到从 T7 到 T9 的横向过程之间的间隙是可见的.
    6. 用钳移除 T9 棘过程。在 T9 和 T10 过程之间的小开口处, 用钝钳和轻轻提起 T8 棘突, 提升 T9 叶片.
    7. 从开口和移动 rostrally 中取出叶片, 钳在 T9。尽可能地侧移叶片;椎板切除后的背根应可见.
    8. 一旦移除叶片, 重复 T8 和 T7 的过程.
      注意: 在椎板切除术中, 使用吸收矛去除血液, 同时继续与椎板切除。如果出现过量出血, 请在出血部位放置一个压缩海绵, 加盐水以帮助血液凝固.
  3. 横断在 T8
    1. 将牵引器放在 T7 T9。一旦所有的叶片被移除, 确保横向过程之间的间隙是可见的, 特别是在 T8。还要检查两侧的骨骼沿 T7 至 T9 之间的长度, 以确保没有向外凸出的骨骼碎片.
      注: T8 的这一缺口对执行完全横断面很重要。沿长度的椎骨应该被删除, 以便更容易插入导管.
    2. 使用倾斜的弹簧剪刀将背部和腹根从 T8 的上方和下方切开。在脊髓中加入生理盐水, 等待血液凝结. #160;
      注意: 此步骤对于正确插入管道非常重要.
    3. 将倾斜的弹簧剪刀放置在 T8 的横突之间的间隙上, 使一剪完全切断脊髓。将一小块压缩泡沫放入产生的 2-2. 5 mm 间隙, 并立即将盐水添加到该区域.

3。管道插入

  1. 在等待断线的残肢到达止血时, 从 1x PBS 中取出导管。将吸收三角形切割成细长的长片, 并将它们放入管道中以去除多余的 PBS。检查预窗口是否已打开.
  2. 使用细长的吸收三角形去除生理盐水和血液。用 microspatula 抬起两根脊髓, 确保良好的分离。用 microspatula 轻轻地抬起侧的残肢, 用窗户朝自己的车窗滑动导管。确保整个树桩插入, 并没有多余的出血到管道.
  3. 轻轻抬起尾端, 然后将导管的另一端滑过树桩。确保将整个残肢插入, 并且窗口在背表面 ( 图 2A ).

4。雪旺细胞/注射基质 (见材料表) 准备和注射

  1. 在等待被割断的绳子到达止血时, 把 GFP-SC 颗粒上面的培养基除去 (步骤1.2 中准备)。重10和 #181 的 GFP-SCs; 冷 DMEM/F12。添加10和 #181; 冷注射凝胶对细胞悬液的影响, 并通过反复移。将 GFP-SC/DMEM/F12/injectable 基质混合物放在冰上, 直到导管插入完成.
  2. 在确保背表面上的窗口打开 ( 图 2A ) 后, 注入20和 #181; 通过预窗口之一的 GFP-SC/DMEM/F12/injectable 矩阵混合的 l. 46 使用西方印迹加载提示和微。如果 SC/DMEM/F12/injectable 基质混合物应溢导管, 则用吸收三角形除去多余的。注射后关闭窗户;不需要缝合 ( 图 2B ).

5。伤口闭合和术后护理

  1. 缝合肌肉层和表面脂肪层。清洁皮肤与70% 乙醇, 然后主食 ( 例如, 使用伤口剪辑) 皮肤关闭。将动物置于热调节的孵化器中, 直到它们恢复知觉。把动物转移回笼子里给水提供一个长的喂养管和放置在床上用品的食物颗粒, 方便访问.
  2. 每天两次进行丁丙诺啡 (0.1 毫克/千克体重) 3 天皮下手术后立即开始, 以减轻疼痛。注射庆大霉素 (5 毫克/千克体重) 每天一次, 7 天后立即手术, 以防止和减少感染。每天注射10毫升的林格铃声溶液皮下注射两次, 为期7天, 用于水合.
  3. 每天手动清空膀胱两次, 直到膀胱功能恢复。如果发生膀胱感染, 然后管理10毫升生理盐水皮下注射, 直到尿液变得清晰。如果两天没有改善, 注射庆大霉素 (5 毫克/千克体重, 每天一次) 皮下注射, 直到尿液变得清晰.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

