Summary
Dit artikel beschrijft een techniek om het invoegen van een holle buis tussen de stronken van de ruggenmerg na volledige transect en vullen met cellen van Schwann (gcv) en injecteerbare kelder membraan matrix bevorderen van axon regeneratie over de kloof te overbruggen.
Abstract
Onder de verschillende modellen voor dwarslaesie bij ratten, wordt de kneuzingen model het vaakst gebruikt omdat het is het meest voorkomende type van menselijke dwarslaesie. Het volledige transect model, is hoewel niet als klinisch relevant als het model van kneuzingen, de meest rigoureuze method to evaluate methode axon regeneratie. In het model van kneuzingen is het moeilijk te onderscheiden van geregenereerde van gekiemde of bespaard axonen als gevolg van de aanwezigheid van het resterende weefsel post schade. In het volledige transect model is een "passerelle" methode nodig om de leemte opvullen en continuïteit maken vanuit de rostraal de caudal stompen om te evalueren van de doeltreffendheid van de behandelingen. Een betrouwbare "passerelle" operatie is essentieel voor het testen van resultaat maatregelen door het verminderen van de variabiliteit als gevolg van de chirurgische methode. De hier beschreven protocollen worden gebruikt voor het bereiden van Schwann cellen (gcv) en leidingen voorafgaand aan de transplantatie, volledige transect van het ruggenmerg thoracale niveau 8 (T8), invoegen van de leiding en SCs transplantatie in de leiding. Deze aanpak maakt ook gebruik van in situ gelerend van een injecteerbare kelder membraan matrix met SC transplantatie waarmee verbeterde axon groei over de rostraal en caudal interfaces met het weefsel van de gastheer.
Introduction
Spinal cord injury reparatie is een complex en uitdagend probleem dat een strategie van de combinatorische behandeling met betrekking tot vergt, bijvoorbeeld, het gebruik van cellen en een biomaterial te voorzien van een gunstige communicatie voor getransplanteerde cel functie en axon herstel op de site van letsel. Hemisection1,2,3,4,5,6,7,8,9 en volledige transect10 ,11,12,13,14,15,16,17,18,19 ,20,21,22 modellen worden vaak gebruikt om te beoordelen van de effecten van de biomaterial gebaseerde "passerelle" therapieën. Het voordeel van het gebruik van een hemisection model is dat het meer stabiliteit voor de "passerelle" constructie in vergelijking met volledige transect biedt. In de hemisection modellen is het echter moeilijk te bewijzen van axon regeneratie als resultaat van de toegepaste therapeutische methode als gevolg van de aanwezigheid van bespaard weefsel. Het volledige transect model is de meest rigoureuze methode om aan te tonen van axon regeneratie.
Diverse natuurlijke en synthetische materialen zijn bestudeerd voor gebruik als een injecteerbare gel, een pre-gevormde gel in kneuzingen of hemisection modellen, of als een gestructureerde conduit in hemisection geplaatst of voltooien transect modellen (gedetailleerd in de beoordelingen23 , 24 , 25). in situ gelerend van een mengsel van injecteerbare matrix/SC maakt een meer tolerante interface tussen de transplantatie, het snoer van de gastheer voor axon kruising26,27 ten opzichte van vooraf gegeleerde matrix/SC implantaten 5 , 18 , 19 , 28. in situ gelerend de matrix contour rond de onregelmatige host-interfaces, overwegende dat een meer rigide en gestructureerde conduit of een minder vormbare pre-gevormde gel kon niet toegestaan. Een gestructureerde conduit biedt vaak contact begeleiding en implantaat stabiliteit in tegenstelling tot een injecteerbare matrix. De protocollen die hier gepresenteerd beschrijven een chirurgische ingreep die maakt gebruik van zowel een injecteerbare kelder membraan-matrix (bijvoorbeeld matrigel, zie die de Tabel van materialen, bedoeld als injecteerbare matrix hier) en een gestructureerde conduit te evalueren van axon regeneratie in de meest rigoureuze ruggenmerg letsel model.
Electrospun poly-vinylidenedifluoride-trifluoroethylene (PVDF-TrFE) uitgelijnd vezelig holle leidingen worden gebruikt in onze experimentele aanpak. PVDF-TrFE is een piëzo-elektrische polymeer dat genereert een voorbijgaande lading wanneer mechanisch vervormd en is aangetoond dat het bevorderen van de uitbreiding en de axon regeneratie van de neurite zowel in vitro29,30 en in vivo 31. Electrospinning is een gemeenschappelijk steiger fabricage methode die kan snel produceren betrouwbare vezelig steigers met behulp van een verscheidenheid van polymeren met controleerbare eigenschappen zoals uitlijning van de vezels, de diameter van de vezel en dikte van de steiger voor neurale en andere toepassingen32,33,34.
Talrijke studies van rat SCs getransplanteerd in ruggenmerg letsel sites hebben aangetoond dat behandeling werkzaamheid5,9,18,19,20,21 ,26. Deze transplantaties zijn neuroprotectieve voor weefsel rondom de laesie, laesie holte verkleinen, en bevorderen van axon regeneratie in de laesie/transplantatie site en de myelinisering van de geregenereerde axonen. Menselijke SCs autologously kunnen worden getransplanteerd, een voordeel in vergelijking met de meeste andere neurale-gerelateerde cellen24. Na een biopsie van de perifere zenuwen, SCs kunnen worden geïsoleerd en gezuiverd en zal verspreiden tot het gewenste bedrag voor transplantatie in mensen. Autologe transplantatie van de SC voor ruggenmerg gewonde patiënten is bewezen veilig in Iran35,36,,37,38, China39,40, en de Verenigde Staten41,42. SCs staan bekend om afscheiden van talrijke neurotrophic factoren en extracellulaire matrix eiwitten belangrijk voor de groei van de axon en een essentiële rol te spelen bij axon regeneratie na perifere zenuw verwonding. Ons doel hier is om te beschrijven van methoden die conduit ontwerpen onderzoeken kunnen ter verbetering van de resultaten van SC transplantatie in een volledige rat ruggenmerg transect model.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
vrouwelijke volwassen Fischer ratten (180-200 g lichaamsgewicht) volgens de NIH en USDA richtlijnen zijn ondergebracht. De institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) van de Universiteit van Miami alle dierlijke procedures afgekeurd.
