Summary
Este artículo describe una técnica para insertar un tubo hueco entre los tocones de la médula espinal después de la transección completa y se llenan de células de Schwann (SCs) y matriz inyectable la membrana del sótano para salvar y promover la regeneración del axón a través de la brecha.
Abstract
Entre los distintos modelos de lesión de la médula espinal en ratas, el modelo de la contusión se utiliza lo más a menudo porque es el tipo más común de lesión de la médula espinal humana. El modelo de transección completa, aunque no clínicamente relevantes como el modelo de contusión, es el método más riguroso para evaluar la regeneración del axón. En el modelo de contusión, es difícil distinguir de axones germinados o ahorrados debido a la presencia de remanente post lesión de tejido regenerado. En el modelo transection completo, un método de adaptación es necesario para llenar la brecha y crear continuidad de la rostral a los caudales muñones para evaluar la eficacia de los tratamientos. Una cirugía de puente confiable es esencial para poner a prueba las medidas de resultado reduciendo la variabilidad debido al método quirúrgico. Los protocolos descritos aquí se utilizan para preparar a Schwann las células (SCs) y conductos antes del trasplante, transección completa de la médula espinal a nivel torácico 8 (T8), inserte el conducto y trasplante del SCs en el conducto. Este enfoque también utiliza en situ de gelificación de una matriz de membrana del sótano inyectable con el trasplante de SC que permite el crecimiento del axón mejor a través de las interfaces rostrales y caudales con el tejido del anfitrión.
Introduction
Reparación de lesión de la médula espinal es un problema complejo y difícil que requiere una estrategia de tratamiento combinatoria que involucran, por ejemplo, el uso de células y un biomaterial para proporcionar un microambiente favorable para la función de las células trasplantadas y axon regeneración en el sitio de la lesión. Hemisección1,2,3,4,5,6,7,8,9 y transección completa10 ,11,12,13,14,15,16,17,18,19 ,20,21,22 modelos se utilizan con frecuencia para evaluar los efectos de terapias puente basadas en biomateriales. La ventaja de utilizar un modelo de Hemisección es que proporciona más estabilidad para la construcción de puente en comparación con el transection completo. Sin embargo, en modelos de Hemisección, es difícil probar la regeneración del axón como un resultado del método terapéutico aplicado debido a la presencia de tejido ahorrado. El modelo del transection completo es el método más riguroso para demostrar la regeneración del axón.
Se han estudiado diversos materiales naturales y sintéticos para el uso como un gel inyectable, gel formado colocan en contusión o Hemisección modelos, o como un medio estructurado en Hemisección o completar modelos de corte transversal (detallados en los comentarios23 , 24 , 25). in situ gelificación de una mezcla de matriz/SC inyectable crea una interfaz más permisiva entre el trasplante y el cable host axon travesía26,27 comparado con implantes pregelados matriz/SC 5 , 18 , 19 , 28. in situ gelificante permite la matriz de contorno alrededor de las interfaces de host irregulares mientras que un tubo más rígido y más estructurado o un gel menos moldeable de formado no podría. Un conducto estructurado a menudo proporciona estabilidad contacto de guía y el implante en contraste con una matriz inyectable. Los protocolos aquí presentados describen un procedimiento quirúrgico que se aprovecha de una matriz inyectable la membrana del sótano (p. ej., matrigel, vea la Tabla de materiales, que se refiere como inyectable matriz aquí) y un conducto estructurado a evaluar la regeneración del axón en el más riguroso modelo de lesión de la médula espinal.
Electrospun poly-vinylidenedifluoride-trifluoroethylene (PVDF-TrFE) se utilizan conductos huecos fibrosos alineados en nuestro abordaje experimental. PVDF-TrFE es un polímero piezoeléctrico que genera una carga transitoria cuando se deforma mecánicamente y se ha demostrado para promover la regeneración de extensión y axon neurita en vitro29,30 y vivo en 31. Electrospinning es un método común de fabricación de andamio que puede producir rápidamente andamios fibrosos confiables usando una variedad de polímeros con propiedades controlables tales como la alineación de la fibra, fibra diámetro y espesor del andamio para 33,de32,34de nervios y otras aplicaciones.
Numerosos estudios de SCs trasplantados en sitios de lesión de médula espinal de rata han demostrado tratamiento eficacia5,9,18,19,20,21 ,26. Estos trasplantes son neuroprotectores para el tejido que rodea la lesión, reducir el tamaño de la cavidad de lesión y promueve la regeneración del axón en el sitio de trasplante de lesión y la mielinización de los axones regenerados. SCs humanos pueden trasplantarse autologously, una ventaja en comparación con otras neuronales relacionadas con las células24. Después de una biopsia de nervio periférico, SCs pueden ser aislados y purificados y se proliferan a la cantidad deseada para el trasplante en seres humanos. Trasplante autólogo de SC para pacientes lesionados medulares ha demostrado para ser seguro en Irán35,36,37,38, China39,40y el Estados Unidos41,42. SCs se conocen secretan numerosos factores neurotróficos y matriz extracelular proteínas importantes para el crecimiento del axón y juegan un papel esencial en la regeneración del axón después de lesión de nervio periférico. Nuestro objetivo aquí es describir los métodos que pueden investigar diseños de conducto para mejorar los resultados del trasplante de la SC en un modelo de corte transversal de médula espinal de ratas completa.
