Summary
Cet article décrit une technique pour insérer un tube creux entre les souches de la moelle épinière après transection complète et remplissez-le de cellules de Schwann (SCs) et matrice injectable membrane basale afin de combler et de promouvoir la régénération axonale dans le fossé.
Abstract
Parmi les différents modèles pour la blessure de la moelle épinière chez le rat, le modèle de la contusion est le plus souvent utilisé parce que c’est le type le plus commun de la moelle épinière humaine. Le modèle de transection complète, bien que pas aussi cliniquement pertinente que le modèle de la contusion, est la méthode la plus rigoureuse pour évaluer la régénération axonale. Dans le modèle de la contusion, il est difficile de distinguer régénérée des axones germés ou épargnés en raison de la présence d’autres lésions post. Dans le modèle de transection complète, une méthode de raccordement est nécessaire pour combler le vide et de créer une continuité de la rostrale des caudales souches afin d’évaluer l’efficacité des traitements. Une chirurgie de pontage fiable est indispensable pour tester les mesures de résultats en réduisant la variabilité due à la méthode chirurgicale. Les protocoles décrits ici sont utilisées pour préparer Schwann, cellules (SCs) et conduits avant la greffe, une résection complète de la moelle épinière au niveau thoracique 8 (T8), insérer le tube et transplant SCs dans le conduit. Cette approche utilise également en situ gélifiant d’une matrice injectable membrane basale avec transplantation SC qui permet la croissance axonale améliorée via les interfaces rostrales et caudales avec les tissus de l’hôte.
Introduction
Réparation de lésions de la moelle épinière est un problème complex et difficile qui nécessitera une stratégie de traitement combinatoire impliquant, par exemple, l’utilisation de cellules et un biomatériau pour fournir un micro-environnement favorable pour la fonction des cellules transplantées et axon régénération sur le site de lésion. Hémisection1,2,3,4,5,6,7,8,9 et transection complète10 ,11,12,13,14,15,16,17,18,19 ,20,21,22 modèles sont fréquemment utilisés pour évaluer les effets des thérapies ponts à base de biomatériaux. L’avantage d’utiliser un modèle hémisection est qu’il offre plus de stabilité pour la construction de pontage par rapport à la résection complète. Toutefois, dans les modèles hémisection, il est difficile de prouver la régénération axonale à l’issue de la méthode thérapeutique appliquée en raison de la présence de tissu épargné. Le modèle de transection complète est la méthode la plus rigoureuse de démontrer la régénération axonale.
Divers matériaux naturels et synthétiques ont été étudiés pour une utilisation comme un gel injectable, un gel pré-formé placé dans une contusion ou hémisection modèles, ou comme un conduit structuré dans hémisection ou toutes les modèles de transection (détaillés dans les commentaires23 , 24 , 25). in situ gélifiant d’un mélange de matrice/SC injectable crée une interface plus permissive entre la greffe et le cordon de l’hôte pour axon passage26,27 par rapport aux implants pré gélifié matrice/SC 5 , 18 , 19 , 28. in situ gélifiant a permis la matrice au contour autour des interfaces hôte irrégulière, alors qu’une conduite plus rigide et plus structurée ou un gel moins malléable préformé ne pouvait pas. Une conduite structurée offre souvent une stabilité orientation et implant contact contrairement à une matrice injectable. Les protocoles présentés ici décrivent une procédure chirurgicale qui profite des fois une matrice injectable membrane basale (p. ex., matrigel, voir la Table des matières, dénommé comme matrice injectable ici) et un tuyau structuré en vue de évaluer la régénération axonale dans le modèle de blessure de la moelle épinière plus rigoureux.
Électrofilées poly-vinylidenedifluoride-trifluoroéthylène (PVDF-TrFE) alignées fibreux conduites creux sont utilisés dans notre approche expérimentale. PVDF-TrFE est un polymère piézoélectrique qui génère une charge transitoire lorsque déformée mécaniquement et a été montré pour favoriser la régénération d’extension et axon neurites fois in vitro29,30 et in vivo 31. électrofilage est une méthode de fabrication échafaudage commune capable de produire rapidement des échafaudages fibreux fiables en utilisant une variété de polymères ayant des propriétés contrôlables telles que l’alignement de fibre, fibre de diamètre et l’épaisseur de l’échafaud pour neural et d’autres applications32,33,34.
De nombreuses études sur le rat SCs repiquées dans des sites de lésion de la moelle épinière ont démontré traitement efficacité5,9,18,19,20,21 ,26. Ces greffes sont neuroprotecteurs pour tissu qui entoure la lésion, de réduire la taille de cavité de lésion et promouvoir la régénération axonale dans le site de la lésion/transplantation et la myélinisation des axones régénérés. SCs humaines peuvent être transplantées autologously, un avantage par rapport à la plupart des autres neurones liés cellules24. Après une biopsie de nerf périphérique, SCs peuvent être isolées et purifiées et va proliférer à la quantité désirée pour la transplantation dans les humains. Autogreffe de SC pour les patients de la moelle épinière blessée a été prouvé pour être sûr en Iran35,36,37,38, Chine39,40et la United States41,42. SCs sont connus pour sécréter des nombreux facteurs neurotrophiques et les protéines de la matrice extracellulaire importants pour la croissance de l’axone et à jouer un rôle essentiel dans la régénération axonale après une lésion des nerfs périphériques. Notre objectif ici est de décrire les méthodes qui peuvent enquêter sur des conceptions de conduit pour améliorer les résultats de la transplantation de SC dans un modèle de transection de moelle épinière de rat complet.
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Protocol
rats femelles adultes de Fischer (180-200 g de poids corporel) sont logés conformément aux directives NIH et USDA. L’utilisation Comité (IACUC) de l’Université de Miami et un animalier institutionnel approuvé toutes les procédures animaux.
1. préparation avant Transplantation
- préparation Conduit.
- Coupe le conduit à 5 mm de longueur à l’aide d’une lame #10 sous un microscope à dissection.
NOTE : Le diamètre intérieur du conduit est entre 2,4 et 2,7 mm ; le diamètre extérieur est de 2,5-2,8 mm. - Plier le conduit doucement le long de la face longitudinale ( Figure 1 a). Couper quatre petites incisions sur 0,4 mm de long et au moins 1 mm sur les ouvertures du conduit et environ 1 mm d’intervalle à l’aide de straight edge ciseaux de Vannas ( Figure 1 b).
- Déplier le conduit ( Figure 1) et couper entre les deux incisions le long du même côté, créant deux fenêtres côte à côte ( Figure 1). S’assurer que les fenêtres peuvent être ouverts et fermés correctement le long du côté non coupé.
- Stériliser les conduits dans l’éthanol à 75 % pendant 25 min dans un plat de Pétri de 10 cm. Rincer les conduites une fois pendant 4 min avec 1 x en solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et transférer les conduites avec une pince stérile à une nouvelle boîte de Pétri 10 cm. Rincer les conduits deux fois avec du PBS 1 x pour chaque 25 min.
- Conserver les conduits dans du PBS 1 x jusqu'à l’intervention chirurgicale.
Remarque : Plusieurs conduites peuvent être stérilisés à la fois. Stocker les conduites dans des tubes à centrifuger distinct stérile de 1,5 mL pour les garder stérile.
- Coupe le conduit à 5 mm de longueur à l’aide d’une lame #10 sous un microscope à dissection.
- Green fluorescent protein (GFP)-préparation de la cellule de Schwann (SC)
- préparer des cultures SC purifiées par les nerfs tibiales de Fischer femelle adulte des rats comme décrit précédemment 43. À la fin de cette étape, plaque les SCs sur la poly-L-lysine (PLL)-enduit Pétri de 10 cm et maintenir dans un milieu D10/3M ; Ces SCs sont définis comme passage 0.
NOTE : D10/3M milieu est composé des éléments suivants : 10 % foetale de sérum bovin (FBS), 1 % la pénicilline-streptomycine (stylo/strep), 20 pituitaire µg/mL extrait, 2 µM forskoline, 2,5 nM heregulin dans Dulbecco ' s modified Eagle ' s moyenne (DMEM). - Reconstituer avec un milieu frais D10/3M (7 mL/10 cm boîte de Pétri) tous les 3 à 4 jours.
- Culture Split SC lorsqu’elle atteint le confluent de 70 à 80 %.
- Moyen de retirer et de rincer deux fois à Hank ' s équilibré de solution saline (HBSS) sans calcium ou magnésium.
- Ajouter 5 mL de 0,25 % de trypsine/EDTA dans chaque boîte de Pétri 10 cm et incuber pendant 5 min à température ambiante (RT).
- Ajouter 5 mL de milieu D10 (10 % SVF et 1 % plume/strep en DMEM) dans un tube à centrifuger de 50 mL pour neutraliser la trypsine. Solution
- doucement pipette la trypsine/EDTA dans le Petri plat plusieurs fois pour détacher SCs. Retirer la suspension cellulaire du plat et placez-le dans le tube à centrifuger préparé à l’étape précédente. Rincer le plat avec 5 mL de milieu de D10 et placez-le dans le tube à centrifuger afin d’optimiser la récolte de la cellule.
- Centrifuger les cellules à 370 x g pendant 5 min à 4 o C. Retirer le surnageant et remettre en suspension les cellules dans un milieu D10/3M 4 mL pour chaque division Pétri.
- Diluer 1 mL de suspension SC et 6 mL de milieu de D10/3M dans un plat de Pétri de 10 cm ; chaque boîte de Pétri de split se traduira par 4 boîtes de Pétri. Ces SCs sont définis comme passage 1.
- Reconstituer avec un milieu frais D10/3M le jour après l’ensemencement et chaque 3-4 jours après l’ensemencement.
- Une fois les SCs atteindre 70-80 % confluence, répétez les étapes 1.2.3.1 à 1.2.3.6. Les SCs courent maintenant le passage 2.
- Transduce les SCs atteignant une fois confluence de 50 %, avec un vecteur lentiviral codant la GFP dans D10/3M, milieu du jour au lendemain à une multiplicité d’infection de 30 décrite précédemment 44 , 45 .
- Reconstituer avec un milieu frais D10/3M le lendemain et chaque 3-4 jours après l’ensemencement.
- Une fois que les GFP-SCs atteint 70-80 % confluence, répétez les étapes 1.2.3.1 à 1.2.3.5 mais remettre en suspension les GFP-SCs dans 6 mL de milieu de D10 à la place. Déposer 15 µL de suspension GFP-SC dans un tube à centrifuger 1,5 mL et ajouter 15 µL de solution de bleu de trypan de 0,4 %. Mettez le tube à centrifuger doucement et diluer 10 µL du mélange dans une chambre de la diapositive de comptage cellulaire.
- Placez le chariot dans un compteur de cellules automatisées et de déterminer la densité cellulaire.
- Centrifuger les cellules à 370 x g pendant 5 min à 4 o C. Retirer le surnageant, resuspendre avec 1,5 mL de milieu de congélation pour chaque 3 x 10 6 GFP-SCs. Dispense 1,5 mL de suspension de GFP-SC dans un flacon cryogénique et congélation à -80 o C pendant au moins 24 h avant de passer à l’azote liquide pour le stockage.
NOTE : Congélation moyen : 25 % de FBS et 8 % diméthyl sulfoxide en DMEM. - GFP-SCs décongeler une semaine avant la chirurgie.
- Ajouter 10 mL D10 médium dans un tube à centrifuger 50 mL.
- Décongeler des flacons de GFP-SCs congelés au bain-marie à 37 o C jusqu'à ce que partiellement décongelé.
- Supprimer la suspension de GFP-SC de la fiole cryogénique et placez-le dans le tube à centrifuger 50 mL préparé en 1.2.8.1. Pipette de doucement la solution haut et bas à plusieurs reprises.
- Centrifuger les cellules à 370 x g pendant 5 min à 4 o C. Retirer le surnageant et remettre en suspension les cellules dans un milieu D10/3M 4 mL pour chaque flacon décongelé.
- Distribuer 2 mL de suspension de GFP-SC et 5 mL de milieu de D10/3M dans un plat de Pétri de 10 cm ; chaque flacon devrait se traduire par 2 boîtes de Pétri. Les GFP-SCs sont définis comme passage 3.
Remarque : Une boîte de Pétri 10 cm donne habituellement autour de 8 x 10 6 GFP-SCs après une semaine.
- Le jour de la chirurgie, répétez l’étape 1.2.6. Utilisation de la densité cellulaire calculée à l’étape 1.2.10.
- Dosage aliquotes de 3 x 10 6 GFP-SCs dans centrifugeuse stérile de 1,5 mL tubes basés sur la densité de la cellule calculée à partir d’étape 1.2.9. Centrifuger les aliquotes de GFP-SC à 370 x g pendant 5 min à 4 o C et éliminer le surnageant. Ajouter 1 mL de milieu DMEM/F12 à chaque aliquote et centrifuger à 370 x g.
Remarque : Chaque animal reçoit 3 x 10 6 GFP-SCs. moyennes avec du sérum est utilisé avec GFP-SCs jusqu'à cette étape. - Garder GFP-SCs sur la glace jusqu’au moment de la transplantation.
- préparer des cultures SC purifiées par les nerfs tibiales de Fischer femelle adulte des rats comme décrit précédemment 43. À la fin de cette étape, plaque les SCs sur la poly-L-lysine (PLL)-enduit Pétri de 10 cm et maintenir dans un milieu D10/3M ; Ces SCs sont définis comme passage 0.
2. Compléter la Transection au niveau thoracique 8 (T8)
- préparation animaux pour la chirurgie
- anesthésier un Fischer femelle rat (180-200 g) avec une injection intrapéritonéale de kétamine (60 mg/kg de poids corporel) et de xylazine (5 mg/kg de poids corporel). Contrôler la profondeur de l’anesthésie avant de passer à l’étape suivante en cochant orteil pincement et réponses clignement des yeux.
- Raser l’arrière du rat avec une tondeuse électrique et essuyer la peau avec l’éthanol à 70 %. Appliquer du lubrifiant ophtalmique sur les deux yeux. Transférer l’animal dans la table de chirurgie sur un coussin chauffant pour maintenir la température corporelle à environ 37 o C. Place l’animal sur un rouleau pour les vertèbres sont faciles d’accès.
Remarque : Le rouleau peut faire du papier essuie-tout ou 2 en x2 en gaze qui peut être stérilisé. Plus gros rouleaux est recommandés lorsque T7-T9 doit être posé à plat sur le dessus du rouleau.
- T7 à T9 laminectomie
- localiser le point de repère pour les apophyses épineuses T9-T11.
NOTE : Les écarts entre T9 et T10 T11 sont petites par rapport aux autres segments j’ain la région. Après avoir placé le rat sur le rouleau, les apophyses épineuses T9-T11 se sentira comme une petite bosse triangulaire à travers la peau. - Faire une incision médiane de 4 à 5 cm de la peau à l’aide d’une lame #10 de T4 à T11. Faire une petite incision dans la couche de graisse superficielle avec des ciseaux courbes avec les extrémités franches à disséquer la graisse.
NOTE : Autres types d’instruments peuvent être utilisés pour séparer la graisse, mais les ciseaux courbes avec les extrémités franches activez la méthode plus efficace et moins invasive pour la séparation des graisse. - Localiser les apophyses épineuses T9 T7 en utilisant le dos de la lame #10. Tenez le muscle à propos de T4 avec une pince émoussée et faites une incision dans le muscle le long de chaque côté des vertèbres de T6-T10. Faire la coupe au plus près les vertèbres que possible à faire, une ouverture propre à l’animal un préjudice minime.
- Isoler chaque chaque apophyse de T7 à T9 en coupant les muscles et les ligaments entre T6 et T7, T7 et T8, T8 et T9 et T9 et T10 avec une lame #10.
- Utilisez un rongeur pour supprimer tout muscles et des ligaments sur les lamelles de T7 à T9. Supprimer les muscles et les ligaments aussi latéralement que possible jusqu'à ce que les écarts entre les apophyses transverses de T7 à T9 sont visibles.
- Enlever l’apophyse T9 avec un rongeur. Maintenez l’apophyse T8 avec pince émoussée et soulevez doucement pour élever la lamina T9 à la petite ouverture entre les processus T9 et T10.
- Supprimer la lamina à partir de l’ouverture et le déplacement rostralement avec un rongeur à T9. Retirez la lame latéralement autant que possible ; les racines de la dorsale doit être visibles après la laminectomie.
- Une fois que la lame est enlevée, répétez le processus pour T8 et T7.
Remarque : Au cours de la laminectomie, utilisez absorption lances pour enlever le sang tout en continuant avec la laminectomie. En cas de saignement excessif, placer une éponge compressée sur le site de saignement et ajouter une solution saline pour aider à la coagulation sanguine.
- localiser le point de repère pour les apophyses épineuses T9-T11.
- Transection à T8
- Placer le rétracteur autour de T7 à T9. Une fois que toutes les lamelles sont enlevés, s’assurer que les écarts entre les apophyses transverses sont visibles, en particulier à T8. Examinez également les os le long des deux côtés entre T7 à T9 pour assurer il n’y a aucune saillie vers l’extérieur des fragments d’os.
Remarque : Cette lacune à T8 est importante pour réaliser la résection complète. Les vertèbres sur toute la longueur doivent être retirés pour faciliter leur insertion conduit. - Couper la partie dorsale et des racines ventrales au-dessus et en dessous à l’aide de T8 inclinée ciseaux de printemps. Ajouter une solution saline à la moelle épinière et attendez que le sang au caillot.
Remarque : cette étape est importante pour une insertion correcte conduit. - Placer les ciseaux coudé printemps au-dessus de la moelle épinière dans les écarts entre les apophyses transverses à T8 et faites une coupe de rompre complètement la moelle épinière. Placer un petit morceau de mousse compressée dans l’écart de 2 à 2,5 mm et ajoutez une solution saline à la zone immédiatement.
- Placer le rétracteur autour de T7 à T9. Une fois que toutes les lamelles sont enlevés, s’assurer que les écarts entre les apophyses transverses sont visibles, en particulier à T8. Examinez également les os le long des deux côtés entre T7 à T9 pour assurer il n’y a aucune saillie vers l’extérieur des fragments d’os.
3. Insertion de conduit
- en attendant que les souches de cordon sectionné atteindre l’hémostase, sortez un conduit de PBS 1 x. Couper les triangles d’absorption en mince longs morceaux et rangez-les dans le conduit pour enlever l’excès PBS. S’assurer que les fenêtres prédécoupées sont ouverts.
- Supprimer une solution saline et le sang à l’aide de fines pièces longues de triangles d’absorption. Soulevez les deux souches de la moelle épinière utilise une microspatula pour assurer la bonne séparation. Soulevez le moignon rostral avec le microspatula doucement et faire passer le conduit sur le moignon avec les fenêtres face à soi-même. Assurez-vous que le moignon tout est inséré et il n’y a pas de saignement excessif dans le conduit.
- Soulever le moignon caudal délicatement et glissez l’autre extrémité du tube sur le moignon. Assurez-vous que le moignon tout est inséré et les fenêtres sont sur la face dorsale ( Figure 2 a).
4. Cellule de Schwann / matrice Injectable (voir Table des matières) préparation et Injection
- en attendant le cordon sectionné atteindre l’hémostase, retirez le support au-dessus du culot de GFP-SC (préparé à l’étape 1.2). Resuspendre les GFP-SCs dans 10 µl de froid DMEM/F12. Ajouter 10 µl de froid gel injectable dans la suspension cellulaire et bien mélanger en répété de pipetage. Garder le mélange de matrice de GFP-SC/DMEM/F12/injectable sur la glace jusqu'à insertion conduit fin.
- Après s’être assuré que les fenêtres sur la surface dorsale sont ouvertes ( Figure 2 a), injecter 20 µl du mélange matrice GFP-SC/DMEM/F12/injectable dans le conduit par l’une des fenêtres prédécoupées 46 à l’aide d’une embout et une micropipette de chargement la tache occidentale. Si le mélange de matrice de SC/DMEM/F12/injectable doit déborder le conduit, enlevez le surplus avec des triangles d’absorption. Fermez les fenêtres après l’injection ; suture n’est pas nécessaire ( Figure 2 b).
5. La fermeture et soins postopératoires
calques de- Suture du muscle et la graisse superficielle. Nettoyer la peau avec l’éthanol à 70 % et puis agrafe (p. ex., utiliser des agrafes de plaie) la peau ferme. Garder les animaux dans un incubateur thermiquement réglementé jusqu'à ce qu’ils reprennent conscience. Transférer les animaux dans des cages. Fournir de l’eau avec un tube d’alimentation depuis longtemps et placer les boulettes sur la literie pour un accès facile.
- Administrer buprénorphine (0,1 mg/kg de poids corporel) deux fois par jour pendant 3 jours par voie sous-cutanée commençant immédiatement après la chirurgie pour réduire la douleur. Injecter de gentamycine (5 mg/kg de poids corporel) par voie sous-cutanée une fois par jour pendant 7 jours immédiatement après la chirurgie pour prévenir et réduire l’infection. Injecter 10 mL de solution de Ringer amorcez par voie sous-cutanée deux fois par jour pendant 7 jours pour l’hydratation.
- Vide vessies manuellement deux fois par jour jusqu'à la vessie fonctionnent retourne. En cas d’infection de la vessie, puis administrer 10 mL de solution saline par voie sous-cutanée jusqu'à ce que l’urine devient clair. S’il n’y a aucune amélioration en deux jours, injecter gentamycine (5 mg/kg de poids corporel, une fois par jour) par voie sous-cutanée jusqu'à ce que l’urine devient clair.
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Representative Results
L’objectif de l’utilisation de cette technique chirurgicale consiste à évaluer l’utilisation d’un conduit structuré et matrice injectable qui maximise la fonction SC après la transplantation en rempli sectionnées moelles épinières. Trois semaines après la transplantation, les animaux sont perfusés avec paraformaldéhyde à 4 % et les colonnes vertébrales sont grossièrement disséqués et fixe le même fixateur pour encore 24 h. La moelle épinière est ensuite disséquée et les échantillons pour les coupes sagittales cryostat sont placés dans une solution de saccharose 30 % pour la cryoprotection. 1 mm coupes épaisses isolées au milieu du pont d’un autre ensemble de disséqués moelles épinières SC sont placés dans le fixateur de glutaraldéhyde à traiter pour profilés en plastique. Les échantillons sont soumis à un calendrier pour la préparation microscopique électron comme détaillé par Bates et al. 47. les coupes sagittales cryostat étaient immunomarquage avec un anticorps primaire contre GFP, protéine fibrillaire acide gliale (GFAP), neurofilaments (RT97) de la chaîne lourde et neurofilament à chaîne moyenne (NF) suivie des anticorps secondaires y compris chèvre-anti-poulet-488, chèvre-anti-lapin-546, chèvre-anti-souris-647 et chèvre-anti-lapin 647, respectivement. GFP-SCs ont été distribués uniformément le long et à l’intérieur du conduit (Figure 3 a; murs intérieurs indiquées par des lignes jaunes). La régénération axonale est observée (Figure 3 b) et est étroitement liée à la présence de GFP-SCs (figures 3 a et Figure 3) qui indique que cette technique est de proposer un pont SC dans un canal d’échange structuré et en promouvoir la régénération axonale le long du pont entre les souches rostrales et caudales. Les vaisseaux sanguins et des axones myélinisés se retrouvent également dans le centre du pont SC (Figure 3D). On trouvera plus de détails sur l’effet de SCs avec électrofilées PVDF-TrFE fibreux conduites sur la régénération axonale dans notre récent ouvrage publié31.
Autres mesures de résultats peuvent être effectuées notamment : quantifier la régénération axonale en coupes sagittales de la ligne-transect-méthode décrite dans nos récents travaux31 et de quantifier le nombre d’axones myélinisés et vaisseaux dans des coupes en plastique. Échantillons préparés pour profilés en plastique peuvent être sectionnées davantage pour la microscopie électronique à transmission quantifier le nombre d’axones amyélinisés. La cryoprotected moelle épinière échantillons peuvent également être transversales au lieu de sagittally sectionné et l’immunomarquage afin de quantifier la régénération axonale et la présence de GFP-SCs. tests comportementaux peuvent également être effectuées sur les animaux à des intervalles appropriés tout en les animaux sont maintenus.
Figure 1 : préparation de la fenêtre dans le conduit. Plier un côté le long de l’axe longitudinal de la conduite de 5 mm (A). Couper quatre incisions sur 0,4 mm de long et au moins 1 mm par les ouvertures de la conduite (B). Chaque incision est séparés d’environ 1 mm. Par déplier le conduit, les 4 coupes parallèles sont observés (C). Couper entre les deux incisions le long de l’axe rostral caudal pour créer une fenêtre qui s’ouvre en soulevant le rabat. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : fermeture de la fenêtre après injection SC/DMEM/F12/matrice. Fenêtres sont ouvertes en pliant retour chaque lambeau après avoir placé le conduit entre souches rostrales et caudales (A). Fenêtres sont fermées après l’injection (B). Echelle = 1 mm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : images confocales de fluorescents de coupes sagittales et une image de champ lumineux d’une coupe en plastique de moelles épinières transplantés avec GFP-SCs en alignement fibreux conduites PVDF-TrFE. Vue d’ensemble du pont SC dans les conduits où les murs intérieurs sont indiquées par des lignes jaunes et immunomarquage pour GFP et protéine fibrillaire acide gliale (GFAP) de visualiser les transplantés SCs et astrocytes de hôte de la moelle épinière, respectivement. Axones régénérés sont marquées avec le RT97 (heavy-chain neurofilaments) (A, B) et les anticorps chaîne moyenne neurofilaments (NF, C). Les axones n’apparaissent pas comme en (A) en raison de son association étroite avec GFP-SCs comme on l’observe dans la région du Mid-conduite en (C) avec un grossissement supérieur. Les axones ne sont pas visibles dans le moignon rostral en raison de l’analyse incomplète dans la profondeur de la section de tissu lors de l’imagerie par microscopie confocale. Les vaisseaux sanguins (étiquetées v en ré) et des axones myélinisés (étiquetés comme MA en ré) étaient tous deux observés dans la région de Mid-conduite dans une section en plastique. Agrandissements et barreaux de l’échelle : A, B (10 x, 200 µm) ; C (20 x, 100 µm) ; D (63 x, 25 µm). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
L’étape la plus importante dans la création d’un modèle efficace de transection est sectionnant la moelle épinière dans une ou deux coupes. Un écart de 2 à 2,5 mm entre les souches médullaires rostral et caudale devrait être présent sur le site de transection. Les trois raisons très probables de tel un fossé n’apparaissant ne pas sont (1) les racines dorsales/ventrale n’étaient pas correctement supprimés, (2) la dure-mère ventrale n’a pas été éliminée adéquatement et/ou (3) l’animal n’était pas correctement positionné sur le rouleau placé sous lui.
Pour effectuer une insertion efficace conduit entre les souches : le (1) diamètre du conduit doit être adapté pour des espèces spécifiques et âge de l’animal utilisé dans l’expérience ; (2) limbes doivent être enlevées assez latéralement jusqu'à ce que l’écart entre les apophyses transverses peut être visualisée ; (3) il faut enlever les racines et (4) insertion conduit entre les souches devrait être mise en oeuvre du premier coup. Si plusieurs tentatives sont nécessaires, cela peut causer un oedème dans les souches, outre ce qui complique la tâche d’insertion conduits entre les souches et causant des blessures supplémentaires.
Pour effectuer l’introduction efficace de matrice GFP-SC/DMEM/F12/injectable dans le conduit, veiller à ce que : (1) la moelle épinière n’est pas saignement avant insertion conduit entre les souches. S’il y a le liquide dans le conduit après l’insertion entre les souches, utiliser un petit morceau de lance de l’absorption pour supprimer via les fenêtres prédécoupées. (2) s’assurer que le conduit est bien glissé sur les deux souches de la moelle épinière et (3) que les fenêtres prédécoupées dorsales sont ouverts. L’injection de 20 µl du mélange matrice SC/injectable doit être plus que suffisant pour remplir le conduit. Débordement des fenêtres prédécoupées est un bon indicateur pour la transplantation efficace.
Les limites de cette procédure sont : (1) aucune restauration de la dure-mère, (2) aucun contrôle sur le mouvement du conduit/SC ne transplantation après la chirurgie et (3) aucune méthode alternative s’il y a fuite en injectant le mélange de matrice de SC/injectable.
L’avantage de cette procédure est la combinaison de l’utilisation d’un conduit les deux structuré avec une matrice injectable. Un conduit fait avec un matériau de choix qui est souple à insérer entre les souches peut être utilisé dans cette procédure chirurgicale. N’importe quelle matrice injectable de choix peut également être utilisée dans cette procédure ; un gel thermosensible est préférable en raison de sa capacité à gel in situ et le contour de la forme du moignon créant une interface transparente. Conduites avec une structure interne plus complexe peuvent être utilisés au lieu d’un intérieur creux. Médicaments, facteurs de croissance, petites molécules ou n’importe quel type de cellule peut être incorporé dans le canal d’échange structuré ou la matrice injectable ou les deux à améliorer la survie de la greffe, neural protègent immédiatement après la blessure, réduire l’inflammation, promouvoir l’axone régénération et promouvoir l’angiogenèse.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Nous tenons à remercier le vecteur Viral et les noyaux de l’Animal au projet de Miami à la paralysie de la Cure pour produisant la lenti-GFP-virus et fournissant soins des animaux, respectivement et l’histologie et noyaux d’imagerie pour l’utilisation du cryostat, microscope confocal, et microscope à fluorescence avec stéréo enquêteur. Financement a été assuré par NINDS (09923), DOD (W81XWH-14-1-0482) et NSF (DMR-1006510). M.B. Bunge est le Christine E Lynn distingué professeur de neurosciences.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cryogenic vials | ThermoFisher Scientific | 5000-0020 | |
| 10 cm Petri dish | VWR | 25382-428 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium: nutrient mixture F-12 | ThermoFisher Scientific | 11039-021 | "DMEM/F12" in protocol. |
| Penicillin-streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140-122 | "Pen/Strep" in protcol. |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH300-70-03 | "FBS" in protocol. |
| Pituitary extract | Biomedical Technologies | BT-215 | |
| Forskolin | Sigma-Aldrich | F6886 | |
| Heregulin | R&D Systems | 396-HB/CF | |
| Poly L-lysine | Sigma-Aldrich | P2636 | "PLL" in protocol. |
| Dulbecco's modified Eagle's medium | ThermoFisher Scientific | 11965-092 | "DMEM" in protocol. |
| Hank's balanced salt solution | ThermoFisher Scientific | 14170-112 | "HBSS" in protocol. |
| Tryspin-EDTA | ThermoFisher Scientific | 15400-054 | |
| Female Fischer rat (160-180g) | Envigo | ||
| Vannas scissor, straight | FST | 15018-10 | |
| Ketamine | Vedco Inc | 5098976106 | 100 mg/ml |
| Xylazine | Lloyd Inc | AnaSed | 20 mg/ml |
| Gentamycin | APP Pharmaceuticals | NDC 63323-010-02 | Can be any brand of choice. |
| Micro Spatula | FST | 10089-11 | Can be any brand of choice. |
| Curved scissors with blunt end | FST | 14017-18 | Can be any brand of choice. |
| Blunt forceps | FST | 11006-12 | Can be any brand of choice. |
| rongeur | FST | 16121-14 | Can be any brand of choice. |
| Angled spring scissors | FST | 15006-09 | Can be any brand of choice. |
| Absorption triangles | FST | 18105-03 | Can be any brand of choice. |
| Gelfoam | Henry Schein | 9083300 | "Compressed foam" in protocol. |
| #10 blades | Sklar | 06-3010 | Can be any brand of choice. |
| Matrigel | Corning | 354234 | "Injectable matrix" in protocol. |
| Chicken anti-green fluorescent protein antibody | Millipore | AB16901 | |
| Mouse RT97 hybridoma antibody | DSHB | RT97 | |
| Rabbit anti-neurofilament antibody | Encor Biotechnology, Inc | PRCA-NF-H | |
| Polyclonal Rabbit anti-Glial Fibrillary Acidic Protein antibody | Dako | Z033401 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-chicken IgG (H+L) | ThermoFisher Scientific | A-11039 | |
| Alexa Fluor 546 goat anti-rabbit IgG (H+L) | ThermoFisher Scientific | A-11035 | |
| Alexa Fluor 647 goat anti-rabbit IgG (H+L) | ThermoFisher Scientific | A-21244 | |
| Alexa Fluor 647 goat anti-mouse IgG (H+L) | ThermoFisher Scientific | A-21236 | |
| Confocal Microscopy | Nikon | clsi |
References
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