使用这种手术技术的目的是评估使用的结构导管和注射基质, 最大限度地发挥 SC 功能后移植到完成断脊髓。移植后三周, 动物被灌入4% 甲醛, 脊柱被严重解剖, 并固定在同一定影液中, 用于另24小时。然后解剖脊髓, 将低温矢状切面的样品放入30% 蔗糖溶液中冻。从另一组解剖脊髓的 SC 桥中间分离出来的1毫米厚的横断面被放进戊二醛固定剂中, 用于塑料切片。样品被服从于电子显微镜准备的日程表由贝茨et al.详述47. 低温矢状切面 immunostained 与 GFP、胶质纤维酸性蛋白 (胶质细胞)、重链丝 (RT97) 和中等链丝 (NF), 其次是继发抗体, 包括goat-anti-chicken-488, goat-anti-rabbit-546, goat-anti-mouse-647 和山羊-兔 647, 分别。GFP-SCs 均匀分布在管道内 (图 3A; 由黄色线指示的内壁)。轴突再生观察 (图 3B), 并且与 GFP-SCs (图 3A和图 3C) 的存在密切相关, 这表明该技术成功地在结构化管道中提供了 SC 桥, 并在促进轴突再生沿侧和尾部树桩之间的桥梁。血管和髓轴突也被发现在 SC 桥的中心 (图 3D)。更多细节的影响, SCs 与纺 PVDF-TrFE 纤维导管的轴突再生可以找到在我们最近发布的工作31。

其他的结果措施可以执行, 包括: 定量轴突再生的直线样条法, 描述在我们最近的工作31和量化的髓轴突和在塑料横断面的船只数量。为塑料切片准备的样品可以进一步分段为透射电子显微镜, 以量化髓轴突的数量。cryoprotected 脊髓标本也可以截面, 而不是矢切片和 immunostained, 以量化轴突再生和存在的 GFP-SCs. 行为测试也可以在适当的时间间隔对动物进行, 而动物们正在被维护。

Figure 1
图 1: 管道中的窗口准备沿 5 mm 导管 (A) 的纵轴折叠一侧。切开四切口大约0.4 毫米长和至少1毫米从导管的开头 (B)。每个切口大约1毫米分开。通过展开管道, 可观察到4平行切口 (C)。沿侧-尾轴的两个切口之间进行切割, 以创建一个可以通过提起襟翼打开的窗口。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 2
图 2: SC/DMEM/F12/matrix 注入后的窗口关闭在将导管放置在侧和尾端 (A) 之间后, 通过折叠每个襟翼打开窗口。在注入后关闭窗口 (B)。缩放条 = 1 mm请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 3
图 3: 在对齐纤维 PVDF-TrFE 导管中, 用 GFP-SCs 移植的脊柱的矢状切面共聚焦荧光图像和一个塑料横断面的明亮场图像.在管道内的 SC 桥的概述, 其中内壁是由黄线和 immunostained 的 GFP 和胶质纤维酸性蛋白 (胶质), 以可视化的移植 SCs 和宿主脊髓星形胶质细胞分别。再生轴突被标记为 RT97 (重链丝) (A, B) 和中链丝 (NF, C) 抗体。轴突在 (A) 中不可见, 因为它们与 GFP-SCs 的密切关联, 在 mid-conduit 区域 (C) 中观察到放大率较高。轴突是不可见的侧树桩由于不完全扫描在深度的组织切片时, 成像的共焦显微镜。血管 (标记为 v 在d) 和髓轴突 (标记为 MA 在d) 在 mid-conduit 区域在一个塑料部分被观察了。放大和刻度条: A、B (10x、200µm);C (20x, 100 µm);D (63x, 25 µm)。请单击此处查看此图的较大版本.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

建立有效的横断面模型的最关键的一步是在一个或两个切口切断脊髓。2-2. 5 毫米之间的间隙之间的侧和尾部脊髓残肢应存在于横断现场。三最可能的原因, 这样的差距没有出现的是 (1) 背部/腹根没有被正确删除, (2) 腹侧硬脑膜没有被充分删除, 和/或 (3) 该动物没有正确放置在她下面的轧辊。

