Waiting
Procesando inicio de sesión ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Transplantation af Schwann celler inde PVDF-TrFE ledningsnet til bro Transected rotte rygmarven træstubbe for at fremme Axon regenerering over kløften

Published: November 3, 2017 doi: 10.3791/56077
Automatic Translation
1, 2, 3, 1,4,5
1The Miami Project to Cure Paralysis, University of Miami Miller School of Medicine, 2Department of Materials Science and Engineering, New Jersey Institute of Technology, 3Department of Biomedical Engineering, New Jersey Institute of Technology, 4Department of Cell Biology, University of Miami Miller School of Medicine, 5Department of Neurological Surgery, University of Miami Miller School of Medicine

Summary

I denne artikel beskrives en teknik til at indsætte en hule conduit mellem rygmarven stubbe efter komplet transection og fyld med Schwann celler (SCs) og injicerbar basalmembranen matrix for at bygge bro og fremme axon regeneration på tværs af hullet.

Abstract

Blandt forskellige modeller for rygmarvsskader i rotter bruges kontusion model mest ofte fordi det er den mest almindelige type af menneskelige rygmarvsskader. Komplet transection model, er men ikke som klinisk relevant som kontusion model, den mest stringent metode til at evaluere axon regenerering. I kontusion model er det vanskeligt at skelne regenereret fra spirede eller skånet axoner på grund af tilstedeværelsen af de resterende post vævsskade. I komplet transection model er en "passerelle" metode nødvendigt at udfylde tomrummet og skabe kontinuitet fra den rostralt til caudale stubbe for at evaluere effektiviteten af behandlingerne. En pålidelig passerelle kirurgi er afgørende for at teste resultatet foranstaltninger ved at reducere variabiliteten på grund af den kirurgiske metode. De protokoller er beskrevet her er brugt til at forberede Schwann celler (SCs) og ledningsanlæg før transplantation, komplet transection af rygmarven på thorax plan 8 (T8), indsætte kanalen, og transplantation SCs ind på conduit. Denne fremgangsmåde bruger også i situ geldannende af en injicerbar basalmembranen matrix med SC transplantation, der giver forbedret axon vækst på tværs af de rostralt og caudale grænseflader med værten væv.

Introduction

Rygmarv skade reparation er en kompleks og udfordrende problem, som vil kræve en kombinatorisk behandlingsstrategi, der omfatter, for eksempel, brug af celler og en biomateriale at skabe en gunstig mikromiljø for transplanterede cellefunktion og axon Regeneration på stedet for skade. Hemisection1,2,3,4,5,6,7,8,9 og komplet transection10 ,11,12,13,14,15,16,17,18,19 ,20,21,22 modeller er ofte bruges til at vurdere virkningerne af biomateriale-baserede passerelle behandlinger. Fordelen ved at bruge en hemisection model er, at det giver mere stabilitet for passerelle konstruktionen i forhold til komplet transection. I hemisection modeller, er det imidlertid vanskeligt at bevise axon regenerering som et resultat af den anvendte terapeutiske metode på grund af tilstedeværelsen af skånet væv. Komplet transection model er den mest stringent metode til at påvise axon regenerering.

Forskellige naturlige og syntetiske materialer er blevet undersøgt til brug som en injicerbar gel, en præ-dannet gel placeret i kontusion eller hemisection modeller, eller som en struktureret conduit i hemisection eller komplet transection modeller (detaljeret i anmeldelser23 , 24 , 25). in situ geldannende af en injicerbar matrix/SC blanding skaber en mere eftergivende grænseflade mellem transplantation og vært ledningen til axon passage26,27 i forhold til pre geléagtig matrix/SC implantater 5 , 18 , 19 , 28. i situ geldannende tilladt matrix til kontur omkring uregelmæssige vært grænseflader der henviser til, at en mere stiv og struktureret conduit eller en mindre moldable præformerede gel ikke kunne. En struktureret conduit giver ofte kontakt vejledning og implantat stabilitet i modsætning til en injicerbar matrix. Protokollerne præsenteres her beskrive en kirurgisk procedure, der udnytter både en injicerbar basalmembranen matrix (f.eks. matrigel, se Tabel af materialer, omhandlet som injicerbar matrix her) og en struktureret kanal til evaluere axon regenerering i den strengeste rygmarv skade model.

Electrospun poly-vinylidenedifluoride-trifluorethylen (PVDF-TrFE) justeret fibrøst hule ledningsanlæg bruges i vores eksperimenterende tilgang. PVDF-TrFE er en piezoelektriske polymer, der genererer en forbigående afgift når mekanisk deforme og har vist sig at fremme neurite forlængelse og axon regenerering både in vitro-29,30 og in vivo 31. Electrospinning er en fælles stillads fabrikationsanlæg metode, der hurtigt kan producere pålidelige fibrøst stilladser ved hjælp af en række polymerer med kontrollerbare egenskaber som fiber justering, fiber diameteren og tykkelsen af stillads til neurale og andre applikationer32,33,34.

