Waiting
Procesando inicio de sesión ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Transplantasjon av Schwann celler inne PVDF-TrFE rør å bygge bro Transected Rat ryggmargen stubber fremme Axon foryngelse over gapet

Published: November 3, 2017 doi: 10.3791/56077
Automatic Translation
1, 2, 3, 1,4,5
1The Miami Project to Cure Paralysis, University of Miami Miller School of Medicine, 2Department of Materials Science and Engineering, New Jersey Institute of Technology, 3Department of Biomedical Engineering, New Jersey Institute of Technology, 4Department of Cell Biology, University of Miami Miller School of Medicine, 5Department of Neurological Surgery, University of Miami Miller School of Medicine

Summary

Denne artikkelen beskriver en teknikk for å sette inn en hul kanal mellom ryggmargen stubber etter fullført transection og fyll med Schwann cellene (SCs) og injiserbare kjelleren membran matrise for å bygge og markedsføre axon gjenfødelse på gapet.

Abstract

Blant ulike modeller for ryggmargsskade i rotter brukes oftest contusion modellen fordi det er den vanligste typen menneskelige ryggmargsskade. Komplett transection modellen, er men ikke som klinisk relevante som contusion modell, den strengeste metoden å evaluere axon gjenfødelse. I contusion modellen er det vanskelig å skille gjenskapte fra spiret eller spart axons av gjenværende vev innlegg skade. Komplett transection modellen er bygge bro metode nødvendig å fylle gapet og opprette kontinuitet fra den rostral til de caudal stumper for å vurdere effektiviteten av behandlingene. En pålitelig bygge bro kirurgi er viktig å teste utfallsmål ved å redusere variasjon på grunn av kirurgiske metoden. Protokollene beskrives her brukes til å forberede Schwann celler (SCs) og kanaler før transplantasjon, fullstendig transection i ryggmargen i thorax level 8 (T8), sette kanal og transplantere SCs i kanal. Denne fremgangsmåten bruker også i situ gelling av en injiserbare kjelleren membran matrise med SC transplantasjon som gir forbedret axon vekst over de rostral og caudal grensesnittene med vert vev.

Introduction

Ryggmarg skade reparasjon er et komplisert og utfordrende problem som krever en kombinasjon behandling strategi som involverer, for eksempel, bruk av celler og en biomateriale å gi en gunstig microenvironment for transplantert celle funksjon og axon regenerering på stedet for skade. Hemisection1,2,3,4,5,6,7,8,9 og komplett transection10 ,11,12,13,14,15,16,17,18,19 ,20,21,22 modeller brukes ofte til å vurdere effekten av biomateriale-basert bygge bro behandling. Fordelen med å bruke en hemisection modell er at det gir mer stabilitet for bygge bro Konstruer sammenlignet med komplett transection. I hemisection modeller er det imidlertid vanskelig å bevise axon fornyelse som et resultat av anvendt terapeutiske metoden på grunn av tilstedeværelsen av spart vev. Komplett transection modellen er den strengeste metoden å demonstrere axon gjenfødelse.

Ulike naturlige og syntetiske materialer har blitt studert som en injeksjon gel, en pre-formet gel plassert i contusion eller hemisection modeller, eller som en strukturert kanal i hemisection eller fullføre transection modeller (detaljert i anmeldelser23 , 24 , 25). in situ gelling en injiserbare matrise/SC blanding oppretter et mer ettergivende grensesnitt mellom transplantasjon og vert ledningen for axon krysset26,27 sammenlignet pre gelled matrise/SC implantater 5 , 18 , 19 , 28. i situ gelling tillatt matrix å kontur rundt de uregelmessig vertsgrensesnitt mens en mer rigid og strukturert kanal eller en mindre formes pre-formet gel ikke kan. En strukturert kanal gir ofte kontakt veiledning og implantat stabilitet i motsetning til en injiserbare matrise. Protokollene presenteres her beskriver et kirurgisk inngrep som utnytter en injiserbare kjelleren membran matrise (f.eks matrigel, se Tabell av materialer, referert til som injiserbare matrix her) og en strukturert kanal til evaluere axon fornyelse i de strengeste ryggmarg skade modellen.

Electrospun poly-vinylidenedifluoride-trifluoroethylene (PVDF-TrFE) justert fibrøs hult rør brukes i vår eksperimentelle tilnærming. PVDF-TrFE er en piezoelectric polymer som genererer en forbigående kostnad når mekanisk deformert og har vist seg å fremme neurite forlengelse og axon regenerering både i vitro29,30 og i vivo 31. Electrospinning er en vanlig stillaset fabrikasjon metode som kan raskt produsere pålitelige fibrøs stillaser bruker en rekke polymerer med kontrollerbar egenskaper som fiber justering, fiber diameter og tykkelsen på skafottet for nevrale og andre programmer32,33,34.

