Summary
이 문서는 완전 한 transection 후 척수 젊고 아름 다운 여자와 채우기 Schwann 세포 (SCs)와 다리 하 고 격차에 걸쳐 축 삭 재생을 촉진 주사 지하실 멤브레인 매트릭스 사이 빈 도관을 삽입 하는 기법을 설명 합니다.
Abstract
쥐에서 척수 부상에 대 한 다양 한 모델 중에서 박상 모델 그것은 인간의 척수 상해의 가장 일반적인 유형 때문에 가장 자주 사용 됩니다. 전체 transection 모델 비록 타 박상 모델로 하지으로 임상으로 관련 축 삭 재생을 평가 하기 위해 가장 엄격한 방법입니다. 타 박상 모델에서 조직 게시물 부상을 나머지의 존재로 인해 부 화 또는 절약 axons에서 재생성 구별 하기가 어렵습니다. 완전 한 transection 모델에는 브리징 방법은 격차를 만들어 연속성 있는 rostral에서 꼬리 젊고 아름 다운 여자를 치료의 효과 평가 하는 데 필요한입니다. 신뢰할 수 있는 브리징 수술 수술 방법에 따른 가변성을 감소 결과 측정을 테스트 하는 필수적 이다. 여기에 설명 된 프로토콜 Schwann 세포 (SCs)를 준비 하는 데 사용 됩니다 이식, 흉부 레벨 8 (T8)에서 척수의 완전 한 transection 전 도관에 도관을 삽입 하 고 도관으로 SCs를 이식. 이 접근은 또한 제자리에 고 SC 이식 호스트 조직으로 rostral와 꼬리 인터페이스를 통해 향상 된 축 삭 성장을 허용 하는 주 사용 지하실 멤브레인 행렬의 사용 합니다.
Introduction
척수 부상 수리는 관련 된, 예를 들어 조합 처리 전략을 필요로 하는 복잡 하 고 어려운 문제, 세포와 이식된 세포 기능 및 축 삭에 대 한 유리한 microenvironment를 제공 하는 소재를 사용 하 여 다시 부상의 생성 사이트 Hemisection1,2,,34,5,6,7,,89 및 완료 transection10 ,11,12,13,14,15,,1617,18,19 ,20,,2122 모델 소재 기반 브리지 치료의 효과 평가 하기 위해 자주 사용 됩니다. Hemisection 모델을 사용 하 여의 장점은 그것 완료 transection에 비해 브리징 구문에 대 한 더 많은 안정성을 제공입니다. 그러나, hemisection 모델, 그것은 절약된 조직의 존재로 인해 적용 된 치료 방법의 결과로 축 삭 재생을 증명 어렵다. 완전 한 transection 모델은 축 삭 재생을 보여 주기 위해 가장 엄격한 방법입니다.
다양 한 자연 및 합성 물질 주사 젤으로 사용 하기 위해 연구, 미리 형성 된 젤 hemisection에 타 박상 또는 hemisection 모델 또는 구조적된 도관 배치 또는 transection 모델 (에 대 한 자세한 리뷰23 를 완료합니다 , 24 , 25). 제자리에서 고 주 사용 매트릭스/SC 혼합물의 이식 및 축 삭 교차점26,27 미리 gelled 매트릭스/SC 임 플 란 트에 비해 호스트 코드 사이 더 인터페이스를 만듭니다 5 , 18 , 19 , 28. 제자리에서 고 허용 더 엄밀 하 고 구조화 된 도관 또는 덜 moldable 미리 형성 된 젤 수 없습니다 반면 불규칙 한 호스트 인터페이스 주위 윤곽을 매트릭스. 구조화 된 도관 자주 주사 매트릭스 달리 연락처 지침과 임 플 란 트 안정성을 제공합니다. 여기에 제시 된 프로토콜 설명 주사 지하실 멤브레인 매트릭스 (예: matrigel, 주사 매트릭스 여기로 테이블의 자료를 참조 하는 참조) 및 구조화 된 도관을 이용 하는 수술 가장 엄격한 척수 손상 모델에서 축 삭 재생을 평가 합니다.