1. pre transplantatie voorbereiding
- Conduit voorbereiding.
- Gesneden de leiding tot 5 mm in lengte met een #10 mes onder een Microscoop ontleden.
Opmerking: De inwendige diameter van de leiding is tussen 2.4-2.7 mm; de buitendiameter is tussen 2.5-2.8 mm. - Vouwen de leiding zachtjes langs de longitudinale kant ( figuur 1A). Snijd vier kleine incisies over 0.4 mm lang en ten minste 1 mm van de openingen van de leiding en ongeveer 1 mm uit elkaar met behulp van rechte rand Vannas schaar ( figuur 1B).
- Ontvouwen van de leiding ( Figuur 1 c) en snijd tussen twee incisies langs dezelfde kant maken twee vensters naast elkaar ( Figuur 1 d). Zorgen dat de Vensters kunnen worden geopend en goed Onbesneden langs gesloten.
- De leidingen in 75% ethanol voor 25 min in een petrischaal 10-cm steriliseren. Spoel de leidingen eens voor 4 min met 1 x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en de leidingen met steriel pincet overbrengen in een nieuwe 10-cm petrischaal. Spoel de slangen tweemaal met 1 x PBS voor elke 25 min.
- Bewaren de leidingen in 1 x PBS tot chirurgie.
Opmerking: Veel leidingen kunnen tegelijk worden gesteriliseerd. De leidingen worden opgeslagen in aparte steriele 1,5 mL centrifuge buizen om hen te houden steriele.
- Gesneden de leiding tot 5 mm in lengte met een #10 mes onder een Microscoop ontleden.
- Groen fluorescente proteïne (GFP)-voorbereiding van de cel van Schwann (SC)
- bereiden gezuiverde SC culturen van de tibiale zenuwen van volwassen vrouwelijke Fischer ratten als eerder beschreven 43. Bij de voltooiing van deze stap, plaat het SCS systeem op poly-L-lysine (PLL)-gecoat 10-cm petrischalen en handhaven in D10 / 3M medium; Deze SCs zijn gedefinieerd als passage 0.
Opmerking: D10 / 3M medium is samengesteld uit de volgende: 10% foetale runderserum (FBS), 1% penicilline-streptomycine (pen/strep), 20 µg Mo/mL hypofyse extract, 2 µM forskolin, 2,5 nM heregulin in Dulbecco ' s bewerkt Eagle ' s medium (DMEM). - Vullen met vers D10 / 3M medium (7 mL/10-cm petrischaal) elke 3 tot 4 dagen.
- Split SC cultuur zodra zij 70-80% samenvloeiing tot.
- Verwijderen medium en spoel tweemaal met Hank ' s evenwichtig zoutoplossing (HBSS) zonder calcium of magnesium.
- Voeg 5 mL van 0,25% trypsine/EDTA aan elke petrischaal 10-cm en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur (RT).
- Voeg 5 mL van D10 medium (10% FBS en 1% pen/strep in DMEM) in een centrifugebuis van 50 mL te neutraliseren trypsine.
- Pipet zachtjes de trypsine/EDTA oplossing in de Petri schotel meermaals loskoppelen van SCs. Verwijder de celsuspensie van de schotel en plaats deze in de centrifugebuis bereid in de vorige stap. Spoel de schotel met 5 mL D10 voedingsbodem en leg deze in de centrifugebuis te maximaliseren cel oogst.
- Centrifugeren van de cellen bij 370 x g gedurende 5 min bij 4 o C. Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in 4 mL D10/3 M medium voor elke petrischaal split.
- Afzien 1 mL SC schorsing en 6 mL D10 / 3M voedingsbodem in een petrischaal 10-cm; elke petrischaal split zal resulteren in 4 petrischalen. Deze SCs zijn gedefinieerd als passage 1.
- Vullen met vers D10 / 3M medium de dag na de beplating en elke 3-4 dagen na plating.
- Eens de SCs bereiken van 70-80% samenvloeiing, herhaal stap 1.2.3.1 te 1.2.3.6. Het SCS systeem zijn nu bij passage 2.
- Transduce van de SCs 50% samenvloeiing eens te bereiken, met een lentivirale vector codering GFP in D10 / 3M medium's nachts bij een veelheid van infectie van 30 zoals eerder beschreven 44 , 45 .
- Vullen met vers D10 / 3M medium, de volgende dag en elke 3-4 dagen na plating.
- Zodra het GFP-SCs bereiken 70-80% samenvloeiing, herhaal stap 1.2.3.1 te 1.2.3.5 maar resuspendeer de GFP-SCs in 6 mL D10 voedingsbodem in plaats daarvan. 15 µL van GFP-SC schorsing afzien in een centrifugebuis 1,5 mL en voeg 15 µL van 0.4% trypan blauw-oplossing. Flick de centrifugebuis zachtjes en afzien van 10 µL van het mengsel in een kamer van de dia van cel-tellen.
- Plaats van de dia in een geautomatiseerde cel teller en bepalen van de celdichtheid.