Tallrike studier av rotte SCs transplantert inn i ryggmargen skaden nettsteder har vist behandling effekt5,9,18,19,20,21 ,26. Disse transplantasjoner er neuroprotective for vevet rundt lesjonen, redusere lesjon hulrom størrelse og fremme axon regenerering i lesjon/transplantasjon området og myelination av gjenfødte axons. En fordel i forhold til de fleste andre neural-relaterte celler24menneskelige SCs kan transplanteres autologously. Etter en ekstern nerve biopsi, SCs kan være isolert og renset og vil spre seg til det ønskede beløpet for transplantasjon i mennesker. Autolog SC transplantasjon for ryggmargen skadet pasienter har vist seg for å være trygg i Iran35,36,37,38, Kina39,40, og USA41,42. SCs er kjent for å skille ut mange nevrotropisk faktorer og ekstracellulær matrix proteiner viktig for axon vekst og spille en viktig rolle i axon regenerering etter eksterne nerve skader. Vårt mål er å beskrive metoder som kan undersøke kanal design å forbedre resultatet av SC transplantasjon i en komplett rotte ryggmargen transection modell.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

voksen Fischer hunnrotter (180-200 g kroppsvekt) ligger i henhold til NIH og USDA retningslinjer. Institusjonelle Animal Care og bruk Committee (IACUC) av University of Miami godkjent alle dyr prosedyrer.

1. før transplantasjon forberedelse

  1. kanal forberedelse.
    1. Kutt på kanal 5 mm i lengde med et #10 blad under dissecting mikroskop.
      Merk: Den indre diameteren på kanal er mellom 2.4-2.7 mm; den ytre diameteren er mellom 2,5-2,8 mm.
    2. Brett kanal forsiktig langs langsgående ( figur 1A). Skjær fire små incisions om 0.4 mm lang og minst 1 mm fra åpningene på kanal og ca 1 mm stykker med vinkelhake Vannas saks ( figur 1B).
      1. Brette kanal ( figur 1 c) og klipp opp mellom to snitt langs samme side å lage to vinduer side ved side ( figur 1 d). Sikre at Vinduer kan åpnes og lukkes korrekt langs uklippet.
    3. Sterilisere rør i 75% etanol for 25 min i en 10 cm Petriskål. Skyll rør når for 4 min med 1 x fosfat bufret saltvann (PBS) og overføre the rør med sterilt tang til en ny 10 cm Petriskål. Skyll rør to ganger med 1 x PBS for 25 min.
    4. Lagre the rør i 1 x PBS til kirurgi.
      Merk: Mange kanaler kan steriliseres samtidig. Lagre kanaler i separate bakteriefri 1.5 mL sentrifuge rør for å holde dem sterile.
  2. Grønne fluorescerende protein (GFP)-Schwann celle (SC) forberedelse
    1. forberede renset SC kulturer fra tibial nerver av voksne kvinnelige Fischer rotter som beskrevet tidligere 43. Dette trinnet er ferdig, plate SCs på poly-L-lysine (PLL)-belagt 10 cm Petri retter og opprettholde i D10 / 3M medium; disse SCs er definert som passasjen 0.
      Merk: D10 / 3M medium består av følgende: 10% fosterets bovin serum (FBS), 1% penicillin-streptomycin (penn/strep), 20 µg/mL hypofysen ekstrakt, 2 µM forskolin, 2,5 nM heregulin i Dulbecco ' s endret Eagle ' s medium (DMEM).
    2. Fylle med fersk D10 / 3M medium (7 mL/10-cm Petriskål) hver 3-4 dager.
    3. Delt SC kultur når den når 70-80% samløpet.
      1. Fjern medium og skyll to ganger med Hank ' s balansert salt løsning (HBSS) uten kalsium og magnesium.
      2. Legge til 5 mL av 0,25% trypsin/EDTA hver 10 cm Petriskål og ruge i 5 minutter ved romtemperatur (RT).
      3. Legge til 5 mL av D10 medium (10% FBS og 1% penn/strep i DMEM) i et 50-mL sentrifuge rør å nøytralisere trypsin.
      4. Forsiktig Pipetter trypsin/EDTA løsning i Petri rett flere ganger for å løsne SCs. Fjern celle suspensjon fra retten og plasser den i sentrifuge røret i forrige trinn. Skyll parabolen med 5 mL av D10 medium og plasser den i sentrifuge røret å maksimere cellen høsting.
      5. Sentrifuge cellene 370 x g i 5 min på 4 o C. Fjern nedbryting og resuspend cellene i 4 mL D10/3 M medium for hver Petriskål delt.
      6. Dispensere 1 mL av SC suspensjon og 6 mL av D10 / 3M medium i en 10 cm Petriskål; hver Petriskål deling vil resultere i 4 Petri retter. Disse SCs er definert som passering 1.
      7. Replenish med fersk D10 / 3M medium dagen etter plating og hver 3-4 dager etter plating.
      8. En gang SCs nå 70-80% samløpet, gjenta 1.2.3.1 til 1.2.3.6. SCs er nå på passage 2.
    4. Transduce SCs gang nådde 50% samløpet, med en lentiviral vektor koding GFP i D10 / 3M middels natten på et mangfold av infeksjon 30 som tidligere beskrevet 44 , 45 .
    5. Fylle med fersk D10 / 3M medium neste dag og hver 3-4 dager etter plating.
    6. Når GFP-SCs når 70-80% samløpet, gjenta 1.2.3.1 til 1.2.3.5, men resuspend GFP-SCs i 6 mL av D10 medium i stedet. Dispensere 15 µL av GFP-SC suspensjon i en 1,5 mL sentrifuge rør og legge 15 µL 0,4% trypan blå løsning. Sveip sentrifuge røret forsiktig og dispensere 10 µL av blandingen i et kammer av celle-telling lysbildet.
      1. Sett lysbildet inn i en automatisert celle teller og bestemme cellen tettheten.
    7. Sentrifuge cellene 370 x g i 5 min på 4 o C. Fjern nedbryting, resuspend med 1,5 mL av frysing medium for hver 3 x 10 6 GFP-SCs. Dispense 1,5 mL av GFP-SC suspensjon i en kryogene medisinglass og Frys på-80 o C i minst 24 timer før han flyttet til flytende nitrogen for lagring.
      Merk: Frysing medium: 25% FBS og 8% dimethyl sulfoxide i DMEM.
    8. Tine GFP-SCs en uke før operasjonen.
      1. Legge 10 mL D10 medium i en 50 mL sentrifuge tube.
      2. Tine ampuller av frosne GFP-SCs i vannbad på 37 o C til delvis tint.
      3. Fjerne GFP-SC suspensjon fra kryogene ampullen og sett den inn i 50 mL sentrifuge røret i 1.2.8.1. Pipetter forsiktig løsningen opp og ned flere ganger.
      4. Sentrifuge cellene 370 x g i 5 min på 4 o C. Fjern nedbryting og resuspend cellene i 4 mL D10/3 M medium for hvert hetteglass tint.
      5. Dispensere 2 mL av GFP-SC suspensjon og 5 mL D10 / 3M medium i en 10 cm Petriskål; hvert hetteglass skal resultere i 2 Petri retter. GFP-SCs er definert som passering 3.
        Merk: En 10 cm Petriskål gir vanligvis rundt 8 x 10 6 GFP-SCs etter en uke.
    9. På dagen for kirurgi, gjentar du trinn 1.2.6. Bruk cellen tetthet beregnet i trinn 1.2.10.
    10. Dispense dele 3 x 10 6 GFP-SCs i bakteriefri 1.5 mL sentrifuge rør basert på celle tetthet beregnet fra trinn 1.2.9. Sentrifuge GFP-SC dele 370 x g i 5 min på 4 o C og fjerne nedbryting. Legge 1 mL av DMEM/F12 medium til hver aliquot og sentrifuger på 370 x g.
      Merk: Hvert dyr får 3 x 10 6 GFP-SCs. Medium med serum brukes med GFP-SCs til dette trinnet.
    11. Holde GFP-SCs på is inntil transplantasjon.