在树桩之间进行有效的导管插入: (1) 导管的直径应根据实验中所用动物的特定种类和年龄而定制;(2) 叶片必须横向移除, 直到横向过程之间的间隙可以可视化;(3) 根必须除去, (4) 在第一次尝试时, 应完成在树桩之间的导管插入。如果需要多次尝试, 这可能会导致在树桩的水肿, 进一步复杂化的任务, 导管插入之间的树桩和造成额外的伤害。

要执行有效的 GFP-SC/DMEM/F12/injectable 基质引入导管, 确保: (1) 脊髓不流血前导管插入之间的树桩。如果管道内有液体在树桩之间插入, 使用一小块吸收矛通过预窗口去除它。(2) 确保导管在两个脊髓残肢井上滑动, (3) 背预窗打开。注射20µl 的 SC/可注射基质混合物应足以填补管道。从预窗口溢出是一个很好的衡量有效的移植。

这一过程的局限性是: (1) 没有恢复硬脑膜, (2) 没有控制的运动的导管/sc 移植后完成的手术, 和 (3) 没有其他方法, 如果有泄漏时, 注射 sc/注射基质混合物。

这一过程的优点是结合使用两个结构管道与注射基质。任何用可弯曲的材料制成的导管, 都可以在这个手术过程中使用。任何可注射的选择基质也可用于本程序;温度敏感的凝胶是可取的, 因为它能够凝胶原位和轮廓形状的树桩创建一个无缝的接口。具有更复杂的内部结构的导管可以使用, 而不是空心内部。药物, 生长因子, 小分子, 或任何细胞类型可以纳入结构化导管或注射基质或两者都增加移植生存, 提供神经保护立即损伤后, 减少炎症, 促进轴突再生, 促进血管生成。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

我们要感谢在迈阿密项目的病毒载体和动物核心, 以治疗瘫痪的生产 lenti-GFP 病毒和提供动物护理, 分别和组织学和成像核心的使用低温, 共焦显微镜,荧光显微镜与立体侦探。资金由一 (09923), 国防部 (W81XWH-14-1-0482) 和 NSF (DMR-1006510) 提供。鹰是克里斯汀·林恩杰出的神经科学教授。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cryogenic vials ThermoFisher Scientific 5000-0020
10 cm Petri dish VWR 25382-428
Dulbecco's modified Eagle's medium: nutrient mixture F-12 ThermoFisher Scientific 11039-021 "DMEM/F12" in protocol.
Penicillin-streptomycin ThermoFisher Scientific 15140-122 "Pen/Strep" in protcol.
Fetal bovine serum Hyclone SH300-70-03 "FBS" in protocol.
Pituitary extract Biomedical Technologies BT-215
Forskolin Sigma-Aldrich F6886
Heregulin R&D Systems 396-HB/CF
Poly L-lysine Sigma-Aldrich P2636 "PLL" in protocol.
Dulbecco's modified Eagle's medium ThermoFisher Scientific 11965-092 "DMEM" in protocol.
Hank's balanced salt solution ThermoFisher Scientific 14170-112 "HBSS" in protocol.
Tryspin-EDTA ThermoFisher Scientific 15400-054
Female Fischer rat (160-180g) Envigo
Vannas scissor, straight FST 15018-10
Ketamine Vedco Inc 5098976106 100 mg/ml
Xylazine Lloyd Inc AnaSed 20 mg/ml
Gentamycin APP Pharmaceuticals NDC 63323-010-02 Can be any brand of choice.
Micro Spatula FST 10089-11 Can be any brand of choice.
Curved scissors with blunt end FST 14017-18 Can be any brand of choice.
Blunt forceps FST 11006-12 Can be any brand of choice.
rongeur FST 16121-14 Can be any brand of choice.
Angled spring scissors FST 15006-09 Can be any brand of choice.
Absorption triangles FST 18105-03 Can be any brand of choice.
Gelfoam Henry Schein 9083300 "Compressed foam" in protocol.
#10 blades Sklar 06-3010 Can be any brand of choice.
Matrigel Corning 354234 "Injectable matrix" in protocol.
Chicken anti-green fluorescent protein antibody Millipore AB16901
Mouse RT97 hybridoma antibody DSHB RT97
Rabbit anti-neurofilament antibody Encor Biotechnology, Inc PRCA-NF-H
Polyclonal Rabbit anti-Glial Fibrillary Acidic Protein antibody Dako Z033401
Alexa Fluor 488 goat anti-chicken IgG (H+L) ThermoFisher Scientific A-11039
Alexa Fluor 546 goat anti-rabbit IgG (H+L) ThermoFisher Scientific A-11035
Alexa Fluor 647 goat anti-rabbit IgG (H+L) ThermoFisher Scientific A-21244
Alexa Fluor 647 goat anti-mouse IgG (H+L) ThermoFisher Scientific A-21236
Confocal Microscopy Nikon clsi

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. King, V. R., Alovskaya, A., Wei, D. Y., Brown, R. A., Priestley, J. V. The use of injectable forms of fibrin and fibronectin to support axonal ingrowth after spinal cord injury. Biomaterials. 31 (15), 4447-4456 (2010).
  2. Liu, T., Houle, J. D., Xu, J., Chan, B. P., Chew, S. Y. Nanofibrous collagen nerve conduits for spinal cord repair. Tissue Eng Part A. 18 (9-10), 1057-1066 (2012).
  3. Novikova, L. N., Pettersson, J., Brohlin, M., Wiberg, M., Novikov, L. N. Biodegradable poly-beta-hydroxybutyrate scaffold seeded with Schwann cells to promote spinal cord repair. Biomaterials. 29 (9), 1198-1206 (2008).
  4. Bamber, N. I., Li, H., Aebischer, P., Xu, X. M. Fetal spinal cord tissue in mini-guidance channels promotes longitudinal axonal growth after grafting into hemisected adult rat spinal cords. Neural Plast. 6 (4), 103-121 (1999).
  5. Xu, X. M., Zhang, S. X., Li, H., Aebischer, P., Bunge, M. B. Regrowth of axons into the distal spinal cord through a Schwann-cell-seeded mini-channel implanted into hemisected adult rat spinal cord. Eur J Neurosci. 11 (5), 1723-1740 (1999).
  6. Bamber, N. I., et al. Neurotrophins BDNF and NT-3 promote axonal re-entry into the distal host spinal cord through Schwann cell-seeded mini-channels. European Journal of Neuroscience. 13 (2), 257-268 (2001).
  7. Iannotti, C., et al. Glial cell line-derived neurotrophic factor-enriched bridging transplants promote propriospinal axonal regeneration and enhance myelination after spinal cord injury. Exp Neurol. 183 (2), 379-393 (2003).
  8. Deng, L. X., et al. GDNF modifies reactive astrogliosis allowing robust axonal regeneration through Schwann cell-seeded guidance channels after spinal cord injury. Exp Neurol. 229 (2), 238-250 (2011).
  9. Deng, L. X., et al. A Novel Growth-Promoting Pathway Formed by GDNF-Overexpressing Schwann Cells Promotes Propriospinal Axonal Regeneration, Synapse Formation, and Partial Recovery of Function after Spinal Cord Injury. J Neurosci. 33 (13), 5655-5667 (2013).
  10. Chen, X., et al. Bone marrow stromal cells-loaded chitosan conduits promote repair of complete transection injury in rat spinal cord. J Mater Sci Mater Med. 22 (10), 2347-2356 (2011).
  11. Hurtado, A., et al. Robust CNS regeneration after complete spinal cord transection using aligned poly-L-lactic acid microfibers. Biomaterials. 32 (26), 6068-6079 (2011).
  12. Cheng, H., Huang, Y. C., Chang, P. T., Huang, Y. Y. Laminin-incorporated nerve conduits made by plasma treatment for repairing spinal cord injury. Biochem Biophys Res Commun. 357 (4), 938-944 (2007).
  13. Fan, J., et al. Neural regrowth induced by PLGA nerve conduits and neurotrophin-3 in rats with complete spinal cord transection. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 97 (2), 271-277 (2011).
  14. Lietz, M., et al. Physical and biological performance of a novel block copolymer nerve guide. Biotechnol Bioeng. 93 (1), 99-109 (2006).
  15. Novikova, L. N., Novikov, L. N., Kellerth, J. O. Biopolymers and biodegradable smart implants for tissue regeneration after spinal cord injury. Curr Opin Neurol. 16 (6), 711-715 (2003).
  16. Tang, S., et al. The effects of controlled release of neurotrophin-3 from PCLA Scaffolds on the survival and neuronal differentiation of transplanted neural stem cells in a rat spinal cord injury model. PLoS One. 9 (9), e107517 (2014).
  17. Yao, L., et al. Improved axonal regeneration of transected spinal cord mediated by multichannel collagen conduits functionalized with neurotrophin-3 gene. Gene Ther. , (2013).
  18. Xu, X. M., Guénard, V., Kleitman, N., Bunge, M. B. Axonal regeneration into Schwann cell-seeded guidance channels grafted into transected adult rat spinal cord. J Comp Neurol. 351 (1), 145-160 (1995).
  19. Xu, X. M., Chen, A., Guenard, V., Kleitman, N., Bunge, M. B. Bridging Schwann cell transplants promote axonal regeneration from both the rostral and caudal stumps of transected adult rat spinal cord. J Neurocytol. 26 (1), 1-16 (1997).
  20. Takami, T., et al. Schwann cell but not olfactory ensheathing glia transplants improve hindlimb locomotor performance in the moderately contused adult rat thoracic spinal cord. J Neurosci. 22 (15), 6670-6681 (2002).
  21. Bunge, M. B., Wood, P. M. Handbook of Clinical Neurology. 109, 523-540 (2012).
  22. Fortun, J., Hill, C. E., Bunge, M. B. Combinatorial strategies with Schwann cell transplantation to improve repair of the injured spinal cord. Neurosci Lett. 456 (3), 124-132 (2009).
  23. Haggerty, A. E., Oudega, M. Biomaterials for spinal cord repair. Neurosci Bull. , (2013).
  24. Nomura, H., Tator, C. H., Shoichet, M. S. Bioengineered strategies for spinal cord repair. J Neurotrauma. 23 (3-4), 496-507 (2006).
  25. Straley, K. S., Foo, C. W. P., Heilshorn, S. C. Biomaterial Design Strategies for the Treatment of Spinal Cord Injuries. J Neurotrauma. 27 (1), 1-19 (2010).
  26. Williams, R. R., Henao, M., Pearse, D. D., Bunge, M. B. Permissive Schwann cell graft/spinal cord interfaces for axon regeneration. Cell Transplant. 24 (1), 115-131 (2015).
  27. Williams, R. R., Pearse, D. D., Tresco, P. A., Bunge, M. B. The assessment of adeno-associated vectors as potential intrinsic treatments for brainstem axon regeneration. J Gene Med. 14 (1), 20-34 (2012).
  28. Xu, X. M., Guenard, V., Kleitman, N., Aebischer, P., Bunge, M. B. A combination of BDNF and NT-3 promotes supraspinal axonal regeneration into Schwann cell grafts in adult rat thoracic spinal cord. Exp Neurol. 134 (2), 261-272 (1995).
  29. Lee, Y. S., Arinzeh, T. L. The influence of piezoelectric scaffolds on neural differentiation of human neural stem/progenitor cells. Tissue Eng Part A. 18 (19-20), 2063-2072 (2012).
  30. Lee, Y. S., Collins, G., Arinzeh, T. L. Neurite extension of primary neurons on electrospun piezoelectric scaffolds. Acta Biomater. 7 (11), 3877-3886 (2011).
  31. Lee, Y. S., Wu, S., Arinzeh, T. L., Bunge, M. B. Enhanced noradrenergic axon regeneration into schwann cell-filled PVDF-TrFE conduits after complete spinal cord transection. Biotechnol Bioeng. 114 (2), 444-456 (2017).
  32. Haider, A., Haider, S., Kang, I. -K. A comprehensive review summarizing the effect of electrospinning parameters and potential applications of nanofibers in biomedical and biotechnology. Arab J Chem. , (2015).
  33. Hassiba, A. J., et al. Review of recent research on biomedical applications of electrospun polymer nanofibers for improved wound healing. Nanomedicine (Lond). 11 (6), 715-737 (2016).
  34. Lee, Y. -S., Livingston Arinzeh, T. Electrospun Nanofibrous Materials for Neural Tissue Engineering. Polymers. 3 (1), 413-426 (2011).
  35. Oraee-Yazdani, S., et al. Co-transplantation of autologous bone marrow mesenchymal stem cells and Schwann cells through cerebral spinal fluid for the treatment of patients with chronic spinal cord injury: safety and possible outcome. Spinal Cord. 54 (2), 102-109 (2016).
  36. Saberi, H., et al. Safety of intramedullary Schwann cell transplantation for postrehabilitation spinal cord injuries: 2-year follow-up of 33 cases. J Neurosurg Spine. 15 (5), 515-525 (2011).
  37. Saberi, H., et al. Treatment of chronic thoracic spinal cord injury patients with autologous Schwann cell transplantation: an interim report on safety considerations and possible outcomes. Neurosci Lett. 443 (1), 46-50 (2008).
  38. Yazdani, S. O., et al. A comparison between neurally induced bone marrow derived mesenchymal stem cells and olfactory ensheathing glial cells to repair spinal cord injuries in rat. Tissue Cell. 44 (4), 205-213 (2012).
  39. Zhou, X. H., et al. Transplantation of autologous activated Schwann cells in the treatment of spinal cord injury: six cases, more than five years of follow-up. Cell Transplant. 21, Suppl 1. S39-S47 (2012).
  40. Chen, L., et al. A prospective randomized double-blind clinical trial using a combination of olfactory ensheathing cells and Schwann cells for the treatment of chronic complete spinal cord injuries. Cell Transplant. 23, Suppl 1. S35-S44 (2014).
  41. Guest, J., Santamaria, A. J., Benavides, F. D. Clinical translation of autologous Schwann cell transplantation for the treatment of spinal cord injury. Curr Opin Organ Transplant. 18 (6), 682-689 (2013).
  42. Bunge, M. B., Monje, P. V., Khan, A., Wood, P. M. Progress in Brain Research. , Elsevier. (2017).
  43. Meijs, M. F., et al. Basic fibroblast growth factor promotes neuronal survival but not behavioral recovery in the transected and Schwann cell implanted rat thoracic spinal cord. J Neurotrauma. 21 (10), 1415-1430 (2004).
  44. Blits, B., et al. Lentiviral vector-mediated transduction of neural progenitor cells before implantation into injured spinal cord and brain to detect their migration, deliver neurotrophic factors and repair tissue. Restor Neurol Neurosci. 23 (5-6), 313-324 (2005).
  45. Follenzi, A., Naldini, L. HIV-based vectors. Preparation and use. Methods Mol Med. 69, 259-274 (2002).
  46. Fouad, K., et al. Combining Schwann cell bridges and olfactory-ensheathing glia grafts with chondroitinase promotes locomotor recovery after complete transection of the spinal cord. J Neurosci. 25 (2), 1169-1178 (2005).
  47. Bates, M. L., Puzis, R., Bunge, M. B. Animal Models of Movement Disorders: Volume II. Lane, E. L., Dunnett, S. B. , Humana Press. 381-399 (2011).

Tags

药物 问题 129 雪旺细胞 脊髓损伤 PVDF-TrFE 导管 完全横断 静电纺丝 压电
氟 TrFE 导管内许旺细胞移植桥断大鼠脊髓残肢促进轴突再生跨越间隙
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lee, Y. S., Wu, S., Arinzeh, T. L.,… More

Lee, Y. S., Wu, S., Arinzeh, T. L., Bunge, M. B. Transplantation of Schwann Cells Inside PVDF-TrFE Conduits to Bridge Transected Rat Spinal Cord Stumps to Promote Axon Regeneration Across the Gap. J. Vis. Exp. (129), e56077, doi:10.3791/56077 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video
Waiting X
Simple Hit Counter