- Centrifugeren van de cellen bij 370 x g gedurende 5 min bij 4 o C. Verwijder de bovendrijvende substantie, resuspendeer met 1,5 mL bevriezing medium voor elke 3 x 10 6 GFP-SCs. Doseer 1,5 mL GFP-SC schorsing in een cryogene flacon, en bevriezing bij -80 o C gedurende ten minste 24 uur voordat hij naar de vloeibare stikstof voor opslag.
Opmerking: Bevriezing medium: 25% FBS en 8% dimethylsulfoxide in DMEM. - Ontdooien GFP-SCs één week voor de operatie.
- Voeg toe 10 mL D10 medium in een centrifugebuis 50 mL.
- Ontdooien flesjes van bevroren GFP-SCs in waterbad bij 37 o C totdat gedeeltelijk ontdooid.
- Verwijderen van het GFP-SC-schorsing van de cryogene flacon en leg deze in de centrifugebuis van 50 mL bereid in 1.2.8.1. Pipet zachtjes de oplossing op en neer herhaaldelijk.
- Centrifugeren van de cellen bij 370 x g gedurende 5 min bij 4 o C. Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in 4 mL D10/3 M medium voor elke flacon ontdooid.
- Afzien 2 mL GFP-SC schorsing en 5 mL D10 / 3M voedingsbodem in een petrischaal 10-cm; elke flacon zou moeten resulteren in 2 petrischalen. Het GFP-SCs worden gedefinieerd als de passage 3.
Opmerking: Een 10-cm petrischaal meestal levert ongeveer 8 x 10 6 GFP-SCs na één week.
- Op de dag van de operatie, herhaal stap 1.2.6. Gebruik de celdichtheid berekend in stap 1.2.10.
- Doseer aliquots van 3 x 10 6 GFP-SCs in steriele 1,5 mL centrifuge buizen op basis van de celdichtheid berekend op basis van stap 1.2.9. Centrifugeer het GFP-SC aliquots bij 370 x g gedurende 5 min bij 4 o C en verwijder de bovendrijvende substantie. 1 mL van DMEM/F12 medium toevoegen aan elk aliquot en centrifuge op 370 x g.
Opmerking: Elk dier ontvangt 3 x 10 6 GFP-SCs. Medium met serum is tot deze stap gebruikt met GFP-SCs. - Houden GFP-SCs op ijs tot het tijdstip van de transplantatie.
- bereiden gezuiverde SC culturen van de tibiale zenuwen van volwassen vrouwelijke Fischer ratten als eerder beschreven 43. Bij de voltooiing van deze stap, plaat het SCS systeem op poly-L-lysine (PLL)-gecoat 10-cm petrischalen en handhaven in D10 / 3M medium; Deze SCs zijn gedefinieerd als passage 0.
2. Voltooien transect op thoracale Level 8 (T8)
- dierlijke voorbereiding operatie
- verdoving een vrouwelijke Fischer rat (180-200 g) met een intraperitoneale injectie van ketamine (60 mg/kg lichaamsgewicht) en xylazine (5 mg/kg lichaamsgewicht). De diepte van de verdoving voordat u verdergaat met de volgende stap te controleren door het controleren van de teen knijpen en in het oog van de knipperende reacties.
- De achterkant van de rat met een elektrische clipper scheren en veeg de huid met 70% ethanol. Ophthalmic smeermiddel toepassen op beide ogen. Het dier overbrengen in de operatie tafel op een verwarming pad te handhaven van de lichaamstemperatuur op ongeveer 37 o C. plaats het dier op een broodje zodat de wervels gemakkelijk toegankelijk zijn.
Opmerking: Het broodje kan worden gemaakt van papieren handdoek of 2 in x2 in gaas die kan worden gesteriliseerd. Grotere rollen worden aanbevolen wanneer T7-T9 moet worden plat op de top van de roll.
- T7 aan T9 laminectomie
- Zoek de mijlpaal voor de T9-T11 spinous processen.
Opmerking: De kloof tussen T9, T10 en T11 zijn klein in vergelijking met andere segmenten ikn de regio. Na het plaatsen van de rat op het broodje, T9-T11 spinous processen zal voelen als een kleine driehoekige hobbel via de huid. - Maakt een incisie middellijn 4 tot 5 cm van de huid met behulp van een mes van de #10 van T4 naar T11. Maak een kleine incisie in de oppervlakkige vetlaag met gebogen schaar met stompe uiteinden te ontleden de vet.
Opmerking: Andere soorten instrumenten kunnen worden gebruikt om te scheiden van het vet maar gebogen schaar met stompe uiteinden de meest effectieve en minst invasieve methode voor vet scheiding inschakelen. - Zoeken de T7 T9 spinous processen met behulp van de achterzijde van het mes #10. Houd de spier op over T4 met een botte Tang en maak een incisie in de spier langs elke kant van de wervels van T6-T10. Maak de snede zo dicht mogelijk bij de wervels mogelijk te maken van een schone opening en minimale letsel aan het dier.
- Isoleren van elke individuele proces van het spinous van T7 tot T9 door het snijden van de spieren en ligamenten tussen T6 T7, T7 en T8, T8 en T9, en T9 en T10 met een mes #10.
- Gebruiken een rongeur om te verwijderen van alle spieren en ligamenten op de laminae van T7 naar T9. De spieren en ligamenten als lateraal mogelijk verwijderen totdat de kloof tussen de dwarsuitsteeksels van de T7 te T9 zichtbaar zijn.
- Verwijder de T9 spinous proces met een rongeur. Houd de T8 spinous proces met botte pincet en lift zachtjes te verheffen de T9 lamina bij de kleine opening tussen de processen T9 en T10.