2. Fullføre Transection på Thoracic Level 8 (T8)

  1. dyr forberedelsene for kirurgi
    1. Anesthetize en kvinnelig Fischer rotten (180-200 g) med en intraperitoneal injeksjon av ketamin (60 mg/kg kroppsvekt) og xylazine (5 mg/kg kroppsvekt). Overvåke dybden av anestesi før du fortsetter til neste trinn ved å kontrollere tå klemming og øye blinkende svar.
    2. Barbere baksiden av rotte med en elektrisk avklipt og tørke huden med 70% etanol. Bruke ophthalmica smøremiddel på begge øynene. Overføre dyret til tabellen kirurgi på en varmeputen å opprettholde kroppstemperatur på ca 37 o C. sted dyret roll slik ryggvirvlene er det lett å.
      Merk: Roll kan gjøres fra papirhåndkle eller 2 i x2 i gasbind som kan steriliseres. Større ruller anbefales når T7-T9 må legges flat på rull.
  2. T7 til T9 laminectomy
    1. finne landemerket for T9-T11 spinous prosesser.
      Merk: Gapene mellom T9, T10 og T11 er liten sammenlignet med andre segmenter jegn regionen. Etter å plassere rotta på roll, T9-T11 spinous prosesser vil føle deg som en liten trekantet bump gjennom huden.
    2. Gjør en 4-5 cm midtlinjen snitt i huden med en #10 blad fra T4 til T11. Lag et lite innsnitt i overfladisk fett laget med buet saks med Butte endene å dissekere fettet.
      Merk: Andre typer instrumenter kan brukes til å skille fettet men buet saks med Butte endene aktivere den mest effektive og minst invasive metoden for fett separasjon.
    3. Finn T7 til T9 spinous prosesser ved hjelp av baksiden av #10 bladet. Hold muskelen på om T4 med sløv tang og gjøre et snitt i muskelen langs hver side av ryggsøylen fra T6-T10. Gjøre kutt så nær ryggvirvlene som mulig å gjøre en ren åpning og minimal skade til dyret.
    4. Isolerer hver individuelle spinous prosessen fra T7 til T9 ved å kutte muskler og leddbånd mellom T6 og T7, T7 og T8, T8 og T9, T9 og T10 med #10 blad.
    5. Bruker en rongeur fjerne noen muskler og leddbånd på laminae fra T7 til T9. Fjerne muskler og leddbånd som lateralt som mulig før gapene mellom transverse prosesser fra T7 til T9 vises.
    6. Fjerne T9 spinous prosessen med en rongeur. Hold T8 spinous prosessen med sløv tang og løft forsiktig å heve T9 lamina på små åpningen mellom T9 og T10 prosessene.
    7. Fjerne lamina fra åpningen og flytte rostrally med en rongeur på T9. Fjerne lamina lateralt som mulig; dorsal røttene skal vises etter laminectomy.
    8. Når lamina er fjernet, gjenta prosessen for T8 og T7.
      Merk: Under laminectomy, bruke absorpsjon spears for å fjerne blod mens du fortsetter med laminectomy. Hvis overflødig blødning oppstår, Plasser en komprimert svamp blødning området og legge saline å blodlevring.
  3. Transection på T8
    1. Plasser festepunkt rundt T7 til T9. Når alle laminae er fjernet, pass på at gapene mellom transverse prosessene er synlig, spesielt på T8. Også undersøke bein langs lengden på begge sider mellom T7 til T9 å sikre det er ingen beinfragmenter stikker utover.
      Merk: Dette gapet på T8 er viktig for å utføre den fullstendige transection. Ryggvirvlene langs bør fjernes for enklere kanal innsetting.
    2. Skjær den rygg og ventrale røtter over og under T8 bruker vinklet spring saks. Legge til saltvann i ryggmargen og vente for blodet å koagulere.
      Merk: dette trinnet er viktig for riktig kanal innsetting.
    3. Plasser vinklet spring saksen over ryggmargen hullene mellom transverse prosessene på T8 og gjør en kuttet helt bryte ryggmargen. Legg en liten bit av komprimert skum i resulterende 2-2.5 mm gapet og legge saline til området umiddelbart.