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Protocol
ratas Fischer adulto (peso 180-200 g) se encuentran directrices NIH y del USDA. El Animal cuidado institucional y el Comité uso (IACUC) de la Universidad de Miami aprobaron todos los procedimientos animales.
1. preparación de pre-trasplante
- preparación de conducto.
- Corta el conducto a 5 mm de longitud con una cuchilla #10 con un microscopio de disección.
Nota: El diámetro interno del conducto está entre 2.4-2.7 m; el diámetro exterior es de entre 2.5-2.8 mm. - Pliegue el conducto suavemente a lo largo del lado longitudinal ( figura 1A). Corte cuatro pequeñas incisiones sobre 0,4 mm de largo y 1 mm, como mínimo, de las aberturas del conducto y cerca de 1 milímetro aparte utilizando el canto recto tijeras de Vannas ( figura 1B).
- Desplegar el conducto ( figura 1) y cortar entre dos incisiones a lo largo del mismo lado, creando dos ventanas lado por lado ( figura 1). Asegúrese de que el windows puede abrir y cerrar correctamente a lo largo de la parte sin cortar.
- Esterilizar los conductos en etanol al 75% durante 25 minutos en un plato de Petri de 10 cm. Enjuague los conductos una vez durante 4 minutos con 1 x de tampón fosfato salino (PBS) y los conductos de transferencia con pinzas estériles una nueva placa de Petri de 10 cm. Enjuague las conductas dos veces con PBS 1 x durante 25 minutos.
- Almacenar los conductos en PBS 1 x hasta cirugía.
Nota: Muchos conductos se pueden esterilizar a la vez. Almacenar los conductos en tubos de centrífuga estériles separadas 1,5 mL para mantenerlos estériles.
- Corta el conducto a 5 mm de longitud con una cuchilla #10 con un microscopio de disección.
- Verde proteína fluorescente (GFP)-preparación de la célula de Schwann (SC)
- preparar purificadas culturas SC de los nervios tibiales de Fischer hembra adulta ratas como se describió anteriormente 43. Una vez terminado este paso, la placa del SCs en poly-L-lisina (PLL)-cubierto de Petri de 10 cm y mantener en medio de la D10 / 3M; Estos CS se definen como paso 0.
Nota: D10 / 3M medio se compone de los siguientes: 10% suero bovino fetal (FBS), 1% de penicilina-estreptomicina (pen/strep), 20 pituitaria μg/mL del extracto, 2 μm forskoline, 2,5 nM heregulin en Dulbecco ' s modificado Eagle ' medio s (DMEM). - Reponer con medio fresco de D10 / 3M (7 mL/10 cm plato de Petri) cada 3 a 4 días.
- Cultura de Split SC una vez que alcanza el 70-80% de confluencia.
- Medio de Quite y enjuague dos veces con Hank ' s equilibrada solución de sal (HBSS) sin calcio ni magnesio.
- Añadir 5 mL de 0.25% tripsina/EDTA a cada plato de Petri de 10 cm e incubar 5 min a temperatura ambiente (RT).
- Añadir 5 mL de medio de D10 (10% FBS y 1% pluma/strep en DMEM) en un tubo de centrífuga de 50 mL para neutralizar la tripsina.
- Suavemente la pipeta la tripsina/EDTA solución en el Petri plato varias veces para separar SCs. quitar la suspensión de la célula del plato y lo coloca en el tubo de centrífuga preparado en el paso anterior. Enjuagar el plato con 5 mL de medio de D10 y colóquelo en el tubo de la centrífuga para maximizar la cosecha celular.
- Centrifugar las células a 370 x g durante 5 minutos a 4 o C. Retire el sobrenadante y resuspender las células en medio de D10/3 M de 4 mL por cada caja de Petri dividida.
- Dispense 1 mL de la suspensión de la SC y 6 mL de medio de D10 / 3M en un plato de Petri de 10 cm, cada plato de Petri dividida resultará en 4 placas de Petri. Estos CS se definición como el paso 1.
- Replenish con medio fresco de D10 / 3M el día después de placas y cada 3-4 días después de la galjanoplastia.
- Una vez el SCs alcanzar 70-80% de confluencia, repita los pasos 1.2.3.1 a 1.2.3.6. El SCs están ahora en el paso 2.
- Transduce el SCs una vez llegando a la confluencia del 50%, con un vector lentivirales codificación GFP en D10 / 3M mediano durante la noche en una multiplicidad de infección de 30 como describió anteriormente 44 , 45 .
- Reponer con medio fresco de D10 / 3M al día siguiente y cada 3-4 días después de la galjanoplastia.
- Una vez que la GFP-SCs alcanzar 70-80% de confluencia, repita los pasos 1.2.3.1 a 1.2.3.5 pero Resuspender el GFP-SCs en 6 mL de medio de D10 en su lugar. Dispensar 15 μl de la suspensión de la GFP-SC en un tubo de centrífuga de 1.5 mL y añadir 15 μl de solución de azul de tripano 0.4%. Mueva suavemente el tubo de centrífuga y dispensar 10 μl de la mezcla en una cámara del portaobjetos de conteo de células.
- Coloque el portaobjetos en un contador de células automatizado y determinar la densidad celular.