- Verwijder de lamina vanaf de opening en rostrally met een rongeur op T9 verplaatsen. Verwijder de lamina lateraal zoveel mogelijk; de dorsale wortels zichtbaar moeten zijn na de laminectomie.
- Zodra de lamina verwijderd is, herhaal het proces voor T8 en T7.
Opmerking: Tijdens de laminectomie, gebruik absorptie spears om bloed te verwijderen terwijl het voortdurend met de laminectomie. Als er overmatige bloeding optreedt, plaatst u een gecomprimeerde spons aan de site bloeden en voeg zout om te helpen met de bloedstolling.
- Zoek de mijlpaal voor de T9-T11 spinous processen.
- Transect in T8
- plaats van het oprolmechanisme rond T7 aan T9. Zodra alle van de laminae zijn verwijderd, ervoor te zorgen dat de kloof tussen de dwarsuitsteeksels zichtbaar, vooral op T8 zijn. Ook het onderzoeken van de botten langs de lengte aan beide zijden tussen T7 aan T9 om ervoor te zorgen dat er geen naar buiten uitstekende botfragmenten.
Opmerking: Deze kloof op T8 is belangrijk voor het uitvoeren van de volledige transect. De wervels langs de lengte moeten worden verwijderd voor gemakkelijker conduit inbrengen. - Knip de dorsale en ventrale wortels boven en onder met behulp van de T8 schuin voorjaar schaar. Voeg zout toe aan het ruggenmerg en wacht tot het bloed stollen.
Opmerking: deze stap is belangrijk voor het juiste conduit inbrengen. - Plaats van de schuine voorjaar schaar boven het ruggenmerg in de kloof tussen de dwarsuitsteeksels op T8 en maken een cut te volledig verbreken het ruggenmerg. Plaats een klein stukje van samengeperst schuim in de resulterende 2-2.5 mm kloof en zout toevoegen aan het gebied onmiddellijk.
- plaats van het oprolmechanisme rond T7 aan T9. Zodra alle van de laminae zijn verwijderd, ervoor te zorgen dat de kloof tussen de dwarsuitsteeksels zichtbaar, vooral op T8 zijn. Ook het onderzoeken van de botten langs de lengte aan beide zijden tussen T7 aan T9 om ervoor te zorgen dat er geen naar buiten uitstekende botfragmenten.
3. Conduit invoeging
- tijdens het wachten voor de afgehakte snoer stompen hemostase bereiken, neem een geleider uit 1 x PBS. De absorptie driehoeken in dunne lange stukken gesneden en plaats hen in de leiding te verwijderen overtollige PBS. Controleer dat de voorgesneden ramen openstaan.
- Verwijderen zoutoplossing en bloed met behulp van dunne lange stukken van absorptie driehoeken. Til de twee stronken van het ruggenmerg met behulp van een microspatula om te zorgen voor een goede scheiding. Zachtjes til de rostraal stomp met de microspatula en de leiding over de stomp glijden met de ramen tegenover zichzelf. Ervoor zorgen dat de gehele stomp wordt ingevoegd en er geen overtollige bloeden in de conduit.
- Zachtjes til de caudal stomp en het andere uiteinde van de leiding over de stomp glijden. Zorg ervoor dat de gehele stomp wordt ingevoegd en de Vensters op het dorsale oppervlak ( figuur 2A).
4. Cel van Schwann / injecteerbare Matrix (zie tabel van materialen) voorbereiding en injectie
- tijdens het wachten voor de afgehakte snoer hemostase bereiken, verwijder het medium boven de GFP-SC pellet (bereid in stap 1.2). Resuspendeer de GFP-SCs in 10 µl van koude DMEM/F12. Voeg 10 µl van koude injecteerbare gel om de celsuspensie en meng goed door herhaald pipetteren. Houd van het GFP-SC/DMEM/F12/injectable matrix mengsel op ijs totdat conduit invoeging is voltooid.
- Als u zeker bent dat de Vensters op de dorsale oppervlak zijn open ( figuur 2A), 20 µl van het mengsel van de matrix GFP-SC/DMEM/F12/injectable te injecteren in de leiding via een van de voorgesneden windows 46 met behulp van een westelijke vlek laden uiteinde en een micropipet. Als het mengsel van SC/DMEM/F12/injectable matrix moet de leiding overvol, verwijder de overmaat met absorptie driehoeken. Sluit de Vensters na injectie; wordt is niet noodzakelijk ( figuur 2B).
5. Wond sluiting en postoperatieve zorg
- hechtdraad de spier lagen en de oppervlakkige vet lagen. Reinigen van de huid met 70% ethanol en dan nieten (bijvoorbeeld met behulp van de wond clips) de huid sluiten. De dieren in een thermisch gereglementeerde incubator houden totdat ze bewustzijn herwinnen. Breng de dieren terug in de kooien. Water voorzien van een lange vultrechter en voedsel pellets plaats op het beddengoed voor gemakkelijke toegang.
- Beheren buprenorfine (0,1 mg/kg lichaamsgewicht) twee keer per dag gedurende 3 dagen subcutaan starten onmiddellijk na de operatie om pijn te verminderen. Injecteren gentamycine (5 mg/kg lichaamsgewicht) subcutaan eenmaal per dag gedurende 7 dagen onmiddellijk na de operatie ter voorkoming en vermindering van de infectie. 10 mL lactated Ringers oplossing injecteren subcutaan tweemaal per dag gedurende 7 dagen voor hydratatie.