Talrige undersøgelser af rotte SCs transplanteret ind i rygmarv skade websteder har demonstreret behandling virkning5,9,18,19,20,21 ,26. Disse Transplantationer er neuroprotektive for væv omkring læsion, reducere læsion hulrum størrelse og fremme axon regenerering i læsion/transplantation site og myelination af regenereret axoner. Menneskelige SCs kan transplanteres autologously, en fordel i forhold til de fleste andre neurale-relaterede celler24. Efter en perifer nerve biopsi, SCs kan isoleres og renses og vil formere sig til den ønskede mængde til transplantation ind i mennesker. Autolog SC transplantation for rygmarvsskadede patienter har vist sig for at være sikkert i Iran35,36,37,38, Kina39,40, og den USA41,42. SCs er kendt for at udskille talrige neurotrope faktorer og ekstracellulære matrix proteiner vigtigt for axon vækst og til at spille en væsentlig rolle i axon regenerering efter perifer nerveskade. Vores mål her er at beskrive metoder, der kan undersøge conduit design til at forbedre resultatet af SC transplantation i en komplet rotte rygmarven transection model.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

kvindelige voksne Fischer rotter (180-200 g kropsvægt) er anbragt ifølge NIH og USDA retningslinjer. Den institutionelle Animal Care og brug udvalg (IACUC) på University of Miami godkendt alle animalske procedurer.

1. før Transplantation forberedelse

  1. Conduit forberedelse.
    1. Afskåret 5 mm i længden ved hjælp af en #10 blade under et mikroskop for dissekere conduit.
      Bemærk: Den indvendige diameter af kanalen er mellem 2,4-2.7 mm; den ydre diameter er mellem 2,5-2,8 mm.
    2. Fold conduit forsigtigt langs længderetningen side ( figur 1A). Cut fire små indsnit omkring 0,4 mm lang og mindst 1 mm fra åbninger af kanalen og ca. 1 mm fra hinanden ved hjælp af lige kant markriyor saks ( figur 1B).
      1. Udfolde conduit ( figur 1 c) og skåret mellem to indsnit langs den samme side at skabe to vinduer side om side ( figur 1 d). Sikre at vinduerne kan åbnes og lukkes ordentligt langs uncut.
    3. Sterilisere ledningsanlæg i 75% ethanol i 25 min i en 10-cm petriskål. Skyl ledningsanlæg engang i 4 min. med 1 x fosfatbufferet saltopløsning (PBS) og overføre ledningsnet med steril pincet til en ny 10-cm petriskål. Skyl ledningsanlæg to gange med 1 x PBS i 25 min.
    4. Gemme ledningsanlæg i 1 x PBS indtil kirurgi.
      Bemærk: Mange ledningsanlæg kan steriliseres på én gang. Gemme ledningsanlæg i separate sterile 1,5 mL centrifugeglas at holde dem sterile.
  2. Grøn fluorescerende proteiner (NGL)-Schwann celle (SC) forberedelse
    1. forberede renset SC kulturer fra de tibial nerver af voksne kvindelige Fischer rotter som tidligere beskrevet 43. Ved afslutningen af dette trin plade på SCs på poly-L-lysin (PLL)-coatede 10-cm petriskåle og vedligeholde i D10 / 3M medium; disse SCs defineres som passage 0.
      Bemærk: D10 / 3M medium er sammensat af følgende: 10% føtal bovint serum (FBS), 1% penicillin-streptomycin (pen/strep), 20 µg/mL hypofyse ekstrakt, 2 µM forskolin, 2,5 nM heregulin i Dulbecco ' s ændret Eagle ' s medium (DMEM).
    2. Genopbygge med friske D10 / 3M medium (7 mL/10-cm petriskål) hver 3-4 dage.
    3. Split SC kultur når det når 70-80% sammenløb.
      1. Fjern medium og skylles to gange med Hank ' s afbalanceret saltopløsning (HBSS) uden calcium eller magnesium.
      2. Tilsættes 5 mL 0,25% trypsin/EDTA til hver 10 cm petriskål og Inkuber i 5 min. ved stuetemperatur (RT).
      3. Tilsættes 5 mL af D10 medium (10% FBS og 1% pen/strep i DMEM) i en 50 mL-centrifugerør at neutralisere trypsin.
      4. Forsigtigt afpipetteres trypsin/EDTA løsning i Petri fad flere gange for at løsne SCs. Fjern cellesuspension fra fadet og læg det i centrifugeglasset forberedt i forrige trin. Skyl skål med 5 mL af D10 medium og læg det i centrifugeglasset at maksimere celle høst.
      5. Centrifugeres celler på 370 x g i 5 min på 4 o C. Fjern supernatanten og resuspend celler i 4 mL D10/3 M medium for hver petriskål opdelt.
      6. Give afkald på 1 mL SC suspension og 6 mL af D10 / 3M medium til et 10-cm petriskål; hver petriskål split vil resultere i 4 petriskåle. Disse SCs defineres som passage 1.
      7. Fylde med friske D10 / 3M medium dagen efter plating og hver 3-4 dage efter plating.
      8. Engang SCs nå 70-80% sammenløb, Gentag trin 1.2.3.1 til 1.2.3.6. SCs er nu på passage 2.
    4. Transduce SCs engang at nå 50% sammenløb, med en lentiviral vektor kodning normal god landbrugspraksis i D10 / 3M medium natten på en mangfoldighed af infektion af 30 som tidligere beskrevet 44 , 45 .
    5. Genopbygge med friske D10 / 3M medium næste dag og hver 3-4 dage efter plating.
    6. Når normal god landbrugspraksis-SCs nå 70-80% sammenløb, Gentag trin 1.2.3.1 til 1.2.3.5 men resuspend normal god landbrugspraksis-SCs i 6 mL af D10 medium i stedet. Dispensere 15 µL af normal god landbrugspraksis-SC suspension i en 1,5 mL-centrifugerør og tilføje 15 µL af 0,4% trypan blå løsning. Svirp centrifugeglasset forsigtigt og dispensere 10 µL af blandingen ind i et kammer i diasset celle-optælling.
      1. Placere dias i en automatiseret celle counter og bestemme den celle tæthed.
    7. Centrifugeres celler på 370 x g i 5 min på 4 o C. Fjern supernatanten, resuspend med 1,5 mL indefrysning medium for hver 3 x 10 6 NGL-SCs. dispensere 1,5 mL af normal god landbrugspraksis-SC suspension i en kryogene hætteglas og fryse på-80 o C i mindst 24 timer før flytter til flydende nitrogen for oplagring.
      Bemærk: Frysning medium: 25% FBS og 8% dimethylsulfoxid i DMEM.
    8. Tø normal god landbrugspraksis-SCs én uge før operationen.
      1. Tilføje 10 mL D10 medium i et 50 mL-centrifugerør.
      2. Tø hætteglas af frosne normal god landbrugspraksis-SCs i vandbad på 37 o C indtil delvis optøet.
      3. Fjerne normal god landbrugspraksis-SC suspension fra kryogene hætteglasset og placere det i 50 mL-centrifugerør parat i 1.2.8.1. Forsigtigt afpipetteres løsningen op og ned flere gange.
      4. Centrifugeres celler på 370 x g i 5 min på 4 o C. Fjern supernatanten og resuspend celler i 4 mL D10/3 M medium for hvert hætteglas optøet.
      5. Give afkald på 2 mL af normal god landbrugspraksis-SC suspension og 5 mL af D10 / 3M medium til et 10-cm petriskål; hvert hætteglas bør resultere i 2 petriskåle. Normal god landbrugspraksis-SCs defineres som passage 3.
        Bemærk: En 10 cm petriskål udbytter normalt omkring 8 x 10 6 NGL-SCs efter én uge.
    9. På dagen for operationen, Gentag trin 1.2.6. Brug celle tæthed beregnet i trin 1.2.10.
    10. Dispensere delprøver af 3 x 10 6 NGL-SCs i sterile 1,5 mL centrifugeres rør baseret på celle massefylden beregnes fra trin 1.2.9. Centrifugeres normal god landbrugspraksis-SC delprøver på 370 x g i 5 min på 4 o C og Fjern supernatanten. Der tilsættes 1 mL af DMEM/F12 medium til hver delprøve og centrifugeres på 370 x g.
      Bemærk: Hvert dyr modtager 3 x 10 6 NGL-SCs. Medium med serum bruges med normal god landbrugspraksis-SCs indtil dette trin.
    11. Holde normal god landbrugspraksis-SCs på is indtil tidspunktet for transplantation.

2. Komplet Transection på thorax Level 8 (T8)

  1. dyrs forberedelse til operation
    1. Anesthetize en kvindelig Fischer rotte (180-200 g) med en intraperitoneal injektion af ketamin (60 mg/kg kropsvægt) og xylazin (5 mg/kg legemsvægt). Overvåge dybde af anæstesi før du fortsætter til næste trin ved at kontrollere tå klemme og øjet blinker svar.
    2. Barbere bagsiden af rotte med en elektrisk clipper og aftør huden med 70% ethanol. Anvende oftalmologiske smøremiddel på begge øjne. Overføre dyret til tabellen kirurgi på en varmepude til at opretholde kropstemperaturen på ca 37 o C. sted dyret på et kast så ryghvirvler er let at adgang.
      Bemærk: Roll kan foretages fra køkkenrulle eller 2 i x2 i gaze, der kan steriliseres. Større ruller anbefales når T7-T9 skal være lagt flad oven på rullen.
  2. T7 til T9 laminektomi
    1. Find vartegn for torntappene T9-T11.
      Bemærk: Huller mellem T9, T10 og T11 er små sammenlignet med andre segmenter jegn regionen. Efter at placere rotten på rullen, T9-T11 torntappene vil føles som en lille trekantet bule gennem huden.
    2. Lave en 4 til 5 cm midterlinjen snit i huden ved hjælp af en #10 blade fra T4 til T11. Gør et lille snit i den overfladiske fedtlag med buet saks med stumpe ender til at dissekere fedt.
      Bemærk: Andre typer af instrumenter kan bruges til at adskille fedt men buet saks med stumpe ender aktiverer den mest effektive og mindst invasive metode til fedt adskillelse.
    3. Find T7 T9 spinosus processer ved hjælp af bagsiden af #10 blade. Holder muskler på om T4 med stumpe pincet og gøre et snit i muskel langs hver side af ryghvirvler fra T6-T10. Gøre cut så tæt på ryghvirvler som muligt at gøre en ren åbning og påføre dyret minimal skade.
    4. Isolere hver enkelte spinosus proces fra T7 T9 ved at skære muskler og ledbånd mellem T6 og T7, T7 og T8, T8 og T9, og T9 og T10 med en #10 blade.
    5. Bruge en rongeur til at fjerne enhver muskler og ledbånd på bladplader fra T7 til T9. Fjerne muskler og ledbånd som sideværts som muligt indtil forskellene mellem tværgående processer fra T7 til T9 er synlige.
    6. Fjerne T9 spinosus processen med en rongeur. Hold T8 spinosus processen med stumpe pincet og løft forsigtigt at ophøje T9 lamina på den lille åbning mellem T9 og T10 processer.
    7. Fjerne lamina startende fra åbningen og flytte rostrally med en rongeur på T9. Fjerne lamina sideværts så meget som muligt; de dorsale rødder skal være synlige efter laminectomy.
    8. Når lamina er fjernet, Gentag processen for T8 og T7.
      Bemærk: Under laminektomi, bruge absorption spears til at fjerne blod, mens han fortsatte med laminectomy. Hvis overskydende blødning opstår, placere en komprimeret svamp på det blødende sted og tilføje saltvand til at hjælpe med blodpropper.
  3. Transection på T8
    1. placere retractor omkring T7 til T9. Når alle bladplader er fjernet, Sørg for at hullerne mellem tværgående processer er synlige, især på T8. Også undersøge knogler langs længden på begge sider mellem T7 til T9 at sørge for der er ingen knoglerester fremspringende udad.
      Bemærk: Denne kløft på T8 er vigtigt for at udføre en komplet transection. Hvirvlerne langs længden bør fjernes for lettere conduit indsættelse.
    2. Skære den dorsal og ventral rødderne ovenfor og nedenfor T8 ved hjælp af vinklet foråret saks. Tilføje saltvand til rygmarven og vente for blodet at størkne.
      Bemærk: dette trin er vigtigt for korrekt conduit indsættelse.
    3. Placer vinklet foråret saks over rygmarven i hullerne mellem de tværgående processer på T8 og gøre en skåret til helt sever rygmarven. Læg et lille stykke af komprimerede skum i den resulterende 2-2,5 mm hul og straks tilføje saltvand til området.

3. Conduit indsættelse

  1. mens vi venter afhuggede ledningen stubbe at opnå hæmostase, tage en kanal fra 1 x PBS. Skær absorption trekanter i tynde lange stykker og læg dem til conduit at fjerne overskydende PBS. Kontroller, at pre-cut vinduerne er åbne.
  2. Fjern saltvand og blod ved hjælp af tynde lange stykker af absorption trekanter. Lift to stubbe af rygmarven ved hjælp af en microspatula til at sikre god adskillelse. Forsigtigt løfte den rostralt stub med microspatula og glide på conduit over stumpen med vinduer mod sig selv. Sikre, at hele stumpen er indsat, og der er ingen overskydende blødning i conduit.
  3. Forsigtigt løfte den caudale stump og glider anden enden af en ledning over stumpen. Sørg for at hele stumpen er indsat, og vinduerne på den dorsale overflade ( figur 2A).

4. Schwann celle / injicerbare Matrix (se tabel af materialer) forberedelse og injektion

  1. mens vi venter de afhuggede ledningen til at nå hæmostase, fjerne medium over normal god landbrugspraksis-SC pellet (udarbejdet i trin 1.2). Resuspend normal god landbrugspraksis-SCs i 10 µl af kolde DMEM/F12. Tilføje 10 µl koldt injicerbar gel til cellesuspension og bland godt ved gentaget pipettering. Holde normal god landbrugspraksis-SC/DMEM/F12/injicerbar matrix blandingen på is, indtil conduit indsættelse er fuldført.
  2. Efter at sikre, at windows på den dorsale overflade er åbne ( figur 2A), indsprøjtes 20 µl af normal god landbrugspraksis-SC/DMEM/F12/injicerbar matrix blanding til conduit gennem en af præ-cut windows 46 ved hjælp af en vestlige skamplet lastning spids og en mikropipette. Hvis SC/DMEM/F12/injicerbar matrix blandingen bør meget kanalen, fjerne overskydende med absorption trekanter. Luk vinduerne efter injektion; suturering er ikke nødvendig ( figur 2B).

5. Sår lukning og Postoperative pleje

  1. sutur muskel lag og de overfladiske fedt lag. Rens huden med 70% ethanol og derefter korte (f.eks. ved hjælp af sår klip) huden lukkes. Holde dyrene i en termisk regulerede inkubator, indtil de genvinde bevidsthed. Overføre dyrene tilbage i bure. Give vand med en lang påfyldningsrør og placere mad pellets på bedding for nem adgang.
  2. Administrere buprenorphin (0,1 mg/kg kropsvægt) to gange om dagen i 3 dage subkutant starter straks efter operation for at mindske smerter. Injicere phosphatbufferet (5 mg/kg kropsvægt) subcutaneously en gang om dagen i 7 dage umiddelbart efter operation for at forebygge og reducere infektion. Injicér 10 mL af laktat Ringers løsning subkutant to gange om dagen i 7 dage for hydrering.
  3. Tom blærer funktion manuelt to gange om dagen indtil blæren returnerer. Hvis blæreinfektion opstår, derefter administrere 10 mL saltvand subkutant indtil urinen bliver klar. Hvis der ikke er nogen forbedring i to dage, injicere phosphatbufferet (5 mg/kg legemsvægt, én gang dagligt) subcutaneously indtil urinen bliver klart.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Målet med ved hjælp af denne kirurgiske teknik er at evaluere brugen af en struktureret conduit og injicerbar matrix, der maksimerer SC funktion efter transplantation til færdige transected rygmarv. Tre uger efter transplantation, dyrene er perfunderet med 4% PARAFORMALDEHYD og rygsøjler er groft dissekeret og fast i den samme fixativ for en anden 24 h. Rygmarven er derefter dissekeret og prøver for sagittal frysemikrotomsnit er placeret i en 30% rørsukkeropløsning for cryoprotection. 1 mm tyk tværsnit isoleret fra midten af SC broen af et andet sæt af dissekerede rygmarv placeres i glutaraldehyd fiksativ at behandle til plast dele. Prøveeksemplarerne udsættes for en tidsplan for elektron Mikroskopisk forberedelse som beskrevet af Bates et al. 47. sagittal frysemikrotomsnit var immunostained med primær antistof mod normal god landbrugspraksis, glial fibrillære sure protein (GFAP), tunge kæde neurofilament (RT97) og mellemlang kæde neurofilament (NF) efterfulgt af sekundære antistoffer herunder gede-anti-kylling-488, gede-anti-kanin-546, gede-anti-mus-647 og gede-anti-kanin 647, henholdsvis. Normal god landbrugspraksis-SCs blev fordelt jævnt langs og inden for conduit (figur 3A, indre vægge angivet af gule linjer). Axon regenerering er observeret (figur 3B) og er tæt forbundet med tilstedeværelsen af normal god landbrugspraksis-SCs (figur 3A og figur 3 c) angiver, at denne teknik er succesfulde i at yde SC bro inden for en struktureret conduit og i fremme axon regenerering langs broen mellem rostralt og caudale stubbe. Blodkar og myelinerede axoner blev også fundet i centrum af SC-broen (figur 3D). Flere oplysninger om effekten af SCs med electrospun PVDF-TrFE fibrøst ledningsanlæg på axon regeneration kan findes i vores seneste offentliggjorte arbejde31.

Andre statusmålinger kan udføres herunder: kvantificere axon regenerering i sagittal sektioner af linje-Transekttællinger-metoden i vores seneste arbejde31 og kvantificerer antallet af myelinerede axoner og fartøjer i plast tværsnit. Prøver forberedt til plast dele kan yderligere sectioned for transmissions Elektron Mikroskopi til at opgøre antallet af unmyelinated axoner. Cryoprotected rygmarven prøver kan også være cross-sectioned i stedet for sagittally i snit og immunostained til at kvantificere axon regenerering og tilstedeværelsen af normal god landbrugspraksis-SCs. adfærdsmæssige undersøgelser kan også udføres på dyr med passende mellemrum mens dyrene vedligeholdes.

Figure 1
Figur 1: vinduet forberedelse i conduit. Fold side langs den langsgående akse af 5 mm conduit (A). Cut fire snit omkring 0,4 mm lang og mindst 1 mm fra åbninger af conduit (B). Hvert snit er ca 1 mm fra hinanden. Af udfolder kanalen, overholdes de 4 parallelle udskæringer (C). Skåret mellem de to indsnit langs den rostralt-caudale akse til at oprette et vindue, der kan åbnes ved at løfte flappen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: vinduet lukker efter SC/DMEM/F12/matrix injektion. Windows er åbnet ved at folde tilbage hver klap efter markedsføring conduit mellem rostralt og caudale stubbe (A). Windows er lukket efter injektion (B). Skalalinjen = 1 mm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Konfokal fluorescerende billeder af sagittal sektioner og en lysfelt billede af en plast tværsnit fra rygmarv transplanteret med normal god landbrugspraksis-SCs i justeret fibrøst PVDF-TrFE ledningsanlæg. Oversigt over SC broen i ledningskanaler hvor de indre vægge er markeret med gule linjer og immunostained for normal god landbrugspraksis og glial fibrillære sure protein (GFAP) til at visualisere transplanteret SCs og vært rygmarven astrocytter, henholdsvis. Folier axoner var mærket med RT97 (heavy-kæde neurofilament) (A, B) og medium-chain neurofilament (NF, C) antistoffer. Axoner er ikke så synlige i (A) på grund af deres nære forhold til normal god landbrugspraksis-SCs som er observeret i regionen midten conduit i (C) med højere forstørrelse. Axoner er ikke synlige i den rostralt stump på grund af ufuldstændige scanningen i dybden af afsnittet væv, når imaging af Konfokal mikroskopi. Blodkar (mærket som v i D) og myelinerede axoner (mærket som MA i D) blev både observeret i regionen midten conduit i en plastik sektion. Forstørrelser og skala barer: A, B (10 x 200 µm); C (20 x 100 µm); D (63 x 25 µm). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Det mest afgørende skridt i at skabe en effektiv transection model er severing rygmarven i én eller to nedskæringer. Et 2-2,5 mm hul mellem rostralt og caudale rygmarven stubbe bør være til stede på webstedet transection. De tre mest sandsynligt årsager til sådan et hul ikke vises er (1) de dorsale/ventral rødder ikke blev fjernet korrekt, (2) den ventrale dura blev ikke fjernet tilstrækkeligt og/eller (3) dyr blev ikke placeret korrekt på rullen placeret under hende.

Til at udføre en effektiv conduit indsættelse mellem stubbe: (1) diameter af conduit skal skræddersys til bestemte arterne af og alder af de dyr som bruges i eksperimentet; (2) bladplader skal fjernes sideværts nok indtil afstanden mellem tværgående processer kan visualiseres; (3) rødder skal fjernes og (4) conduit indsættelse mellem stubbe bør ske i første forsøg. Hvis flere forsøg er nødvendige, kan dette forårsage ødemer i stubbe, yderligere komplicerer opgaven med conduit indsættelse mellem stubbe og forårsager yderligere skade.

Til at udføre effektiv normal god landbrugspraksis-SC/DMEM/F12/injicerbar matrix Introduktion til kanalen, sikre, at: (1) rygmarven er ikke blødning før conduit indsættelse mellem stubbe. Hvis der er væske i conduit efter indsættelse mellem stubbe, skal du bruge et lille stykke af absorption spyd til at fjerne det via vinduerne pre-cut. (2) at sikre, at kanalen er gled ind på begge rygmarven træstubbe godt og (3) at den dorsale pre-cut vinduer er åbne. Injektion af 20 µl af SC/injicerbar matrix blandingen bør være mere end nok til at fylde conduit. Overløb fra vinduerne pre-cut er en god målestok for effektiv transplantation.

Begrænsningerne i denne procedure er: (1) ingen restaurering af dura, (2) ingen kontrol over bevægelsen af conduit/SC transplantation efter afslutningen af operationen, og (3) ingen alternative metode hvis der er lækage samtidig indsprøjtning SC/injicerbar matrix blanding.

Fordelen ved denne procedure er en kombination af brugen af både en struktureret conduit med en injicerbar matrix. Enhver conduit lavet med et materiale af valg, der er bøjelig skal indsættes mellem træstubbe kan bruges i denne kirurgiske procedure. Enhver injicerbare matrix valg kan også bruges i denne procedure; en temperatur-følsomme gel er at foretrække på grund af dens evne til at gel i situ og konturer til form træstub at skabe en problemfri interface. Ledningsnet med en mere kompleks indre struktur kan bruges i stedet for et hul interiør. Narkotika, vækstfaktorer, små molekyler eller enhver celletype kan indarbejdes i den strukturerede conduit eller injicerbare matrix eller både at forbedre transplantation overlevelse, neurale beskyttelse umiddelbart efter skaden, reducere inflammation, fremme axon Regeneration, og fremme angiogenese.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Vi vil gerne takke Viral vektor og dyr kerner på Miami projektet til Cure lammelse for at producere den lenti-normal god landbrugspraksis-virus og giver dyrs pleje, henholdsvis, og histologi og Imaging kerner for brug af kryostaterne, Konfokal mikroskop, og fluorescerende mikroskop med Stereo Investigator. Finansieringen blev leveret af NINDS (09923), DOD (W81XWH-14-1-0482) og NSF (DMR-1006510). M.B. Bunge er det Christine E Lynn Distinguished Professor i neurovidenskab.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cryogenic vials ThermoFisher Scientific 5000-0020
10 cm Petri dish VWR 25382-428
Dulbecco's modified Eagle's medium: nutrient mixture F-12 ThermoFisher Scientific 11039-021 "DMEM/F12" in protocol.
Penicillin-streptomycin ThermoFisher Scientific 15140-122 "Pen/Strep" in protcol.
Fetal bovine serum Hyclone SH300-70-03 "FBS" in protocol.
Pituitary extract Biomedical Technologies BT-215
Forskolin Sigma-Aldrich F6886
Heregulin R&D Systems 396-HB/CF
Poly L-lysine Sigma-Aldrich P2636 "PLL" in protocol.
Dulbecco's modified Eagle's medium ThermoFisher Scientific 11965-092 "DMEM" in protocol.
Hank's balanced salt solution ThermoFisher Scientific 14170-112 "HBSS" in protocol.
Tryspin-EDTA ThermoFisher Scientific 15400-054
Female Fischer rat (160-180g) Envigo
Vannas scissor, straight FST 15018-10
Ketamine Vedco Inc 5098976106 100 mg/ml
Xylazine Lloyd Inc AnaSed 20 mg/ml
Gentamycin APP Pharmaceuticals NDC 63323-010-02 Can be any brand of choice.
Micro Spatula FST 10089-11 Can be any brand of choice.
Curved scissors with blunt end FST 14017-18 Can be any brand of choice.
Blunt forceps FST 11006-12 Can be any brand of choice.
rongeur FST 16121-14 Can be any brand of choice.
Angled spring scissors FST 15006-09 Can be any brand of choice.
Absorption triangles FST 18105-03 Can be any brand of choice.
Gelfoam Henry Schein 9083300 "Compressed foam" in protocol.
#10 blades Sklar 06-3010 Can be any brand of choice.
Matrigel Corning 354234 "Injectable matrix" in protocol.
Chicken anti-green fluorescent protein antibody Millipore AB16901
Mouse RT97 hybridoma antibody DSHB RT97
Rabbit anti-neurofilament antibody Encor Biotechnology, Inc PRCA-NF-H
Polyclonal Rabbit anti-Glial Fibrillary Acidic Protein antibody Dako Z033401
Alexa Fluor 488 goat anti-chicken IgG (H+L) ThermoFisher Scientific A-11039
Alexa Fluor 546 goat anti-rabbit IgG (H+L) ThermoFisher Scientific A-11035
Alexa Fluor 647 goat anti-rabbit IgG (H+L) ThermoFisher Scientific A-21244
Alexa Fluor 647 goat anti-mouse IgG (H+L) ThermoFisher Scientific A-21236
Confocal Microscopy Nikon clsi

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. King, V. R., Alovskaya, A., Wei, D. Y., Brown, R. A., Priestley, J. V. The use of injectable forms of fibrin and fibronectin to support axonal ingrowth after spinal cord injury. Biomaterials. 31 (15), 4447-4456 (2010).
  2. Liu, T., Houle, J. D., Xu, J., Chan, B. P., Chew, S. Y. Nanofibrous collagen nerve conduits for spinal cord repair. Tissue Eng Part A. 18 (9-10), 1057-1066 (2012).
  3. Novikova, L. N., Pettersson, J., Brohlin, M., Wiberg, M., Novikov, L. N. Biodegradable poly-beta-hydroxybutyrate scaffold seeded with Schwann cells to promote spinal cord repair. Biomaterials. 29 (9), 1198-1206 (2008).
  4. Bamber, N. I., Li, H., Aebischer, P., Xu, X. M. Fetal spinal cord tissue in mini-guidance channels promotes longitudinal axonal growth after grafting into hemisected adult rat spinal cords. Neural Plast. 6 (4), 103-121 (1999).
  5. Xu, X. M., Zhang, S. X., Li, H., Aebischer, P., Bunge, M. B. Regrowth of axons into the distal spinal cord through a Schwann-cell-seeded mini-channel implanted into hemisected adult rat spinal cord. Eur J Neurosci. 11 (5), 1723-1740 (1999).
  6. Bamber, N. I., et al. Neurotrophins BDNF and NT-3 promote axonal re-entry into the distal host spinal cord through Schwann cell-seeded mini-channels. European Journal of Neuroscience. 13 (2), 257-268 (2001).
  7. Iannotti, C., et al. Glial cell line-derived neurotrophic factor-enriched bridging transplants promote propriospinal axonal regeneration and enhance myelination after spinal cord injury. Exp Neurol. 183 (2), 379-393 (2003).
  8. Deng, L. X., et al. GDNF modifies reactive astrogliosis allowing robust axonal regeneration through Schwann cell-seeded guidance channels after spinal cord injury. Exp Neurol. 229 (2), 238-250 (2011).
  9. Deng, L. X., et al. A Novel Growth-Promoting Pathway Formed by GDNF-Overexpressing Schwann Cells Promotes Propriospinal Axonal Regeneration, Synapse Formation, and Partial Recovery of Function after Spinal Cord Injury. J Neurosci. 33 (13), 5655-5667 (2013).
  10. Chen, X., et al. Bone marrow stromal cells-loaded chitosan conduits promote repair of complete transection injury in rat spinal cord. J Mater Sci Mater Med. 22 (10), 2347-2356 (2011).
  11. Hurtado, A., et al. Robust CNS regeneration after complete spinal cord transection using aligned poly-L-lactic acid microfibers. Biomaterials. 32 (26), 6068-6079 (2011).
  12. Cheng, H., Huang, Y. C., Chang, P. T., Huang, Y. Y. Laminin-incorporated nerve conduits made by plasma treatment for repairing spinal cord injury. Biochem Biophys Res Commun. 357 (4), 938-944 (2007).
  13. Fan, J., et al. Neural regrowth induced by PLGA nerve conduits and neurotrophin-3 in rats with complete spinal cord transection. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 97 (2), 271-277 (2011).
  14. Lietz, M., et al. Physical and biological performance of a novel block copolymer nerve guide. Biotechnol Bioeng. 93 (1), 99-109 (2006).
  15. Novikova, L. N., Novikov, L. N., Kellerth, J. O. Biopolymers and biodegradable smart implants for tissue regeneration after spinal cord injury. Curr Opin Neurol. 16 (6), 711-715 (2003).
  16. Tang, S., et al. The effects of controlled release of neurotrophin-3 from PCLA Scaffolds on the survival and neuronal differentiation of transplanted neural stem cells in a rat spinal cord injury model. PLoS One. 9 (9), e107517 (2014).
  17. Yao, L., et al. Improved axonal regeneration of transected spinal cord mediated by multichannel collagen conduits functionalized with neurotrophin-3 gene. Gene Ther. , (2013).
  18. Xu, X. M., Guénard, V., Kleitman, N., Bunge, M. B. Axonal regeneration into Schwann cell-seeded guidance channels grafted into transected adult rat spinal cord. J Comp Neurol. 351 (1), 145-160 (1995).
  19. Xu, X. M., Chen, A., Guenard, V., Kleitman, N., Bunge, M. B. Bridging Schwann cell transplants promote axonal regeneration from both the rostral and caudal stumps of transected adult rat spinal cord. J Neurocytol. 26 (1), 1-16 (1997).
  20. Takami, T., et al. Schwann cell but not olfactory ensheathing glia transplants improve hindlimb locomotor performance in the moderately contused adult rat thoracic spinal cord. J Neurosci. 22 (15), 6670-6681 (2002).
  21. Bunge, M. B., Wood, P. M. Handbook of Clinical Neurology. 109, 523-540 (2012).
  22. Fortun, J., Hill, C. E., Bunge, M. B. Combinatorial strategies with Schwann cell transplantation to improve repair of the injured spinal cord. Neurosci Lett. 456 (3), 124-132 (2009).
  23. Haggerty, A. E., Oudega, M. Biomaterials for spinal cord repair. Neurosci Bull. , (2013).
  24. Nomura, H., Tator, C. H., Shoichet, M. S. Bioengineered strategies for spinal cord repair. J Neurotrauma. 23 (3-4), 496-507 (2006).
  25. Straley, K. S., Foo, C. W. P., Heilshorn, S. C. Biomaterial Design Strategies for the Treatment of Spinal Cord Injuries. J Neurotrauma. 27 (1), 1-19 (2010).
  26. Williams, R. R., Henao, M., Pearse, D. D., Bunge, M. B. Permissive Schwann cell graft/spinal cord interfaces for axon regeneration. Cell Transplant. 24 (1), 115-131 (2015).
  27. Williams, R. R., Pearse, D. D., Tresco, P. A., Bunge, M. B. The assessment of adeno-associated vectors as potential intrinsic treatments for brainstem axon regeneration. J Gene Med. 14 (1), 20-34 (2012).
  28. Xu, X. M., Guenard, V., Kleitman, N., Aebischer, P., Bunge, M. B. A combination of BDNF and NT-3 promotes supraspinal axonal regeneration into Schwann cell grafts in adult rat thoracic spinal cord. Exp Neurol. 134 (2), 261-272 (1995).
  29. Lee, Y. S., Arinzeh, T. L. The influence of piezoelectric scaffolds on neural differentiation of human neural stem/progenitor cells. Tissue Eng Part A. 18 (19-20), 2063-2072 (2012).
  30. Lee, Y. S., Collins, G., Arinzeh, T. L. Neurite extension of primary neurons on electrospun piezoelectric scaffolds. Acta Biomater. 7 (11), 3877-3886 (2011).
  31. Lee, Y. S., Wu, S., Arinzeh, T. L., Bunge, M. B. Enhanced noradrenergic axon regeneration into schwann cell-filled PVDF-TrFE conduits after complete spinal cord transection. Biotechnol Bioeng. 114 (2), 444-456 (2017).
  32. Haider, A., Haider, S., Kang, I. -K. A comprehensive review summarizing the effect of electrospinning parameters and potential applications of nanofibers in biomedical and biotechnology. Arab J Chem. , (2015).
  33. Hassiba, A. J., et al. Review of recent research on biomedical applications of electrospun polymer nanofibers for improved wound healing. Nanomedicine (Lond). 11 (6), 715-737 (2016).
  34. Lee, Y. -S., Livingston Arinzeh, T. Electrospun Nanofibrous Materials for Neural Tissue Engineering. Polymers. 3 (1), 413-426 (2011).
  35. Oraee-Yazdani, S., et al. Co-transplantation of autologous bone marrow mesenchymal stem cells and Schwann cells through cerebral spinal fluid for the treatment of patients with chronic spinal cord injury: safety and possible outcome. Spinal Cord. 54 (2), 102-109 (2016).
  36. Saberi, H., et al. Safety of intramedullary Schwann cell transplantation for postrehabilitation spinal cord injuries: 2-year follow-up of 33 cases. J Neurosurg Spine. 15 (5), 515-525 (2011).
  37. Saberi, H., et al. Treatment of chronic thoracic spinal cord injury patients with autologous Schwann cell transplantation: an interim report on safety considerations and possible outcomes. Neurosci Lett. 443 (1), 46-50 (2008).
  38. Yazdani, S. O., et al. A comparison between neurally induced bone marrow derived mesenchymal stem cells and olfactory ensheathing glial cells to repair spinal cord injuries in rat. Tissue Cell. 44 (4), 205-213 (2012).
  39. Zhou, X. H., et al. Transplantation of autologous activated Schwann cells in the treatment of spinal cord injury: six cases, more than five years of follow-up. Cell Transplant. 21, Suppl 1. S39-S47 (2012).
  40. Chen, L., et al. A prospective randomized double-blind clinical trial using a combination of olfactory ensheathing cells and Schwann cells for the treatment of chronic complete spinal cord injuries. Cell Transplant. 23, Suppl 1. S35-S44 (2014).
  41. Guest, J., Santamaria, A. J., Benavides, F. D. Clinical translation of autologous Schwann cell transplantation for the treatment of spinal cord injury. Curr Opin Organ Transplant. 18 (6), 682-689 (2013).
  42. Bunge, M. B., Monje, P. V., Khan, A., Wood, P. M. Progress in Brain Research. , Elsevier. (2017).
  43. Meijs, M. F., et al. Basic fibroblast growth factor promotes neuronal survival but not behavioral recovery in the transected and Schwann cell implanted rat thoracic spinal cord. J Neurotrauma. 21 (10), 1415-1430 (2004).
  44. Blits, B., et al. Lentiviral vector-mediated transduction of neural progenitor cells before implantation into injured spinal cord and brain to detect their migration, deliver neurotrophic factors and repair tissue. Restor Neurol Neurosci. 23 (5-6), 313-324 (2005).
  45. Follenzi, A., Naldini, L. HIV-based vectors. Preparation and use. Methods Mol Med. 69, 259-274 (2002).
  46. Fouad, K., et al. Combining Schwann cell bridges and olfactory-ensheathing glia grafts with chondroitinase promotes locomotor recovery after complete transection of the spinal cord. J Neurosci. 25 (2), 1169-1178 (2005).
  47. Bates, M. L., Puzis, R., Bunge, M. B. Animal Models of Movement Disorders: Volume II. Lane, E. L., Dunnett, S. B. , Humana Press. 381-399 (2011).

Tags

Medicin sag 129 Schwann celler rygmarv skade PVDF-TrFE conduit komplet transection electrospinning piezoelektriske
Transplantation af Schwann celler inde PVDF-TrFE ledningsnet til bro Transected rotte rygmarven træstubbe for at fremme Axon regenerering over kløften
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lee, Y. S., Wu, S., Arinzeh, T. L.,… More

Lee, Y. S., Wu, S., Arinzeh, T. L., Bunge, M. B. Transplantation of Schwann Cells Inside PVDF-TrFE Conduits to Bridge Transected Rat Spinal Cord Stumps to Promote Axon Regeneration Across the Gap. J. Vis. Exp. (129), e56077, doi:10.3791/56077 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter