Summary
I denna artikel visar vi live avbildning av enskilda maskar anställa en anpassad mikroflödessystem enhet. I enheten, är flera maskar individuellt begränsade till separata kammare, så att multiplexade längsgående övervakning av olika biologiska processer.
Abstract
Under det senaste decenniet, ultrakalla tekniker har använts för att studera små djur, inklusive Nematoden Caenorhabditis elegans, och har visat sig användbar som en bekväm levande imaging plattform tillhandahåller funktioner för exakt kontroll av experimentella förhållanden i realtid. I denna artikel visar vi live avbildning av enskilda maskar anställa WormSpa, en tidigare publicerade anpassade mikroflödessystem enhet. I enheten, är flera maskar individuellt begränsade till separata kammare, så att multiplexade längsgående övervakning av olika biologiska processer. För att illustrera förmåga, utförde vi ett proof-of-principle experiment där maskar smittades i enheten med patogena bakterier och dynamiken i uttryck av immunsvar gener och äggläggning övervakades kontinuerligt i enskilda djur. Enkel konstruktion och drift av denna enhet gör den lämplig för användare utan tidigare erfarenhet med mikroflödessystem-baserade experiment. Vi föreslår att detta tillvägagångssätt blir användbar för många forskares longitudinella observationer av biologiska processer under väl definierade förhållanden.
Introduction
Förändringar i miljöförhållanden kan leda till aktivering av genetiska program åtföljs av induktion och förtryck av uttrycket av specifika gener1,2. Dessa kinetiska förändringar kan vara variabel bland vävnader i samma djur och mellan olika djur. Studier av sådana genetiska program efterlyser därför metoder som längsgående avbildning av enskilda djur och ge exakt dynamiska kontroll av miljöförhållanden.
Under de senaste åren har biochips fluidic enheter använts för att studera många aspekter av svar och beteende i små djur, inklusive maskar, flugor, vatten björnar och mer3,4,5,6, 7. Tillämpningar inkluderar, till exempel djup fenotypning, optogenetic inspelning av neuronal aktivitet som svar på kemiska stimuli, och spårning av motor beteenden såsom förflyttning och pumpa8,9,10 , 11.
Mikroflödessystem tillvägagångssätt håller många egenskaper som skulle kunna gynna långsiktiga längsgående avbildning av svar på miljömässiga ledtrådar, inklusive dynamiska precisionskontroll av den lokala mikromiljö, flexibel konstruktion som möjliggör underhåll av enskilda djur i separata håll och gynnsamma attribut för avbildning. Att upprätthålla djur i en mikroflödessystem kammare under en lång tid med minsta möjliga negativa påverkan på deras väl varelser är dock en utmaning, som kräver särskild omsorg i utformningen av mikrofabricerade enheten samt i utförandet av experimentet.
Här visar vi användningen av WormSpa, en mikroflödessystem enhet för längsgående avbildning av Caenorhabditis elegans. 5 enskilda maskar är begränsade i kamrarna. En konstant lågt flöde av vätska och bakteriell suspension garanterar att maskar är välnärda och tillräckligt aktiv för att upprätthålla god hälsa och lindra stress, och strukturera av kamrarna gör maskar att lägga ägg. Enkelheten i utformningen och driften av WormSpa bör tillåta forskare utan tidigare erfarenhet i mikrofluidik att införliva denna enhet i sina egna forskningsplaner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokollet nedan använder WormSpa5, en tidigare beskrivna mikroflödessystem enhet för längsgående avbildning av maskar. Tillverkning av WormSpa (start med CAD-filer som kan erhållas från författarna på begäran) är enkel men kräver viss expertis. I de flesta fall kan tillverkning lätt göras av en core facilitet eller ett kommersiellt företag som tillhandahåller sådana tjänster. När fabricera enheten, kontrollera att ange att höjden av funktioner är 50 µm.
1. experimentellt ställa in
- Montera mikroflödessystem enheten på en inverterad fluorescens Mikroskop med en motoriserad scen.
- Placera orbitalskak nära mikroskopet, men se till att vibrationer från shakern inte påverkar direkt mikroskopet. Till exempel sätta shaker på en hylla fast på en vägg som gör ingen kontakt med tabellen optiska.
- Placera en sprutpumpen på den roterande blandare. Tejpa shaker pumpen så att det inte litegrann under omskakning.
2. beredning av mikrofabricerade miljön
Obs: Under experimentet, fyra sprutor är anslutna till mikroflödessystem enheten via spruta rör, som beskrivs i figur 1. Detta steg beskriver utarbetandet av dessa sprutor. Om inget annat nämns, hålla sprutan rören så korta som möjligt utan att göra dem spända.
- Förbered en outlet spruta och en spruta slang. Denna spruta (S1 i figur 1) kommer senare att ansluten till uttaget av enheten via spruta röret, och användas för tillfällig lagring av vätska kommer ut ur enheten.
- Göra en adapter nålen genom att ta bort plast delar av en 20 G x 1/2 tums sprutspetsen, hålla bara nålen (metall delen). Göra det genom att hålla de plast och metall delarna med tång och dra dem isär. Återstående plastrester på nålen kan brännas med en bunsenbrännare.
- Böja nålen enligt geometri av den experimentella setup medan du håller dess två ändar med tång. I den design som beskrivs här, är det mest praktiskt att böja nålen i dess mitt till ~ 110° vinkel.
- Anslut adaptern nålen halvvägs in i röret. Den andra hälften kommer att senare anslutas till enheten. Sprutan röret bör vara förenlig med en 20 G sprutspetsen utan en läcka (exempelvis slang med innerdiameter på 0,86 mm och yttre diameter på 1,32 mm). Den Rekommenderad rörlängd är ~ 50 cm.
- Ansluta en 10 mL luer-lock spruta till andra (öppen) ände spruta röret via en 20 G x 1/2 tums sprutspetsen.
- Förbereda buffert-inlopp sprutor och sprutan rör. En av dessa sprutor (S2 i figur 1) används som en reservoar för den vätska som går in i enheten och att styra injektion flödet. Andra sprutan (S3 i figur 1) krävs för bufferten utbyte, som förklaras i steg 3,2.
- Ansluta en 10 mL luer-lock spruta (S2) direkt till en 3-vägs ventil och ansluta en annan spruta (S3) till samma ventilen via en spruta slang (figur 1): Anslut S3 till röret via en sprutspetsen och Anslut röret till ventilen via en annan sprutspetsen.
Obs: Den ordning i vilken dessa material är anslutna spelar ingen roll. - Anslut en spruta slang till kvarvarande porten av 3-vägs ventil. Förbereda en annan adapter nål som i steg 2.1.2 och Anslut nålen halvvägs in i andra (öppen) ände spruta röret.
- Ställ ventilen så att spruta röret i steg 2.2.2 och S2 är anslutna medan S3 är stängd (figur 1).
- Ansluta en 10 mL luer-lock spruta (S2) direkt till en 3-vägs ventil och ansluta en annan spruta (S3) till samma ventilen via en spruta slang (figur 1): Anslut S3 till röret via en sprutspetsen och Anslut röret till ventilen via en annan sprutspetsen.
- Förbered en mask-inlopp spruta och en spruta slang. Denna spruta (S4 i figur 1) används för inläsning av maskar i enheten.
- Anslut en lång spruta slang till en 10 mL luer-lock spruta (S4). Bestämma längden på denna tube från volymen av vätska som används för lastning. 100 cm av slangar stöder till exempel över 2 mL vätska (se även steg 4.2).
- Förbereda en annan adapter nål som i steg 2.1.2 och ansluter den halvan av nålen till den andra (öppna) änden av sprutan slangen.
- Skölj alla sprutor och slangar med S-medium12 två gånger. Fyll sprutorna och rören med S-medium, noga med för att avlägsna alla luftbubblor.
- Anslut outlet spruta röret till enheten utlopp.
- Anslut adaptern nålen i slutet av sprutan slangen till outlet-porten.
- Injicera en liten volym för S-medium genom utloppet att fylla upp enheten, tills en liten S-medium kommer ur både buffert inloppet och inloppet till mask.
- Anslut buffert-inlopp spruta röret till buffert-inlopp porten på enheten, medan du sätter mask-inloppet med en nål (rostfritt stål pluggen stift med en 1/32-tums diameter).
- Injicera ett konstant flöde av buffert i enheten. Fyll i buffert-inlopp sprutan S2 på en spruta pump13och ställa in pumpen så att mediet i S2 sprutas kontinuerligt in enheten med en flödeshastighet av 3 µL/min.
3. läsa in bakterier i ultrakalla enheten
- Förbereda Escherichia coli OP50 upphängd i S-medium12.
- Efter ett standardprotokoll, Inokulera en 250 mL kolv med 50 mL LB och en enda koloni och inkubera över natten vid 37 ° C.
- Centrifugera övernattning kulturen på 4000 rpm i 10 minuter och återsuspendera pelleten i 30 mL för S-medium.
- Filtrera suspensionen genom ett filter med 5 µm i sprutan. Mätning av bakteriell koncentrationen av dess optiska densitet på 600 nm (OD600), och justera koncentration till en OD600 3. Denna hög densitet är skyldig att hålla maskar välnärda.
- Utbyta bufferten i enheten med OP50 fjädring.
- Förbered en ren spruta (S5) fylld med OP50 fjädring. Håll sprutan vertikalt och på det flera gånger för att samla alla luftbubblor överst.
- Vrid 3-vägs ventilen av buffert-inlopp sprutor att stänga anslutningen till enheten och Anslut de två sprutorna, S2 och S3. Utloppet S2 ur sprutpumpen.
- Koppla från S2 från ventilen och Anslut S5 till ventilen. Pressa ut all luft samlas överst i S5 till S3 genom ventilen tills lite OP50 bufferten går till S3. Så se till att inga luftbubblor finns kvar i S5 eller ventilen.
- Vrid 3-vägs ventilen tillbaka till den ursprungliga positionen att stänga anslutningen mellan S3 och S5 och ansluta S5 till enheten. Lasta S5 på sprutpumpen. Slå på den roterande blandare som håller pumpen. Som skakar hastigheten till ca 200 rpm.
- Ställa in flödet vara 100 µL/min. Den tid det tar för nya bufferten att anlända till maskar i enheten beror på längden på den buffert-inlopp spruta tuben (cirka 5 minuter med den slangen som beskrivs ovan). En högre flöde kan vara anställd om en snabbare buffert exchange krävs.
- När OP50 bufferten sprider sig genom enheten, ställa flödet tillbaka till 3 µL/min.
4. lastning maskar i ultrakalla enheten
- Förbereda en liten låg bindande mikrocentrifug rör (650 µL) och fyll den med 100 µL OP50 suspension. Överföra runt 20-30 år-synkroniserad unga vuxna maskar (46 timmar efter L1 larver gripande vid 25 ° C) från en NGM (nematoder odlingsmedium) agarplatta till röret genom att plocka dem en efter en med en mask plocka. Ålder-synkronisering kan göras efter ett standardprotokoll12.
- Fyll mask-inloppet sprutan och spruta tube (S4 i figur 1) med OP50 fjädring. Injicera ~ 500 µL av vätska i mikrocentrifug röret med maskar. Rita fjädringen med maskar i mask-inlopp spruta röret. Kontrollera att sprutan röret är tillräckligt lång (> 1 m) och att ritade maskar bo i sprutan röret inte och göra hela vägen till sprutan S4.
- Anslut S4 till mask-inloppet. Injicera alla maskar i mask-inlopp spruta röret i ultrakalla enheten. Koppla från S4 och spruta röret. Anslut masken-inloppet med en PIN-kod.
- Frikoppla buffert-inlopp sprutan S2 från mekaniska pumpen ( figur 1) och manuellt styra S1 och S2 för att driva alla maskar i separata kanaler. Att trycka på S2 kommer flytta maskar in i kanalerna, medan du trycker på S1 kommer flytta dem i omvänd riktning. När en kanal är laddad, kommer att masken i varje kanal blockera införsel av andra maskar.
- Låt maskar justera till den nya miljön för 2-3 timmar.
5. ställa in ett Imaging-protokoll
- Hitta alla maskar som säkert finns i enheten och ange en tänkbar position för var och en av dem i förvärvet bildbehandlingsprogram som styr ditt Mikroskop. Observera att i vissa fall (t.ex. när högre förstoring önskas eller använder kameror med en mindre CCD-sensor) flera imaging positioner krävs för varje kanal.
Medan detta kan göras manuellt, några förvärv programpaket kan Lägg en textfil som listar de ståndpunkter som var bilderna ska tas. Eftersom dessa befattningar ordnas regelbundet i WormSpa, kan en användare skriva ett litet script (t.ex. i Python eller kommersiell programvara) som automatiskt skapar en sådan lista. Det exakta formatet av detta script skulle bero på formatet förväntat av programvaran förvärvet (se ett exempel i kompletterande Material 1). - Ange obligatoriska frekvensen för time-lapse imaging. Till exempel görs avbildning av immuna genen svar på infektion en frekvens på 10 minuter per bildruta. Kontrollera att alla nödvändiga kanaler (t.ex. ljusa fält och god Jordbrukarsed fluorescensen) förvärvas vid varje tidpunkt.
6. värd svar på Pseudomonas infektion
Obs: Detta steg är specifika för att studera värd-patogen interaktioner. Alternativt kan man förbereda en buffert som innehåller andra miljömässiga ledtrådar av intresse (biotiska och abiotiska stressfaktorer, läkemedel, signaling molekyler, etc.).
- Förbereda Pseudomonas aeruginosa PA14 upphängd i SK-medium14.
- Inokulera en 250 mL kolv med 50 mL LB och en enda koloni och inkubera över natten vid 37 ° C.
- Inokulera en annan 250 mL kolv med 50 mL LB och en alikvot av kultur och inkubera över natten vid 37 ° C.
- Centrifugera övernattning kulturen på 4000 rpm i 10 minuter och återsuspendera pelleten i 10 mL av SK-medium. Mätning av bakteriell koncentrationen och justera koncentration till OD600 = 4.
- Överför till en ren kolv, och inkubera vid 37 ° C i 24 timmar och vid 25 ° C i ytterligare 24 timmar under omskakning. Detta steg härmar den plattan-INKUBERINGSSTEGET i standarden döda assay14.
- Filtrera suspensionen genom ett filter med 5 µm i sprutan. Detta är att förhindra bakteriell aggregat från igensättning enheten.
- Ersätta OP50 suspensionen i enheten med PA14 fjädringen, på samma sätt som i steg 3,2. Hålla imaging i 10 timmar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ålder-synkroniserad unga vuxna maskar (46 timmar post L1 larver gripande vid 25 ° C)12 lastades i enheten, som beskrivs i protokollet. I separata kanaler, aktivera längsgående mätning av djurens svar att patogenen fanns individuellt maskar. När experimentet är framgångsrika, kvar de flesta maskar i sina kanaler för varaktigheten av experimentet. I det här fallet tas bilder av enskilda maskar helt enkelt genom att placera sin kanal i sökvägen imaging, undvika behovet av att aktivt hitta djuret. Figur 2 A visar ljusa fält bilder av en enda representativa mask under loppet av 10 timmar i enheten. Även maskar är begränsade inom sina kanaler, de kan flytta upp - och nedströms, och fritt kan vända deras huvuden. Detta är avgörande för att garantera att enheten själv inte orsaka stress eller skada djuren.
Vi övervakas svar av maskar till bakteriell infektion av P. aeruginosa, en av de bäst studerade bakteriella patogenerna av C. elegans. Det är också en opportunistisk mänskliga patogen som orsakar infektion i cystisk fibros och immunsupprimerade patienter. Utfodring maskar med särskilda stammar av P. aeruginosa, sådan som den kliniska isolera PA14, leder till dödliga intestinal infektion, och virulensfaktorer som är inblandade i denna process är också inblandad i infektionen av däggdjur värdar. 14 , 15
För att undersöka mönster av förändringar i genuttryck under bakterieinfektion, kan fluorescerande reportrar användas. Bland många gener som visar dynamiska svar på infektion, vi övervakas irg-1 (infektion svar gen 1), transkriptionell svar av imaging GFP fluorescens från transgena maskar uttrycker irg-1::GFP (AU0133 [agIs17 () Pirg-1::GFP; pmyo-2::mCherry)], framställt av Ausubel labbet). IRG-1 är känt för att vara starkt induceras i inälvan av infekterade djur på det tidiga skedet av infektionen av P. aeruginosa PA14. 16 , 17 Figur 2 B visar tid bilder av en representativ mask (samma djur som i figur 2A). Varje fluorescens bild togs omedelbart efter motsvarande ljusa fält bilden. I första 5 timmar post infektion, GFP fluorescens ökar bara milt i mitten av kroppen och svansen. Sedan, en betydande ökning av fluorescens observeras, start från mitten av kroppen. Den totala fluorescensen i varje mask ritas i figur 2C som funktion av tid efter infektion. Dessa uppgifter illustrerar inte bara tidigare beskrivna induktion av irg-1 vid PA14 infektion, men också av mask-till-worm variabiliteten i tidpunkten och omfattningen av induktion.
Utformningen av WormSpa mikroflödessystem enheten innehåller filter som samlar ägg som lagts av varje enskild mask5. När Äggen kläcks tvättas L1 larver genom filtret och in i outlet-röret. Detta tillät oss att manuellt övervaka äggläggningen kineticsen av enskilda maskar under bakteriell infektion. Tid förflutit bilderna av ägg som lagts av samma mask som i figur 2 visas i figur 3A. Dessa bilder togs rätt efter motsvarande ljusa fält bilder i figur 2A. Det sammanlagda antalet ägg som av varje mask visas som en funktion av tid post infektion i figur 3B, och i genomsnitt och standardavvikelse över hela befolkningen redovisas i figur 3C. Dessa data fånga djur-till-djur föränderlighet samt den tidigare beskrivna minskningen äggläggningen eftersom infektion fortskrider. Däremot i oinfekterade djur äggläggningen ränta inte sjunka tills det toppar vid ~ 54 timmar post L1 vid 25 ° C5,18.
Figur 1: experimentella system för levande imaging av maskar i en mikroflödessystem enhet. Maskar är inlästa i enheten via mask inloppoch trycks därefter in separata kanaler. Bakteriesuspensionen injiceras i enheten från buffert inloppet av en mekanisk pump monterad i orbitalskak. Bufferten utgångar via utlopp port på enheten. Fyra sprutor (S1, S2/S5, S3 och S4) används för att styra enheten. De röda streckade linjerna är sprutan rör ansluta sprutor och enheten. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: representant gen uttryck kinetik. Tid förflutit bilder av en representativ mask som vidtagits av (A) Bright-området och (B) GFP fluorescensmikroskopi. Vänstra bilden togs precis innan patogenen infördes, medan de högra bilderna togs 10 timmar efter infektion av PA14. Tidsintervallet mellan bilder är 1 timme. (C) tidsförloppet för totala irg-1:: GFP fluorescens i enskilda maskar. Varje rad motsvarar ett enskilt djur. Rader var sorterade i fallande ordning efter genomsnittlig fluorescens. Fluorescensintensiteten är färgkodade och färgskalan visas till höger. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: representativa äggläggningen kinetik. (A) Time lapse bilder av antalet ägg som lagts av samma mask visas i figur 2A och B. Vänstra bilden togs precis innan patogenen infördes, medan de högra bilderna togs 10 timmar efter infektion av PA14. Tidsintervallet mellan bilder är 1 timme. (B) tid kursen kumulativt antal ägg i enskilda maskar. Varje rad motsvarar ett enskilt djur. Rader var sorterade i fallande ordning efter det totala antalet ägg som per mask. Antalet ägg är färgkodade och färgskalan visas till höger. (C) det genomsnittliga antalet ägg som per mask som funktion av tiden. Det grå området anger ± en standardavvikelse. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande Material 1: ett exempelskript som skapar en textfil som innehåller de imaging positionerna för alla kanaler i WormSpa enhet. Vänligen klicka här för att hämta den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mikroflödessystem verktyg ger flera fördelar i att studera maskar. Imaging i en PDMS erbjuder enheten högre imaging kvalitet jämfört med en standard NGM agarplatta. Flera bilder kan tas från en enda mask, i motsats till traditionella metoder där djur är plockade från plattan och monterade på ett objektglas för avbildning. I närmiljön där maskar bosatta kan dessutom hållas konstant eller modulerad som önskat, tillåter exakt mappning mellan sammansättningen av miljön och djuren respons.
Här har vi visat hur du utför en längsgående mätning av värdrespons till bakteriell infektion med imaging svaret av flera enskilda maskar till opportunistisk patogen P. aeruginosa PA14 använder en anpassad mikroflödessystem enhet (WormSpa). Både ljus-området och fluorescens bilder togs på flera gånger utan störande pågående experiment. Kinetiken för äggläggningen och irg-1 genuttrycket var särskilt probed varje 10 minuter, en betydande ökning av temporal upplösning över traditionella metoder14,15.
I denna enhet, kan längsgående mätningar av flera maskar utföras av återbesök den sparade platsen av varje mask vid varje given tidpunkt. Detta visades i figurerna 2C och 3B, där vi kvantifiera irg-1:: GFP fluorescens och ägg som lagts av enskilda maskar. Dessa siffror visar att maskar visar mängder av kinetiska profiler. Som tidigare visas i encelliga studier19,20,21, kan denna individualitet användas för att förstå utformningen av genetiska kretsar, samt sambandet mellan skilda vägar19, 22.
För framgångsrika experiment är det viktigt att läsa in maskar i ultrakalla enheten snabbt. Maskar krypa på agar yta, de tenderar att spöa i flytande miljö medan detta beteende inducerar ett genetiska program där AMP aktiveras proteinkinaser är inblandade23,24. För att minimera denna oönskade störning, är det viktigt att placera maskar i sin separata kammare snabbt, eftersom mikrostrukturer i kammaren och Luftgenomsläpplighet av PDMS ger maskar med en miljö som efterliknar fast yta. 5 trots att tillämpa högre tryck hjälper snabbare lastning maskar, tryckförvaring enheten för mycket kunde framkalla mekanisk stress på maskar. Maskar som är allvarligt stressade gör inte foder eller lägga ägg, vilket resulterar i en tydligt observerbara uppsamlare fenotyp25. Efter lastning matas maskar E. coli OP50 för 2-3 timmar, vilket gör att maskar att justera mikroflödessystem miljön och ger forskaren möjlighet att observera djuren och kasta de som skadades.
Storlek och avstånd av mikrostrukturer i varje kammare är optimerade för maskar odlas för 46 timmar från L1 gripande vid 25 ° C. Strukturer kan skalas upp till studera äldre maskar eller minskas för att undersöka L4 larver som är mindre i storlek. Maskar är dock inte kunna framgångsrikt molt i kammaren, utgör hinder för studie av efter embryonala utveckling i den här enheten. Sådana program övervägas metoder såsom WorMotel26 . Eftersom maskar är begränsade men inte orörlig i WormSpa, beror ett framgångsrikt tålig experiment på huruvida djuren bo i kammaren. Vi finner att detta kan vara utmanande för tidigt larver, för manliga vuxna, och för vissa hermafrodit mutanter.
Istället för att använda en enskild buffert inlopp (vid mitten av toppen, figur 1), kan två uppochner ballong-formade öppningarna användas samtidigt. Fyller de två sprutorna med olika buffertar, kan man generera temporally strukturerade miljöer genom att trycka på olika sprutor vid annan tidpunkt. Detta kan exempelvis studie av anpassning till föränderliga miljön. 27 , 28
Som nämnts ovan, kan ultrakalla enheten beskrivs här användas för en rad andra program. Dessa inkluderar studera Svaren till andra miljömässiga ledtrådar. Sådana svar kan omfatta förändringar i genuttryck och äggläggningen beteenden, som exemplifieras här, men också förändringar i ämnesomsättningen och fett ackumulering (t.ex. genom fett färgning av Nile Red), neuronala fysiologi och signalering (t.ex. genom kalcium imaging och optogenetic störningar), förändringar i motor beteenden såsom pumpa, defekation och huvud rörelse (via automatiserade kvantitativa avbildning av time-lapse sekvenser), och mer.
Slutligen, detta tillvägagångssätt är i hög grad automatiserad och minskar den arbetskraft som krävs för lång experiment över många timmar, dagar. När platserna för enskilda maskar sparas i programvaran data förvärv, består experimentet av automatisk inspelning av bilder medan mekaniska pumpstyrningen bibehåller konstant flödet av buffert i enheten. Ännu viktigare, tillverkning av en WormSpa-enhet kräver inte mer än standard mjuk litografi protokoll, och dess utformning och drift är enkla nog även till forskare med ingen tidigare erfarenhet av mikrofluidik. Med de olika fördelar som diskuterats ovan och relativt enkla förberedelser, kan detta tillvägagångssätt vara till hjälp för dem som funderar på längsgående mätning av levande maskar under exakt kontrollerade förhållanden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Denna forskning stöddes av National Science Foundation genom bidrag PHY-1205494 och MCB-1413134 (EL) och av den National Research Foundation of Korea grant 2017R1D1A1B03035671 (KSL).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| WormSpa | N/A | N/A | The CAD file for WormSpa is available from the Levine lab. |
| Compound Microscope | Zeiss | AxioObserver Z1 | An inverted fluorescence microscope with a motorized stage |
| Syringe Pump | New Era Pump Systems | NE-501 | |
| Tubing | SCI Scientific Commodities Inc. | BB31695-PE/5 | 0.034” (0.86 mm) I.D. x 0.052” (1.32 mm) O.D |
| Syringe Tip | CMLsupply | 901-20-050 | 20 Gauge x 1/2” blunt tip stainless steel canula |
| Syringe Filter | PALL | 4650 | Acrodisc 32 mm Syringe Filter with 5 um Supor Membrane |
| Syringe | Qosina | C3307 | 10 mL Male Luer Lock Syringe |
| 3 Way Valve | ColeParmer | FF-30600-23 | Large-bore 3-way, male-lock, stopcocks, 10/pack, Non-sterile |
| Dowel Pin | McMaster-Carr | 90145A317 | 18-8 Stainless Steel Dowel Pins (1/32" Dia. x 1/2" Lg.) |
| Low Binding Microcentrifuge Tube | Corning | CL S3206 | 0.65 mL low binding snap cap microcentrifuge tube |
References
- Lopez-Maury, L., Marguerat, S., Bahler, J. Tuning gene expression to changing environments: from rapid responses to evolutionary adaptation. Nat Rev Genet. 9 (8), 583-593 (2008).
- de Nadal, E., Ammerer, G., Posas, F. Controlling gene expression in response to stress. Nat Rev Genet. 12 (12), 833-845 (2011).
- Hulme, S. E., Shevkoplyas, S. S., Samuel, A. Microfluidics: Streamlining discovery in worm biology. Nat Methods. 5 (7), 589-590 (2008).
- San-Miguel, A., Lu, H. Microfluidics as a tool for C. elegans research. WormBook. , (2013).
- Kopito, R. B., Levine, E. Durable spatiotemporal surveillance of Caenorhabditis elegans response to environmental cues. Lab Chip. 14 (4), 764-770 (2014).
- Mishra, B., et al. Using microfluidics chips for live imaging and study of injury Responses in Drosophila larvae. J Vis Exp. (84), e50998 (2014).
- Grisi, M., et al. NMR spectroscopy of single sub-nL ova with inductive ultra-compact single-chip probes. Sci Rep. 7, 44670 (2017).
- Crane, M. M., Chung, K., Stirman, J., Lu, H. Microfluidics-enabled phenotyping, imaging, and screening of multicellular organisms. Lab Chip. 10 (12), 1509-1517 (2010).
- Leifer, A. M., Fang-Yen, C., Gershow, M., Alkema, M. J., Samuel, A. D. T. Optogenetic manipulation of neural activity in freely moving Caenorhabditis elegans. Nat Meth. 8 (2), 147-152 (2011).
- Lee, K. S., Lee, L. E., Levine, E. HandKAchip - Hands-free killing assay on a chip. Sci Rep. 6, 35862 (2016).
- Lee, K. S., et al. Serotonin-dependent kinetics of feeding bursts underlie a graded response to food availability in C. elegans. Nat Commun. 8, 14221 (2017).
- Stiernagle, T.
- NE-1000 Series of Programmable Syringe Pumps. , New Era Pump Systems Inc. (2017).
- Tan, M. W., Mahajan-Miklos, S., Ausubel, F. M. Killing of Caenorhabditis elegans by Pseudomonas aeruginosa used to model mammalian bacterial pathogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (2), 715-720 (1999).
- Kim, D. H., et al. A conserved p38 MAP kinase pathway in Caenorhabditis elegans innate immunity. Science. 297 (5581), 623-626 (2002).
- Troemel, E. R., et al. p38 MAPK regulates expression of immune response genes and contributes to longevity in C. elegans. PLoS Genet. 2 (11), 183 (2006).
- Estes, K. A., Dunbar, T. L., Powell, J. R., Ausubel, F. M., Troemel, E. R. bZIP transcription factor zip-2 mediates an early response to Pseudomonas aeruginosa infection in Caenorhabditis elegans. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (5), 2153-2158 (2010).
- Byerly, L., Cassada, R. C., Russell, R. L. The life cycle of the nematode Caenorhabditis elegans: I. Wild-type growth and reproduction. Dev Biol. 51 (1), 23-33 (1976).
- Chalancon, G., et al. Interplay between gene expression noise and regulatory network architecture. Trends Genet. 28 (5), 221-232 (2012).
- Sanchez, A., Choubey, S., Kondev, J.
- Norman, T. M., Lord, N. D., Paulsson, J., Losick, R. Stochastic Switching of Cell Fate in Microbes. Annu Rev Microbiol. 69, 381-403 (2015).
- Gardner, T. S., di Bernardo, D., Lorenz, D., Collins, J. J. Inferring genetic networks and identifying compound mode of action via expression profiling. Science. 301 (5629), 102-105 (2003).
- Samuelson, A. V., Carr, C. E., Ruvkun, G. Gene activities that mediate increased life span of C. elegans insulin-like signaling mutants. Genes Dev. 21 (22), 2976-2994 (2007).
- Edwards, C. B., Copes, N., Brito, A. G., Canfield, J., Bradshaw, P. C. Malate and Fumarate Extend Lifespan in Caenorhabditis elegans. PLoS ONE. 8 (3), 58345 (2013).
- Riddle, D. L., Blumenthal, T., Meyer, B. J., Priess, J. R. C. elegans II. Riddle, D. L., Blumenthal, T., Meyer, B. J., Priess, J. R. , (1997).
- Churgin, M. A., et al. Longitudinal imaging of Caenorhabditis elegans in a microfabricated device reveals variation in behavioral decline during aging. eLife. 6, 26652 (2017).
- Scholz, M., Lynch, D. J., Lee, K. S., Levine, E., Biron, D. A scalable method for automatically measuring pharyngeal pumping in C. elegans. J Neurosci Methods. 274, 172-178 (2016).
- Scholz, M., Dinner, A. R., Levine, E., Biron, D. Stochastic feeding dynamics arise from the need for information and energy. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (35), 9261-9266 (2017).