- Leeg blazen functioneren handmatig tweemaal per dag tot blaas als resultaat gegeven. Als blaasontsteking optreedt, vervolgens beheren 10 mL zoutoplossing subcutaan tot urine duidelijk wordt. Als er geen verbetering in twee dagen, injecteren gentamycine (5 mg/kg lichaamsgewicht, eenmaal per dag) subcutaan tot de urine duidelijk wordt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het doel van het gebruik van deze chirurgische techniek is om het gebruik van een gestructureerde conduit en injecteerbare matrix dat SC functie na transplantatie in voltooide verbeelde spinal koorden maximaliseert te evalueren. Drie weken na de transplantatie, de dieren zijn geperfundeerd met 4% paraformaldehyde en de spinale kolommen zijn grove ontleed en vastgesteld in de dezelfde fixeerspray voor een andere 24 h. Het ruggenmerg is vervolgens ontleed en de monsters voor de cryostaat Sagittaal secties worden geplaatst in een 30% sacharoseoplossing voor cryoprotection. 1 mm dik kruissecties geïsoleerd uit het midden van de brug van de SC voor een andere set van ontleed spinal koorden worden in Glutaaraldehyde fixatief om te verwerken voor kunststof secties geplaatst. De monsters worden onderworpen aan een tijdschema voor de elektron microscopisch preparaat als gedetailleerde door Bates et al. 47. cryostaat Sagittaal secties waren immunostained met primair antilichaam tegen GFP, gliale fibrillary zuur eiwit (GFAP), zware ketting neurofilament (RT97) en middellange keten neurofilament (NF), gevolgd door secundaire antilichamen met inbegrip van geit-anti-kip-488, geit-anti-konijn-546, geit-anti-muis-647 en geit-anti-konijn 647, respectievelijk. GFP-SCs werden gelijkmatig verdeeld langs en binnen de leiding (figuur 3A; binnenmuren aangegeven door gele lijnen). Axon regeneratie wordt waargenomen (figuur 3B) en is nauw verbonden met de aanwezigheid van GFP-SCs (figuur 3A en Figuur 3 c) die aangeeft dat deze techniek succesvol is in het verstrekken van een brug van de SC binnen een gestructureerde conduit en in bevordering van axon regeneratie langs de brug tussen de rostraal en caudal stompen. Bloedvaten en myelinated axonen werden ook gevonden in het midden van de SC-brug (figuur 3D). Meer details van het effect van SCs met electrospun PVDF-TrFE vezelig leidingen op axon regeneratie kunnen worden gevonden in onze recente gepubliceerde werk31.
Andere maatregelen uitkomst kunnen worden uitgevoerd met inbegrip van: kwantificeren van axon regeneratie in Sagittaal secties door de lijn-transect-methode beschreven in onze recente werk31 en kwantificeren van het aantal myelinated axonen en schepen in kunststof doorsneden. Monsters kunststof secties voorbereid kunnen verder worden gesegmenteerd voor transmissie-elektronenmicroscopie te kwantificeren van het aantal unmyelinated axonen. De cryoprotected-ruggenmerg monsters ook cross-sectioned in plaats van sagittally gesegmenteerd worden kunnen en immunostained te kwantificeren axon regeneratie en de aanwezigheid van GFP-SCs. Behavioral proeven kunnen ook worden uitgevoerd op de dieren met passende tussenpozen terwijl de dieren worden onderhouden.
Figuur 1: venster voorbereiding in de conduit. Vouw één kant langs de longitudinale as van de 5 mm leiding (A). Snijd vier insnijdingen over 0.4 mm lang en ten minste 1 mm uit de openingen van de leiding (B). Elke snede is ongeveer 1 mm uit elkaar. Door de ontplooiing van de leiding, worden de 4 parallelle bezuinigingen waargenomen (C). Gesneden tussen de twee incisies langs de rostraal-caudal as maken van een venster dat kan worden geopend door het opheffen van de klep. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: venster sluiten na injectie SC/DMEM/F12/matrix. Vensters worden geopend door het vouwen terug elke klep na het plaatsen van de leiding tussen rostraal en caudal stompen (A). Vensters worden gesloten na injectie (B). Schaal bar = 1 mm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: Confocal fluorescent beelden van Sagittaal secties en een heldere veld beeld van een kunststof dwarsdoorsnede van spinale koorden getransplanteerde met GFP-SCs in uitgelijnd vezelig PVDF-TrFE leidingen. Overzicht van de SC-brug in de leidingen waar de binnenmuren worden aangeduid met de gele lijnen en immunostained voor GFP en gliale fibrillary zuur eiwit (GFAP) te visualiseren getransplanteerd SCs en host ruggenmerg astrocyten, respectievelijk. Geregenereerde axonen werden aangeduid met RT97 (zware-keten neurofilament) (A, B) en middellange-keten neurofilament (NF, C) antistoffen. Axonen zijn niet zo zichtbaar in (A) als gevolg van hun nauwe samenwerking met GFP-SCs zoals wordt waargenomen halverwege conduit regio (C) met hogere vergroting. Axonen zijn niet zichtbaar in de rostraal stomp als gevolg van de onvolledige scan in de diepte van de weefselsectie wanneer imaging door confocale microscopie. Bloedvaten (aangeduid als v in D) en myelinated axonen (aangeduid als MA in D) werden waargenomen in de regio Midden conduit in een kunststof sectie. Vergrotingen en schaal bars: A, B (10 x, 200 µm); C (20 x, 100 µm); D (63 x, 25 µm). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De meest kritische stap in het creëren van een effectieve transect model is het doorsnijden van het ruggenmerg in één of twee delen. Een 2-2.5 mm kloof tussen de rostraal en caudal ruggenmerg stompen moet aanwezig zijn op de site van transect. De drie meest waarschijnlijke redenen voor dergelijke een kloof niet weergegeven zijn (1) de dorsale/ventrale wortels niet correct verwijderd, (2) de ventrale dura niet adequaat is verwijderd, en/of (3) het dier was niet goed gepositioneerd op de rol geplaatst onder haar.
Voor het uitvoeren van een effectieve conduit invoeging tussen de stompen: de (1) diameter van de leiding moet worden aangepast voor de specifieke soorten en de leeftijd van het dier gebruikt in het experiment; (2) laminae moeten lateraal genoeg worden verwijderd, totdat de kloof tussen de dwarsuitsteeksels kan worden gevisualiseerd; (3) de wortels moeten worden verwijderd en (4) conduit invoeging tussen de stompen moet worden uitgevoerd op de eerste poging. Als meerdere pogingen nodig zijn, kan dit oedeem veroorzaken in de stompen, verder bemoeilijken de taak van conduit invoeging tussen de stronken en extra schade veroorzaakt.
Voor het uitvoeren van effectieve GFP-SC/DMEM/F12/injectable matrix binnenbrengen in de leiding, er zorg voor dat: (1) het ruggenmerg is niet bloeden voordat conduit invoeging tussen de stompen. Als er vloeistof in de leiding na invoeging tussen de stompen, gebruik een klein stukje van absorptie speer om het te verwijderen via de voorgesneden windows. (2) Zorg ervoor dat de leiding is gleed op beide ruggenmerg stompen goed en (3) dat de dorsale voorgesneden vensters geopend zijn. De injectie van 20 µl van het mengsel van SC/injectable matrix moet meer dan genoeg te vullen van de leiding. Overloop van de voorgesneden windows is een goede graadmeter voor effectieve transplantatie.
De beperkingen van deze procedure zijn: (1) geen herstel van de dura, (2) geen controle over de beweging van de leiding/SC overplanten na afloop van de operatie, en (3) geen alternatieve methode als er sprake is van lekkage terwijl het injecteren van het SC/injectable matrix mengsel.
Het voordeel van deze procedure is de combinatie van het gebruik van zowel een gestructureerde geleider met een injecteerbare matrix. Elke conduit gemaakt met een materiaal bij uitstek dat is buigzaam moet worden ingevoegd tussen de stompen kan worden gebruikt in deze chirurgische ingreep. Een injecteerbare matrix van keuze kan ook worden gebruikt in deze procedure; een temperatuurgevoelige gel verdient de voorkeur vanwege zijn vermogen gel in situ en contour aan de vorm van de stronk een naadloze interface maken. Slangen met een meer complexe inwendige structuur kunnen worden gebruikt in plaats van een holle interieur. Drugs, groeifactoren, kleine molecules, of elk celtype kan worden opgenomen in de gestructureerde conduit de injecteerbare matrix en/of te verbeteren van transplantatie overleving neurale beschermen onmiddellijk na verwonding, ontsteking verminderen, bevordering van axon regeneratie, en bevordering van angiogenese.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij wil bedanken de virale Vector en dier Cores bij het Project van de Miami tot verlamming van de remedie voor produceren de lenti-GFP-virus en bieden dierenverzorgers, respectievelijk, de histologie en Imaging Cores voor het gebruik van de cryostaat, confocal microscoop, en fluorescente microscoop met Stereo-Detective. Financiering werd verstrekt door NINDS (09923), DOD (W81XWH-14-1-0482) en NSF (DMR-1006510). M.B. Bunge is de Christine E Lynn Distinguished Professor of Neuroscience.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cryogenic vials | ThermoFisher Scientific | 5000-0020 | |
| 10 cm Petri dish | VWR | 25382-428 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium: nutrient mixture F-12 | ThermoFisher Scientific | 11039-021 | "DMEM/F12" in protocol. |
| Penicillin-streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140-122 | "Pen/Strep" in protcol. |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH300-70-03 | "FBS" in protocol. |
| Pituitary extract | Biomedical Technologies | BT-215 | |
| Forskolin | Sigma-Aldrich | F6886 | |
| Heregulin | R&D Systems | 396-HB/CF | |
| Poly L-lysine | Sigma-Aldrich | P2636 | "PLL" in protocol. |
| Dulbecco's modified Eagle's medium | ThermoFisher Scientific | 11965-092 | "DMEM" in protocol. |
| Hank's balanced salt solution | ThermoFisher Scientific | 14170-112 | "HBSS" in protocol. |
| Tryspin-EDTA | ThermoFisher Scientific | 15400-054 | |
| Female Fischer rat (160-180g) | Envigo | ||
| Vannas scissor, straight | FST | 15018-10 | |
| Ketamine | Vedco Inc | 5098976106 | 100 mg/ml |
| Xylazine | Lloyd Inc | AnaSed | 20 mg/ml |
| Gentamycin | APP Pharmaceuticals | NDC 63323-010-02 | Can be any brand of choice. |
| Micro Spatula | FST | 10089-11 | Can be any brand of choice. |
| Curved scissors with blunt end | FST | 14017-18 | Can be any brand of choice. |
| Blunt forceps | FST | 11006-12 | Can be any brand of choice. |
| rongeur | FST | 16121-14 | Can be any brand of choice. |
| Angled spring scissors | FST | 15006-09 | Can be any brand of choice. |
| Absorption triangles | FST | 18105-03 | Can be any brand of choice. |
| Gelfoam | Henry Schein | 9083300 | "Compressed foam" in protocol. |
| #10 blades | Sklar | 06-3010 | Can be any brand of choice. |
| Matrigel | Corning | 354234 | "Injectable matrix" in protocol. |
| Chicken anti-green fluorescent protein antibody | Millipore | AB16901 | |
| Mouse RT97 hybridoma antibody | DSHB | RT97 | |
| Rabbit anti-neurofilament antibody | Encor Biotechnology, Inc | PRCA-NF-H | |
| Polyclonal Rabbit anti-Glial Fibrillary Acidic Protein antibody | Dako | Z033401 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-chicken IgG (H+L) | ThermoFisher Scientific | A-11039 | |
| Alexa Fluor 546 goat anti-rabbit IgG (H+L) | ThermoFisher Scientific | A-11035 | |
| Alexa Fluor 647 goat anti-rabbit IgG (H+L) | ThermoFisher Scientific | A-21244 | |
| Alexa Fluor 647 goat anti-mouse IgG (H+L) | ThermoFisher Scientific | A-21236 | |
| Confocal Microscopy | Nikon | clsi |
References
- King, V. R., Alovskaya, A., Wei, D. Y., Brown, R. A., Priestley, J. V. The use of injectable forms of fibrin and fibronectin to support axonal ingrowth after spinal cord injury. Biomaterials. 31 (15), 4447-4456 (2010).
- Liu, T., Houle, J. D., Xu, J., Chan, B. P., Chew, S. Y. Nanofibrous collagen nerve conduits for spinal cord repair. Tissue Eng Part A. 18 (9-10), 1057-1066 (2012).
- Novikova, L. N., Pettersson, J., Brohlin, M., Wiberg, M., Novikov, L. N. Biodegradable poly-beta-hydroxybutyrate scaffold seeded with Schwann cells to promote spinal cord repair. Biomaterials. 29 (9), 1198-1206 (2008).
- Bamber, N. I., Li, H., Aebischer, P., Xu, X. M. Fetal spinal cord tissue in mini-guidance channels promotes longitudinal axonal growth after grafting into hemisected adult rat spinal cords. Neural Plast. 6 (4), 103-121 (1999).
- Xu, X. M., Zhang, S. X., Li, H., Aebischer, P., Bunge, M. B. Regrowth of axons into the distal spinal cord through a Schwann-cell-seeded mini-channel implanted into hemisected adult rat spinal cord. Eur J Neurosci. 11 (5), 1723-1740 (1999).
- Bamber, N. I., et al. Neurotrophins BDNF and NT-3 promote axonal re-entry into the distal host spinal cord through Schwann cell-seeded mini-channels. European Journal of Neuroscience. 13 (2), 257-268 (2001).
- Iannotti, C., et al. Glial cell line-derived neurotrophic factor-enriched bridging transplants promote propriospinal axonal regeneration and enhance myelination after spinal cord injury. Exp Neurol. 183 (2), 379-393 (2003).
- Deng, L. X., et al. GDNF modifies reactive astrogliosis allowing robust axonal regeneration through Schwann cell-seeded guidance channels after spinal cord injury. Exp Neurol. 229 (2), 238-250 (2011).
- Deng, L. X., et al. A Novel Growth-Promoting Pathway Formed by GDNF-Overexpressing Schwann Cells Promotes Propriospinal Axonal Regeneration, Synapse Formation, and Partial Recovery of Function after Spinal Cord Injury. J Neurosci. 33 (13), 5655-5667 (2013).
- Chen, X., et al. Bone marrow stromal cells-loaded chitosan conduits promote repair of complete transection injury in rat spinal cord. J Mater Sci Mater Med. 22 (10), 2347-2356 (2011).
- Hurtado, A., et al. Robust CNS regeneration after complete spinal cord transection using aligned poly-L-lactic acid microfibers. Biomaterials. 32 (26), 6068-6079 (2011).
- Cheng, H., Huang, Y. C., Chang, P. T., Huang, Y. Y. Laminin-incorporated nerve conduits made by plasma treatment for repairing spinal cord injury. Biochem Biophys Res Commun. 357 (4), 938-944 (2007).
- Fan, J., et al. Neural regrowth induced by PLGA nerve conduits and neurotrophin-3 in rats with complete spinal cord transection. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 97 (2), 271-277 (2011).
- Lietz, M., et al. Physical and biological performance of a novel block copolymer nerve guide. Biotechnol Bioeng. 93 (1), 99-109 (2006).
- Novikova, L. N., Novikov, L. N., Kellerth, J. O. Biopolymers and biodegradable smart implants for tissue regeneration after spinal cord injury. Curr Opin Neurol. 16 (6), 711-715 (2003).
- Tang, S., et al. The effects of controlled release of neurotrophin-3 from PCLA Scaffolds on the survival and neuronal differentiation of transplanted neural stem cells in a rat spinal cord injury model. PLoS One. 9 (9), e107517 (2014).
- Yao, L., et al. Improved axonal regeneration of transected spinal cord mediated by multichannel collagen conduits functionalized with neurotrophin-3 gene. Gene Ther. , (2013).
- Xu, X. M., Guénard, V., Kleitman, N., Bunge, M. B. Axonal regeneration into Schwann cell-seeded guidance channels grafted into transected adult rat spinal cord. J Comp Neurol. 351 (1), 145-160 (1995).
- Xu, X. M., Chen, A., Guenard, V., Kleitman, N., Bunge, M. B. Bridging Schwann cell transplants promote axonal regeneration from both the rostral and caudal stumps of transected adult rat spinal cord. J Neurocytol. 26 (1), 1-16 (1997).
- Takami, T., et al. Schwann cell but not olfactory ensheathing glia transplants improve hindlimb locomotor performance in the moderately contused adult rat thoracic spinal cord. J Neurosci. 22 (15), 6670-6681 (2002).
- Bunge, M. B., Wood, P. M. Handbook of Clinical Neurology. 109, 523-540 (2012).