- Centrifugar las células a 370 x g durante 5 minutos a 4 o C. Retire el sobrenadante, resuspender con 1,5 mL de medio de congelación para cada 3 x 10 6 GFP-SCs. Dispense 1,5 mL de GFP-SC suspensión en un vial criogénico y congelar a -80 o C por al menos 24 h antes de pasar a nitrógeno líquido para el almacenamiento de.
Nota: Medio de congelación: 25% FBS y 8% Dimetil sulfóxido en DMEM. - SCs de GFP descongelar una semana antes de la cirugía.
- Medio de añadir 10 mL D10 en un tubo de centrífuga de 50 mL.
- Deshielo frascos de congelados GFP-SCs en baño de agua a 37 o C hasta descongelado parcialmente.
- Quitar la suspensión de la GFP-SC del frasco criogénico y colóquelo en el tubo de centrífuga de 50 mL en 1.2.8.1. Pipetee suavemente la solución arriba y abajo varias veces.
- Centrifugar las células a 370 x g durante 5 minutos a 4 o C. Retire el sobrenadante y resuspender las células en medio de D10/3 M 4 mL de cada vial descongelado.
- Añada 2 mL de la suspensión de la GFP-SC y 5 mL de medio de D10 / 3M en un plato de Petri de 10 cm, cada frasco debe resultar en 2 placas de Petri. El GFP-SCs se definen como el paso 3.
Nota: Un plato de Petri de 10 cm generalmente produce alrededor de 8 x 10 6 GFP-SCs después de una semana.
- En el día de la cirugía, repita el paso 1.2.6. Uso de la densidad celular se calcula en el paso 1.2.10.
- Dispensar alícuotas de 3 x 10 6 GFP-SCs en centrífuga de 1,5 mL estéril tubos basados en la densidad celular se calculan de paso 1.2.9. Centrifugue las alícuotas de GFP-SC 370 x g durante 5 min a 4 o C y eliminar el sobrenadante. Añadir 1 mL de medio DMEM/F12 para cada alícuota y centrifugar a x 370 g.
Nota: Cada animal recibe 3 x 10 6 GFP-SCs. medio con suero se utiliza con GFP-SCs hasta este paso. - Mantener GFP-SCs en hielo hasta el momento del trasplante.
- preparar purificadas culturas SC de los nervios tibiales de Fischer hembra adulta ratas como se describió anteriormente 43. Una vez terminado este paso, la placa del SCs en poly-L-lisina (PLL)-cubierto de Petri de 10 cm y mantener en medio de la D10 / 3M; Estos CS se definen como paso 0.
2. Completar la transección a nivel torácico 8 (T8)
- Animal preparación para la cirugía
- Anesthetize Fischer hembra rata (180-200 g) con una inyección intraperitoneal de ketamina (60 mg/kg de peso corporal) y xilacina (5 mg/kg de peso corporal). Controlar la profundidad de la anestesia antes de proceder al siguiente paso marcando dedos pellizcando y ojo parpadeantes respuestas.
- Afeitar la parte posterior de la rata con una maquinilla eléctrica y limpie la piel con etanol al 70%. Aplicar lubricante oftálmico en ambos ojos. Traslado del animal a la mesa de cirugía en un cojín de calefacción para mantener la temperatura corporal en unos 37 o C. lugar el animal en un rollo así las vértebras son fáciles de acceso.
Nota: Es posible el rollo de toalla de papel o 2 en x2 en una gasa que puede ser esterilizada. Rollos más grandes se recomiendan T7-T9 tiene que colocarse plana sobre el rollo de.
- T7 a T9 laminectomía
- localizar el punto de referencia para los procesos espinosos de T9-T11.
Nota: Las diferencias entre T9, T10 y T11 son pequeños en comparación con otros segmentosn la región. Después de colocar la rata en el rodillo, apófisis espinosas T9-T11 se sentirá como una pequeña protuberancia triangular a través de la piel. - Hacer una incisión de línea media de 4 a 5 cm de la piel con una cuchilla #10 de T4 a T11. Hacer una pequeña incisión en la capa grasa superficial con tijeras curvas con extremos embotados para disecar la grasa.
Nota: Otros tipos de instrumentos se pueden utilizar para separar la grasa pero tijeras curvadas con extremos embotados habilitar el método más eficaz y menos invasivo para la separación de grasa. - Localizar la T7 a T9 apófisis mediante la parte posterior de la cuchilla #10. Mantener el músculo en sobre T4 con fórceps romos y hacer una incisión en el músculo a lo largo de cada lado de las vértebras desde T6-T10. Hacer el corte cerca de las vértebras para hacer una apertura limpia y causar lesión mínima a los animales.
- Aislar cada individuo apófisis de T7 a T9 cortando los músculos y ligamentos entre T6 y T7, T7, T8, T8, T9 y T9 y T10 con una cuchilla #10.
- Utilizar una pinza para quitar cualquier músculo y los ligamentos en las láminas de T7 a T9. Quitar los músculos y ligamentos lateralmente como sea posible hasta que las diferencias entre los procesos transversales de T7 a T9 visibles.
- Quitar el T9 del proceso espinoso con una gubia. Mantener el proceso espinoso de T8 con fórceps romos y levantar suavemente para elevar la lámina de T9 a la pequeña abertura entre los procesos T9 y T10.
- Quitar la lámina a partir de la apertura y hacia rostral con una gubia en T9. Retire la lámina lateralmente tanto como sea posible; las raíces dorsales deben ser visibles después de la laminectomía.