3. Kanal innsetting

  1. mens du venter kuttet ledningen stubber å nå hemostasen, ta ut en kanal fra 1 x PBS. Skjær absorpsjon trekanter i tynne lange stykker og plassere dem i kanal å fjerne overflødig PBS. Kontroller at pre-cut vinduene er åpne.
  2. Fjern saltvann og blod med tynne lange biter av absorpsjon trekanter. Løft de to stumper av ryggmargen bruke en microspatula for å sikre god separasjon. Forsiktig løfte rostral stump med microspatula og slip kanal over stump med windows vendt seg. Kontroller at hele stump settes og det er ingen overflødig blødning i kanal.
  3. Forsiktig løft caudal stump og sett den andre enden av kanal over stump. Kontroller at hele stump settes og windows er dorsal overflaten ( figur 2A).

4. Schwann celle / injiserbare Matrix (se tabell for materiale) forberedelse og injeksjon

  1. mens du venter kuttet ledningen til nå hemostasen, fjerne mediet over GFP-SC pellet (forberedt i trinn 1.2). Resuspend GFP-SCs i 10 µl av kalde DMEM/F12. Legg 10 µl av kaldt injiserbare gel til celle suspensjon og bland godt av gjentatt pipettering. Holde GFP-SC/DMEM/F12/injectable matrix blandingen på is til kanal innsetting er fullført.
  2. Kontroller at vinduene på dorsal overflaten er åpne ( figur 2A), injisere 20 µl av GFP-SC/DMEM/F12/injectable matrix blandingen i kanalen blant pre-cut windows 46 bruker en western blot lasting tips og brønnene. Hvis SC/DMEM/F12/injectable matrix blandingen bør overfylle kanal, fjerne overflødig med absorpsjon trekanter. Lukk windows etter injeksjon; suturing er ikke nødvendig ( figur 2B).

5. Sår nedleggelse og postoperativ omsorg

  1. Sutur muskelen lag og overfladiske fett lag. Rens huden med 70% etanol og deretter stift (f.eks bruker såret klipp) huden stengt. Holde dyr i en termisk regulert inkubator til de gjenvinne bevissthet. Overføre dyrene tilbake til merdene. Gi vann med en lang fôring rør og plassere mat pellets på bedding for enkel tilgang.
  2. Administrere buprenorfin (0,1 mg/kg kroppsvekt) to ganger daglig i 3 dager subcutaneously begynner umiddelbart etter operasjonen for å redusere smerte. Sette inn gentamycin (5 mg/kg kroppsvekt) subcutaneously en gang pr. dag for 7 dager umiddelbart etter operasjonen for å forebygge og redusere infeksjon. Injisere 10 mL lactated Ringers løsning subcutaneously to ganger om dagen for 7 dager for hydration.
  3. Tom blærer funksjonen manuelt dobbelt en dag før blæren returnerer. Hvis blæren infeksjon oppstår, deretter administrere 10 mL saline subcutaneously til urin blir klart. Hvis det ikke er noen forbedring i to dager, injisere gentamycin (5 mg/kg kroppsvekt, en gang daglig) subcutaneously til urinen blir klart.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Målet med å bruke denne kirurgiske teknikken er å vurdere bruken av et strukturert kanal og injiserbare matrisen som maksimerer SC funksjon etter transplantasjon til ferdigutfylte transected spinal snorer. Tre uker etter transplantasjon, dyrene er parfyme med 4% paraformaldehyde og spinal kolonnene er grovt dissekert og fast i den samme bindemiddel for en annen 24 timer. Ryggmargen er så dissekert og prøvene for kryostaten sagittal inndelinger er plassert i en 30% sukrose løsning for cryoprotection. 1 mm tykk tverrsnitt isolert fra midten av SC broen av et annet sett med dissekert spinal snorer plasseres i glutaraldehyde bindemiddel behandle plast deler. Prøvene er utsatt for en tidsplan for elektron mikroskopiske forberedelse som beskrevet av Bates et al. 47. kryostaten sagittal delene var immunostained med primær antistoff mot GFP, glial fibrillary Sure protein (GFAP), tunge kjeden neurofilament (RT97) og middels chain neurofilament (NF) etterfulgt av sekundær antistoffer inkludert geit-anti-kylling-488, geit-anti-kanin-546, geit-anti-mus-647 og geit-anti-kanin 647, henholdsvis. GFP-SCs ble distribuert jevnt langs og innenfor kanal (figur 3A, indre veggene angitt av gule linjer). Axon gjenfødelse er observert (figur 3B) og er nært forbundet med tilstedeværelse av GFP-SCs (figur 3A og Figur 3 c) som angir at denne teknikken er lykkes i å gi en SC bro i en strukturert kanal og i fremme axon regenerering langs broen mellom rostral og caudal stubber. Blodkar og myelinated axons ble også funnet i midten av SC broen (figur 3D). Flere detaljer om effekten av SCs med electrospun PVDF-TrFE fibrøs rør på axon gjenfødelse kan finnes i vår nylig utgitte verk31.

Andre utfallsmål kan utføres inkludert: kvantifisere axon gjenfødelse sagittal deler av linje-mudderbunn-metoden beskrevet i vår siste arbeid31 og kvantifisere myelinated axons og fartøy i plast tverrsnitt. Prøver forberedt for plast inndelinger kan videre deles for overføring elektronmikroskop å tallfeste antallet unmyelinated axons. Cryoprotected ryggmarg prøver også kan kryss-delt i stedet for sagittally delt og immunostained å kvantifisere axon regenerasjon og tilstedeværelsen av GFP-SCs. atferdsmessige tester kan også utføres på dyrene på passende mellomrom mens dyrene opprettholdes.

Figure 1
Figur 1: vinduet forberedelse i kanal. Brett ene langs den langsgående aksen 5 mm kanal (A). Skjær fire incisions 0.4 mm lang og minst 1 mm fra åpningene på kanal (B). Hvert snitt er ca 1 mm fra hverandre. Ved unfolding på kanal, er 4 parallelle kutt observert (C). Klipp opp mellom de to incisions langs rostral-caudal aksen opprette et vindu som kan åpnes ved å løfte klaffen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: vinduet lukker etter SC/DMEM/F12/matrise injeksjon. Windows åpnes ved folding tilbake hver klaff etter plassering kanal mellom rostral og caudal stubber (A). Vinduer er lukket etter injeksjon (B). Skala bar = 1 mm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: AC Confocal fluorescerende bilder sagittal seksjoner og en lysende felt bilde av en plast tverrsnitt fra spinal snorer transplantert med GFP-SCs i justert fibrøs PVDF-TrFE rør. Oversikt over SC broen i rør der indre veggene er angitt av gule linjer og immunostained for GFP og glial fibrillary Sure protein (GFAP) å visualisere transplantert SCs og vert ryggmargen astrocyttene, henholdsvis. Spartments axons ble merket med RT97 (heavy-kjeden neurofilament) (A, B) og medium-kjeden neurofilament (NF, C) antistoffer. Axons er ikke så synlig i (A) på grunn av deres nært samarbeid med GFP-SCs er observert i regionen midt kanalCmed høyere forstørrelse. Axons vises ikke i rostral stump skyldes ufullstendig skanningen i dybden av delen vev når imaging av AC confocal mikroskopi. Blodkar (merket v i D) og myelinated axons (merket som MA i D) var begge observert i regionen midt kanal i en plast delen. Forstørrelse og skala barer: A, B (10 x 200 µm); C (20 x, 100 µm); D (63 x 25 µm). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Det viktigste trinnet i å skape en effektiv transection modell er kuttet ryggmargen i en eller to kutt. En 2-2.5 mm avstand mellom rostral og caudal ryggmargen stubber bør være til stede på transection nettstedet. Tre mest sannsynlige årsakene til slikt tomrom vises ikke er (1) dorsal/ventrale røtter ikke ble riktig fjernet, (2) ventrale dura ble ikke fjernet tilstrekkelig eller (3) dyret var ikke plassert riktig på roll plassert under henne.

Utføre en effektiv kanal innsetting mellom stubber: (1) diameteren på kanal skal være skreddersydd for bestemte arter og alder på dyret i eksperimentet. (2) laminae må fjernes lateralt nok til gapet mellom transverse prosessene kan visualiseres; (3) røtter må fjernes og (4) kanal innsetting mellom stubber bør gjøres på første forsøk. Hvis det trengs flere forsøk, kan dette forårsake ødem i stubber, ytterligere kompliserende oppgaven med kanal innsetting mellom stumper og forårsaker skader.

For å utføre effektive GFP-SC/DMEM/F12/injectable matrix innføring i kanal, sikre at: (1) ryggmargen blør ikke før kanal innsetting mellom stubber. Hvis det er væske i kanal etter innsetting mellom stubber, bruk en liten bit av absorpsjon spyd for å fjerne det via vinduene pre-cut. (2) Kontroller at kanal er gled på begge ryggmargen stubber godt og (3) at dorsal pre-cut vinduene er åpne. Injeksjon av 20 µl av SC/injectable matrix blandingen bør være mer enn nok å fylle på conduit. Overflyt pre-cut vinduene er en god målestokk for effektiv transplantasjon.

Begrensningene i denne fremgangsmåten er: (1) ingen restaurering av dura, (2) ingen kontroll over bevegelsen av kanal/SC transplantasjon etter fullføring av operasjonen, og (3) ingen alternativ metode hvis det er lekkasje mens injisering SC/injectable matrix blandingen.

Fordelen med denne fremgangsmåten er kombinasjonen av både en strukturert kanal med en injiserbare matrise. En kanal med et materiale til valg som er smidig settes mellom stubber kan brukes i denne kirurgiske prosedyren. Noen injiserbare matrise av valg kan også brukes i denne fremgangsmåten. en temperatur-sensitive gel anbefales på grunn av sin evne til å gel i situ og konturen til figuren av stump å opprette en sømløs grensesnitt. Rør med en mer kompleks indre struktur kan brukes i stedet for en hul interiør. Narkotika, vekstfaktorer, små molekyler eller en celle type kan innarbeides i den strukturerte kanal eller injiserbare matrix eller begge å forbedre transplantasjon overlevelse, neural beskytter umiddelbart etter skader, redusere betennelse, fremme axon gjenfødelse, og fremme angiogenese.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Vi vil gjerne takke Viral vektor og dyr kjerner på Miami prosjektet kur lammelse for produsere lenti-GFP-virus og gi dyr omsorg, henholdsvis og Histology og Imaging kjerner for bruk av kryostaten, AC confocal mikroskop, og fluorescerende mikroskop med Stereo etterforsker. Midler ble gitt av NINDS (09923), DOD (W81XWH-14-1-0482) og NSF (DMR-1006510). MB Bunge er Christine E Lynn Distinguished Professor av nevrovitenskap.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cryogenic vials ThermoFisher Scientific 5000-0020
10 cm Petri dish VWR 25382-428
Dulbecco's modified Eagle's medium: nutrient mixture F-12 ThermoFisher Scientific 11039-021 "DMEM/F12" in protocol.
Penicillin-streptomycin ThermoFisher Scientific 15140-122 "Pen/Strep" in protcol.
Fetal bovine serum Hyclone SH300-70-03 "FBS" in protocol.
Pituitary extract Biomedical Technologies BT-215
Forskolin Sigma-Aldrich F6886
Heregulin R&D Systems 396-HB/CF
Poly L-lysine Sigma-Aldrich P2636 "PLL" in protocol.
Dulbecco's modified Eagle's medium ThermoFisher Scientific 11965-092 "DMEM" in protocol.
Hank's balanced salt solution ThermoFisher Scientific 14170-112 "HBSS" in protocol.
Tryspin-EDTA ThermoFisher Scientific 15400-054
Female Fischer rat (160-180g) Envigo
Vannas scissor, straight FST 15018-10
Ketamine Vedco Inc 5098976106 100 mg/ml
Xylazine Lloyd Inc AnaSed 20 mg/ml
Gentamycin APP Pharmaceuticals NDC 63323-010-02 Can be any brand of choice.
Micro Spatula FST 10089-11 Can be any brand of choice.
Curved scissors with blunt end FST 14017-18 Can be any brand of choice.
Blunt forceps FST 11006-12 Can be any brand of choice.
rongeur FST 16121-14 Can be any brand of choice.
Angled spring scissors FST 15006-09 Can be any brand of choice.
Absorption triangles FST 18105-03 Can be any brand of choice.
Gelfoam Henry Schein 9083300 "Compressed foam" in protocol.
#10 blades Sklar 06-3010 Can be any brand of choice.
Matrigel Corning 354234 "Injectable matrix" in protocol.
Chicken anti-green fluorescent protein antibody Millipore AB16901
Mouse RT97 hybridoma antibody DSHB RT97
Rabbit anti-neurofilament antibody Encor Biotechnology, Inc PRCA-NF-H
Polyclonal Rabbit anti-Glial Fibrillary Acidic Protein antibody Dako Z033401
Alexa Fluor 488 goat anti-chicken IgG (H+L) ThermoFisher Scientific A-11039
Alexa Fluor 546 goat anti-rabbit IgG (H+L) ThermoFisher Scientific A-11035
Alexa Fluor 647 goat anti-rabbit IgG (H+L) ThermoFisher Scientific A-21244
Alexa Fluor 647 goat anti-mouse IgG (H+L) ThermoFisher Scientific A-21236
Confocal Microscopy Nikon clsi

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. King, V. R., Alovskaya, A., Wei, D. Y., Brown, R. A., Priestley, J. V. The use of injectable forms of fibrin and fibronectin to support axonal ingrowth after spinal cord injury. Biomaterials. 31 (15), 4447-4456 (2010).
  2. Liu, T., Houle, J. D., Xu, J., Chan, B. P., Chew, S. Y. Nanofibrous collagen nerve conduits for spinal cord repair. Tissue Eng Part A. 18 (9-10), 1057-1066 (2012).
  3. Novikova, L. N., Pettersson, J., Brohlin, M., Wiberg, M., Novikov, L. N. Biodegradable poly-beta-hydroxybutyrate scaffold seeded with Schwann cells to promote spinal cord repair. Biomaterials. 29 (9), 1198-1206 (2008).
  4. Bamber, N. I., Li, H., Aebischer, P., Xu, X. M. Fetal spinal cord tissue in mini-guidance channels promotes longitudinal axonal growth after grafting into hemisected adult rat spinal cords. Neural Plast. 6 (4), 103-121 (1999).
  5. Xu, X. M., Zhang, S. X., Li, H., Aebischer, P., Bunge, M. B. Regrowth of axons into the distal spinal cord through a Schwann-cell-seeded mini-channel implanted into hemisected adult rat spinal cord. Eur J Neurosci. 11 (5), 1723-1740 (1999).
  6. Bamber, N. I., et al. Neurotrophins BDNF and NT-3 promote axonal re-entry into the distal host spinal cord through Schwann cell-seeded mini-channels. European Journal of Neuroscience. 13 (2), 257-268 (2001).
  7. Iannotti, C., et al. Glial cell line-derived neurotrophic factor-enriched bridging transplants promote propriospinal axonal regeneration and enhance myelination after spinal cord injury. Exp Neurol. 183 (2), 379-393 (2003).
  8. Deng, L. X., et al. GDNF modifies reactive astrogliosis allowing robust axonal regeneration through Schwann cell-seeded guidance channels after spinal cord injury. Exp Neurol. 229 (2), 238-250 (2011).
  9. Deng, L. X., et al. A Novel Growth-Promoting Pathway Formed by GDNF-Overexpressing Schwann Cells Promotes Propriospinal Axonal Regeneration, Synapse Formation, and Partial Recovery of Function after Spinal Cord Injury. J Neurosci. 33 (13), 5655-5667 (2013).
  10. Chen, X., et al. Bone marrow stromal cells-loaded chitosan conduits promote repair of complete transection injury in rat spinal cord. J Mater Sci Mater Med. 22 (10), 2347-2356 (2011).
  11. Hurtado, A., et al. Robust CNS regeneration after complete spinal cord transection using aligned poly-L-lactic acid microfibers. Biomaterials. 32 (26), 6068-6079 (2011).
  12. Cheng, H., Huang, Y. C., Chang, P. T., Huang, Y. Y. Laminin-incorporated nerve conduits made by plasma treatment for repairing spinal cord injury. Biochem Biophys Res Commun. 357 (4), 938-944 (2007).
  13. Fan, J., et al. Neural regrowth induced by PLGA nerve conduits and neurotrophin-3 in rats with complete spinal cord transection. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 97 (2), 271-277 (2011).
  14. Lietz, M., et al. Physical and biological performance of a novel block copolymer nerve guide. Biotechnol Bioeng. 93 (1), 99-109 (2006).
  15. Novikova, L. N., Novikov, L. N., Kellerth, J. O. Biopolymers and biodegradable smart implants for tissue regeneration after spinal cord injury. Curr Opin Neurol. 16 (6), 711-715 (2003).
  16. Tang, S., et al. The effects of controlled release of neurotrophin-3 from PCLA Scaffolds on the survival and neuronal differentiation of transplanted neural stem cells in a rat spinal cord injury model. PLoS One. 9 (9), e107517 (2014).
  17. Yao, L., et al. Improved axonal regeneration of transected spinal cord mediated by multichannel collagen conduits functionalized with neurotrophin-3 gene. Gene Ther. , (2013).
  18. Xu, X. M., Guénard, V., Kleitman, N., Bunge, M. B. Axonal regeneration into Schwann cell-seeded guidance channels grafted into transected adult rat spinal cord. J Comp Neurol. 351 (1), 145-160 (1995).
  19. Xu, X. M., Chen, A., Guenard, V., Kleitman, N., Bunge, M. B. Bridging Schwann cell transplants promote axonal regeneration from both the rostral and caudal stumps of transected adult rat spinal cord. J Neurocytol. 26 (1), 1-16 (1997).
  20. Takami, T., et al. Schwann cell but not olfactory ensheathing glia transplants improve hindlimb locomotor performance in the moderately contused adult rat thoracic spinal cord. J Neurosci. 22 (15), 6670-6681 (2002).
  21. Bunge, M. B., Wood, P. M. Handbook of Clinical Neurology. 109, 523-540 (2012).
  22. Fortun, J., Hill, C. E., Bunge, M. B. Combinatorial strategies with Schwann cell transplantation to improve repair of the injured spinal cord. Neurosci Lett. 456 (3), 124-132 (2009).
  23. Haggerty, A. E., Oudega, M. Biomaterials for spinal cord repair. Neurosci Bull. , (2013).
  24. Nomura, H., Tator, C. H., Shoichet, M. S. Bioengineered strategies for spinal cord repair. J Neurotrauma. 23 (3-4), 496-507 (2006).
  25. Straley, K. S., Foo, C. W. P., Heilshorn, S. C. Biomaterial Design Strategies for the Treatment of Spinal Cord Injuries. J Neurotrauma. 27 (1), 1-19 (2010).
  26. Williams, R. R., Henao, M., Pearse, D. D., Bunge, M. B. Permissive Schwann cell graft/spinal cord interfaces for axon regeneration. Cell Transplant. 24 (1), 115-131 (2015).
  27. Williams, R. R., Pearse, D. D., Tresco, P. A., Bunge, M. B. The assessment of adeno-associated vectors as potential intrinsic treatments for brainstem axon regeneration. J Gene Med. 14 (1), 20-34 (2012).
  28. Xu, X. M., Guenard, V., Kleitman, N., Aebischer, P., Bunge, M. B. A combination of BDNF and NT-3 promotes supraspinal axonal regeneration into Schwann cell grafts in adult rat thoracic spinal cord. Exp Neurol. 134 (2), 261-272 (1995).
  29. Lee, Y. S., Arinzeh, T. L. The influence of piezoelectric scaffolds on neural differentiation of human neural stem/progenitor cells. Tissue Eng Part A. 18 (19-20), 2063-2072 (2012).
  30. Lee, Y. S., Collins, G., Arinzeh, T. L. Neurite extension of primary neurons on electrospun piezoelectric scaffolds. Acta Biomater. 7 (11), 3877-3886 (2011).
  31. Lee, Y. S., Wu, S., Arinzeh, T. L., Bunge, M. B. Enhanced noradrenergic axon regeneration into schwann cell-filled PVDF-TrFE conduits after complete spinal cord transection. Biotechnol Bioeng. 114 (2), 444-456 (2017).
  32. Haider, A., Haider, S., Kang, I. -K. A comprehensive review summarizing the effect of electrospinning parameters and potential applications of nanofibers in biomedical and biotechnology. Arab J Chem. , (2015).
  33. Hassiba, A. J., et al. Review of recent research on biomedical applications of electrospun polymer nanofibers for improved wound healing. Nanomedicine (Lond). 11 (6), 715-737 (2016).
  34. Lee, Y. -S., Livingston Arinzeh, T. Electrospun Nanofibrous Materials for Neural Tissue Engineering. Polymers. 3 (1), 413-426 (2011).
  35. Oraee-Yazdani, S., et al. Co-transplantation of autologous bone marrow mesenchymal stem cells and Schwann cells through cerebral spinal fluid for the treatment of patients with chronic spinal cord injury: safety and possible outcome. Spinal Cord. 54 (2), 102-109 (2016).
  36. Saberi, H., et al. Safety of intramedullary Schwann cell transplantation for postrehabilitation spinal cord injuries: 2-year follow-up of 33 cases. J Neurosurg Spine. 15 (5), 515-525 (2011).
  37. Saberi, H., et al. Treatment of chronic thoracic spinal cord injury patients with autologous Schwann cell transplantation: an interim report on safety considerations and possible outcomes. Neurosci Lett. 443 (1), 46-50 (2008).
  38. Yazdani, S. O., et al. A comparison between neurally induced bone marrow derived mesenchymal stem cells and olfactory ensheathing glial cells to repair spinal cord injuries in rat. Tissue Cell. 44 (4), 205-213 (2012).
  39. Zhou, X. H., et al. Transplantation of autologous activated Schwann cells in the treatment of spinal cord injury: six cases, more than five years of follow-up. Cell Transplant. 21, Suppl 1. S39-S47 (2012).
  40. Chen, L., et al. A prospective randomized double-blind clinical trial using a combination of olfactory ensheathing cells and Schwann cells for the treatment of chronic complete spinal cord injuries. Cell Transplant. 23, Suppl 1. S35-S44 (2014).
  41. Guest, J., Santamaria, A. J., Benavides, F. D. Clinical translation of autologous Schwann cell transplantation for the treatment of spinal cord injury. Curr Opin Organ Transplant. 18 (6), 682-689 (2013).
  42. Bunge, M. B., Monje, P. V., Khan, A., Wood, P. M. Progress in Brain Research. , Elsevier. (2017).
  43. Meijs, M. F., et al. Basic fibroblast growth factor promotes neuronal survival but not behavioral recovery in the transected and Schwann cell implanted rat thoracic spinal cord. J Neurotrauma. 21 (10), 1415-1430 (2004).
  44. Blits, B., et al. Lentiviral vector-mediated transduction of neural progenitor cells before implantation into injured spinal cord and brain to detect their migration, deliver neurotrophic factors and repair tissue. Restor Neurol Neurosci. 23 (5-6), 313-324 (2005).
  45. Follenzi, A., Naldini, L. HIV-based vectors. Preparation and use. Methods Mol Med. 69, 259-274 (2002).
  46. Fouad, K., et al. Combining Schwann cell bridges and olfactory-ensheathing glia grafts with chondroitinase promotes locomotor recovery after complete transection of the spinal cord. J Neurosci. 25 (2), 1169-1178 (2005).
  47. Bates, M. L., Puzis, R., Bunge, M. B. Animal Models of Movement Disorders: Volume II. Lane, E. L., Dunnett, S. B. , Humana Press. 381-399 (2011).

Tags

Medisin problemet 129 Schwann celler ryggmargen skaden PVDF-TrFE kanal komplett transection electrospinning piezoelectric
Transplantasjon av Schwann celler inne PVDF-TrFE rør å bygge bro Transected Rat ryggmargen stubber fremme Axon foryngelse over gapet
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lee, Y. S., Wu, S., Arinzeh, T. L.,… More

Lee, Y. S., Wu, S., Arinzeh, T. L., Bunge, M. B. Transplantation of Schwann Cells Inside PVDF-TrFE Conduits to Bridge Transected Rat Spinal Cord Stumps to Promote Axon Regeneration Across the Gap. J. Vis. Exp. (129), e56077, doi:10.3791/56077 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter