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PVDF के अंदर Schwann कोशिकाओं के प्रत्यारोपण-TrFE नाली Transected चूहा रीढ़ की हड्डी स्टंप को पाटने के लिए अंतर भर में Axon पुनर्जनन को बढ़ावा देने के लिए

Published: November 3, 2017 doi: 10.3791/56077
Automatic Translation
1, 2, 3, 1,4,5
1The Miami Project to Cure Paralysis, University of Miami Miller School of Medicine, 2Department of Materials Science and Engineering, New Jersey Institute of Technology, 3Department of Biomedical Engineering, New Jersey Institute of Technology, 4Department of Cell Biology, University of Miami Miller School of Medicine, 5Department of Neurological Surgery, University of Miami Miller School of Medicine

Summary

इस लेख को पूरा transection के बाद रीढ़ की हड्डी स्टंप के बीच एक खोखले नाली डालने के लिए और Schwann कोशिकाओं (SCs) और इंजेक्शन तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स के साथ भरने के लिए एक तकनीक का वर्णन करने के लिए पुल और अंतर भर में axon पुनर्जनन को बढ़ावा देने के ।

Abstract

चूहों में रीढ़ की हड्डी में चोट के लिए विभिन्न मॉडलों के बीच, चोट मॉडल सबसे अधिक बार इस्तेमाल किया है क्योंकि यह मानव रीढ़ की हड्डी की चोट का सबसे आम प्रकार है । पूरा transection मॉडल है, हालांकि के रूप में नैदानिक चोट मॉडल के रूप में प्रासंगिक नहीं है, सबसे कठोर विधि axon पुनर्जनन का मूल्यांकन करने के लिए है । चोट मॉडल में, यह अंकुरित या बख्शा axons से पुनर्जीवित करने के लिए शेष ऊतक पोस्ट चोट की उपस्थिति के कारण अंतर मुश्किल है । पूरा transection मॉडल में, एक पाटन विधि अंतर को भरने और rostral से caudal स्टंप को निरंतरता बनाने के क्रम में उपचार की प्रभावशीलता का मूल्यांकन करने के लिए आवश्यक है । एक विश्वसनीय ब्रिजिंग शल्य चिकित्सा पद्धति के कारण परिवर्तनशीलता को कम करके परिणाम उपायों का परीक्षण करने के लिए आवश्यक है । यहां वर्णित प्रोटोकॉल Schwann कोशिकाओं को तैयार करने के लिए उपयोग किया जाता है (SCs) और प्रत्यारोपण करने से पहले नाली, वक्ष स्तर 8 पर रीढ़ की हड्डी की पूरी transection (T8), नाली डालें, और नाली में SCs प्रत्यारोपण. यह दृष्टिकोण भी अनुसूचित जाति ट्रांसप्लांटेशन के साथ एक इंजेक्शन तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स के सीटू तालमेल में का उपयोग करता है कि मेजबान ऊतक के साथ rostral और caudal इंटरफेस भर में सुधार axon विकास की अनुमति देता है ।

Introduction

रीढ़ की हड्डी में चोट की मरंमत एक जटिल और चुनौतीपूर्ण समस्या यह है कि एक मिश्रित उपचार शामिल रणनीति की आवश्यकता होगी, उदाहरण के लिए, कोशिकाओं के उपयोग और एक के लिए एक अनुकूल microenvironment के लिए प्रत्यारोपण सेल समारोह और axon प्रदान करने के लिए सामग्री चोट के स्थल पर पुनर्जनन । Hemisection1,2,3,4,5,6,7,8,9 और पूर् transection10 ,11,12,13,14,15,16,17,18,19 ,20,21,22 मॉडल अक्सर के लिए उपयोग किया जाता है के प्रभाव का आकलन करने के लिए सामग्री आधारित ब्रिजिंग चिकित्सा । एक hemisection मॉडल का उपयोग कर के लाभ यह है कि यह पाटने के लिए और अधिक स्थिरता प्रदान करता है पूरा transection की तुलना में निर्माण । हालांकि, hemisection मॉडलों में, यह axon पुनर्जनन बख्शी ऊतक की उपस्थिति के कारण लागू चिकित्सीय विधि के एक परिणाम के रूप में साबित करने के लिए मुश्किल है । पूरा transection मॉडल axon पुनर्जनन प्रदर्शित करने के लिए सबसे कठोर तरीका है ।

विभिन्न प्राकृतिक और सिंथेटिक सामग्री एक इंजेक्शन जेल के रूप में उपयोग के लिए अध्ययन किया गया है, एक पूर्व गठित जेल चोट या hemisection मॉडल में रखा, या hemisection या पूरा transection मॉडल में एक संरचित नाली के रूप में (विस्तृत समीक्षा में23 , 24 , 25). एक इंजेक्शन मैट्रिक्स के सीटू तालमेल में /axon पार करने के लिए प्रत्यारोपण और मेजबान कॉर्ड के बीच एक और स्वतंत्र इंटरफेस बनाता है26,27 की तुलना में पूर्व gelled मैट्रिक्स/अनुसूचित जाति समाविष्ट 5 , 18 , 19 , 28. सीटू में तालमेल की अनुमति मैट्रिक्स अनियमित मेजबान इंटरफेस के आसपास समोच्च जबकि एक और अधिक कठोर और संरचित नाली या एक कम मोल्ड पूर्व गठित जेल नहीं सकता है । एक संरचित नाली अक्सर एक इंजेक्शन मैट्रिक्स के विपरीत संपर्क मार्गदर्शन और प्रत्यारोपण स्थिरता प्रदान करता है । यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल एक शल्य प्रक्रिया है कि दोनों एक इंजेक्शन तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स का लाभ लेता है का वर्णन (जैसे, matrigel, सामग्री की तालिका देखने के लिए, यहां इंजेक्शन मैट्रिक्स के रूप में संदर्भित) और एक संरचित नाली सबसे कठोर रीढ़ की हड्डी चोट मॉडल में axon पुनर्जनन का मूल्यांकन करें ।

Electrospun पाली-vinylidenedifluoride-trifluoroethylene (PVDF-TrFE) गठबंधन रेशेदार खोखले नाली हमारे प्रयोगात्मक दृष्टिकोण में उपयोग किया जाता है । PVDF-TrFE एक piezoelectric बहुलक है कि जब यांत्रिक विकृत और neurite विस्तार और axon पुनर्जनन दोनों इन विट्रो29,30 और vivo में बढ़ावा देने के लिए दिखाया गया है पर एक क्षणिक चार्ज उत्पन्न करता है 31. Electrospinning एक आम पाड़ निर्माण विधि है कि तेजी से फाइबर संरेखण, फाइबर व्यास, और के लिए पाड़ की मोटाई के रूप में नियंत्रणीय गुणों के साथ पॉलिमर की एक किस्म का उपयोग कर विश्वसनीय रेशेदार पाड़ का उत्पादन कर सकते है तंत्रिका और अंय अनुप्रयोगों३२,३३,३४।

चूहे रीढ़ की हड्डी की चोट साइटों में प्रत्यारोपित SCs के कई अध्ययनों उपचार प्रभावकारिता का प्रदर्शन किया है5,9,18,19,20,21 ,26. इन प्रत्यारोपण घावों के आसपास के ऊतकों के लिए न्यूरोप्रोटेक्टिव हैं, घाव गुहा आकार को कम करने, और पुनर्जीवित axons के घावों/प्रत्यारोपण साइट और myelination में axon पुनर्जनन को बढ़ावा देने के । मानव SCs autologously प्रत्यारोपण किया जा सकता है, एक लाभ जब सबसे अन्य तंत्रिका से संबंधित कोशिकाओं की तुलना में24. एक परिधीय तंत्रिका बायोप्सी के बाद, SCs अलग और शुद्ध किया जा सकता है और मानव में प्रत्यारोपण के लिए वांछित राशि के लिए पैदा होगा । रीढ़ की हड्डी के लिए ऑटोलॉगस SC ट्रांसप्लांटेशन घायल मरीजों में सुरक्षित साबित हो रहा है ईरान३५,३६,३७,३८, चीन३९,४०, और संयुक्त राज्य अमेरिका४१,४२। SCs कई neurotrophic कारकों और extracellular मैट्रिक्स axon विकास के लिए महत्वपूर्ण प्रोटीन और परिधीय तंत्रिका चोट के बाद axon पुनर्जनन में एक आवश्यक भूमिका निभाने के लिए गुप्त करने के लिए जाना जाता है । हमारे यहां लक्ष्य विधियों जो नाली डिजाइन की जांच करने के लिए एक पूरा चूहा रीढ़ की हड्डी transection मॉडल में अनुसूचित जाति के प्रत्यारोपण के परिणाम में सुधार कर सकते है का वर्णन है ।

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Protocol

< p class = "jove_content" > महिला वयस्क फिशर चूहों (१८०-२०० & #160; जी शरीर के वजन) NIH और USDA दिशानिर्देश के अनुसार घर कर रहे हैं । विश्वविद्यालय के संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) मियामी के सभी पशु प्रक्रियाओं को मंजूरी दे दी ।

< p class = "jove_title" > 1. प्री-ट्रांसप्लांटेशन वडा

  1. नाली वडा.
    1. एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत एक #10 ब्लेड का उपयोग कर लंबाई में 5 मिमी के लिए नाली में कटौती ।
      नोट: नाली के भीतरी व्यास 2.4-2.7 मिमी के बीच है; बाहरी व्यास 2.5-2.8 मिमी के बीच है ।
    2. अनुदैर्ध्य पक्ष के साथ धीरे नाली गुना (< मजबूत वर्ग = "xfig" > चित्रा 1a ). चार छोटे चीरा के बारे में ०.४ मिमी लंबे समय और नाली के उद्घाटन और के बारे में 1 मिमी के अलावा सीधे किनारे Vannas कैंची (< मजबूत वर्ग = "xfig" > चित्रा 1b ) का उपयोग करने से कम 1 मिमी कट.
      1. प्रकट नाली (< मजबूत वर्ग = "xfig" > चित्रा 1C ) और एक ही पक्ष द्वारा दो खिड़कियों पक्ष बनाने के साथ साथ दो चीरा के बीच कट (< मजबूत वर्ग = "xfig" > चित्रा 1 डी ). सुनिश्चित करें कि windows खोला जा सकता है और ठीक से काटा पक्ष के साथ बंद कर दिया ।
    3. एक 10 सेमी पेट्री डिश में 25 मिनट के लिए ७५% इथेनॉल में नाली निष्फल । एक बार नाली कुल्ला 1x फास्फेट के साथ 4 मिनट के लिए खारा (पंजाब) और एक नया 10 सेमी पेट्री डिश के लिए बाँझ संदंश के साथ नाली हस्तांतरण. 25 मिनट प्रत्येक.
      4. के लिए 1x पंजाबियों के साथ दो बार नाली कुल्ला
    4. सर्जरी तक 1x पंजाब में नाली की दुकान ।
      नोट: कई नाली एक बार में निष्फल जा सकता है । उन्हें बाँझ रखने के लिए अलग बाँझ १.५ मिलीलीटर केंद्रापसारक ट्यूबों में नाली की दुकान.
  2. Green फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP)-Schwann सेल (SC) की तैयारी
    1. वयस्क मादा फिशर चूहों की टिबियल नसों से शुद्ध अनुसूचित जाति संस्कृतियों तैयार के रूप में पहले से वर्णित < सुप वर्ग = "xref" > ४३ . इस कदम के पूरा होने पर, पाली-एल-lysine (पीएलएल) पर SCs प्लेट-लेपित 10 सेमी पेट्री व्यंजन और D10/3m माध्यम में बनाए रखने; इन SCs को गद्यांश 0 के रूप में परिभाषित किया गया है ।
      नोट: D10/3m मध्यम निंनलिखित से बना है: 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), 1% पेनिसिलिन-streptomycin (pen/strep), 20 & #181; g/एमएल पिट्यूटरी निकालें, 2 & #181; M forskolin, २.५ एनएम हेरेगुलिन इन Dulbecco & #39; s संशोधित ईगल & #39; एस मीडियम (DMEM).
    2. ताजा D10/3m मध्यम (7 मिलीलीटर/10-सेमी पेट्री डिश) के साथ हर 3 से 4 दिनों के लिए भरपाई ।
    3. विभाजन अनुसूचित जाति संस्कृति एक बार यह 70-80% संगम तक पहुंचता है ।
      1. निकाल मध्यम और कुल्ला दो बार हांक & #39 के साथ; एस कैल्शियम या मैग्नीशियम के बिना संतुलित नमक समाधान (HBSS) ।
      2. ०.२५% trypsin/EDTA के प्रत्येक 10 सेमी पेट्री डिश और कमरे के तापमान (आरटी) में 5 मिनट के लिए मशीन के 5 मिलीलीटर जोड़ें ।
      3. D10 मध्यम के 5 मिलीलीटर जोड़ें (10% FBS और 1% कलम/DMEM में strep) में एक ५०-एमएल केंद्रापसारक ट्यूब trypsin बेअसर करने के लिए ।
      4. लिएर प्लास्टिक पेट्री डिश में trypsin/EDTA हल करने के लिए कई बार SCs को अलग करें । डिश से सेल सस्पेंशन निकालें और इसे पिछले चरण में तैयार केंद्रापसारक ट्यूब में जगह है । D10 मध्यम के 5 मिलीलीटर के साथ पकवान कुल्ला और यह केंद्रापसारक ट्यूब में जगह के लिए सेल हार्वेस्ट को अधिकतम ।
      5. 5 मिनट के लिए ३७० x g पर कोशिकाओं केंद्रापसारक 4 o C. supernatant निकालें और प्रत्येक D10 डिश विभाजन के लिए 4 मिलीलीटर पेट्री/3m माध्यम में कोशिकाओं reसस्पैंड ।
      6. एक 10-सेमी पेट्री डिश में अनुसूचित जाति के 1 मिलीलीटर और D10/3m माध्यम के 6 मिलीलीटर वितरण; प्रत्येक पेट्री डिश विभाजन 4 पेट्री व्यंजन में परिणाम होगा । ये SCs गद्यांश 1.
        7. के रूप में परिभाषित हैं
      7. नए सिरे से D10/3m मध्यम चढ़ाना के बाद दिन और हर 3-4 चढ़ाना के बाद दिन के साथ भरपाई ।
      8. एक बार SCs रीच 70-80% संगम, 1.2.3.6 करने के लिए कदम 1.2.3.1 दोहराएँ. SCs अब बीतने वाले हैं 2.
    4. Transduce SCs एक बार ५०% संगम तक पहुंचने के साथ, lentiviral में एक GFP वेक्टर एंकोडिंग D10 के साथ 30 के संक्रमण की बहुलता में रातोंरात/पहले वर्णित < सुप class = "xref" > 44 , < सुप class = "xref" > 45 .
    5. ताजा D10/3m मध्यम अगले दिन और चढ़ाना के बाद हर 3-4 दिन के साथ भरपाई ।
    6. एक बार GFP-SCs तक 70-80% संगम तक पहुंच जाते हैं, 1.2.3.5 करने के लिए चरण 1.2.3.1 दोहराएँ लेकिन GFP मीडियम की 6 एमएल में SCs-D10 को फिर से सस्पेंड कर दीजिये. औषधालय 15 & #181; l का GFP-SC निलंबन में १.५ मिलीलीटर केंद्रापसारक ट्यूब और जोड़ें 15 & #181; l के ०.४% trypan ब्लू समाधान. झटका के केंद्रापसारक ट्यूब धीरे और वितरण 10 & #181, सेल के एक कक्ष में इस मिश्रण के एल की गिनती स्लाइड ।
      1. एक स्वचालित सेल काउंटर में स्लाइड जगह और कोशिका घनत्व निर्धारित करते हैं ।
    7. 4 ओ सी में 5 मिनट के लिए ३७० x g पर कोशिकाओं केंद्रापसारक । supernatant निकालें, हर 3x10 के लिए ठंड मध्यम के १.५ मिलीलीटर के साथ reसस्पैंड 6 GFP-SCs । औषधालय १.५ एमएल के GFP-SC निलंबन एक क्रायोजेनिक शीशी में, और फ्रीज में-८० हे भंडारण के लिए तरल नाइट्रोजन के लिए ले जाने से पहले सी के लिए कम से 24 ज.
      नोट: फ्रीजिंग मीडियम: 25% FBS और 8% dimethyl sulfoxide में DMEM.
    8. गल GFP-SCs सर्जरी से एक सप्ताह पहले ।
      1. एक ५० मिलीलीटर केंद्रापसारक ट्यूब में 10 मिलीलीटर D10 मध्यम जोड़ें ।
      2. गल शीशियों के जमे हुए GFP-SCs में पानी स्नान में ३७ o C तक आंशिक रूप से गल.
      3. क्रायोजेनिक शीशी से GFP-SC निलंबन निकालें और इसे 1.2.8.1 में तैयार ५० मिलीलीटर केंद्रापसारक ट्यूब में रखें । धीरे से समाधान को ऊपर और नीचे प्लास्टिक बार ।
      4. 5 मिनट के लिए ३७० x g पर कोशिकाओं केंद्रापसारक 4 o C. supernatant निकालें और 4 मिलीलीटर D10 में कोशिकाओं reसस्पेंड/प्रत्येक शीशी गल के लिए 3m मध्यम ।
      5. एक 10 सेमी पेट्री डिश में GFP-SC निलंबन और D10/3m माध्यम के 5 मिलीलीटर के 2 मिलीलीटर वितरण; प्रत्येक शीशी 2 पेट्री व्यंजन में परिणाम चाहिए । GFP-SCs बीतने के रूप में परिभाषित कर रहे हैं 3.
        नोट: एक 10 सेमी पेट्री डिश आमतौर पर एक सप्ताह के बाद 8x10 6 GFP-SCs के आसपास पैदावार ।
        6. सर्जरी के दिन
    9. पर दोहरा कदम 1.2.6 । चरण 1.2.10 में परिकलित कक्ष घनत्व का उपयोग करें.
    10. तिरस्कृत aliquots के 3x10 6 GFP-SCs में बाँझ १.५ मिलीलीटर केंद्रापसारक ट्यूबों सेल घनत्व के आधार पर कदम 1.2.9 से गणना की । केंद्रापसारक GFP-अनुसूचित जाति aliquots पर 5 मिनट के लिए ३७० x g 4 o C पर और supernatant निकालें । DMEM/F12 मध्यम के प्रत्येक aliquot के लिए 1 मिलीलीटर जोड़ें और ३७० x g.
      पर केंद्रापसारक नोट: प्रत्येक पशु 3x10 6 GFP-SCs प्राप्त करता है । सीरम के साथ मध्यम GFP-SCs के साथ इस कदम तक प्रयोग किया जाता है.
    11. रोपाई के समय तक बर्फ पर GFP-SCs रखें.
< p class = "jove_title" > 2. वक्ष स्तर पर पूरा Transection 8 (T8)

  1. सर्जरी के लिए पशु तैयार
    1. Anesthetize एक महिला फिशर चूहा (180-200 & #160; छ) intraperitoneal के एक ketamine इंजेक्शन के साथ (६० mg/kg & #160; शरीर का वजन) और xylazine (5 mg/kg & #160; शरीर का वजन). पैर की अंगुली चुटकी और आँख निमिष प्रतिक्रियाओं की जाँच द्वारा अगले कदम के लिए आगे बढ़ने से पहले संज्ञाहरण की गहराई पर नजर रखें ।
    2. एक इलेक्ट्रिक क्लिपर के साथ चूहे के पीछे दाढ़ी और ७०% इथेनॉल के साथ त्वचा पोंछ । दोनों आंखों के लिए नेत्र स्नेहक लागू करें । के बारे में ३७ में शरीर का तापमान बनाए रखने के लिए एक हीटिंग पैड पर शल्य चिकित्सा तालिका के लिए पशु हस्तांतरण हे ग. एक रोल पर जानवर जगह तो कशेरुकाओं का उपयोग करने के लिए आसान कर रहे हैं.
      नोट: रोल कागज तौलिया से बनाया जा सकता है या 2 x2 में धुंध में है कि निष्फल जा सकता है । बड़े रोल की सिफारिश की जब T7-T9 रोल के शीर्ष पर फ्लैट रखी जाने की जरूरत है ।
  2. T7 ते T9 laminectomy
    1. T9-टी11 स्पाइनल प्रक्रियाओं के लिए मील का पत्थर का पता लगाएँ.
      नोट: T9, T10, और टी11 के बीच अंतराल छोटे है अंय क्षेत्रों की तुलना में मैंn क्षेत्र । रोल पर चूहे को रखने के बाद T9-टी11 स्पाइनल प्रोसेस त्वचा के जरिए एक छोटे त्रिकोणीय धक्के की तरह महसूस करेगी ।
    2. -टी-4 से टी11 करने के लिए एक #10 ब्लेड का उपयोग कर त्वचा का एक चार से 5 सेमी midline चीरा बनाओ । वसा टुकड़े करने के लिए कुंद सिरों के साथ घुमावदार कैंची के साथ सतही वसा परत में एक छोटा सा चीरा बनाओ ।
      नोट: उपकरणों के अंय प्रकार के वसा अलग करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन कुंद के साथ घुमावदार कैंची, वसा जुदाई के लिए सबसे प्रभावी और कम इनवेसिव विधि सक्षम करें ।
    3. #10 ब्लेड के पीछे का उपयोग करके स्पाइनल प्रक्रियाओं को T9 करने के लिए T7 का पता लगाएँ । कुंद संदंश के साथ टी 4 के बारे में पेशी पकड़ो और T6-T10 से कशेरुकाओं के प्रत्येक पक्ष के साथ मांसपेशियों में एक चीरा बनाते हैं । एक साफ खोलने बनाने के लिए और पशु के लिए ंयूनतम चोट के कारण के रूप में संभव के रूप में कशेरुकाओं के करीब कटौती बनाओ ।
    4. मांसपेशियों और T6 और T7, T7 और T8, T8 और T9, और T9 और एक #10 ब्लेड के साथ T10 के बीच बंध काटने से T9 के लिए T7 से प्रत्येक व्यक्ति की रीढ़ की प्रक्रिया को अलग ।
    5. T7 से T9 पर laminae पर किसी भी मांसपेशी और बंध को हटाने के लिए एक rongeur का उपयोग करें । T7 से T9 तक अनुप्रस्थ प्रक्रियाओं के बीच अंतराल दिखाई दे रहे हैं जब तक कि बाद में संभव के रूप में मांसपेशियों और बंधन को दूर.
    6. एक rongeur के साथ T9 रीढ़ की हड्डी की प्रक्रिया को दूर । कुंद संदंश के साथ T8 रीढ़ की प्रक्रिया पकड़ो और धीरे लिफ्ट करने के लिए T9 और T10 प्रक्रियाओं के बीच छोटे खोलने पर T9 लेमिना तरक्की ।
    7. खोलने से शुरू लेमिना को हटाने और T9 पर एक rongeur के साथ rostrally चलती है । लेमिना को बाद में जितना हो सके निकालें; पृष्ठीय जड़ों laminectomy के बाद दिखाई जानी चाहिए ।
    8. एक बार लेमिना निकाल दिया जाता है, T8 और T7 के लिए प्रक्रिया को दोहराएँ.
      नोट: laminectomy के दौरान, laminectomy के साथ जारी रखते हुए रक्त निकालने के लिए अवशोषण स्पीयर्स का उपयोग करें । यदि अतिरिक्त रक्तस्राव होता है, खून बह रहा है साइट पर एक संपीड़ित स्पंज जगह और खारा जोड़ने के लिए रक्त के थक्के के साथ मदद ।
  3. Transection पर T8
    1. जगह T7 के आसपास रिट्रेक्टर को T9. एक बार सभी laminae हटा रहे हैं, सुनिश्चित करें कि अनुप्रस्थ प्रक्रियाओं के बीच अंतराल, विशेष रूप से T8 में दिखाई दे रहे हैं । इसके अलावा दोनों पक्षों पर लंबाई के साथ हड्डियों की जांच करने के लिए T7 के बीच T9 सुनिश्चित करने के लिए कोई हड्डी जावक फैलाने के टुकड़े कर रहे हैं.
      नोट: T8 पर यह अंतर पूरा transection प्रदर्शन के लिए महत्वपूर्ण है । लंबाई के साथ कशेरुकाओं आसान नाली प्रविष्टि के लिए हटाया जाना चाहिए ।
    2. ऊपर और नीचे T8 angled स्प्रिंग कैंची का उपयोग कर ऊपर और नीचे ventral जड़ों में कटौती । रीढ़ की हड्डी में खारा जोड़ें और खून का थक्का करने के लिए प्रतीक्षा करें । & #160;
      नोट: यह चरण उचित नाली प्रविष्टि के लिए महत्वपूर्ण है ।
    3. अनुप्रस्थ प्रक्रियाओं के बीच अंतराल में T8 पर रीढ़ की हड्डी के ऊपर angled स्प्रिंग कैंची जगह है और एक को पूरी तरह से रीढ़ की हड्डी तोड़ काट कर । इसके परिणामस्वरूप 2 में संकुचित फोम का एक छोटा सा टुकड़ा प्लेस-2.5 mm गैप और तुरंत क्षेत्र में खारा जोड़ें ।
< p class = "jove_title" > 3. नाली सम्मिलन

  1. रक्तस्तम्भन तक पहुंचने के लिए गंभीर कॉर्ड स्टंप के लिए इंतजार कर, 1x पंजाबियों से एक नाली बाहर ले । पतले लंबे टुकड़ों में अवशोषण त्रिकोण काटें और उंहें नाली में जगह अतिरिक्त पंजाबियों को हटा दें । जांच लें कि पूर्व में काटी गई खिड़कियां खुली हैं ।
  2. निकालें खारा और रक्त अवशोषण त्रिकोण के पतले लंबे टुकड़े का उपयोग कर । रीढ़ की हड्डी के दो स्टंप लिफ्ट एक microspatula का उपयोग करने के लिए अच्छी जुदाई सुनिश्चित करते हैं । धीरे microspatula के साथ rostral स्टंप उठा और अपने आप को सामना करना पड़ खिड़कियों के साथ स्टंप पर नाली पर्ची । सुनिश्चित करें कि पूरा स्टंप डाला गया है और नाली में कोई अतिरिक्त रक्तस्राव है ।
  3. धीरे caudal स्टंप उठा और स्टंप पर नाली के दूसरे छोर पर्ची । सुनिश्चित करें कि संपूर्ण स्टंप डाला गया है और खिड़कियां पृष्ठीय सतह पर हैं (< मजबूत वर्ग = "xfig" > चित्रा 2a ).
< p class = "jove_title" > 4. Schwann Cell/इंजेक्शन मैट्रिक्स (सामग्री की तालिका देखें) तैयारी और इंजेक्शन

  1. जबकि रक्तस्तम्भन तक पहुंचने के लिए गंभीर कॉर्ड के लिए प्रतीक्षा कर रहा है, GFP-SC गोली (१.२ कदम में तैयार) के ऊपर के माध्यम से हटा दें । reसस्पैंड GFP-SCs में 10 & #181; l शीत DMEM के F12/ सेल सस्पेंशन के लिए कोल्ड इंजेक्टर जेल के 10 & #181; एल जोड़ें और दोहराया pipetting द्वारा अच्छी तरह से मिश्रण । नाली प्रविष्टि पूर्ण होने तक बर्फ पर GFP-SC/DMEM/F12/इंजेक्शन मैट्रिक्स मिश्रण रखें ।
  2. के बाद यह सुनिश्चित करना कि पृष्ठीय सतह पर खिड़कियां खुली हों (< सबल वर्ग = "xfig" > चित्रा 2a ), इंजेक्षन 20 & #181; GFP-SC/DMEM/F12/इंजेक्शन मैट्रिक्स मिश्रण में से एक के माध्यम से नाली में पूर्व कट windows < सुप वर्ग = "xref" > ४६ एक पश्चिमी दाग लोड हो रहा है टिप और एक micropipette का उपयोग करना । यदि SC/DMEM/F12/इंजेक्शन मैट्रिक्स मिश्रण नाली को भरना चाहिए, अवशोषण त्रिकोण के साथ अतिरिक्त हटा दें । इंजेक्शन के बाद खिड़कियों को बंद करें; suturing की जरूरत नहीं है (< मजबूत वर्ग = "xfig" > चित्रा बी ).
< p class = "jove_title" > 5. घाव बंद करने और पश्चात की देखभाल

  1. मांसपेशियों की परतों और सतही वसा परतों सीवन । ७०% इथेनॉल के साथ त्वचा को साफ और फिर स्टेपल ( उदा, घाव क्लिप का उपयोग ) त्वचा बंद । एक थर्मल विनियमित मशीन में पशुओं रखें जब तक वे चेतना हासिल । पशुओं को पिंजरे में वापस स्थानांतरित । एक लंबी खिला ट्यूब और जगह आसान पहुंच के लिए बिस्तर पर भोजन छर्रों के साथ पानी प्रदान करें ।
  2. प्रशासन Buprenorphine (०.१ मिलीग्राम/शरीर के वजन) 3 दिनों के लिए एक दिन में दो बार त्वचा दर्द को कम करने के लिए तुरंत सर्जरी के बाद शुरू । सुई गेन्तमयसीं (5 मिलीग्राम/किलोग्राम शरीर के वजन) चमड़े के एक दिन में एक बार 7 दिन के लिए तुरंत सर्जरी को रोकने और संक्रमण को कम करने के बाद । एक दिन में दो बार जलयोजन के लिए 7 दिनों के लिए स्तनपान कराने वाले रिंग्स समाधान के 10 मिलीलीटर सुई ।
  3. खाली मूत्राशय को मैंयुअल रूप से दो बार एक दिन तक मूत्राशय समारोह देता है । यदि मूत्राशय में संक्रमण होता है, तो 10 मिलीलीटर खारा प्रशासन जब तक मूत्र स्पष्ट हो जाता है । अगर दो दिन में कोई सुधार नहीं होता है, तो गेन्तमयसीं (5 मिलीग्राम/किलोग्राम शरीर का वजन, एक बार दैनिक) के चमड़े के नीचे जब तक मूत्र साफ हो जाता है ।

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Representative Results

इस शल्य चिकित्सा तकनीक का उपयोग करने का लक्ष्य पूरा transected रीढ़ की हड्डी में प्रत्यारोपण के बाद अनुसूचित जाति समारोह को अधिकतम करता है कि एक संरचित नाली और इंजेक्शन मैट्रिक्स के उपयोग का मूल्यांकन करने के लिए है । रोपाई के तीन सप्ताह बाद पशुओं को 4% paraformaldehyde से perfused जाता है और स्पाइनल कॉलम घोर विच्छेदित और एक और 24 एच के लिए एक ही निर्धारण में तय हो जाते हैं । रीढ़ की हड्डी तो विच्छेदित है और cryostat sagittal वर्गों के लिए नमूने cryoprotection के लिए एक 30% सुक्रोज समाधान में रखा जाता है । 1-mm मोटी क्रॉस वर्गों विच्छेदित रीढ़ की हड्डी का एक और सेट के अनुसूचित जाति के पुल के बीच से पृथक glutaraldehyde निर्धारण में रखा प्लास्टिक वर्गों के लिए प्रक्रिया कर रहे हैं । नमूनों Bates एट अल द्वारा विस्तृत रूप में इलेक्ट्रॉन सूक्ष्म तैयारी के लिए एक अनुसूची के अधीन हैं । ४७. Cryostat sagittal वर्गों GFP के खिलाफ प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ immunostained थे, glial fibrillary अम्लीय प्रोटीन (GFAP), भारी श्रृंखला neurofilament (RT97), और मध्यम श्रृंखला neurofilament (NF) सहित माध्यमिक एंटीबॉडी के बाद बकरी-विरोधी-चिकन-४८८, बकरी-विरोधी-खरगोश-५४६, बकरी-विरोधी-माउस-६४७, और बकरी-विरोधी-खरगोश ६४७, क्रमशः । GFP-SCs नाली के भीतर और साथ समान रूप से वितरित किया गया (चित्र 3ए; भीतरी दीवारें पीली रेखाओं द्वारा दर्शाई गई) । Axon पुनर्जनन (चित्र 3 बी) मनाया जाता है और बारीकी से GFP की उपस्थिति के साथ जुड़ा हुआ है-SCs (चित्र 3 ए और चित्रासी) यह दर्शाता है कि यह तकनीक एक संरचित नाली के भीतर एक अनुसूचित जाति पुल प्रदान करने में सफल है और rostral और caudal स्टंप के बीच पुल के साथ axon उत्थान को बढ़ावा देना । अनुसूचित जाति पुल (चित्रा 3d) के केंद्र में रक्त वाहिकाओं और myelinated axons भी पाए गए. axon पुनर्जनन पर electrospun PVDF-TrFE रेशेदार नाली के साथ SCs के प्रभाव का अधिक विवरण हमारे हाल ही में प्रकाशित कार्य31में पाया जा सकता है ।

अंय परिणाम उपायों सहित प्रदर्शन किया जा सकता है: रेखा से sagittal वर्गों में axon पुनर्जनन बढ़ाता-transect-विधि हमारे हाल के काम में वर्णित31 और प्लास्टिक पार वर्गों में myelinated axons और जहाजों की संख्या बढ़ाता है । प्लास्टिक वर्गों के लिए तैयार किए गए नमूनों को unmyelinated axons की संख्या को बढ़ाता हुआ ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए आगे खोदी जा सकती है । cryoprotected रीढ़ की हड्डी के नमूनों को भी पार किया जा सकता है के बजाय sagittally खोदी और immunostained के axon पुनर्जनन और GFP-SCs की उपस्थिति । व्यवहार परीक्षण भी उचित अंतराल पर पशुओं पर किया जा सकता है, जबकि पशुओं का रखरखाव किया जा रहा है ।

Figure 1
चित्रा 1: नाली में खिड़की की तैयारी. 5 मिमी नाली (ए) के अनुदैर्ध्य अक्ष के साथ एक तरफ गुना । चार चीरा के बारे में ०.४ मिमी लंबे समय और नाली (बी) के उद्घाटन से कम से कम 1 मिमी कट । प्रत्येक चीरा के बारे में 1 मिमी के अलावा है । नाली का खुलासा करके, 4 समानांतर कटौती (ग) मनाया जाता है । rostral-caudal अक्ष के साथ दो चीरा के बीच कट एक खिड़की है कि प्रालंब उठाने से खोला जा सकता है बनाने के लिए । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2: SC/DMEM/F12/मैट्रिक्स इंजेक्शन के बाद बंद खिड़की । Windows rostral और caudal स्टंप्स (ए) के बीच नाली रखने के बाद एक प्रालंब वापस तह द्वारा खोला जाता है । इंजेक्शन (B) के बाद Windows बंद हो जाता है । स्केल बार = 1 mm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: sagittal वर्गों के फोकल फ्लोरोसेंट छवियों और एक प्लास्टिक क्रॉस-खंड के एक चमकदार क्षेत्र छवि रीढ़ की हड्डी से GFP-SCs संरेखित रेशेदार PVDF-TrFE नाली में प्रत्यारोपित डोरियों से । नाली के भीतर अनुसूचित जाति पुल का अवलोकन जहां भीतरी दीवारों पीले लाइनों और GFP और glial fibrillary अम्लीय प्रोटीन (GFAP) के लिए immunostained द्वारा संकेत दिया जाता है के लिए ट्रांसप्लांटेशन SCs और मेजबान रीढ़ की हड्डी astrocytes, क्रमशः कल्पना । पुनर्जीवित axons RT97 (भारी श्रृंखला neurofilament) (ए, बी) और मध्यम श्रृंखला neurofilament (NF, सी) एंटीबॉडी के साथ लेबल थे । Axons के रूप में (एक) GFP-SCs के साथ उनके निकट सहयोग के कारण में नहीं दिख रहे है के रूप में (सी) उच्च आवर्धन के साथ मध्य नाली क्षेत्र में मनाया जाता है । Axons rostral स्टंप में अधूरा स्कैन ऊतक अनुभाग की गहराई में जब फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा इमेजिंग के कारण में दिखाई नहीं दे रहे हैं । रक्त वाहिकाओं ( डीमें वी के रूप में लेबल) और myelinated axons ( डीमें एमए के रूप में लेबल) दोनों एक प्लास्टिक की धारा में मध्य नाली क्षेत्र में मनाया गया. आवर्धन और स्केल बार्स: A, B (10x, २०० µm); ग (20x, १०० µm); D (63x, 25 µm). कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

एक प्रभावी transection मॉडल बनाने में सबसे महत्वपूर्ण कदम एक या दो में कटौती रीढ़ की हड्डी विच्छेद है । rostral और caudal स्पाइनल कॉर्ड स्टंप्स के बीच एक 2-2.5 mm गैप transection साइट पर मौजूद होना चाहिए । इस तरह के एक अंतर के लिए तीन सबसे अधिक संभावना कारणों को प्रदर्शित नहीं कर रहे है (1) पृष्ठीय/ventral जड़ों को ठीक से नहीं हटाया गया, (2) ventral बाडी पर्याप्त रूप से हटा नहीं था, और/या (3) पशु ठीक से उसके नीचे रखा रोल पर तैनात नहीं किया गया था ।

स्टंप्स के बीच एक प्रभावी नाली प्रविष्टि प्रदर्शन करने के लिए: नाली के (1) व्यास विशिष्ट प्रजातियों और प्रयोग में इस्तेमाल जानवर की उम्र के लिए सिलवाया जाना चाहिए; (2) laminae अनुप्रस्थ प्रक्रियाओं के बीच अंतर visualized किया जा सकता है जब तक कि बाद में पर्याप्त हटा दिया जाना चाहिए; (3) जड़ें हटा दिया जाना चाहिए और (4) स्टंप के बीच नाली प्रविष्टि पहली कोशिश पर पूरा किया जाना चाहिए । यदि कई प्रयास की जरूरत है, यह स्टंप में सूजन का कारण हो सकता है, आगे स्टंप के बीच नाली प्रविष्टि के कार्य उलझी और अतिरिक्त चोट के कारण ।

करने के लिए प्रभावी GFP-SC/DMEM/F12/इंजेक्शन मैट्रिक्स नाली में परिचय, सुनिश्चित करें कि: (1) स्पाइनल कॉर्ड स्टंप के बीच नाली प्रविष्टि से पहले खून बह रहा है नहीं है । यदि स्टंप के बीच प्रविष्टि के बाद नाली में द्रव है, अवशोषण भाला का एक छोटा सा टुकड़ा का उपयोग करने के लिए इसे पूर्व कट खिड़कियों के माध्यम से हटा दें । (2) सुनिश्चित करें कि नाली दोनों रीढ़ की हड्डी स्टंप्स पर फिसल गया है और अच्छी तरह से (3) है कि पृष्ठीय पूर्व कट खिड़कियां खुली हैं । अनुसूचित जाति/इंजेक्शन मैट्रिक्स मिश्रण के 20 µ एल के इंजेक्शन नाली को भरने के लिए पर्याप्त से अधिक होना चाहिए । पूर्व में कटौती खिड़कियों से ओवरफ्लो प्रभावी प्रत्यारोपण के लिए एक अच्छा गेज है ।

इस कार्यविधि की सीमाएं हैं: (1) बाडी की कोई बहाली नहीं, (2) शल्य चिकित्सा के पूरा होने के बाद नाली/अनुसूचित जाति प्रत्यारोपण के आंदोलन पर कोई नियंत्रण नहीं है, और (3) यदि वहां रिसाव है जबकि अनुसूचित जाति/इंजेक्शन मैट्रिक्स मिश्रण ।

इस प्रक्रिया का लाभ एक इंजेक्शन मैट्रिक्स के साथ दोनों एक संरचित नाली के उपयोग का संयोजन है. किसी भी पसंद की सामग्री है कि लचीला है स्टंप्स के बीच डाला जा करने के लिए इस शल्य प्रक्रिया में इस्तेमाल किया जा सकता है के साथ बनाया नाली । चुनाव के किसी भी इंजेक्शन मैट्रिक्स भी इस प्रक्रिया में इस्तेमाल किया जा सकता है; एक तापमान के प्रति संवेदनशील जेल एक निर्बाध इंटरफेस बनाने के स्टंप के आकार के लिए सीटू और समोच्च में जेल के लिए अपनी क्षमता के कारण बेहतर है । एक और अधिक जटिल इंटीरियर संरचना के साथ नाली एक खोखले इंटीरियर के बजाय इस्तेमाल किया जा सकता है । ड्रग्स, विकास कारकों, छोटे अणुओं, या किसी भी सेल प्रकार संरचित नाली या इंजेक्शन मैट्रिक्स या दोनों में शामिल किया जा सकता प्रत्यारोपण अस्तित्व को बढ़ाने के लिए, चोट के तुरंत बाद तंत्रिका संरक्षण प्रदान, सूजन को कम करने, axon को बढ़ावा देने के उत्थान, और angiogenesis को बढ़ावा देना ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम मियामी परियोजना में वायरल वेक्टर और पशु कोर धंयवाद करने के लिए लेंती-GFP-वायरस के उत्पादन और पशुओं की देखभाल, क्रमशः प्रदान करने के लिए पक्षाघात का इलाज करना चाहते हैं, और cryostat, फोकल माइक्रोस्कोप के उपयोग के लिए प्रोटोकॉल और इमेजिंग कोर, और स्टीरियो अन्वेषक के साथ फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप. NINDS (०९९२३), DOD (W81XWH-14-1-0482), और NSF (DMR-१००६५१०) द्वारा अनुदान प्रदान किया गया । M.B. डाट क्रिस्टीन E लिन तंत्रिका विज्ञान के प्रतिष्ठित प्रोफेसर है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cryogenic vials ThermoFisher Scientific 5000-0020
10 cm Petri dish VWR 25382-428
Dulbecco's modified Eagle's medium: nutrient mixture F-12 ThermoFisher Scientific 11039-021 "DMEM/F12" in protocol.
Penicillin-streptomycin ThermoFisher Scientific 15140-122 "Pen/Strep" in protcol.
Fetal bovine serum Hyclone SH300-70-03 "FBS" in protocol.
Pituitary extract Biomedical Technologies BT-215
Forskolin Sigma-Aldrich F6886
Heregulin R&D Systems 396-HB/CF
Poly L-lysine Sigma-Aldrich P2636 "PLL" in protocol.
Dulbecco's modified Eagle's medium ThermoFisher Scientific 11965-092 "DMEM" in protocol.
Hank's balanced salt solution ThermoFisher Scientific 14170-112 "HBSS" in protocol.
Tryspin-EDTA ThermoFisher Scientific 15400-054
Female Fischer rat (160-180g) Envigo
Vannas scissor, straight FST 15018-10
Ketamine Vedco Inc 5098976106 100 mg/ml
Xylazine Lloyd Inc AnaSed 20 mg/ml
Gentamycin APP Pharmaceuticals NDC 63323-010-02 Can be any brand of choice.
Micro Spatula FST 10089-11 Can be any brand of choice.
Curved scissors with blunt end FST 14017-18 Can be any brand of choice.
Blunt forceps FST 11006-12 Can be any brand of choice.
rongeur FST 16121-14 Can be any brand of choice.
Angled spring scissors FST 15006-09 Can be any brand of choice.
Absorption triangles FST 18105-03 Can be any brand of choice.
Gelfoam Henry Schein 9083300 "Compressed foam" in protocol.
#10 blades Sklar 06-3010 Can be any brand of choice.
Matrigel Corning 354234 "Injectable matrix" in protocol.
Chicken anti-green fluorescent protein antibody Millipore AB16901
Mouse RT97 hybridoma antibody DSHB RT97
Rabbit anti-neurofilament antibody Encor Biotechnology, Inc PRCA-NF-H
Polyclonal Rabbit anti-Glial Fibrillary Acidic Protein antibody Dako Z033401
Alexa Fluor 488 goat anti-chicken IgG (H+L) ThermoFisher Scientific A-11039
Alexa Fluor 546 goat anti-rabbit IgG (H+L) ThermoFisher Scientific A-11035
Alexa Fluor 647 goat anti-rabbit IgG (H+L) ThermoFisher Scientific A-21244
Alexa Fluor 647 goat anti-mouse IgG (H+L) ThermoFisher Scientific A-21236
Confocal Microscopy Nikon clsi

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References

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दवा अंक १२९ Schwann कोशिकाओं रीढ़ की हड्डी में चोट PVDF-TrFE नाली पूरा transection electrospinning piezoelectric
PVDF के अंदर Schwann कोशिकाओं के प्रत्यारोपण-TrFE नाली Transected चूहा रीढ़ की हड्डी स्टंप को पाटने के लिए अंतर भर में Axon पुनर्जनन को बढ़ावा देने के लिए
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