Electrospun 폴 리-vinylidenedifluoride-trifluoroethylene (PVDF TrFE) 정렬 된 섬유 빈 도관 우리의 실험적인 접근 방식에 사용 됩니다. PVDF TrFE는 기계적으로 변형 하는 경우 임시 충전을 생성 하 neurite 연장 및 축 삭 재생을 촉진을 보여줘 왔다 압 전 폴리머29,30 생체 외에서그리고 vivo에서 31. 전기는 빠르게 제어 속성 섬유 정렬, 섬유 직경, 및을 위한 발판의 두께 등 다양 한 고분자를 사용 하 여 신뢰할 수 있는 섬유 건설 기계를 생산할 수 있는 일반적인 비 계 제조 방법 신경 및 기타 응용 프로그램32,,3334
쥐 척수 부상 사이트에 이식 하는 SCs의 수많은 학문은 치료 효능5,9,,1819,20,21 설명 했다 ,26. 이러한 이식 병 변 주위의 조직에 대 한 신경, 병 변 캐비티 크기를 줄일 수 있으며 병 변/이식 사이트 및 myelination 재생성 된 축 삭의 축 삭 재생을 촉진. 인간의 SCs autologously 이식 될 수 있습니다, 그리고 이점을 비교 될 때 대부분의 다른 관련 된 신경 세포24. 말 초 신경 생 검 후 SCs 수 고립 된 고 정화 및 인간으로 이식에 대 한 원하는 금액을 확산 것입니다. 척수 부상 환자에 대 한 헌 SC 이식 이란35,36,,3738, 중국39,40, 안전한 것으로 입증 되었습니다 및 미국41,42. SCs는 수많은 neurotrophic 요인 및 축 삭 성장을 위한 중요 한 세포 외 기질 단백질을 분 비 하 고 말 초 신경 손상 후 축 삭 재생에 필수적인 역할을 알려져 있습니다. 우리의 목표는 여기 도관 디자인 완전 한 쥐 척수 transection 모델에 SC 이식의 결과 개선 하기 위해 조사할 수 있는 방법을 설명 하는 것입니다.
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Protocol
여성 성인 피셔 쥐 (180-200 g 몸 무게) NIH와 USDA 지침에 따라 보관 됩니다. 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 마이애미 대학의 모든 동물 절차 승인.
1. 사전 이식 준비
- 도관 준비.
- 잘라 도관 #10 블레이드 해 현미경을 사용 하 여 길이 5 m m.
참고: 2.4-2.7 m m; 사이 도관의 내부 직경은 외부 직경은 2.5-2.8 m m 사이. - 경도 측면 ( 그림 1A)을 따라 부드럽게 도관을 접어. 0.4 m m 길이 및 적어도 1mm 도관의 구멍에서 떨어져 똑 바른 가장자리 욕실이 위 ( 그림 1B)를 사용 하 여 약 1 m m에 대 한 4 개의 작은 절 개를 잘라.
- 도관 ( 그림 1C)을 전개 하 고 만드는 두 개의 창을 나란히 같은 측면을 따라 두 절 사이 ( 그림 1D)를 잘라. 창문을 열어 하 고 포경을 따라 제대로 닫혀 수.
- 10 cm 배양 접시에서 25 분 75% 에탄올에 도관을 소독. 1 버퍼링 하는 인산 염 (PBS) x 4 분 한 번 도관 린스 하 고 살 균 겸 새로운 10 cm 배양 접시에는 도관 전송. 각 25 분에 대 한 1 x PBS로 두 번 도관 린스.
- 수술까지 1 x PBS에는 도관을 저장.
참고: 많은 도관 수 있다 살 균 되어야 한 번에. 별도 살 균 1.5 mL 원심 분리기 튜브 메 마른 그들을 유지 하는 도관 저장.
- 잘라 도관 #10 블레이드 해 현미경을 사용 하 여 길이 5 m m.
- 녹색 형광 단백질 (GFP)-Schwann 세포 (SC) 준비
- 앞에서 설명한 43에서 성인 여성 피셔의 tibial 신경 정화 사우스 캐롤라이나 문화 쥐를 준비. 이 단계의 완료에 접시에 폴 리-L-리 신 (PLL) SCs-10 cm 배양 접시를 코팅 하 고 유지 하는 d 10/3 M 매체; 이러한 SCs 통로 0으로 정의 됩니다.
참고: d 10/3 M 매체는 다음 구성: 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), 1% 페니실린-스 (펜/strep), 20 µ g/mL 뇌 하 수 체 추출, 2 µ M 산림, Dulbecco에서 2.5 nM heregulin ' s 수정이 글 ' s 매체 (DMEM). - 3 ~ 4 일 마다 신선한 d 10/3 M 매체 (mL/10-7cm 페 트리 접시)와 보충.