- Fortun, J., Hill, C. E., Bunge, M. B. Combinatorial strategies with Schwann cell transplantation to improve repair of the injured spinal cord. Neurosci Lett. 456 (3), 124-132 (2009).
- Haggerty, A. E., Oudega, M. Biomaterials for spinal cord repair. Neurosci Bull. , (2013).
- Nomura, H., Tator, C. H., Shoichet, M. S. Bioengineered strategies for spinal cord repair. J Neurotrauma. 23 (3-4), 496-507 (2006).
- Straley, K. S., Foo, C. W. P., Heilshorn, S. C. Biomaterial Design Strategies for the Treatment of Spinal Cord Injuries. J Neurotrauma. 27 (1), 1-19 (2010).
- Williams, R. R., Henao, M., Pearse, D. D., Bunge, M. B. Permissive Schwann cell graft/spinal cord interfaces for axon regeneration. Cell Transplant. 24 (1), 115-131 (2015).
- Williams, R. R., Pearse, D. D., Tresco, P. A., Bunge, M. B. The assessment of adeno-associated vectors as potential intrinsic treatments for brainstem axon regeneration. J Gene Med. 14 (1), 20-34 (2012).
- Xu, X. M., Guenard, V., Kleitman, N., Aebischer, P., Bunge, M. B. A combination of BDNF and NT-3 promotes supraspinal axonal regeneration into Schwann cell grafts in adult rat thoracic spinal cord. Exp Neurol. 134 (2), 261-272 (1995).
- Lee, Y. S., Arinzeh, T. L. The influence of piezoelectric scaffolds on neural differentiation of human neural stem/progenitor cells. Tissue Eng Part A. 18 (19-20), 2063-2072 (2012).
- Lee, Y. S., Collins, G., Arinzeh, T. L. Neurite extension of primary neurons on electrospun piezoelectric scaffolds. Acta Biomater. 7 (11), 3877-3886 (2011).
- Lee, Y. S., Wu, S., Arinzeh, T. L., Bunge, M. B. Enhanced noradrenergic axon regeneration into schwann cell-filled PVDF-TrFE conduits after complete spinal cord transection. Biotechnol Bioeng. 114 (2), 444-456 (2017).
- Haider, A., Haider, S., Kang, I. -K. A comprehensive review summarizing the effect of electrospinning parameters and potential applications of nanofibers in biomedical and biotechnology. Arab J Chem. , (2015).
- Hassiba, A. J., et al. Review of recent research on biomedical applications of electrospun polymer nanofibers for improved wound healing. Nanomedicine (Lond). 11 (6), 715-737 (2016).
- Lee, Y. -S., Livingston Arinzeh, T. Electrospun Nanofibrous Materials for Neural Tissue Engineering. Polymers. 3 (1), 413-426 (2011).
- Oraee-Yazdani, S., et al. Co-transplantation of autologous bone marrow mesenchymal stem cells and Schwann cells through cerebral spinal fluid for the treatment of patients with chronic spinal cord injury: safety and possible outcome. Spinal Cord. 54 (2), 102-109 (2016).
- Saberi, H., et al. Safety of intramedullary Schwann cell transplantation for postrehabilitation spinal cord injuries: 2-year follow-up of 33 cases. J Neurosurg Spine. 15 (5), 515-525 (2011).
- Saberi, H., et al. Treatment of chronic thoracic spinal cord injury patients with autologous Schwann cell transplantation: an interim report on safety considerations and possible outcomes. Neurosci Lett. 443 (1), 46-50 (2008).
- Yazdani, S. O., et al. A comparison between neurally induced bone marrow derived mesenchymal stem cells and olfactory ensheathing glial cells to repair spinal cord injuries in rat. Tissue Cell. 44 (4), 205-213 (2012).
- Zhou, X. H., et al. Transplantation of autologous activated Schwann cells in the treatment of spinal cord injury: six cases, more than five years of follow-up. Cell Transplant. 21, Suppl 1. S39-S47 (2012).
- Chen, L., et al. A prospective randomized double-blind clinical trial using a combination of olfactory ensheathing cells and Schwann cells for the treatment of chronic complete spinal cord injuries. Cell Transplant. 23, Suppl 1. S35-S44 (2014).
- Guest, J., Santamaria, A. J., Benavides, F. D. Clinical translation of autologous Schwann cell transplantation for the treatment of spinal cord injury. Curr Opin Organ Transplant. 18 (6), 682-689 (2013).
- Bunge, M. B., Monje, P. V., Khan, A., Wood, P. M. Progress in Brain Research. , Elsevier. (2017).
- Meijs, M. F., et al. Basic fibroblast growth factor promotes neuronal survival but not behavioral recovery in the transected and Schwann cell implanted rat thoracic spinal cord. J Neurotrauma. 21 (10), 1415-1430 (2004).
- Blits, B., et al. Lentiviral vector-mediated transduction of neural progenitor cells before implantation into injured spinal cord and brain to detect their migration, deliver neurotrophic factors and repair tissue. Restor Neurol Neurosci. 23 (5-6), 313-324 (2005).
- Follenzi, A., Naldini, L. HIV-based vectors. Preparation and use. Methods Mol Med. 69, 259-274 (2002).
- Fouad, K., et al. Combining Schwann cell bridges and olfactory-ensheathing glia grafts with chondroitinase promotes locomotor recovery after complete transection of the spinal cord. J Neurosci. 25 (2), 1169-1178 (2005).
- Bates, M. L., Puzis, R., Bunge, M. B. Animal Models of Movement Disorders: Volume II. Lane, E. L., Dunnett, S. B. , Humana Press. 381-399 (2011).