- Una vez retirada la lámina, repita el proceso para T8 y T7.
Nota: Durante la laminectomía, utilizar lanzas de absorción para eliminar sangre mientras continúa con la laminectomía. Si se presenta un exceso de sangrado, coloque una esponja comprimida en el sitio de sangrado y añada solución salina para ayudar a la coagulación de la sangre.
- localizar el punto de referencia para los procesos espinosos de T9-T11.
- Corte transversal de T8
- colocar el retractor alrededor de T7 a T9. Una vez que las láminas se retiran, asegúrese de que las brechas entre las apófisis transversas son visibles, especialmente en T8. También examinar los huesos a lo largo de la longitud en ambos lados entre T7 a T9 para no hay ningún fragmento de hueso que sobresale hacia el exterior.
Nota: Esta brecha en T8 es importante para realizar la transección completa. Deben eliminarse las vértebras a lo largo de la longitud para facilitar la inserción conducto. - Cortar el dorsal y raíces ventrales por encima y por debajo de T8 utilizando tijeras de primavera en ángulo. Añada solución salina a la médula espinal y esperar a que la sangre al coágulo.
Nota: este paso es importante para la inserción del conducto apropiado. - Colocar las tijeras del resorte angular por encima de la médula espinal en el espacio entre las apófisis transversas en T8 y hacer un corte para separar completamente la médula espinal. Coloque un pedazo pequeño de espuma comprimida en el espacio de 2-2.5 mm resultante y agregar inmediatamente solución salina a la zona.
- colocar el retractor alrededor de T7 a T9. Una vez que las láminas se retiran, asegúrese de que las brechas entre las apófisis transversas son visibles, especialmente en T8. También examinar los huesos a lo largo de la longitud en ambos lados entre T7 a T9 para no hay ningún fragmento de hueso que sobresale hacia el exterior.
3. Inserción del conducto
- espera de los tocones de cable cortado alcanzar la hemostasia, sacar un conducto de 1 x PBS. Trocear los triángulos de absorción fino largo y colóquelas en el conducto para eliminar el exceso PBS. Compruebe que las ventanas cortadas abiertas.
- Eliminar la solución salina y con finas piezas largas de triángulos de absorción de la sangre. Levante los dos tocones de médula espinal usando un microspatula para asegurar buena separación. Suavemente Levante la cepa rostral con el microspatula y deslice el conducto sobre el tocón con las ventanas frente a sí mismo. Garantizar que se introduce el muñón todo y no hay sangrado excesivo en el conducto.
- Suavemente el muñón caudal de Levante y deslice el otro extremo del conducto sobre el tocón. Asegúrese de que la cepa entera se inserta y las ventanas están en la superficie dorsal ( figura 2A).
4. Célula de Schwann / matriz inyectable (véase tabla de materiales) preparación e inyección
- esperando el cable cortado alcanzar la hemostasia, quitarlo del medio por encima de la pelotilla de GFP-SC (preparado en el paso 1.2). Resuspender el GFP-SCs en 10 μl de DMEM/F12 frío. Añadir 10 μl de frío gel inyectable a la suspensión de células y mezclar bien repite el pipeteo. Mantener la mezcla de matriz de GFP-SC DMEM/F12/inyectable en hielo hasta que se termine la inserción del conducto.
- Después de asegurarse que las ventanas en la superficie dorsal son abiertos ( figura 2A), inyectar 20 μl de la mezcla de matriz de GFP-SC DMEM/F12/inyectable en el conducto a través de uno de los windows corta 46 usando un inmunoblot carga de punta y una micropipeta. Si la mezcla de matriz SC DMEM/F12/inyectable debe sobrellenar el conducto, retirar el exceso con triángulos de absorción. Cerrar las ventanas después de la inyección; la sutura no es necesaria ( figura 2B).
5. Cierre y cuidados postoperatorios de la herida
- sutura del músculo capas y las capas de grasa superficiales. Limpiar la piel con etanol al 70% y luego grapa (por ejemplo, usando los clips de la herida) cierre de la piel. Mantener los animales en una incubadora térmicamente regulada hasta que recupere la conciencia. Transferencia de los animales en las jaulas. Suministrar agua con un tubo de alimentación a largo y colocar bolitas de comida en la ropa de cama para fácil acceso.
- Administrar buprenorfina (0.1 mg/kg de peso corporal) dos veces al día durante 3 días por vía subcutánea a partir inmediatamente después de la cirugía para reducir el dolor. Inyecte gentamicina (5 mg/kg de peso corporal) por vía subcutánea una vez al día por 7 días inmediatamente después de la cirugía para prevenir y reducir la infección. Inyectar 10 mL de solución de timbres entibiada por vía subcutánea dos veces al día por 7 días de hidratación.
- Vacío vejigas manualmente dos veces al día hasta vejiga función devuelve. Si se produce infección de la vejiga, luego administrar solución salina 10 mL por vía subcutánea hasta que la orina se vuelve claro. Si no mejora en dos días, inyecte gentamicina (5 mg/kg de peso corporal, una vez al día) por vía subcutánea hasta que la orina se vuelve clara.
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Representative Results
El objetivo de la utilización de esta técnica quirúrgica es evaluar el uso de un tubo estructurado y matriz inyectable que maximiza la función SC después del trasplante en cuerdas de espinal transected terminados. Tres semanas después del trasplante, los animales son perfundidos con paraformaldehído al 4% y las columnas vertebral son groseramente disecadas y fijo en el mismo fijador por otro 24 h. Luego se diseca la médula espinal y las muestras para las secciones sagitales criostato se colocan en una solución de sacarosa de 30% para crioprotección. 1 mm espesor secciones aisladas desde el centro del puente SC de otro conjunto de médulas espinales disecadas se colocan en fijador de glutaraldehido para procesar las secciones plástica. Las muestras se someten a un programa para la preparación microscópica electrónica según lo detallado por Bates et al. 47. secciones sagitales criostato immunostained con anticuerpo primario contra GFP, proteína ácida fibrilosa glial (GFAP), neurofilamentos de cadena pesada (RT97) y neurofilamentos de cadena media (NF) seguido por los anticuerpos secundarios incluyendo cabra-anti-pollo-488, cabra-anti-conejo-546, cabra-anti-mouse-647 y cabra anti-conejo-647, respectivamente. GFP-SCs fueron distribuidos uniformemente a lo largo y dentro del conducto (Figura 3A; paredes internas indicadas por líneas amarillas). Regeneración del axón se observa (figura 3B) y está estrechamente relacionada con la presencia de GFP-SCs (Figura 3A y figura 3) que indica que esta técnica es exitosa en la prestación de un puente de SC dentro de un conducto estructurado y en promover la regeneración del axón en el puente entre los tocones rostrales y caudales. Los vasos sanguíneos y los axones myelinated también fueron encontrados en el centro del puente SC (figura 3D). En nuestro reciente trabajo publicado31encontrará más detalles sobre el efecto de SCs con electrospun PVDF-TrFE conductos fibrosos en la regeneración del axón.
Otras medidas de resultado se pueden realizar como: cuantificación de la regeneración del axón en secciones sagitales mediante método de transectos línea descrito en nuestro reciente trabajo31 y cuantificar el número de axones myelinated y vasos de plástico de las secciones transversales. Muestras preparadas para secciones de plástico pueden ser seccionadas más microscopía electrónica de transmisión cuantificar el número de axones unmyelinated. La cryoprotected de la médula espinal las muestras también pueden ser sección en vez de sagittally seccionadas y immunostained para cuantificar la regeneración del axón y la presencia de GFP-SCs. pruebas de comportamiento también se pueden realizar sobre los animales a intervalos apropiados mientras se mantienen los animales.
Figura 1: preparación de ventana en el conducto. Doblar un lado sobre el eje longitudinal del conducto 5 mm (A). Corte cuatro incisiones de 0,4 mm de largo y 1 mm, como mínimo, de las aberturas del conducto (B). Cada incisión es cerca de 1 milímetro de separación. Por desplegar el conducto, los 4 cortes paralelos se observan (C). Corte entre las dos incisiones en el rostral caudal eje para crear una ventana que puede abrirse al levantar el colgajo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: cierre de la ventana después de la inyección SC y DMEM/F12/matrix. Windows se abren doblando hacia atrás cada aleta después de colocar el conducto entre tocones rostrales y caudales (A). Las ventanas son cerradas después de la inyección (B). Barra de escala = 1 mm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: imágenes fluorescentes confocales de secciones sagitales y una imagen de campo claro de sección plástico de médulas espinales transplantados con GFP-SCs en alineados conductos fibrosos de PVDF-TrFE. Resumen del puente SC dentro de los conductos en las paredes interiores están indicadas por las líneas amarillas y immunostained para GFP y la proteína ácida fibrilosa glial (GFAP) para visualizar trasplantados SCs y anfitrión de la médula espinal astrocitos, respectivamente. Axones regenerados fueron etiquetadas con RT97 (neurofilamentos de cadena pesada) (A, B) y anticuerpos de cadena media neurofilament (NF, C). Axones no son tan visibles en (A) debido a su estrecha asociación con GFP-SCs como se observa en la región media del conducto en (C) con aumento mayor. Axones no son visibles en el tocón rostral debido a la incompleta exploración en la profundidad de la sección del tejido cuando la proyección de imagen por microscopía confocal. Los vasos sanguíneos (con v en D) y axones mielinizados (con MA en la D) se observaron en la región media del conducto en una pieza de plástico. Ampliaciones y barras de escala: A, B (10 x 200 μm); C (20 x 100 μm); D (63 x 25 μm). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
El paso más crítico en la creación de un modelo de corte transversal eficaz es cortar la médula espinal en uno o dos cortes. Un 2-2.5 mm de espacio entre los tocones rostral y caudal de la médula espinal debe estar presente en el sitio de transección. Las tres razones más probables para tal espacio no aparece son (1) las raíces dorsal/ventral no se limpiaron adecuadamente, (2) la dura ventral no se elimina adecuadamente, o (3) el animal no fue colocado correctamente sobre el rodillo colocado debajo de ella.
Para realizar una inserción eficaz conducto entre las cepas: el (1) diámetro de la tubería portacables se debe adaptar para la especie y edad de los animales utilizados en el experimento; (2) láminas deben extraerse lateralmente lo suficiente hasta que se puede visualizar el espacio entre las apófisis transversas; (3) raíces deben quitarse y (4) inserción de conducto entre los tocones debe lograrse al primer intento. Si se requieren múltiples intentos, esto puede causar edema en los tocones, más que complica la tarea de inserción de conducto entre los tocones y causar lesiones adicionales.
Para realizar la efectiva introducción de matriz de GFP-SC DMEM/F12/inyectable en el conducto, asegúrese de que: (1) la médula espinal no es un sangrado antes de la inserción del conducto entre los tocones. Si hay líquido en el conducto después de la inserción entre los tocones, use un pequeño trozo de la lanza de absorción para quitar a través de las ventanas cortadas. (2) Asegúrese de que el conducto se desliza sobre dos troncos de la médula espinal bien y (3) que las ventanas cortadas dorsales están abiertas. La inyección de 20 μl de la mezcla de matriz SC inyectable debe ser más que suficiente para llenar el conducto. Desbordamiento de las ventanas cortadas es un buen calibre para trasplante eficaz.
Las limitaciones de este procedimiento son: (1) no hay restauración de la duramadre, (2) ningún control sobre el movimiento del conducto/SC no trasplante después de la terminación de la cirugía y (3) ningún método alternativo si hay fugas al inyectar la mezcla de matriz SC inyectable.
La ventaja de este procedimiento es la combinación del uso de un conducto tanto estructurado con una matriz inyectable. Cualquier conducto fabricado con un material de elección que es flexible para ser insertado entre los tocones se puede utilizar en este procedimiento quirúrgico. Cualquier matriz inyectable de elección puede utilizarse también en este procedimiento; un gel termosensible es preferible debido a su capacidad de gel en situ y contorno a la forma del muñón creando una interfaz perfecta. Conductos con una más compleja estructura interior pueden utilizarse en lugar de un hueco interior. Drogas, factores de crecimiento, moléculas pequeñas o cualquier tipo de células puede ser incorporado en el conducto estructurado o la matriz inyectable o ambos para mejorar la supervivencia del trasplante proporcionan protección neural inmediatamente después de lesión, reducir la inflamación, promover axon regeneración y promover la angiogénesis.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Nos gustaría dar las gracias al Vector Viral y núcleos de animales en el proyecto Miami para curar parálisis para producir el lenti-GFP-virus y proporcionar cuidado animal, respectivamente y la histología y núcleos de proyección de imagen para el uso del criostato, microscopio confocal, y microscopio de fluorescencia con el investigador estéreo. La financiación fue proporcionada por NINDS (09923), DOD (W81XWH-14-1-0482) y NSF (DMR-1006510). M.B. Bunge es el Christine E Lynn distinguido profesor de Neurociencias.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cryogenic vials | ThermoFisher Scientific | 5000-0020 | |
| 10 cm Petri dish | VWR | 25382-428 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium: nutrient mixture F-12 | ThermoFisher Scientific | 11039-021 | "DMEM/F12" in protocol. |
| Penicillin-streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140-122 | "Pen/Strep" in protcol. |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH300-70-03 | "FBS" in protocol. |
| Pituitary extract | Biomedical Technologies | BT-215 | |
| Forskolin | Sigma-Aldrich | F6886 | |
| Heregulin | R&D Systems | 396-HB/CF | |
| Poly L-lysine | Sigma-Aldrich | P2636 | "PLL" in protocol. |
| Dulbecco's modified Eagle's medium | ThermoFisher Scientific | 11965-092 | "DMEM" in protocol. |
| Hank's balanced salt solution | ThermoFisher Scientific | 14170-112 | "HBSS" in protocol. |
| Tryspin-EDTA | ThermoFisher Scientific | 15400-054 | |
| Female Fischer rat (160-180g) | Envigo | ||
| Vannas scissor, straight | FST | 15018-10 | |
| Ketamine | Vedco Inc | 5098976106 | 100 mg/ml |
| Xylazine | Lloyd Inc | AnaSed | 20 mg/ml |
| Gentamycin | APP Pharmaceuticals | NDC 63323-010-02 | Can be any brand of choice. |
| Micro Spatula | FST | 10089-11 | Can be any brand of choice. |
| Curved scissors with blunt end | FST | 14017-18 | Can be any brand of choice. |
| Blunt forceps | FST | 11006-12 | Can be any brand of choice. |
| rongeur | FST | 16121-14 | Can be any brand of choice. |
| Angled spring scissors | FST | 15006-09 | Can be any brand of choice. |
| Absorption triangles | FST | 18105-03 | Can be any brand of choice. |
| Gelfoam | Henry Schein | 9083300 | "Compressed foam" in protocol. |
| #10 blades | Sklar | 06-3010 | Can be any brand of choice. |
| Matrigel | Corning | 354234 | "Injectable matrix" in protocol. |
| Chicken anti-green fluorescent protein antibody | Millipore | AB16901 | |
| Mouse RT97 hybridoma antibody | DSHB | RT97 | |
| Rabbit anti-neurofilament antibody | Encor Biotechnology, Inc | PRCA-NF-H | |
| Polyclonal Rabbit anti-Glial Fibrillary Acidic Protein antibody | Dako | Z033401 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-chicken IgG (H+L) | ThermoFisher Scientific | A-11039 | |
| Alexa Fluor 546 goat anti-rabbit IgG (H+L) | ThermoFisher Scientific | A-11035 | |
| Alexa Fluor 647 goat anti-rabbit IgG (H+L) | ThermoFisher Scientific | A-21244 | |
| Alexa Fluor 647 goat anti-mouse IgG (H+L) | ThermoFisher Scientific | A-21236 | |
| Confocal Microscopy | Nikon | clsi |
References
- King, V. R., Alovskaya, A., Wei, D. Y., Brown, R. A., Priestley, J. V. The use of injectable forms of fibrin and fibronectin to support axonal ingrowth after spinal cord injury. Biomaterials. 31 (15), 4447-4456 (2010).
- Liu, T., Houle, J. D., Xu, J., Chan, B. P., Chew, S. Y. Nanofibrous collagen nerve conduits for spinal cord repair. Tissue Eng Part A. 18 (9-10), 1057-1066 (2012).
- Novikova, L. N., Pettersson, J., Brohlin, M., Wiberg, M., Novikov, L. N. Biodegradable poly-beta-hydroxybutyrate scaffold seeded with Schwann cells to promote spinal cord repair. Biomaterials. 29 (9), 1198-1206 (2008).
- Bamber, N. I., Li, H., Aebischer, P., Xu, X. M. Fetal spinal cord tissue in mini-guidance channels promotes longitudinal axonal growth after grafting into hemisected adult rat spinal cords. Neural Plast. 6 (4), 103-121 (1999).
- Xu, X. M., Zhang, S. X., Li, H., Aebischer, P., Bunge, M. B. Regrowth of axons into the distal spinal cord through a Schwann-cell-seeded mini-channel implanted into hemisected adult rat spinal cord. Eur J Neurosci. 11 (5), 1723-1740 (1999).
- Bamber, N. I., et al. Neurotrophins BDNF and NT-3 promote axonal re-entry into the distal host spinal cord through Schwann cell-seeded mini-channels. European Journal of Neuroscience. 13 (2), 257-268 (2001).
- Iannotti, C., et al. Glial cell line-derived neurotrophic factor-enriched bridging transplants promote propriospinal axonal regeneration and enhance myelination after spinal cord injury. Exp Neurol. 183 (2), 379-393 (2003).
- Deng, L. X., et al. GDNF modifies reactive astrogliosis allowing robust axonal regeneration through Schwann cell-seeded guidance channels after spinal cord injury. Exp Neurol. 229 (2), 238-250 (2011).
- Deng, L. X., et al. A Novel Growth-Promoting Pathway Formed by GDNF-Overexpressing Schwann Cells Promotes Propriospinal Axonal Regeneration, Synapse Formation, and Partial Recovery of Function after Spinal Cord Injury. J Neurosci. 33 (13), 5655-5667 (2013).
- Chen, X., et al. Bone marrow stromal cells-loaded chitosan conduits promote repair of complete transection injury in rat spinal cord. J Mater Sci Mater Med. 22 (10), 2347-2356 (2011).
- Hurtado, A., et al. Robust CNS regeneration after complete spinal cord transection using aligned poly-L-lactic acid microfibers. Biomaterials. 32 (26), 6068-6079 (2011).
- Cheng, H., Huang, Y. C., Chang, P. T., Huang, Y. Y. Laminin-incorporated nerve conduits made by plasma treatment for repairing spinal cord injury. Biochem Biophys Res Commun. 357 (4), 938-944 (2007).
- Fan, J., et al. Neural regrowth induced by PLGA nerve conduits and neurotrophin-3 in rats with complete spinal cord transection. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 97 (2), 271-277 (2011).
- Lietz, M., et al. Physical and biological performance of a novel block copolymer nerve guide. Biotechnol Bioeng. 93 (1), 99-109 (2006).
- Novikova, L. N., Novikov, L. N., Kellerth, J. O. Biopolymers and biodegradable smart implants for tissue regeneration after spinal cord injury. Curr Opin Neurol. 16 (6), 711-715 (2003).
- Tang, S., et al. The effects of controlled release of neurotrophin-3 from PCLA Scaffolds on the survival and neuronal differentiation of transplanted neural stem cells in a rat spinal cord injury model. PLoS One. 9 (9), e107517 (2014).
- Yao, L., et al. Improved axonal regeneration of transected spinal cord mediated by multichannel collagen conduits functionalized with neurotrophin-3 gene. Gene Ther. , (2013).
- Xu, X. M., Guénard, V., Kleitman, N., Bunge, M. B. Axonal regeneration into Schwann cell-seeded guidance channels grafted into transected adult rat spinal cord. J Comp Neurol. 351 (1), 145-160 (1995).
- Xu, X. M., Chen, A., Guenard, V., Kleitman, N., Bunge, M. B. Bridging Schwann cell transplants promote axonal regeneration from both the rostral and caudal stumps of transected adult rat spinal cord. J Neurocytol. 26 (1), 1-16 (1997).
- Takami, T., et al. Schwann cell but not olfactory ensheathing glia transplants improve hindlimb locomotor performance in the moderately contused adult rat thoracic spinal cord. J Neurosci. 22 (15), 6670-6681 (2002).
- Bunge, M. B., Wood, P. M. Handbook of Clinical Neurology. 109, 523-540 (2012).
- Fortun, J., Hill, C. E., Bunge, M. B. Combinatorial strategies with Schwann cell transplantation to improve repair of the injured spinal cord. Neurosci Lett. 456 (3), 124-132 (2009).
- Haggerty, A. E., Oudega, M. Biomaterials for spinal cord repair. Neurosci Bull. , (2013).
- Nomura, H., Tator, C. H., Shoichet, M. S. Bioengineered strategies for spinal cord repair. J Neurotrauma. 23 (3-4), 496-507 (2006).
- Straley, K. S., Foo, C. W. P., Heilshorn, S. C. Biomaterial Design Strategies for the Treatment of Spinal Cord Injuries. J Neurotrauma. 27 (1), 1-19 (2010).
- Williams, R. R., Henao, M., Pearse, D. D., Bunge, M. B. Permissive Schwann cell graft/spinal cord interfaces for axon regeneration. Cell Transplant. 24 (1), 115-131 (2015).
- Williams, R. R., Pearse, D. D., Tresco, P. A., Bunge, M. B. The assessment of adeno-associated vectors as potential intrinsic treatments for brainstem axon regeneration. J Gene Med. 14 (1), 20-34 (2012).
- Xu, X. M., Guenard, V., Kleitman, N., Aebischer, P., Bunge, M. B. A combination of BDNF and NT-3 promotes supraspinal axonal regeneration into Schwann cell grafts in adult rat thoracic spinal cord. Exp Neurol. 134 (2), 261-272 (1995).
- Lee, Y. S., Arinzeh, T. L. The influence of piezoelectric scaffolds on neural differentiation of human neural stem/progenitor cells. Tissue Eng Part A. 18 (19-20), 2063-2072 (2012).
- Lee, Y. S., Collins, G., Arinzeh, T. L. Neurite extension of primary neurons on electrospun piezoelectric scaffolds. Acta Biomater. 7 (11), 3877-3886 (2011).
- Lee, Y. S., Wu, S., Arinzeh, T. L., Bunge, M. B. Enhanced noradrenergic axon regeneration into schwann cell-filled PVDF-TrFE conduits after complete spinal cord transection. Biotechnol Bioeng. 114 (2), 444-456 (2017).
- Haider, A., Haider, S., Kang, I. -K. A comprehensive review summarizing the effect of electrospinning parameters and potential applications of nanofibers in biomedical and biotechnology. Arab J Chem. , (2015).
- Hassiba, A. J., et al. Review of recent research on biomedical applications of electrospun polymer nanofibers for improved wound healing. Nanomedicine (Lond). 11 (6), 715-737 (2016).
- Lee, Y. -S., Livingston Arinzeh, T. Electrospun Nanofibrous Materials for Neural Tissue Engineering. Polymers. 3 (1), 413-426 (2011).
- Oraee-Yazdani, S., et al. Co-transplantation of autologous bone marrow mesenchymal stem cells and Schwann cells through cerebral spinal fluid for the treatment of patients with chronic spinal cord injury: safety and possible outcome. Spinal Cord. 54 (2), 102-109 (2016).
- Saberi, H., et al. Safety of intramedullary Schwann cell transplantation for postrehabilitation spinal cord injuries: 2-year follow-up of 33 cases. J Neurosurg Spine. 15 (5), 515-525 (2011).
- Saberi, H., et al. Treatment of chronic thoracic spinal cord injury patients with autologous Schwann cell transplantation: an interim report on safety considerations and possible outcomes. Neurosci Lett. 443 (1), 46-50 (2008).
- Yazdani, S. O., et al. A comparison between neurally induced bone marrow derived mesenchymal stem cells and olfactory ensheathing glial cells to repair spinal cord injuries in rat. Tissue Cell. 44 (4), 205-213 (2012).
- Zhou, X. H., et al. Transplantation of autologous activated Schwann cells in the treatment of spinal cord injury: six cases, more than five years of follow-up. Cell Transplant. 21, Suppl 1. S39-S47 (2012).
- Chen, L., et al. A prospective randomized double-blind clinical trial using a combination of olfactory ensheathing cells and Schwann cells for the treatment of chronic complete spinal cord injuries. Cell Transplant. 23, Suppl 1. S35-S44 (2014).
- Guest, J., Santamaria, A. J., Benavides, F. D. Clinical translation of autologous Schwann cell transplantation for the treatment of spinal cord injury. Curr Opin Organ Transplant. 18 (6), 682-689 (2013).
- Bunge, M. B., Monje, P. V., Khan, A., Wood, P. M. Progress in Brain Research. , Elsevier. (2017).
- Meijs, M. F., et al. Basic fibroblast growth factor promotes neuronal survival but not behavioral recovery in the transected and Schwann cell implanted rat thoracic spinal cord. J Neurotrauma. 21 (10), 1415-1430 (2004).
- Blits, B., et al. Lentiviral vector-mediated transduction of neural progenitor cells before implantation into injured spinal cord and brain to detect their migration, deliver neurotrophic factors and repair tissue. Restor Neurol Neurosci. 23 (5-6), 313-324 (2005).
- Follenzi, A., Naldini, L. HIV-based vectors. Preparation and use. Methods Mol Med. 69, 259-274 (2002).
- Fouad, K., et al. Combining Schwann cell bridges and olfactory-ensheathing glia grafts with chondroitinase promotes locomotor recovery after complete transection of the spinal cord. J Neurosci. 25 (2), 1169-1178 (2005).
- Bates, M. L., Puzis, R., Bunge, M. B. Animal Models of Movement Disorders: Volume II. Lane, E. L., Dunnett, S. B. , Humana Press. 381-399 (2011).