- 분할 사우스 캐롤라이나 문화 합류 70-80%에 도달 하면.
- 제거 매체와 행 크와 두 번 린스 ' s 균형 소금물 (HBSS) 칼슘 또는 마그네슘.
- 각 10 cm 배양 접시에 0.25 %trypsin / EDTA의 5 mL을 추가 하 고 실 온 (RT)에서 5 분 동안 품 어.
- Trypsin 무력화 50 mL 원심 분리기 관으로 d 10 매체 (10 %FBS 1% 펜/strep DMEM에)의 5 mL을 추가.
- 부드럽게 피펫으로 트립 신/EDTA 솔루션에는 페 트리 접시 SCs. 제거를 분리 하려면 여러 번 접시에서 세포 현 탁 액 고 그것 원심 분리기 튜브 이전 단계에서 준비 합니다. D 10 매체의 5 mL와 함께 접시를 헹 구 고 셀 수확을 최대화 하기 위해 원심 분리기 튜브에 배치.
- 370 x g 4 o C. 제거는 상쾌한에 5 분 동안에 세포를 원심 및 각 페 트리 접시 분할에 대 한 4 mL d 10/3 M 매체에 셀 resuspend.
- 10 cm 배양 접시에 1 mL의 사우스 캐롤라이나 정지 및 d 10/3 M 매체의 6 mL 분배; 각 페 트리 접시 분할 4 접시 귀 착될 것 이다. 이러한 SCs 통과 1로 정의 됩니다.
- 신선한 d 10/3 M 매체는 하루 도금 후 도금 후 3-4 일 마다 Replenish.
- 한번 SCs 합류 70-80%에 도달, 단계 1.2.3.1 1.2.3.6 반복. SCs는 지금 통로 2.
- 50% 합류 한 번 도달 하는 SCs transduce, GFP d 10/3 M에서 인코딩 lentiviral 벡터와 하룻밤 30의 감염의 다양성에 매체 앞 44 , 45에서 설명한 .
- 다음날과 도금 후 3-4 일 마다 신선한 d 10/3 M 매체와 보충.
- GFP-SCs 70-80% 합류, 도달 단계 1.2.3.1 1.2.3.5 반복 하지만 대신 d 10 매체의 6 mL에 GFP SCs를 resuspend. 1.5 mL 원심 분리기 튜브에 GFP-사우스 캐롤라이나 정지의 15 µ L를 분배 하 고 0.4 %trypan 블루 솔루션의 15 µ L를 추가 합니다. 원심 분리기 튜브를 부드럽게 터치 한 셀 계산 슬라이드의 챔버에 혼합물의 10 µ L를 분배 합니다.
- 슬라이드 자동된 셀 카운터에 놓고 셀 밀도 결정.
- 370 x g 4 o C. 제거는 상쾌한에 5 분 동안에 세포를 원심, 모든 3 x 10 6 GFP 냉동 매체의 1.5 mL와 함께 resuspend-극저온 유리병, 그리고-80에서 동결에 GFP-사우스 캐롤라이나 정지의 1.5 mL 디스 펜스 SCs. o 스토리지에 대 한 액체 질소로 이동 하기 전에 적어도 24 h에 대 한 C.
참고: 동결 매체: DMEM에 25 %FBS 8% 디 메 틸 sulfoxide. - 녹여 GFP-SCs 수술 전에 1 주일.
- 50 mL 원심 분리기 관으로 추가 10 mL D10 매체.
- 녹여 물 목욕에서 37 o C 부분적으로 해 동 때까지 냉동된 GFP SCs 튜브.
- 극저온 유리병에서 GFP SC 현 탁 액을 제거 하 고 1.2.8.1에 50 mL 원심 분리기 튜브에 배치. 부드럽게 피펫으로 솔루션 고 반복적으로 아래로.
- 370 x g 4 o C. 제거는 상쾌한에 5 분 동안에 세포를 원심 및 해 동 각 유리병에 대 한 4 mL d 10/3 M 매체에 셀 resuspend.
- 10 cm 배양 접시에 GFP-사우스 캐롤라이나 정지 및 d 10/3 M 매체의 5 mL 2 mL 분배; 각 유리병 2 접시 초래 한다. GFP-SCs 통과 3로 정의 됩니다.
참고: 10 cm 배양 접시 일반적으로 수익률 약 8 x 10 6 GFP SCs 1 주일 후.
