Summary
Bu makalenin tam transeksiyon sonra spinal kord kütükleri ve dolgu Schwann hücreleri (SCs) ve köprü ve akson rejenerasyon arasında boşluk teşvik için enjekte edilebilir membran matris ile arasında içi boş bir kanal eklemek için bir teknik anlatılmaktadır.
Abstract
İnsan Medulla Spinalis Yaralanmalarında en yaygın türü olduğundan Medulla Spinalis Yaralanmalarında Sıçanlarda için çeşitli modeller arasında en sık kontüzyonu modeli kullanılır. Tam transeksiyon modeli olarak klinik kontüzyonu model olarak axon rejenerasyon değerlendirmek için en titiz yöntemi olsa da. Kontüzyonu modelinde, çöllerde veya masraftan aksonlar doku sonrası yaralanma kalan varlığını nedeniyle gelen rejenere ayırt etmek zordur. Tam transeksiyon modelinde köprüleme yöntemi boşluğu doldurmak ve süreklilik rostral Kaudal kütükleri tedavilerin etkinliğini değerlendirmek için oluşturmak gereklidir. Güvenilir bir köprüleme ameliyat sonuç ölçümleri değişkenlik nedeniyle cerrahi yöntem azaltarak test etmek esastır. Burada açıklanan protokoller Schwann hücreleri (SCs) hazırlamak için kullanılır ve borular nakli, omurilik torasik düzeyde 8 (T8), tam transeksiyon önce boru yerleştirin ve SCs boru nakli. Bu yaklaşım aynı zamanda ana bilgisayar doku rostral ve Kaudal arabirimleriyle arasında geliştirilmiş axon büyüme sağlar SC nakli ile enjekte edilebilir membran Matrix in situ gelling kullanır.
Introduction
Omurilik yaralanma onarım olduğunu içeren, örneğin bir birleşimsel tedavi stratejisi gerektiren karmaşık ve zorlu bir sorun, hücreleri ve Transplante hücre işlevi ve akson olumlu bir microenvironment sağlamak için biomaterial kullanımı yaralanma rejenerasyon sitesinde. Hemisection1,2,3,4,5,6,7,8,9 ve tam transeksiyon10 ,11,12,13,14,15,16,17,18,19 ,20,21,22 modelleri sık sık biomaterial tabanlı köprüleme terapiler etkilerini değerlendirmek için kullanılır. Hemisection manken kullanmanın avantajı için tam transeksiyon karşılaştırıldığında köprüleme inşa etmek için daha fazla istikrar sağlar olduğunu. Ancak, hemisection modellerinde, kararlara dokusunun varlığı nedeniyle uygulanan tedavi yöntemi bir sonucu olarak axon rejenerasyon kanıtlamak zordur. Tam transeksiyon modeli axon rejenerasyon göstermek için en titiz bir yöntemdir.
Çeşitli doğal ve sentetik malzeme enjekte edilebilir bir jel olarak kullanmak için inceledik, önceden biçimlendirilmiş jel kontüzyonu veya hemisection modelleri ya da yapısal bir iletken olarak hemisection yerleştirilen veya transeksiyon modelleri (ayrıntılı değerlendirmeleri23 ' tamamlamak , 24 , 25). in situ bir enjekte edilebilir matris/SC karışımı gelling nakli ve ana bilgisayar kablosu önceden genellikle matris/SC implantlar için karşılaştırıldığında axon geçiş26,27 arasında fazla izin veren bir arabirim oluşturur 5 , 18 , 19 , 28. in situ gelling izin daha sert ve yapılandırılmış bir kanal ya da daha az bomba önceden biçimlendirilmiş jel olamazdı, ancak düzensiz konak arayüzlerinin kontur matris. Yapılandırılmış bir kanal kez enjekte edilebilir bir matris aksine iletişim rehberlik ve implant istikrar sağlar. Burada sunulan iletişim kurallarını (Örneğin, matrigel, enjekte edilebilir matris olarak Malzeme tablo başvurulan bakınız) bir enjekte edilebilir membran matris ve yapılandırılmış bir kanal için yararlanır bir cerrahi açıklayınız Axon rejenerasyon en titiz omurilik yaralanma modelinde değerlendir.
Electrospun Poli-vinylidenedifluoride-hizalanmış fibröz içi boş boru deneysel yaklaşımımız kullanılan trifluoroethylene (PVDF-TrFE). PVDF-TrFE olduğunu ne zaman mekanik olarak deforme geçici bir ücret oluşturur ve neurite uzantısı ve akson rejenerasyon teşvik için gösterilen bir piezoelektrik polimer vitro29,30 ve içinde vivo 31. Electrospinning olduğunu hızla fiber hizalama, lif çapı ve İskele için kalınlığı gibi kontrol edilebilir özellikleri polimerler çeşitli kullanarak güvenilir fibröz iskele üretebilir ortak bir iskele imalat yöntemi Sinirsel ve diğer uygulamalar32,33,34.
Çok sayıda çalışma sıçan spinal kord yaralanması siteleri nakledilen SCs tedavi etkinliği5,9,18,19,20,21 göstermiştir ,26. Bu nakli nöroprotektif lezyon çevreleyen doku için vardır, lezyon boşluğu boyutunu küçültmek ve rejenere aksonlar myelination ve lezyon/nakli site içine axon rejenerasyon teşvik. İnsan SCs autologously nakledilen, zaman için diğer birçok ilgili sinirsel göre bir avantaj24hücreleri. Periferik sinir biyopsi sonra SCs izole ve saf ve insanlar içine nakli için istediğiniz miktarı için çoğalırlar. Otolog SC nakli omurilik yaralı hastalar için Iran35,36,37,38, Çin39,40, güvenli olması için kanıtlanmış ve Amerika Birleşik Devletleri41,42. SCs bilinen çok sayıda Nörotrofik faktörler ve hücre dışı matriks proteinlerinin axon büyüme için önemli salgılar ve akson yeniden oluşturma tamamlandıktan sonra periferik sinir yaralanma önemli bir rol oynamaktadır. Amacımız burada SC nakli tam sıçan spinal kord transeksiyon modeli sonucunu iyileştirmek için boru tasarımlar araştırabilirsiniz yöntemleri tarif etmektir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
dişi yetişkin Fischer rats (180-200 g vücut ağırlığı) NIH ve USDA kurallarına göre yer alır. Kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) Miami Üniversitesi tüm hayvan prosedürleri onayladı.
1. transplantasyon öncesi hazırlık
- boru hazırlık.
- 5 mm uzunluğunda bir diseksiyon mikroskop altında #10 bıçak kullanarak için Boru kesme.
Not: Boru iç çapı 2.4-2.7 mm arasında olduğunu; dış çapı 2,5-2,8 mm arasında olduğunu. - Boru yavaşça sol tarafındaki boyuna ( şekil 1A) katlayın. Dört küçük kesiler 0.4 mm uzun ve en az 1 mm boru açıklıklar üzerinden ve yaklaşık 1 mm ayrı düz kenarlı kenasen makas ( şekil 1B) kullanarak hakkında kesin.
- ( şekil 1 c) boru açılmak ve iki pencereyi yan yana oluşturma aynı tarafında iki insizyon arasında ( şekil 1 d) kesti. Windows açılabilir ve düzgün kesilmemiş kenarı boyunca kapalı olun.
- Kablo kanalları % 75 etanol için 10 cm Petri kabına 25 dk içinde sterilize. Bir kez 1 fosfat tamponlu tuz (PBS) x 4 dk için kanalların durulama ve kablo kanalları ile steril forseps için yeni 10 cm Petri kabına aktarın. Kablo kanalları için 25 dk 1 x PBS ile iki kez yıkayın.
- Saklamak kablo kanalları 1 x PBS kadar ameliyat.
Not: Birçok kanallarını hemen sterilize. Kablo kanalları onları steril tutmak için ayrı steril 1,5 mL santrifüj tüplerde depolamak.
- 5 mm uzunluğunda bir diseksiyon mikroskop altında #10 bıçak kullanarak için Boru kesme.
- Yeşil flüoresan protein (GFP)-Schwann hücresi (SC) hazırlık
- yetişkin kadın Fischer tibial sinir arıtılmış SC kültürler sıçan yukarıda açıklanan 43 hazırlamak. Bu adım bitiminde, Poli-L-lizin (PLL) üzerinde SCs plaka-kaplı 10 cm Petri yemekler ve korumak D10/3 M ortamda; Bu SCs geçit 0 tanımlanan.
Not: D10 / 3M orta aşağıdakilerden oluşmaktadır: % 10 fetal sığır serum (FBS), % 1 penisilin-streptomisin (kalem/strep), 20 µg/mL hipofiz özü, 2 µM forskolin, 2.5 nM heregulin Dulbecco içinde ' s modifiye kartal ' s orta (DMEM). - Taze D10/3 M orta (7 mL/10-cm Petri kabına) ile 3-4 günde doldurmak.
- % 70-80 izdiham ulaştıktan sonra Split SC kültür.
- Kaldır orta ve durulama Hank ile iki kez ' s dengeli tuz solüsyonu (HBSS) kalsiyum ve magnezyum.
- 5 mL % 0.25 tripsin/EDTA her 10 cm Petri kabına ekleyin ve oda sıcaklığında (RT) 5 min için kuluçkaya.
- D10 orta (% 10 FBS ve % 1 kalem/strep DMEM içinde) 5 mL tripsin nötralize etmek için 50mL santrifüj tüpüne ekleyin. Petri
- yavaşça damlalıklı tripsin/EDTA çözümde SCs. Kaldır ayırmak için birkaç kez hücre süspansiyon çanak dan çanağı ve önceki adımda hazırlanan santrifüj tüpü yerleştirin. D10 orta 5 mL ile çanak durulayın ve hücre hasat maksimize etmek için santrifüj tüpüne yerleştirin.
- 370 x g 4 o C. Kaldır süpernatant, 5 min için de hücreleri santrifüj kapasitesi ve 4 mL D10/3 M orta her Petri kabına split için hücrelerde resuspend.
- 1 mL SC süspansiyon ve D10/3 M orta 6 mL 10 cm Petri kabına dağıtmak; her Petri kabına bölünmüş 4 Petri yemeklerinde neden olur. Bu SCs geçiş 1 tanımlanan.
- Taze D10 / 3M orta gün sonra kaplama ve her 3-4 gün sonra kaplama ile Replenish.
- Bir kez SCs % 70-80 izdiham ulaşmak, 1.2.3.1-1.2.3.6 olan adımları yineleyin. SCs geçit 2 oldular.
- Transduce bir kez % 50 izdiham ulaşan SCs, GFP içinde D10/3 M kodlama lentiviral bir vektör ile orta gecede 30 enfeksiyon çokluğu, daha önce 44 , 45 açıklandığı gibi .
- Ertesi gün ve her 3-4 gün sonra kaplama ile taze D10/3 M orta doldurmak. % 70-80 izdiham, GFP SCs ulaştıktan sonra
- adımları 1.2.3.1-1.2.3.5 tekrar ama GFP SCs 6 mL D10 orta yerine resuspend. 15 µL GFP-SC süspansiyon, bir 1,5 mL santrifüj tüpüne dağıtmak ve 15 µL % 0,4 trypan mavi çözüm ekleyin. Santrifüj tüpü yavaşça fiske ve karışımı 10 µL Hücre sayımı slayt odasına dağıtmak.
- Bir otomatik hücre sayaç slayta yerleştirin ve hücre yoğunluğu belirlemek.
- 370 x g 4 o C. Kaldır süpernatant, 5 min için de hücreleri santrifüj kapasitesi, her 3 x 10 6 GFP dondurucu orta 1,5 mL ile resuspend-SCs. besleme GFP-SC süspansiyon kriyojenik flakon ve donma-80, içine 1.5 mL o C için sıvı azot depolanmasında geçmeden önce en az 24 h için.
Not: Orta dondurma: DMEM % 25 FBS ve % 8 Dimetil sülfoksit. - Çözülme GFP-SCs ameliyattan önce bir hafta.
- Ekleyin 10 mL D10 orta içine 50 mL santrifüj tüpü.
- Çözülme donmuş GFP-SCs 37 o kısmen çözdürülen kadar C de su banyosunda şişeleri.
- GFP-SC süspansiyon kriyojenik şişeyi çıkarın ve 1.2.8.1 içinde hazırlanan 50 mL santrifüj tüpü içine yerleştirin. Yavaşça damlalıklı çözüm yukarı ve tekrar tekrar aşağı.
- 370 x g 4 o C. Kaldır süpernatant, 5 min için de hücreleri santrifüj kapasitesi ve 4 mL D10/3 M orta çözdürülen her şişe için hücrelerde resuspend.
- 2 mL GFP-SC süspansiyon ve D10/3 M orta 5 mL 10 cm Petri kabına dağıtmak; her şişe 2 Petri yemeklerinde sonuçlanmalıdır. GFP SCs passage 3 tanımlanır.
Not: 10 cm Petri kabına genellikle bir hafta sonra yaklaşık 8 x 10 6 GFP-SCs verimleri.
- Ameliyat günü, adımları yineleyin 1.2.6. Kullanım hücre yoğunluğu hesaplanan adım 1.2.10.
- Besleme aliquots 3 x 10 6 GFP-SCs içine steril 1,5 mL santrifüj tüpleri hücre yoğunluğu üzerinde temel adım 1.2.9 yükleme hesaplanır. GFP-SC aliquots 370 x g 4 o C, 5 min için de santrifüj kapasitesi ve süpernatant kaldırın. Her aliquot ve santrifüj, 370 x g. DMEM/F12 orta 1 mL ekleyin
Not: 3 x 10 6 GFP her hayvan alır-SCs. orta serum ile bu adım kadar GFP-SCs ile kullanılan. - Tutmak GFP-SCs nakli zaman kadar buzda.
- yetişkin kadın Fischer tibial sinir arıtılmış SC kültürler sıçan yukarıda açıklanan 43 hazırlamak. Bu adım bitiminde, Poli-L-lizin (PLL) üzerinde SCs plaka-kaplı 10 cm Petri yemekler ve korumak D10/3 M ortamda; Bu SCs geçit 0 tanımlanan.
2. Torasik Level 8 (T8) adlı transeksiyon tamamlamak
- ameliyat için hayvan hazırlık
- Anesthetize bir kadın Fischer fareyle ketamin (60 mg/kg vücut ağırlığı) ve xylazine (5 mayi enjeksiyonu (180-200 g) mg/kg vücut ağırlığı). Parmak pinching kontrol ederek bir sonraki adıma devam etmeden önce anestezi derinliği izlemek ve göz yanıp sönen yanıt.
- Bir elektrik kesme makinesi fareyle arkası tıraş ve % 70 etanol ile cildinizi silin. Oftalmik yağ her iki gözde için geçerlidir. Hayvan vertebra erişim kolay böylece bir rulo yaklaşık 37 o C. yer hayvan, vücut ısısını korumak için bir Isıtma yastık üzerinde ameliyat tablosuna transfer.
Not: Rulo kağıt havlu veya 2 ' x2 sterilize gazlı bez içinde yapılabilir. Daha büyük rulo T7-T9 düz rulo üstüne koydu gerektiğinde önerilir.
- T7 T9 laminektomi için
- T9-T11 spinöz işlemleri için dönüm noktası bulun.
Not: T9 ve T10 T11 arasındaki boşlukları diğer kesimlerine göre küçük benn bölge. Fare roll üzerine koyduktan sonra T9-T11 spinöz işlemler deri yoluyla küçük bir üçgen şişlik gibi hissedeceksiniz. - 4-5 cm Ensizyon T4 T11 bir #10 bıçak kullanarak deri olun. Küçük bir insizyon attım fat kopyalayabilmek için künt biter kavisli makasla yüzeysel yağ katmanıyla olun.
Not: Diğer türleri araçların yağ ayırmak için kullanılabilir ancak künt biter kavisli makasla etkinleştirmek şişman ayrılması için en etkili ve az invaziv yöntem. - T9 spinöz işlemlere T7 #10 bıçak arkası kullanarak bulun. Künt Forseps ile T4 hakkında kas sık ve kesik vertebra her iki tarafında boyunca kas T6-T10. Omurga gibi temiz bir açılış yapmak ve hayvan için en az yaralanmalara neden mümkün olduğunca yakın kesme olun.
- Her bireysel spinöz proses T7 dan kas ve bağ T6 T7, T7 ve T8, T8 ve T9, arasında kesim tarafından T9 ve T9 ve T10 #10 bıçak ile yalıtmak.
- Bir rongeur herhangi bir kas ve bağ lamina üzerinde T9 için T7 kaldırmak için kullanın. T7 T9 enine işlemlere arasındaki boşlukları görünür hale gelene kadar kas ve bağ mümkün olduğunca yanal kaldırmak.
- Bir rongeur ile T9 spinöz proses kaldırın. T8 spinöz proses künt forseps ve yavaşça küçük açılışında T9 lamina T9 ve T10 süreçler arasında yükseltmek için Asansör ile tutun.
- Ve rostrally ile bir rongeur T9, hareket--dan açılış başlangıç lamina kaldırın. Mümkün olduğunca yanal lamina Kaldır; dorsal kökleri laminektomi sonra görünür olmalıdır. Lamina kaldırılır bir kez
- T7 ve T8 için işlemi yineleyin.
Not: laminektomi sırasında emme spears laminektomi ile devam ederken kan kaldırmak için kullanın. Aşırı kanama meydana gelirse, sıkıştırılmış bir sünger kanama sitesinde yer ve kan pıhtılaşma ile yardımcı olmak için serum ekleyin.
- T9-T11 spinöz işlemleri için dönüm noktası bulun.
- Transeksiyon T8,
- Retraktörü T7 T9 için çevresinde yer. Bir kez tüm lamina kaldırılır, enine süreçler arasındaki boşluklar özellikle T8 görünür olduğundan emin olun. Ayrıca kemik uzunluğu arasında T7 T9 dışa doğru çıkıntılı kemik parçaları yok emin olmak için her iki tarafında boyunca inceleyin.
Not: Bu boşluğu T8, tam transeksiyon gerçekleştirmek için önemlidir. Uzunluğu boyunca omurga daha kolay boru sokmak için kaldırılmalıdır. - Dorsal kesme ve ventral kökleri yukarıda ve T8 kullanarak aşağıda bahar makas açılı. Spinal kord tuz ekleyin ve kan pıhtısı. için bekleyin
Not: uygun boru sokmak için önemli bir adımdır. - Yukarıda Medulla Spinalis açılı bahar makas T8, enine süreçler arasındaki boşluklar yerleştirin ve omurilik tamamen koparmaya bir kesim yapmak. Sıkıştırılmış köpük küçük bir parça elde edilen 2-2,5 mm boşluk yerleştirin ve salin alanı hemen ekleyin.
- Retraktörü T7 T9 için çevresinde yer. Bir kez tüm lamina kaldırılır, enine süreçler arasındaki boşluklar özellikle T8 görünür olduğundan emin olun. Ayrıca kemik uzunluğu arasında T7 T9 dışa doğru çıkıntılı kemik parçaları yok emin olmak için her iki tarafında boyunca inceleyin.
3. Boru ekleme
- kesik kordon yükün hemostaz ulaşmak beklerken, bir kanal 1 x PBS alın. Emme üçgenler ince uzun parçalar halinde kesilmiş ve aşırı PBS kaldırmak için boru koyun. Önceden kesilmiş windows açık olduğundan emin olun.
- Kaldır serum ve kan emme üçgen ince uzun parçalar kullanarak. Omurilik iyi ayırma emin olmak için bir microspatula kullanarak iki kütükleri kaldır. Yavaşça rostral güdük microspatula ile Asansör ve boru üzerinde güdük kendini karşı karşıya windows ile kayma. Tüm güdük takılı ve hiçbir fazla boru kanama olun.
- Yavaşça Kaudal güdük kaldırın ve conduit diğer ucunu güdük üzerinde kayma. Emin olun tüm güdük eklenir ve dorsal yüzeyi ( şekil 2A) pencerelerdir.
4. Schwann hücresi / enjekte edilebilir matris (tablo malzemeleri görmek) hazırlık ve enjeksiyon
- kopmuş bir kablonun hemostaz ulaşmak beklerken, orta (1.2 adımda hazırlanan) GFP-SC Pelet yukarıda kaldırmak. GFP SCs soğuk DMEM/F12 10 µl içinde resuspend. Soğuk enjekte edilebilir jel 10 µl hücre süspansiyon ve de tarafından pipetting tekrar karıştırın. Boru ekleme tamamlanıncaya kadar GFP-SC/DMEM/F12/enjekte edilebilir matris karışımı buz üzerinde devam.
- ( şekil 2A) açık pencere eşiği sırt belgili tanımlık yüzey are üzerinde kontrol ettikten sonra 20 µl GFP-SC/DMEM/F12/enjekte edilebilir matris karışımı içine boru önceden kesilmiş windows 46 biri ile enjekte İpucu ve bir micropipette yükleme bir Batı leke kullanarak. SC/DMEM/F12/enjekte edilebilir matris karışımı conduit bantlayın, emme üçgenler ile aşırı kaldırın. Windows enjeksiyon sonra kapatır; dikiş değildir ( şekil 2B) gerekli.
5. Yaranın kapanması ve ameliyat sonrası bakım
- dikiş kas katmanları ve yüzeysel yağ katmanları. % 70 etanol ve sonra elyaf (yara klip kullanarak Örneğin,) ile cildi temiz cilt kapa. Kendine gelmek kadar hayvanlar termal olarak düzenlenmiş bir kuluçka makinesine sakla. Hayvanları geri kafesler aktarın. Su ile uzun besleme borusu sağlamak ve yataklar kolay erişim için yiyecek parçaları yerleştirin.
- Yönetici buprenorfin (0.1 mg/kg vücut ağırlığı) günde 3 gündür subkutan hemen ameliyat sonrası ağrı azaltmak için başlangıç. Viomisin (5 mg/kg vücut ağırlığı) subkutan bir kez bir gün 7 gün sonra hemen ameliyat önlemek ve enfeksiyon azaltmak için enjekte. Subkutan günde hidrasyon için 7 gün için 10 mL lactated Ringers çözeltisi enjekte.
- Boş mesane el ile iki kez bir gün mesane kadar işlevini döndürür. Mesane enfeksiyonu ortaya çıkarsa, idrar açık hale gelinceye kadar sonra 10 mL serum fizyolojik subkutan yönetmek. İki gün içinde hiçbir gelişme ise, idrar açık hale gelene kadar da, subkutan viomisin (5 mg/kg vücut ağırlığı, bir kez her gün) enjekte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu cerrahi tekniği kullanarak yapılandırılmış boru ve tamamlanan geçmiş spinal kordonlar içine nakli sonra SC fonksiyonu maksimize enjekte edilebilir matris kullanımını değerlendirmek için hedeftir. Üç hafta sonra nakli, hayvanların % 4 paraformaldehyde ile derin ve spinal sütunlar fena halde disseke ve başka bir 24 h için aynı sabitleştirici sabit. Spinal kord sonra disseke ve örnekleri cryostat sagittal bölümleri için cryoprotection için % 30 Sükroz çözüm içine yerleştirilir. 1-mm kalın kesitler disseke spinal kordonlar başka bir dizi SC köprünün ortasından izole için plastik bölümler işlemek için oxazolidin sabitleştirici içine yerleştirilir. Örnekleri elektron mikroskobik hazırlık Bates vd tarafından detaylı olarak için zamanlama tabi 47. cryostat sagittal bölümler vardı immunostained GFP, gliyal fibrillary asidik protein (GFAP'nin), karşı birincil antikor ile ağır zincir neurofilament (RT97) ve orta zincirli neurofilament (NF) de dahil olmak üzere ikincil antikorlar tarafından takip keçi-anti-tavuk-488, keçi-anti-tavşan-546, keçi-anti-fare-647 ve keçi-anti-tavşan 647, anılan sıraya göre. GFP-SCs boyunca ve boru (şekil 3A; iç duvarların sarı çizgilerle gösterilir) içinde eşit olarak dağıtılmıştır. Axon rejenerasyon (şekil 3B) gözlenen ve GFP-SCs (şekil 3A ve şekil 3 c) varlığı ile yakından ilişkili olan bu teknik bir SC köprü yapılandırılmış bir kanal içinde ve olarak sağlayan başarılı olduğunu belirten Axon rejenerasyon rostral ve Kaudal kütükleri arasında köprü boyunca teşvik. Ayrıca kan damarları ve myelinated akson SC Köprüsü (şekil 3D) ortasında bulundu. Bizim son eseri31' SCs axon rejenerasyonu üzerine etkisi electrospun PVDF-TrFE fibröz borular ile daha fazla ayrıntı bulunabilir.
Diğer sonuç tedbirler de dahil olmak üzere gerçekleştirilen: çizgi-transect-bizim son eser31 ' de açıklanan yöntemi tarafından sagittal bölümlerindeki axon rejenerasyon miktarının ve myelinated akson ve plastik kesit damarlarının sayısını miktarının. Plastik bölümler için hazırlanan örnekleri daha fazla unmyelinated akson sayısı ölçmek iletim elektron mikroskopi için kesitli. Cryoprotected omurilik örnekleri de olabilir cross-sectioned yerine sagittally kesitli ve akson rejenerasyon ve GFP varlığını ölçmek için immunostained-SCs. davranış testleri da uygun aralıklarla hayvanlar üzerinde gerçekleştirilebilir hayvanlar sürdürülür.
Şekil 1: Boru penceresini hazırlanmasında. 5 mm boru(a)boyuna ekseni boyunca bir yandan katlanmış. Dört insizyon 0.4 mm uzun ve en az 1 mm boru (B) açıklıklar üzerinden hakkında kesin. Her kesi 1 mm ayrı olan. Conduit unfolding tarafından 4 paralel kesikler (C) gözlenir. Flep kaldırma tarafından açılan bir pencere oluşturmak için Kaudal rostral eksen boyunca iki insizyon arasında kesin. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: pencereyi kapattıktan sonra SC/DMEM/F12/matris enjeksiyon. Windows geri rostral ve Kaudal kütükleri(a)arasında boru koyduktan sonra her flep katlama tarafından açılır. Windows enjeksiyon (B) sonra kapalı. Ölçek çubuğu 1 mm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: sagittal bölümlerinin Confocal floresan görüntü ve spinal kordonlar GFP-SCs içinde ile nakledilen gelen plastik bir kesit parlak alan görüntüsünü hizalanmış fibröz PVDF-TrFE kanallarını. SC köprü nerede GFP için iç duvarları sarı çizgiler ve immunostained tarafından belirtilen ve gliyal fibrillary asidik protein (GFAP'nin) görselleştirmek için SCs ve ana bilgisayar omurilik astrocytes, anılan sıraya göre nakledilen kablo kanalları içinde genel bakış. Rejenere aksonlar RT97 ile etiketli (ağır zincir neurofilament) (A, B) ve orta zincirli neurofilament (NF, C) antikor. Akson (A) görünür değildir GFP-SCs daha yüksek büyütme ile (C) orta kanal bölgesinde gözlemlediği gibi ile onların yakın ilişki nedeniyle. Akson tarafından confocal mikroskobu Imaging rostral güdük doku bölümünün derinlemesine eksik tarama nedeniyle görünür değildir. Kan damarları (v dolarak etiketli) ve myelinated akson (MA dolarak etiketli olan) her ikisi de bir plastik bölümünde Orta kanal bölgesinde tespit edildi. Büyütme ve ölçek çubukları: A, B (10 x 200 µm); C (20 x 100 µm); D (63 x 25 µm). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bir etkili transeksiyon model oluşturmanın en kritik adımı omurilik bir ya da iki kesim severing. Rostral ve Kaudal omurilik kütükleri arasında bir 2-2.5 mm boşluk transeksiyon sitede bulunması gerekir. Böyle bir boşluk değil gözükmek için üç en olası nedenleri (1) dorsal/ventral kökleri düzgün kaldırılmadı, ventral (2 dura yeterince kaldırılmadı ve/veya (3 hayvan düzgün onu yerleştirilen tekerleği yerleştirildi değil vardır.
Bir etkili boru ekleme kütükleri arasında gerçekleştirmek için: Boru çapı (1) belirli türler ve deneme; kullanılan hayvan yaş için uygun (2) enine işlemler arasındaki fark görüntülenir kadar lamina yeterince yanal kaldırılması gerekir; (3) kökleri kaldırılması ve (4) boru ekleme kütükleri arasında ilk denemede başarılı olmak. Birden çok deneme gerekiyorsa, bu daha fazla kanal ekleme kütükleri arasında görev karmaşık hale getiren ve ek yaralanma neden kütükleri içinde ödem neden olabilir.
Etkili GFP-SC/DMEM/F12/enjekte edilebilir matris giriş kanalı içine gerçekleştirmek için emin olun: (1) omurilik kanalı ekleme kütükleri arasında önce kanamıyor. Eğer sıvı boru içinde ekleme kütükleri arasında sonra emme mızrak küçük bir parça ile önceden kesilmiş windows kaldırmak için kullanın. Boru her iki omurilik kütükleri de kaydı (2) olduğundan emin olun ve (3) dorsal önceden kesilmiş windows açıktır. SC/enjekte edilebilir matris karışımı 20 µl enjeksiyon conduit doldurmak için fazlasıyla yeterli olmalıdır. Önceden kesilmiş Windows taşması etkili nakli için iyi bir göstergesi olduğunu.
Bu yordamı sınırlamaları vardır: (1) hiçbir restorasyonu beyin zarı, (2) boru/SC hareket kontrolü nakli ameliyatı ve (3) tamamlanmasından sonra alternatif bir yöntem SC/enjekte edilebilir matris karışımı enjekte ederken sızıntı varsa.
Bu yordamı her iki yapılandırılmış bir kanal enjekte edilebilir bir matris ile kullanımı kombinasyonu avantajdır. Herhangi bir kanalı kütükleri arasında eklenecek bükülebilir seçtikleri bir malzeme ile yapılan bu cerrahi prosedürde kullanılabilir. Seçim enjekte edilebilir herhangi bir matris de bu yordamda kullanılabilir; bir sıcaklığa duyarlı jel in situ içinde ve sorunsuz bir arabirim oluşturma güdük şeklinde kontur jel yeteneği nedeniyle tercih edilir. Daha karmaşık bir iç yapısı ile kanalları yerine içi boş bir iç kullanılabilir. Uyuşturucu, büyüme faktörleri, küçük moleküller veya herhangi bir hücre tipi yapılandırılmış boru veya enjekte edilebilir matris veya nakli hayatta kalma geliştirmek, hemen sonra yaralanma sinirsel koruma sağlamak, inflamasyonu azaltmak, akson tanıtmak için her ikisi de dahil edilebilir rejenerasyon ve anjiogenezi teşvik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Viral vektör ve hayvan çekirdek tedavi felç için Miami Projesi'nde lenti-GFP-virüs ve sağlayan hayvan bakımı, sırasıyla, üreten ve Histoloji ve çekirdek görüntüleme için cryostat, confocal mikroskop, kullanım için teşekkür etmek istiyorum ve Stereo araştırmacı ile floresan mikroskop. Finansman NINDS (09923), DOD (W81XWH-14-1-0482) ve NSF (DMR-1006510) tarafından sağlandı. M.B. Bunge Christine E Lynn ayırt edici Profesör of Neuroscience olduğunu.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cryogenic vials | ThermoFisher Scientific | 5000-0020 | |
| 10 cm Petri dish | VWR | 25382-428 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium: nutrient mixture F-12 | ThermoFisher Scientific | 11039-021 | "DMEM/F12" in protocol. |
| Penicillin-streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140-122 | "Pen/Strep" in protcol. |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH300-70-03 | "FBS" in protocol. |
| Pituitary extract | Biomedical Technologies | BT-215 | |
| Forskolin | Sigma-Aldrich | F6886 | |
| Heregulin | R&D Systems | 396-HB/CF | |
| Poly L-lysine | Sigma-Aldrich | P2636 | "PLL" in protocol. |
| Dulbecco's modified Eagle's medium | ThermoFisher Scientific | 11965-092 | "DMEM" in protocol. |
| Hank's balanced salt solution | ThermoFisher Scientific | 14170-112 | "HBSS" in protocol. |
| Tryspin-EDTA | ThermoFisher Scientific | 15400-054 | |
| Female Fischer rat (160-180g) | Envigo | ||
| Vannas scissor, straight | FST | 15018-10 | |
| Ketamine | Vedco Inc | 5098976106 | 100 mg/ml |
| Xylazine | Lloyd Inc | AnaSed | 20 mg/ml |
| Gentamycin | APP Pharmaceuticals | NDC 63323-010-02 | Can be any brand of choice. |
| Micro Spatula | FST | 10089-11 | Can be any brand of choice. |
| Curved scissors with blunt end | FST | 14017-18 | Can be any brand of choice. |
| Blunt forceps | FST | 11006-12 | Can be any brand of choice. |
| rongeur | FST | 16121-14 | Can be any brand of choice. |
| Angled spring scissors | FST | 15006-09 | Can be any brand of choice. |
| Absorption triangles | FST | 18105-03 | Can be any brand of choice. |
| Gelfoam | Henry Schein | 9083300 | "Compressed foam" in protocol. |
| #10 blades | Sklar | 06-3010 | Can be any brand of choice. |
| Matrigel | Corning | 354234 | "Injectable matrix" in protocol. |
| Chicken anti-green fluorescent protein antibody | Millipore | AB16901 | |
| Mouse RT97 hybridoma antibody | DSHB | RT97 | |
| Rabbit anti-neurofilament antibody | Encor Biotechnology, Inc | PRCA-NF-H | |
| Polyclonal Rabbit anti-Glial Fibrillary Acidic Protein antibody | Dako | Z033401 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-chicken IgG (H+L) | ThermoFisher Scientific | A-11039 | |
| Alexa Fluor 546 goat anti-rabbit IgG (H+L) | ThermoFisher Scientific | A-11035 | |
| Alexa Fluor 647 goat anti-rabbit IgG (H+L) | ThermoFisher Scientific | A-21244 | |
| Alexa Fluor 647 goat anti-mouse IgG (H+L) | ThermoFisher Scientific | A-21236 | |
| Confocal Microscopy | Nikon | clsi |
References
- King, V. R., Alovskaya, A., Wei, D. Y., Brown, R. A., Priestley, J. V. The use of injectable forms of fibrin and fibronectin to support axonal ingrowth after spinal cord injury. Biomaterials. 31 (15), 4447-4456 (2010).
- Liu, T., Houle, J. D., Xu, J., Chan, B. P., Chew, S. Y. Nanofibrous collagen nerve conduits for spinal cord repair. Tissue Eng Part A. 18 (9-10), 1057-1066 (2012).
- Novikova, L. N., Pettersson, J., Brohlin, M., Wiberg, M., Novikov, L. N. Biodegradable poly-beta-hydroxybutyrate scaffold seeded with Schwann cells to promote spinal cord repair. Biomaterials. 29 (9), 1198-1206 (2008).
- Bamber, N. I., Li, H., Aebischer, P., Xu, X. M. Fetal spinal cord tissue in mini-guidance channels promotes longitudinal axonal growth after grafting into hemisected adult rat spinal cords. Neural Plast. 6 (4), 103-121 (1999).
- Xu, X. M., Zhang, S. X., Li, H., Aebischer, P., Bunge, M. B. Regrowth of axons into the distal spinal cord through a Schwann-cell-seeded mini-channel implanted into hemisected adult rat spinal cord. Eur J Neurosci. 11 (5), 1723-1740 (1999).
- Bamber, N. I., et al. Neurotrophins BDNF and NT-3 promote axonal re-entry into the distal host spinal cord through Schwann cell-seeded mini-channels. European Journal of Neuroscience. 13 (2), 257-268 (2001).
- Iannotti, C., et al. Glial cell line-derived neurotrophic factor-enriched bridging transplants promote propriospinal axonal regeneration and enhance myelination after spinal cord injury. Exp Neurol. 183 (2), 379-393 (2003).
- Deng, L. X., et al. GDNF modifies reactive astrogliosis allowing robust axonal regeneration through Schwann cell-seeded guidance channels after spinal cord injury. Exp Neurol. 229 (2), 238-250 (2011).
- Deng, L. X., et al. A Novel Growth-Promoting Pathway Formed by GDNF-Overexpressing Schwann Cells Promotes Propriospinal Axonal Regeneration, Synapse Formation, and Partial Recovery of Function after Spinal Cord Injury. J Neurosci. 33 (13), 5655-5667 (2013).
- Chen, X., et al. Bone marrow stromal cells-loaded chitosan conduits promote repair of complete transection injury in rat spinal cord. J Mater Sci Mater Med. 22 (10), 2347-2356 (2011).
- Hurtado, A., et al. Robust CNS regeneration after complete spinal cord transection using aligned poly-L-lactic acid microfibers. Biomaterials. 32 (26), 6068-6079 (2011).
- Cheng, H., Huang, Y. C., Chang, P. T., Huang, Y. Y. Laminin-incorporated nerve conduits made by plasma treatment for repairing spinal cord injury. Biochem Biophys Res Commun. 357 (4), 938-944 (2007).
- Fan, J., et al. Neural regrowth induced by PLGA nerve conduits and neurotrophin-3 in rats with complete spinal cord transection. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 97 (2), 271-277 (2011).
- Lietz, M., et al. Physical and biological performance of a novel block copolymer nerve guide. Biotechnol Bioeng. 93 (1), 99-109 (2006).
- Novikova, L. N., Novikov, L. N., Kellerth, J. O. Biopolymers and biodegradable smart implants for tissue regeneration after spinal cord injury. Curr Opin Neurol. 16 (6), 711-715 (2003).
- Tang, S., et al. The effects of controlled release of neurotrophin-3 from PCLA Scaffolds on the survival and neuronal differentiation of transplanted neural stem cells in a rat spinal cord injury model. PLoS One. 9 (9), e107517 (2014).
- Yao, L., et al. Improved axonal regeneration of transected spinal cord mediated by multichannel collagen conduits functionalized with neurotrophin-3 gene. Gene Ther. , (2013).
- Xu, X. M., Guénard, V., Kleitman, N., Bunge, M. B. Axonal regeneration into Schwann cell-seeded guidance channels grafted into transected adult rat spinal cord. J Comp Neurol. 351 (1), 145-160 (1995).
- Xu, X. M., Chen, A., Guenard, V., Kleitman, N., Bunge, M. B. Bridging Schwann cell transplants promote axonal regeneration from both the rostral and caudal stumps of transected adult rat spinal cord. J Neurocytol. 26 (1), 1-16 (1997).
- Takami, T., et al. Schwann cell but not olfactory ensheathing glia transplants improve hindlimb locomotor performance in the moderately contused adult rat thoracic spinal cord. J Neurosci. 22 (15), 6670-6681 (2002).
- Bunge, M. B., Wood, P. M. Handbook of Clinical Neurology. 109, 523-540 (2012).
- Fortun, J., Hill, C. E., Bunge, M. B. Combinatorial strategies with Schwann cell transplantation to improve repair of the injured spinal cord. Neurosci Lett. 456 (3), 124-132 (2009).
- Haggerty, A. E., Oudega, M. Biomaterials for spinal cord repair. Neurosci Bull. , (2013).
- Nomura, H., Tator, C. H., Shoichet, M. S. Bioengineered strategies for spinal cord repair. J Neurotrauma. 23 (3-4), 496-507 (2006).
- Straley, K. S., Foo, C. W. P., Heilshorn, S. C. Biomaterial Design Strategies for the Treatment of Spinal Cord Injuries. J Neurotrauma. 27 (1), 1-19 (2010).
- Williams, R. R., Henao, M., Pearse, D. D., Bunge, M. B. Permissive Schwann cell graft/spinal cord interfaces for axon regeneration. Cell Transplant. 24 (1), 115-131 (2015).
- Williams, R. R., Pearse, D. D., Tresco, P. A., Bunge, M. B. The assessment of adeno-associated vectors as potential intrinsic treatments for brainstem axon regeneration. J Gene Med. 14 (1), 20-34 (2012).
- Xu, X. M., Guenard, V., Kleitman, N., Aebischer, P., Bunge, M. B. A combination of BDNF and NT-3 promotes supraspinal axonal regeneration into Schwann cell grafts in adult rat thoracic spinal cord. Exp Neurol. 134 (2), 261-272 (1995).
- Lee, Y. S., Arinzeh, T. L. The influence of piezoelectric scaffolds on neural differentiation of human neural stem/progenitor cells. Tissue Eng Part A. 18 (19-20), 2063-2072 (2012).
- Lee, Y. S., Collins, G., Arinzeh, T. L. Neurite extension of primary neurons on electrospun piezoelectric scaffolds. Acta Biomater. 7 (11), 3877-3886 (2011).
- Lee, Y. S., Wu, S., Arinzeh, T. L., Bunge, M. B. Enhanced noradrenergic axon regeneration into schwann cell-filled PVDF-TrFE conduits after complete spinal cord transection. Biotechnol Bioeng. 114 (2), 444-456 (2017).
- Haider, A., Haider, S., Kang, I. -K. A comprehensive review summarizing the effect of electrospinning parameters and potential applications of nanofibers in biomedical and biotechnology. Arab J Chem. , (2015).
- Hassiba, A. J., et al. Review of recent research on biomedical applications of electrospun polymer nanofibers for improved wound healing. Nanomedicine (Lond). 11 (6), 715-737 (2016).
- Lee, Y. -S., Livingston Arinzeh, T. Electrospun Nanofibrous Materials for Neural Tissue Engineering. Polymers. 3 (1), 413-426 (2011).
- Oraee-Yazdani, S., et al. Co-transplantation of autologous bone marrow mesenchymal stem cells and Schwann cells through cerebral spinal fluid for the treatment of patients with chronic spinal cord injury: safety and possible outcome. Spinal Cord. 54 (2), 102-109 (2016).
- Saberi, H., et al. Safety of intramedullary Schwann cell transplantation for postrehabilitation spinal cord injuries: 2-year follow-up of 33 cases. J Neurosurg Spine. 15 (5), 515-525 (2011).
- Saberi, H., et al. Treatment of chronic thoracic spinal cord injury patients with autologous Schwann cell transplantation: an interim report on safety considerations and possible outcomes. Neurosci Lett. 443 (1), 46-50 (2008).
- Yazdani, S. O., et al. A comparison between neurally induced bone marrow derived mesenchymal stem cells and olfactory ensheathing glial cells to repair spinal cord injuries in rat. Tissue Cell. 44 (4), 205-213 (2012).
- Zhou, X. H., et al. Transplantation of autologous activated Schwann cells in the treatment of spinal cord injury: six cases, more than five years of follow-up. Cell Transplant. 21, Suppl 1. S39-S47 (2012).
- Chen, L., et al. A prospective randomized double-blind clinical trial using a combination of olfactory ensheathing cells and Schwann cells for the treatment of chronic complete spinal cord injuries. Cell Transplant. 23, Suppl 1. S35-S44 (2014).
- Guest, J., Santamaria, A. J., Benavides, F. D. Clinical translation of autologous Schwann cell transplantation for the treatment of spinal cord injury. Curr Opin Organ Transplant. 18 (6), 682-689 (2013).
- Bunge, M. B., Monje, P. V., Khan, A., Wood, P. M. Progress in Brain Research. , Elsevier. (2017).
- Meijs, M. F., et al. Basic fibroblast growth factor promotes neuronal survival but not behavioral recovery in the transected and Schwann cell implanted rat thoracic spinal cord. J Neurotrauma. 21 (10), 1415-1430 (2004).
- Blits, B., et al. Lentiviral vector-mediated transduction of neural progenitor cells before implantation into injured spinal cord and brain to detect their migration, deliver neurotrophic factors and repair tissue. Restor Neurol Neurosci. 23 (5-6), 313-324 (2005).
- Follenzi, A., Naldini, L. HIV-based vectors. Preparation and use. Methods Mol Med. 69, 259-274 (2002).
- Fouad, K., et al. Combining Schwann cell bridges and olfactory-ensheathing glia grafts with chondroitinase promotes locomotor recovery after complete transection of the spinal cord. J Neurosci. 25 (2), 1169-1178 (2005).
- Bates, M. L., Puzis, R., Bunge, M. B. Animal Models of Movement Disorders: Volume II. Lane, E. L., Dunnett, S. B. , Humana Press. 381-399 (2011).