- 수술 당일 단계 1.2.6 반복. 사용 셀 밀도 계산 단계 1.2.10.
- 3 x 10 6 GFP SCs 살 균 1.5 mL 원심 분리기로 디스 펜스 aliquots 튜브 셀 밀도에 따라 단계 1.2.9에서에서 계산. 370 x g 4 o C에서 5 분에 GFP SC aliquots 원심 고는 상쾌한을 제거 합니다. 각 약 수와 원심 분리기에서 370 x g. DMEM/F12 매체의 1 mL을 추가
참고: 각 동물 받는 3 x 10 6 GFP-SCs. 보통 혈 청으로이 단계까지 GFP SCs와 함께 사용 됩니다. - 계속 GFP-SCs 이식의 시간까지 얼음에.
- 앞에서 설명한 43에서 성인 여성 피셔의 tibial 신경 정화 사우스 캐롤라이나 문화 쥐를 준비. 이 단계의 완료에 접시에 폴 리-L-리 신 (PLL) SCs-10 cm 배양 접시를 코팅 하 고 유지 하는 d 10/3 M 매체; 이러한 SCs 통로 0으로 정의 됩니다.
2. 흉부 레벨 8 (T8) Transection 완료
케 타 민 (60 밀리 그램/kg 체중) 및 xylazine (5의 복 주사와- 수술 동물 준비
- Anesthetize 여성 피셔 쥐 (180-200 g) mg/kg 몸 무게)입니다. 발가락을 꼬 집는 것을 선택 하 여 다음 단계로 진행 하기 전에 마 취의 깊이 모니터링 하 고 눈을 깜박이 응답.
- 전기 깎기로 쥐의 뒤를 면도 하 고 70% 에탄올과 피부를 닦아냅니다. 두 눈에 안과 윤 활 유를 적용 합니다. 척추는 접근 하기 쉬운 롤에 약 37 o C. 장소는 동물에서 체온 유지에 생리대에 동물 수술 테이블에 전송.
참고: 롤 종이 타월 이나 살 균 될 수 있는 거 즈에 x2에 2에서 만들 수 있습니다. T7-T9 롤 위에 납작하게 누워 있을 때 더 큰 롤은 것이 좋습니다.
- T9 laminectomy T7
- T9 T11 spinous 프로세스에 대 한 랜드마크를 찾습니다.
참고: T9, T10, T11 사이 격차는 작은 다른 세그먼트에 비해 난n 지역입니다. 롤에 쥐를 놓고, T9 T11 spinous 프로세스는 피부를 통해 작은 삼각형 범프 처럼 느낄 것 이다. - 는 T11에 T4에서 #10 블레이드를 사용 하 여 피부의 4 ~ 5 cm 중간 절 개를 확인 합니다. 지방 부에 무뚝뚝한 끝 곡선가 위 표면 지방 층에 작은 절 개를 만들기.
참고: 악기의 다른 종류는 지방 질을 분리 하에 사용할 수 있지만 무뚝뚝한 끝 곡선된가 위 지방 분리에 대 한 가장 효과적이 고 최소한 침략 적 방법을 사용. - #10 잎의 뒷면을 사용 하 여 T7을 T9 spinous 프로세스를 찾습니다. 무딘 집게로 t 4에 대 한에 근육 누른 T6-T10에서 척추의 각 측면을 따라 근육에 절 개를 확인 합니다. 깨끗 한 오프닝을 만들고 동물에 최소한의 부상의 입을 최대한 척추에 가까운 컷 확인.
- 각 개별 spinous 프로세스 t 7에서 근육과 인 대 사이의 T6와 T7 T7, T8, T8, T9, 절단 하 여 T9와 T9 T10 #10 블레이드와 격리.
- T9에 t 7에서 어떤 근육과 인 대는 하기에 제거 하는 rongeur를 사용 합니다. T7 t 9의 가로 프로세스 사이의 간격 표시 될 때까지 최대한 옆으로 근육과 인 대 제거.
- T9 spinous 프로세스는 rongeur 제거합니다. T8 spinous 프로세스 무딘 집게와 리프트 T9, T10 프로세스 사이의 작은 오프닝에서 T9 lamina 상승를 부드럽게 잡고.
- Lamina 오프닝에서 시작 하 고 t 9에서 rongeur와 rostrally 이동 제거 합니다. 가능한 만큼 많이 옆으로; lamina를 제거 지 뿌리는 laminectomy 후 표시 되어야 합니다.
- 는 lamina 제거 되 면 T8 및 t 7에 대 한 과정을 반복.
참고: laminectomy, 동안를 사용 하 여 흡수 스피어스는 laminectomy 계속 하는 동안 혈액을 제거. 과다 출혈이 발생 하는 경우 압축된 스폰지에 출혈 사이트 놓고 염 혈액 응고에 도움이 추가.
- T9 T11 spinous 프로세스에 대 한 랜드마크를 찾습니다.
- T8에서 transection
- T9에 T7 주위 견인 장소. 모든 하기 제거 되 면 가로 프로세스 사이의 간격 T8에 특히 볼 수 있는지 확인 합니다. 또한 바깥쪽으로 튀어나온 뼈 조각 없습니다 보장 하기 위해 t 9 T7 사이 양쪽에 길이 따라 뼈 검사.
참고: T8에이 격차는 전체 transection 수행 중요 합니다. 길이 따라 척추 쉽게 도관 삽입을 위해 제거 되어야 합니다. - 컷은 등 쪽 그리고 복 부 뿌리 T8 사용 하 여 위아래 각도 봄이 위. 척수에 염 분을 추가 하 고 기다리는 혈액 응고.
참고:이 단계는 적절 한 도관 삽입을 위해 중요 하다. - T8에서 가로 프로세스 사이의 간격 척수 위에 각도 봄이 위 놓고 한 컷 척수를 완전히 끊을 수 있도록. 압축 된 거품의 작은 조각 결과 2-2.5 m m 간격으로 배치 하 고 지역에 식 염 수를 즉시 추가.
- T9에 T7 주위 견인 장소. 모든 하기 제거 되 면 가로 프로세스 사이의 간격 T8에 특히 볼 수 있는지 확인 합니다. 또한 바깥쪽으로 튀어나온 뼈 조각 없습니다 보장 하기 위해 t 9 T7 사이 양쪽에 길이 따라 뼈 검사.
3. 도관 삽입
- 1 x PBS에서 도관 꺼내 hemostasis 도달 절단된 코드 젊고 아름 다운 여자를 기다리는 동안. 얇은 긴 조각으로 흡수 삼각형을 잘라 고 그들 도관 초과 PBS를 제거 합니다. 미리 잘라 창이 열려 확인.
- 염 분을 제거 하 고 혈액 흡수 삼각형의 얇은 긴 조각을 사용 하 여. 좋은 분리를 보장 하는 microspatula를 사용 하 여 척수의 두 젊고 아름 다운 여자를 들어올립니다. 부드럽게 rostral 그 루터 기는 microspatula와 들어올린 자신을 직면 하는 windows와 함께 그 루터 기에 도관을 풀. 전체 그 루터 기를 삽입 하 고 도관에 아무 초과 출혈이 있다. 부드럽게
- 꼬리 밑둥 들어올린 그 루터 기에는 도관의 다른 쪽 끝을 풀. 전체 그 루터 기 삽입 되 고 창 ( 그림 2A) 등 쪽 표면에는 있는지 확인 하십시오.
4. Schwann 세포 / 주 사용 매트릭스 (재료의 표 참조) 준비 및 사출
- hemostasis 도달 절단된 코드를 기다리는 동안 GFP SC 펠 릿 (단계 1.2 준비) 위의 매체를 제거. 차가운 DMEM/F12의 10 µ l에 GFP SCs를 resuspend. 세포 현 탁 액을 감기 주사 젤의 10 µ l을 추가 하 고 반복 pipetting으로 잘 혼합. 도관 삽입 완료 될 때까지 얼음에 GFP-SC/DMEM/F12/주 사용 매트릭스 혼합물을 유지.
- 는 등 쪽 표면에 창문 ( 그림 2A)를 확인 한 후 미리 잘라 창 46 중 하나를 통해 도관에 GFP-SC/DMEM/F12/주 사용 매트릭스 혼합물의 20 µ l 주사 사용 하는 팁과는 micropipette 로드 서쪽 오 점. 사우스 캐롤라이나/DMEM/F12/주 사용 매트릭스 혼합물 도관을 연극 해야, 흡수 삼각형으로 과잉을 제거 합니다. 주사; 후 창 닫기 아니다 봉합 필요 ( 그림 2B).
5. 상처 폐쇄와 수술 후 케어
- 봉합 근육 레이어 및 표면 뚱뚱한 층. 70% 에탄올과 다음 주식 (예를 들어, 상처 클립을 사용 하 여)와 피부를 깨끗 한 피부를 종료. 그들은 식이 되 찾을 때까지 열 레 귤 레이트 인큐베이터에서 동물을 유지. 동물 감 금 소에 다시 전송 합니다. 오래 먹이 튜브 물 제공 하 고 장소 알 약을 음식에 쉬운 접근을 위한 침구.
- 관리 Buprenorphine (0.1 mg/kg 체중) 피하 통증을 줄이기 위해 수술 후 즉시 시작 하는 3 일 동안 하루에 두 번. Gentamycin (5 mg/kg 체중)을 방지 하 고 감염을 줄이기 위해 수술 후 즉시 7 일 동안 하루에 한 번 피하 주사. 10 mL lactated Ringers 솔루션의 수 화에 대 한 일 동안 하루에 두 번 피하 주사.
- 빈 방광 수동으로 두 번 방광까지 하루 함수 반환 합니다. 방광 감염 발생 하는 경우 다음 관리 10 mL의 염 분 피하까지 소변 명확 하 게 된다. 이틀에 개선 경우 주사 gentamycin (5 mg/kg 체중, 하루에 한 번씩) 피하까지 소변 분명해.
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Representative Results
이 수술 기법을 사용 하 여 목표 구조화 된 도관 및 완료 transected 척수에 이식 후 SC 함수를 최대화 하는 주 사용 매트릭스의 사용을 평가 하는 것입니다. 이식 후 3 주 동물 4 %paraformaldehyde 끼얹는다는 고 척추 열 조잡 해 부하 고 다른 24 h에 대 한 동일한 정착 액에 고정. 척수 후 해 부 고 cryostat 화살 섹션에 대 한 샘플은 cryoprotection에 대 한 30% 자당 해결책으로 됩니다. 1 m m 두께 횡단 해 부 척수의 또 다른 세트의 SC 다리의 중간에서 절연 플라스틱 섹션에 대 한 처리도 정착 액에 배치 됩니다. 샘플 전자 현미경 준비 베이츠 외. 여 자세한 일정을 복종 된다 47. cryostat 화살 섹션은 immunostained GFP, 폐해 fibrillary 산 성 단백질 (GFAP)에 대 한 1 차적인 항 체와 무거운 체인 neurofilament (RT97), 및 뒤에 2 차 항 체를 포함 한 중간 체인 neurofilament (NF) 염소-안티-닭-488, 염소-안티-토끼-546, 염소-안티-마우스-647, 및 염소-안티-토끼 647, 각각. GFP SCs 따라와 도관 (그림 3A, 노란색 선으로 표시 하는 내부 벽) 내에서 균등 하 게 배포 했다. 축 삭 재생 (그림 3B)를 관찰 하 고 GFP-SCs (그림 3A 와 그림 3C)의 존재와 밀접 하 게 관련 나타내는이 기술을 제공 하는 사우스 캐롤라이나 다리 구조적된 도관 내에 성공 rostral와 꼬리 등 걸 사이 다리를 따라 축 삭 재생 추진. 혈관 및 myelinated 축 삭 또한 SC 다리 (그림 3D)의 중심에서 발견 됐다. 우리의 최근 게시 작품31에서 축 삭 재생에 electrospun PVDF TrFE 섬유 도관으로 SCs의 효과의 더 자세한 정보를 찾을 수 있습니다.
포함 한 다른 결과 조치를 수행할 수 있습니다: 라인-transect-설명 하는 방법을 우리의 최근 작품31 에 의해 화살 섹션에서 축 삭 재생을 측정 하 고 myelinated 축 삭 및 플라스틱 횡단면에서 혈관의 수를 측정. 샘플 준비를 플라스틱 섹션 unmyelinated 축 삭의 수를 계량 전송 전자 현미경 검사 법에 대 한 추가 구분 될 수 있다. Cryoprotected 척수 샘플 수 대신 cross-sectioned sagittally 구분 및 계량 GFP의 존재와 축 삭 재생을 immunostained-적절 한 간격 동안 동물에 SCs. 행동 테스트를 수행할 수 있습니다 동물 유지 되 고 있다.
그림 1: 창 준비 도관에. 5mm 도관 (A)의 세로 축 따라 한쪽을 접어. 0.4 m m 긴 도관 (B)의 구멍에서 최소 1 mm에 대 한 4 개의 절 개를 잘라. 각 절은 약 1 m m 떨어져. 도관을 전개 하 여 4 병렬 상처 (C) 관찰 된다. 플랩 들어올려 열 수 있는 창을 만들 수 rostral 꼬리 축 두 절 사이 잘라. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: SC/DMEM/F12/매트릭스 주입 후 창 닫기. 윈도 rostral와 꼬리 젊고 아름 다운 여자 (A) 사이 도관을 삽입 후 각 플랩 다시 접는 열립니다. 창 주사 (B) 후 폐쇄 됩니다. 눈금 막대 = 1 m m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 화살 섹션의 Confocal 형광 이미지와 척수에 GFP SCs와 이식에서 플라스틱 횡단면의 밝은 필드 이미지 정렬 섬유 PVDF TrFE 도관. 도관 내부 벽 GFP에 대 한 노란색 선과 immunostained로 표시 됩니다 및 폐해 fibrillary 산 성 단백질 (GFAP) 시각화를 이식 SCs와 호스트 척수 이다, 각각 내 SC 다리의 개요. 재생성 된 축 삭 RT97으로 표시 했다 (무거운 체인 neurofilament) (A, B)와 (NF, C) 중간 체인 neurofilament 항 체. 축 삭 (A)에 표시 되지 않습니다 GFP-SCs 중간 도관 지역 (C)에서 더 높은 확대와 함께 관찰은 그들의 가까운 협회 때문. Confocal 현미경 검사 법에 의해 이미징 때 축 삭 rostral 유세 조직 단면도의 깊이에서 불완전 검사 때문에 표시 되지 않습니다. 혈관 ( d에서v로 표시)과 myelinated 축 삭 ( d에서MA로 표시) 둘 다 플라스틱 섹션에서 중간 도관 지역에서 관찰 되었다. 배율 및 배율 바: A, B (10 배, 200 µ m); C x, 100 µ m (20); D (63 x, 25 µ m)입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
효과적인 transection 모델을 만드는 가장 중요 한 단계는 하나 또는 두 개의 상처에서 척수 절단은. Rostral와 꼬리 척수 젊고 아름 다운 여자 사이 2-2.5 m m 간격 transection 사이트에 존재 해야 합니다. 나타나지 않는 이러한 격차에 대 한 세 가지 가능성이 가장 높은 이유는 (1) 등/복 부 뿌리 제대로 제거 되지 않은, (2) 복 부 두 라 적절 하 게, 제거 되지 않았습니다 및 (3) 동물 그녀 아래 배치 롤에 제대로 위치 하지 했다.
젊고 아름 다운 여자 사이 효과적인 도관 삽입을 수행 하려면: 특정 종과; 실험에 사용 된 동물의 나이 맞출 도관의 (1) 직경 (2) 하기 가로 프로세스 사이의 격차를 구상 될 수 있다; 때까지 옆으로 충분히 제거 되어야 합니다. (3) 뿌리를 제거 해야 하 고 첫 번째 시도에 젊고 아름 다운 여자 사이 (4) 도관 삽입을 달성 한다. 여러 시도 필요한 경우,이 젊고 아름 다운 여자, 더는 젊고 아름 다운 여자 사이 도관 삽입 작업을 복잡 하 게 하 고 추가 부상을 일으키는 부 종을 일으킬 수 있습니다.
도관에 효과적인 GFP-SC/DMEM/F12/주 사용 매트릭스 도입을 수행 하려면 확인: (1) 척수는 젊고 아름 다운 여자 사이 도관 삽입 전에 출혈 하지는. 경우 액체 도관에는 젊고 아름 다운 여자 사이 삽입 후, 흡수 스피어의 작은 조각을 사용 하 여 미리 잘라 창을 통해 그것을 제거 하. (2) 확인 도관은 미 끄 러 두 척수 젊고 아름 다운 여자에 잘 그리고 (3) 지 미리 잘라 창이 열려 있습니다. SC/주 사용 매트릭스 혼합물의 20 µ l의 주입 도관을 채우기 위해 충분 한 이상 있어야 합니다. 미리 잘라 윈도에서 오버플로 효과적인 이식에 대 한 좋은 계기 이다.
이 절차의 한계: 경질의 (1) 복원, 도관/SC의 운동 (2) 제어 이식 수술, 및 (3) 완료 후 대체 방법 SC/주 사용 매트릭스 혼합물을 주입 하는 동안 누설 경우.
이 절차의 장점은 주사 매트릭스 모두 구조적된 도관의 사용의 조합입니다. 젊고 아름 다운 여자는 삽입 하 고 선택의 물자로 만든 모든 도관이 수술에 사용할 수 있습니다. 선택의 어떤 주사 매트릭스;이 절차에서 사용할 수 있습니다. 온도 민감한 젤은 젤 라와 원활한 인터페이스를 만드는 그 루터 기의 모양에 윤곽선의 능력 때문이 바람직합니다. 더 복잡 한 내부 구조와 도관 빈 인테리어 대신 사용할 수 있습니다. 마약, 성장 인자, 작은 분자 또는 세포 구조 도관 주사 매트릭스 또는 이식 생존을 향상, 부상 직후 신경 보호, 염증을 줄이고, 축 삭을 홍보에 포함 될 수 있습니다. 재생, 신생을 촉진 하는 고.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
우리 감사 드리고 싶습니다 바이러스 성 벡터와 동물 코어 치료 마비에 마이애미 프로젝트에서 각각 lenti GFP 바이러스 및 제공 동물 관리, 생산 및 조직학 및 이미징 코어 cryostat, confocal 현미경의 사용에 대 한 고 스테레오 탐정 형광 현미경입니다. 자금 NINDS (09923), 국방부 (W81XWH-14-1-0482), NSF (DMR-1006510)에 의해 제공 했다. M.B. Bunge는 크리스틴 E 린 저명한 교수의 신경 과학 이다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cryogenic vials | ThermoFisher Scientific | 5000-0020 | |
| 10 cm Petri dish | VWR | 25382-428 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium: nutrient mixture F-12 | ThermoFisher Scientific | 11039-021 | "DMEM/F12" in protocol. |
| Penicillin-streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140-122 | "Pen/Strep" in protcol. |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH300-70-03 | "FBS" in protocol. |
| Pituitary extract | Biomedical Technologies | BT-215 | |
| Forskolin | Sigma-Aldrich | F6886 | |
| Heregulin | R&D Systems | 396-HB/CF | |
| Poly L-lysine | Sigma-Aldrich | P2636 | "PLL" in protocol. |
| Dulbecco's modified Eagle's medium | ThermoFisher Scientific | 11965-092 | "DMEM" in protocol. |
| Hank's balanced salt solution | ThermoFisher Scientific | 14170-112 | "HBSS" in protocol. |
| Tryspin-EDTA | ThermoFisher Scientific | 15400-054 | |
| Female Fischer rat (160-180g) | Envigo | ||
| Vannas scissor, straight | FST | 15018-10 | |
| Ketamine | Vedco Inc | 5098976106 | 100 mg/ml |
| Xylazine | Lloyd Inc | AnaSed | 20 mg/ml |
| Gentamycin | APP Pharmaceuticals | NDC 63323-010-02 | Can be any brand of choice. |
| Micro Spatula | FST | 10089-11 | Can be any brand of choice. |
| Curved scissors with blunt end | FST | 14017-18 | Can be any brand of choice. |
| Blunt forceps | FST | 11006-12 | Can be any brand of choice. |
| rongeur | FST | 16121-14 | Can be any brand of choice. |
| Angled spring scissors | FST | 15006-09 | Can be any brand of choice. |
| Absorption triangles | FST | 18105-03 | Can be any brand of choice. |
| Gelfoam | Henry Schein | 9083300 | "Compressed foam" in protocol. |
| #10 blades | Sklar | 06-3010 | Can be any brand of choice. |
| Matrigel | Corning | 354234 | "Injectable matrix" in protocol. |
| Chicken anti-green fluorescent protein antibody | Millipore | AB16901 | |
| Mouse RT97 hybridoma antibody | DSHB | RT97 | |
| Rabbit anti-neurofilament antibody | Encor Biotechnology, Inc | PRCA-NF-H | |
| Polyclonal Rabbit anti-Glial Fibrillary Acidic Protein antibody | Dako | Z033401 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-chicken IgG (H+L) | ThermoFisher Scientific | A-11039 | |
| Alexa Fluor 546 goat anti-rabbit IgG (H+L) | ThermoFisher Scientific | A-11035 | |
| Alexa Fluor 647 goat anti-rabbit IgG (H+L) | ThermoFisher Scientific | A-21244 | |
| Alexa Fluor 647 goat anti-mouse IgG (H+L) | ThermoFisher Scientific | A-21236 | |
| Confocal Microscopy | Nikon | clsi |
References
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