Summary
Bu makalede, biz bireysel Worms özel mikrosıvısal aygıt istihdam canlı görüntüleme göstermek. Cihazda, birden çok solucanlar chambers, çeşitli biyolojik süreçlerin çoğaltılmış boyuna gözetim sağlayan ayrı ayrı ayrı sınırlı.
Abstract
Son on yılda, mikrosıvısal teknikleri küçük hayvanlar Caenorhabditis elegans, Yuvarlak solucanlar da dahil olmak üzere, çalışma için başvuran ve uygun bir canlı görüntüleme platformu için hassas kontrol sağlar yararlı kanıtladık deneysel koşullar içinde gerçek zaman. Bu makalede, biz bireysel Worms WormSpa, daha önce yayımlanmış özel mikrosıvısal aygıt istihdam canlı görüntüleme göstermek. Cihazda, birden çok solucanlar chambers, çeşitli biyolojik süreçlerin çoğaltılmış boyuna gözetim sağlayan ayrı ayrı ayrı sınırlı. Belgili tanımlık yeteneklilik göstermek için biz solucan içinde belgili tanımlık aygıt patojen bakteri ile enfekte ve bağışıklık yanıtı genler ve yumurta atarken ifadesi dinamiklerini sürekli bireysel takip kanıt prensibi deneyler gerçekleştirilen hayvanlar. Basit tasarım ve işletme bu cihazın uygun mikrosıvısal tabanlı deneyleri ile önceki deneyimi olmayan kullanıcılar için yapmak. Önerdiğimiz bu yaklaşım pek çok araştırmacı iyi tanımlanmış koşullar altında biyolojik süreçlerin boyuna gözlemler ilgilenen yararlı olacaktır.
Introduction
Çevre koşulları değişiklikler genetik programlar indüksiyon ve baskı belirli genler1,2ifadenin eşliğinde aktivasyonu neden olabilir. Bu kinetik değişiklikler doku aynı hayvanlarda ve farklı hayvanlar arasında arasında değişken olabilir. Çalışmalar genetik gibi programlar bu nedenle bireysel hayvanların boyuna görüntüleme izin ve çevre koşulları hassas dinamik kontrol sağlar yöntemler için ara.
Son yıllarda, microfabricated sıvı aygıtlar yanıt ve davranış küçük hayvanlarda, solucanlar, sinekler, su ayılar ve daha fazla3,4,5,6de dahil olmak üzere birçok açıdan incelemek için kullanılmıştır, 7. Uygulamalar içerir, örneğin, derin fenotipleme, kimyasal uyaranlara yanıt olarak nöronal aktivite kayıt ve hareket ve pompa8,9,10 gibi motor davranışların optogenetic , 11.
Yanıt-e doğru yerel microenvironment, bakım sağlayan esnek tasarım hassas dinamik kontrol dahil olmak üzere, çevre yardımlar uzun vadeli uzunlamasına görüntüleme faydalı olacağını pek çok özellik mikrosıvısal tabanlı yaklaşımlar tutun bireysel hayvanlar ayrı üç aylık dönemler ve görüntüleme için olumlu nitelikleri. Ancak, onların iyi varlıklar üzerinde en az yan etki ile uzun bir süre bir mikrosıvısal odası hayvanlarda Bakımı mikrosıvısal cihazın tasarımının yanı sıra deneme yürütülmesi özel dikkat gerektirir bir meydan okumadır.
Burada WormSpa, bir mikrosıvısal aygıt Caenorhabditis elegansboyuna görüntüleme için kullanımını göstermektedir. 5 bireysel solucanlar odasında sınırlı. Sıvı ve bakteriyel süspansiyon sürekli bir düşük akış garanti eder iyi beslenmiş ve iyi bir sağlık bakımı ve stresi hafifletmek için yeterince aktif solucanlar ve yumurtalarını bırakmak solucanlar odaları yapısını sağlar. Tasarımın sadeliği ve WormSpa işletme araştırmacılar ile hayır önceki deneyim havacilik bu cihaz kendi araştırma planları dahil etmek için izin vermelidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
İletişim kuralı aşağıdaki WormSpa5, daha önce açıklanan mikrosıvısal aygıt Worms boyuna görüntüleme için kullanır. WormSpa (istek üzerine yazarlardan elde CAD dosyaları ile başlayan) imalatı basit ama bazı uzmanlık gerektirir. Çoğu durumda, imalat kolayca bir çekirdek tesis veya gibi hizmetler sağlar ticari bir şirket tarafından yapılabilir. Cihaz imalatı, belgili tanımlık şekil yüksekliği 50 µm olduğunu belirtmek emin olun.
1. deneysel Kur
- Motorlu bir sahne ile bir ters Floresans mikroskobu mikrosıvısal aygıt bağlama.
- Orbital Çalkalayıcı mikroskop yakın yerde ama titreşim shaker dan mikroskop doğrudan etkilemez emin olun. Örneğin, görme duyusuyla ilgili tablo ile hiçbir temas yapar bir duvar üzerinde sabit bir raf shaker koymak.
- Bir şırınga pompa üzerinde orbital Çalkalayıcı yerleştirin. Sallayarak süre Jikleyi değil shaker pompa teyp.
2. mikrosıvısal ortamı hazırlanması
Not: deneme sırasında dört şırınga mikrosıvısal aygıt yolu ile şırınga tüpler, şekil 1' de belirtildiği gibi bağlanır. Bu adımı bu şırınga hazırlanması açıklar. Aksi takdirde mezkur onları gergin yapmadan şırınga tüpler olabildiğince kısa tutmak.
- Bir çıkış şırınga ve bir şırınga tüp hazırlayın. Bu şırınga ( şekil 1' deki S1) daha sonra olacak şırınga tüpünden cihazın çıkışına bağlı ve sıvı cihazınızdan geçici depolama için kullanılır.
- Bir bağdaştırıcı iğne sadece iğne (metal parça) tutmak bir 20 G x 1/2 inç şırınga ucu plastik parçaları kaldırarak olun. Plastik ve metal parçalar pense ile tutarak ve onları ayrı çekerek bunu. İğne üzerinde kalan plastik kalıntı Bunsen burner ile ebilmek yanmak.
- Deneysel Kur geometrisini göre iğne pense ile iki uçlarından tutarak viraj. Burada açıklanan tasarımında ortasından iğnede ~ 110 ° açı için bükme en uygundur.
- Bağdaştırıcı iğne yarım tüp içine takın. Diğer yarısı daha sonra cihazın içine takılı. Şırınga tüp bir sızıntı (örneğin, boru 0,86 mm iç çap ve 1.32 mm dış çapı ile) olmadan bir 20 G şırınga ucu ile uyumlu olmalıdır. Önerilen boru uzunluğu ~ 50 cm'dir.
- Bir 10 mL radarı-kilit şırınga şırınga tüp 20 G x 1/2 inç şırınga ucu üzerinden (açık) diğer ucunu bağlayın.
- Arabellek girişi şırınga hazırlamak ve tüpler şırınga. Bu şırınga biri ( şekil 1' deki S2) için goes içine belgili tanımlık aygıt ve enjeksiyon akışını kontrol etmek için sıvı su deposu olarak kullanılır. Diğer şırınga (S3 şekil 1' deki) adım 3.2 açıklandığı gibi arabellek alışverişi için gerekli.
- Bir 10 mL radarı-kilit şırınga (S2) doğrudan bir 3-yollu vana bağlanmak ve bir şırınga tüp (şekil 1) ile aynı Vana başka bir şırınga (S3) bağlanmak: S3 tüp bir şırınga ucu üzerinden bağlanmak ve tüp valf başka bir şırınga ucu üzerinden bağlanmak.
Not: Bu malzemelerin bağlandığı sırası önemli değil. - Bir şırınga tüp 3-yollu vana kalan bağlantı noktasına bağlayın. Adım 2.1.2 olduğu gibi başka bir bağdaştırıcı iğne hazırlamak ve yarım iğne şırınga tüp (açık) diğer ucunu takın.
- Adım 2.2.2 ve S2 şırınga tüp bağlı S3 kapalı iken kapak ayarlayın (şekil 1).
- Bir 10 mL radarı-kilit şırınga (S2) doğrudan bir 3-yollu vana bağlanmak ve bir şırınga tüp (şekil 1) ile aynı Vana başka bir şırınga (S3) bağlanmak: S3 tüp bir şırınga ucu üzerinden bağlanmak ve tüp valf başka bir şırınga ucu üzerinden bağlanmak.
- Bir solucan-giriş şırınga ve bir şırınga tüp hazırlayın. Bu şırınga (S4 şekil 1' deki) solucanlar cihazın içine yüklemek için kullanılır.
- Bir uzun şırınga tüp 10 mL radarı-kilit şırınga (S4) bağlayın. Bu yükleme için kullanılacak olan sıvı hacmi tüpünden belirlemek; Örneğin, 100 cm hortumunun üzerinde 2 mL sıvı destekler (Ayrıca, bkz: adım 4.2).
- Adım 2.1.2 olduğu gibi başka bir bağdaştırıcı iğne hazırlamak ve ayaklardan biri iğne şırınga tüp diğer (açık) sonuna yarısı.
- Şırıngalar ve boru S-Orta12 ile iki kez yıkayın. Şırıngaları ve tüpler S-Orta tüm hava kabarcıkları kaldırmak için dikkat çekici doldurun.
- Çıkış şırınga tüp cihazı prize bağlayın.
- Bağdaştırıcı iğne şırınga tüp çıkış bağlantı noktasına sonunda takın.
- Küçük bir S-Orta arabellek giriş ve solucan giriş dışarı gelene kadar aygıt, doldurmak için çıkış S-orta küçük bir birim enjekte.
- Arabellek girişi şırınga tüp solucan-giriş (1/32-inç çapında paslanmaz çelik dübel PIN) PIN'i ile tıkalı ise cihazın tampon-giriş bağlantı noktasına bağlayın.
- Sürekli bir akış arabellek cihazın içine enjekte. Bir şırınga pompa13üzerine tampon-giriş şırınga S2 yük ve S2 ortamda sürekli bir akış hızı 3 µL/dk at cihaz içine enjekte edilir pompa ayarlayın.
3. yükleme bakteri içine mikrosıvısal aygıt
- S-Orta12' askıya Escherichia coli OP50 hazırlayın.
- Standart bir protokol, bir 250 mL şişe 50 mL LB ve bir koloni ile aşılamak ve gecede 37 ° C'de kuluçkaya
- Gecede kültür 4000 devirde 10 dakika santrifüj kapasitesi ve Pelet 30 mL S-Orta resuspend.
- Süspansiyon 5 mikron şırınga filtre ile filtre. 600 optik yoğunluğu tarafından bakteri konsantrasyonu ölçmek nm (OD600) ve 3 bir OD600 konsantrasyonu ayarlayın. Bu yüksek yoğunluklu kurtlar besili tutmak için gereklidir.
- OP50 süspansiyon aygıtla arabellekte değişimi.
- Temiz bir şırınga (S5) OP50 süspansiyon ile dolu hazırlayın. Şırınga dikey tutun ve üstündeki tüm hava baloncuklar toplamak için birkaç kez dokunun.
- 3-yollu vana aygıtına bağlantıyı kapatmak için arabellek giriş şırıngaların açın ve iki şırınga, S2 ve S3 bağlayın. S2 şırınga pompa devreden çıkar.
- S2 Vana dan çıkarıp S5 kapak için takın. Biraz OP50 arabellek S3 gidene S5 üst kısmında S3 için vana toplanan tüm hava dışarı itin. Bunu yaparken, hiçbir hava kabarcığı S5 veya kapak kalır emin olun.
- 3-yollu vana S3 ve S5 arasındaki bağlantıyı kapatmak ve S5 cihaza iletişime geçmek için yeniden orijinal konumuna gelmek. S5 şırınga pompa yükleyin. Pompa tutan orbital Çalkalayıcı üzerinde açın. Yaklaşık 200 rpm sallama hızını ayarlar.
- 100 µL/dk'ya olmak akış hızını ayarlayın. İçinde belgili tanımlık aygıt solucanlar ulaşması için yeni tampon için gereken zaman arabellek giriş şırınga tüp (yaklaşık 5 dakika yukarıda açıklanan boru ile) uzunluğunu bağlıdır. Daha hızlı bir tampon değişimi gerekli ise bir daha yüksek akış hızı istihdam edilebilir.
- Bir kez OP50 arabellek cihazın yayılır, akış hızı 3 µL/dak için geri ayarlayın.
4. yükleme solucanlar mikrosıvısal cihazın içine
- Bir küçük düşük bağlama microcentrifuge tüp (650 µL) hazırlamak ve OP50 süspansiyon 100 µL ile doldurun. Çevresinde transferi tek solucan ile seçerek (46 saat sonrası L1 larva tutuklama 25 ° C'de) Yetişkin solucanlar bir NGM (nematodunun büyüme orta) agar plaka tüp almak 20-30 yaş senkronize genç. Yaş-eşitleme standart protokol12yapılabilir.
- Solucan-giriş doldurmak şırınga ve şırınga tüp (S4 şekil 1' deki) OP50 süspansiyon ile. ~ 500 µL sıvının Kurtlarla microcentrifuge tüp içine enjekte. Süspansiyon ile solucanlar solucan-giriş şırınga tüp içine çizin. Şırınga tüp yeterince uzun olduğundan emin olun (> 1 m) ve çizilmiş solucanlar şırınga tüp içinde kalmak ve yapmak değil yapmak şırınga S4 sonuna kadar.
- S4 solucan-koya bağlayın. Tüm solucanlar solucan-giriş şırınga tüp mikrosıvısal cihazın içine enjekte. S4 ve şırınga tüp çıkarın. Solucan-giriş bir iğne ile takın.
- S2 arabellek giriş şırıngadan mekanik pompa ( Resim 1) kapatın ve el ile S1 ve S2 tüm solucanlar ayrı kanal içine itmek için kontrol edin. S1 basmak onları ters yönde ilerlemeye neden olur iken S2 basmak solucanlar kanallarına ilerlemeye neden olur. Bir kanal yüklendikten sonra solucan her kanaldaki diğer solucanları girişini engeller.
- Solucanlar 2-3 saat için yeni ortamına ayarlamak izin.
5. bir görüntüleme Protokolü kurma
- Güvenli belgili tanımlık aygıt içinde yer alan tüm solucanlar bulmak ve her-in onları içinde senin mikroskop denetler görüntü edinme yazılım için bir görüntüleme konumu ayarlayın. Unutmayın bazı durumlarda (örneğin daha yüksek büyütme istendiğinde veya fotoğraf makinesi ile daha küçük bir CCD sensör kullanırken) birden çok görüntüleme pozisyonlar her kanal için gereklidir.
Not: Bu el ile yapılabilir iken, bazı satın alma yazılım paketleri görüntüleri nereden alınacağını konumlarını listeleyen bir metin dosyası yükleyebilirsiniz. Bu pozisyonlar düzenli olarak WormSpa içinde sıralanır beri bir kullanıcı (Örneğin, Python veya ticari yazılım) otomatik olarak böyle bir liste oluşturduğu küçük bir betik yazabilirsiniz. Bu komut dosyası hassas biçimi edinme yazılım (bakınız ek malzeme 1örnekte bir) tarafından beklenen dosya biçimi bağlıdır. - Hızlandırılmış görüntüleme gerekli sıklığını ayarlayın. Örneğin, görüntüleme bağışıklık gen yanıt enfeksiyon kare başına 10 dakika bir frekansta yapılır. Tüm gerekli kanal (örneğin parlak alan ve GFP floresan) her zaman noktasında iktisap emin olun.
6. ana bilgisayar yanıt Pseudomonas enfeksiyon
Not: Bu ana bilgisayar-patojen etkileşimleri eğitim için belirli bir adımdır. Alternatif olarak, bir faiz (biyotik ve abiyotik stres, ilaçlar, sinyal molekülleri, vb) diğer çevre ipuçları içeren bir arabellek hazırlayabilirsiniz.
- SK-orta14' te askıya Pseudomonas aeruginosa PA14 hazırlayın.
- 50 mL LB ve bir koloni ile 250 mL şişe aşılamak ve gecede 37 ° C'de kuluçkaya
- Başka bir 250 mL şişe 50 mL lb ve bir aliquot kültür aşılamak ve gecede 37 ° C'de kuluçkaya
- Gecede kültür 4000 devirde 10 dakika santrifüj kapasitesi ve Pelet 10 mL SK-orta resuspend. Bakteri konsantrasyonu ölçümü ve konsantrasyon OD600 ayarlamak = 4.
- Süspansiyon için temiz bir şişeye aktarmak ve 24 saattir 37 ° c ve 25 ° c sallayarak süre başka bir 24 saat kuluçkaya. Bu adımı tahlil14öldürme standart plaka-kuluçka adımda taklit eder.
- Süspansiyon 5 mikron şırınga filtre ile filtre. Bu cihazın tıkanma bakteriyel toplamları önlemektir.
- Cihazın OP50 süspansiyon aşağıdaki adım 3.2 olduğu gibi aynı yordamı PA14 süspansiyon ile değiştirin. 10 saat için Imaging tutmak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
(46 saat sonrası L1 larva tutuklama 25 ° c)12 iletişim kuralında tanımlanan olarak cihazda yüklü yaş senkronize genç yetişkin solucanlar. Solucanlar ayrı ayrı ayrı kanalları, hayvanların yanıt patojeni boyuna ölçümü etkinleştirme yer. Deneme başarılı olduğunda, Solucanların çoğu onların kanallarında deneme süresince kalır. Bu durumda, bireysel solucanlar görüntülerini aktif olarak hayvan bulma gereksinimini kaçınarak görüntüleme yolundaki onların kanal yerleştirerek alınır. Resim 2 A aygıt 10 saat boyunca tek temsilcisi solucan alan parlak görüntüleri gösterir. Onlar taşıyabilirsiniz up - solucanlar onların kanal içinde sınırlı iken ve aşağı akım ve özgürce başlarını açabilirsiniz. Bu cihazın kendisi neden stres değil veya hayvanlara zarar güvence altına almak için önemlidir.
Biz yanıt Worms bakteriyel enfeksiyona P. aeruginosa, C. elegansen çok çalışılmış bakteriyel patojenler biri tarafından izlenir. Kistik fibrozis ve immün hastalarda enfeksiyon yol açan insan bir fırsatçı patojen da sağlar. Solucanlar gibi klinik PA14, ölümcül bağırsak enfeksiyonu, yol açar yalıtmak ve virülans faktörleri bu sürecine memeli ev sahibi enfeksiyonunda da karıştığı P. aeruginosa, belirli suşları ile besleme. 14 , 15
Gen ifadesinin bakteriyel enfeksiyon sırasında değişiklikleri paterni incelemek için floresan gazetecilere istihdam edilebilir. Dinamik yanıt enfeksiyon görüntülemek birçok genler arasında biz GFP Floresans transgenik solucanlar IRG-1::GFP ifade üzerinden görüntüleme tarafından IRG-1 (enfeksiyon yanıt gene 1), transkripsiyon yanıt izlenir (AU0133 [agIs17 () PIRG-1::GFP; pmyo-2::mCherry)], Ausubel Laboratuarı'ndan elde edilen). IRG-1 güçlü enfekte hayvanların bağırsak enfeksiyonu erken aşamada P. aeruginosa PA14 tarafından indüklenen olduğu bilinmektedir. 16 , 17 Resim 2 B zaman atlamalı görüntüleri temsilcisi solucan ( Şekil 2Aolduğu gibi aynı hayvan) gösterir. Her floresan görüntü hemen karşılık gelen alan parlak görüntü sonra çekildi. İlk 5 saat sonrası enfeksiyonunda GFP Floresans sadece hafif artar Orta beden ve kuyruk. Sonra orta vücuttan başlayan Floresans önemli bir artış görülmektedir. Her solucan toplam Floresans Şekil 2saat sonrası enfeksiyon'cC bir fonksiyonu olarak çizilir. Bu veriler sadece IRG-1 PA14 enfeksiyon üzerine daha önce açıklanan indüksiyon, aynı zamanda zamanlaması ve ölçüde indüksiyon solucan solucan değişkenlik göstermektedir.
WormSpa mikrosıvısal aygıt tasarımını her bireysel solucan5tarafından atılmıştır yumurta toplamak filtreleri içerir. Yumurtadan sonra L1 larva filtre ve çıkış tüp içine yıkanır. Bu bize el ile bireysel solucan yumurta atarken Kinetik bakteriyel enfeksiyon sırasında izlemek izin. Zaman atlamalı görüntüleri olduğu gibi Resim 2 aynı solucan tarafından yumurta şekil 3' teAgösterilmektedir. Bu görüntüler doğru Şekil 2Akarşılık gelen alan parlak Albümdeki sonra alınmıştır. Her solucan tarafından atılmıştır yumurta toplam kaç saat sonrası şekil 3Benfeksiyonunda bir fonksiyonu olarak gösterilir ve ortalama ve standart sapma tüm popülasyonu üzerinde şekil 3' teCgösterilmektedir. Hayvan hayvan değişkenlik yanı sıra daha önce açıklanan düşüş yumurta atarken enfeksiyon ilerledikçe, bu veri yakalama. Buna ek olarak, yumurta atarken oranı kadar düşüş değil hastalık bulaşmamış tek hayvanlarda 25 ° C5,18, L1 doruklarına ~ 54 saat sonrası.
Resim 1: deneysel bir mikrosıvısal cihazın Worms canlı görüntüleme düzeninin. Solucanlar solucan girişcihazı içine yüklenir ve daha sonra ayrı kanal içine itilir. Bakteriyel süspansiyon arabellek giriş aygıtından içine bir orbital Çalkalayıcı monte mekanik pompa enjekte edilir. Arabellek çıkış bağlantı noktası üzerinden cihazın çıkar. Dört şırınga (S1, S2/S5, S3 ve S4) cihazı çalıştırmak için kullanılır. Kırmızı kesik çizgiler şırınga ve aygıt bağlama şırınga tüpler vardır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2: temsilcisi gen ifade Kinetik. Zaman atlamalı görüntüleri parlak-alan (A) ve (B) GFP Floresans mikroskobu tarafından alınan bir temsilcisi solucan. Sadece patojen tanıtıldı önce en soldaki görüntüleri alındı, en sağdaki görüntüleri alındı, ancak enfeksiyon PA14 tarafından 10 saat sonrası. 1 saat görüntüler arasında zaman aralığıdır. (C) toplam IRG-1saat ders:: bireysel solucanlar GFP floresan. Her satır için tek bir hayvan karşılık gelir. Satır ortalama Floresans azalan şekilde sıralanmış. Floresan yoğunluğu renk kodlu ve renk ölçeği sağ tarafta gösterilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: temsilcisi yumurta atarken Kinetik. (A) zaman atlamalı görüntüleri Şekil 2A ve Bgösterilen aynı solucan tarafından yumurta sayısı. Sadece patojen tanıtıldı önce en soldaki görüntüleri alındı, en sağdaki görüntüleri alındı, ancak enfeksiyon PA14 tarafından 10 saat sonrası. 1 saat görüntüler arasında zaman aralığıdır. (B) zaman ders bireysel solucan yumurta sayısı. Her satır için tek bir hayvan karşılık gelir. Satır solucan koydu yumurta toplam sayısı azalan düzende sıralanır. Yumurta sayısı renk kodlu ve renk ölçeği sağ tarafta gösterilir. (C) yumurta ortalama sayısı bir fonksiyonu olarak solucan koydu. Gri alan ± bir standart sapma gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Takıma giren madde 1: WormSpa aygıtı görüntüleme konumlarda bulunan tüm kanallar için içeren bir metin dosyası oluşturan bir örnek komut dosyası. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mikrosıvısal araçları solucanlar eğitim birden çok yarar sağlar. Bir PDMS görüntüleme aygıt standart NGM agar plaka ile karşılaştırıldığında daha yüksek görüntü kalitesi sunar. Birden çok görüntüyü hangi hayvanlar plaka aldı ve mikroskop slayt görüntüleme için monte geleneksel yöntemler aksine tek bir solucan alınabilir. Buna ek olarak, solucanlar bulunduğu microenvironment sabit veya istediğiniz ortamı bileşimi ve hayvanların yanıt arasındaki eşlemeyi kesin izin kadar modüle tutulabilir.
Burada nasıl bir özel mikrosıvısal aygıtı (WormSpa) kullanarak fırsatçı patojen P. aeruginosa PA14 için birden çok bireysel solucanlar yanıt Imaging tarafından ana bilgisayar yanıt bakteriyel enfeksiyon boyuna bir ölçüm gerçekleştirileceği gösterilmiştir. Alan parlak ve floresan görüntüleri, birden çok kez devam eden deney perturbing olmadan alındı. Özellikle, yumurta döşeme ve IRG-1 gen ekspresyonu Kinetik her 10 dakikada bir, zamansal çözünürlük geleneksel yöntemleri14,15üzerinde önemli bir artış probed.
Bu cihazda herhangi bir zamanda her solucan kaydedilmiş konumunu yeniden ziyaret etme birden çok Worms boyuna ölçümleri gerçekleştirilebilir. Bu rakamlar 2C ve 3Bnerede biz ölçmek IRG-1, gösterilmiştir:: GFP Floresans ve yumurta koydu bireysel solucanlar tarafından. Bu rakamlar solucanlar Kinetik profilleri çok çeşitli ekran göster. Daha önce gösterildiği gibi tek hücreli çalışmalar19,20,21, bu bireysellik tasarım genetik devreleri yanı sıra farklı yolları19, arasındaki ilişkiyi anlamak için kullanılabilir 22.
Başarılı deneyler için solucanlar mikrosıvısal cihazın içine hızlı bir şekilde yüklemek için önemlidir. Solucanlar agar yüzeyinde tarama, sıvı ortamda thrash eğilimindedir ve bu davranış AMP aktive protein kinaz dahil23,24olan genetik bir program neden olmaktadır. Bu istenmeyen pertürbasyon en aza indirmek için katı yüzey taklit eden bir ortam Kurtlarla microstructures odası ve PDMS hava geçirgenliği sağlamak gibi solucanlar ayrı kendi odasında hızlı bir şekilde yerleştirmek önemlidir. 5 yüksek basınç uygulayarak yükleme solucanlar daha hızlı yardımcı olur rağmen cihazın çok fazla bastırmayın solucanlar mekanik stres neden. Ciddi bir şekilde vurguladı solucanlar içinde açıkça gözlemlenebilir torbalama fenotip25kaynaklanan değil yem veya yatıyordu yumurta yapar. Yükledikten sonra solucanlar 2-3 saat için solucanlar mikrosıvısal çevreye ayarlamak izin ve araştırmacı hayvanlar gözlemlemek ve bu da zarar görmüş atmak için bir fırsat sağlayarak, E. coli OP50 beslenir.
Boyutu ve microstructures her odasında aralığını L1 tutuklama 25 ° C'de 46 Saat yetiştirilen solucanlar için optimize edilmiştir Yapıların büyük solucanlar çalışmaya ölçekli ya da boyut olarak daha küçük olan L4 larva incelemek için azaltılmış. Ancak, solucanlar odasında çalışma sonrası embriyonik gelişme bu cihazın çağrısı başarıyla tüy dökme mümkün değildir. Bu tür uygulamalar için WorMotel26 gibi yöntemler kabul edilebilir. Beri solucanlar sınırlı ama WormSpa içinde hareketsiz değil, başarılı bir dayanıklı Deney hayvanları odasında kalmak üstünde bağlıdır. Biz bu aşamasındaki larva, erkek yetişkin ve bazı hermafrodit mutantlar zor olabilir bulmak.
Bir tek Arabellek girişi (üst şekil 1merkezinde) kullanmak yerine, iki baş aşağı balon şeklinde alıcılar aynı anda kullanılabilir. İki şırınga ile farklı arabellekleri doldurma, bir başka zamanda farklı şırınga basarak geçici yapılandırılmış ortamlar oluşturabilirsiniz. Bu, örneğin, çalışma ortamı değiştirme için uyum sağlar. 27 , 28
Yukarıda belirtildiği gibi burada açıklanan mikrosıvısal cihaz çok çeşitli diğer uygulamalar için kullanılabilir. Bu yanıt için diğer çevre ipuçları eğitim içerir. Böyle yanıt gen ekspresyonu ve yumurta atarken değişiklikleri içerebilir davranışları, burada, ama aynı zamanda metabolizması ve yağ birikimi (örneğin yağ Nil kırmızı ile boyama yoluyla), değişimler nöronal fizyolojisi ve (örneğin tarafından sinyal olarak Kalsiyum tedirginlikler) görüntüleme ve optogenetic, pompalama, dışkılama ve kafa hareketi (yolu ile hızlandırılmış dizileri otomatik nicel görüntüleme) ve diğerleri gibi motor davranış değişiklikleri.
Son olarak, bu yaklaşım büyük ölçüde otomatik olarak gerçekleşir ve birçok saat içinde uzun deneyler için gerekli işçi azaltır bile gün. Bir kez bireysel solucanlar konumlarını veri toplama yazılımı içinde kaydedilir, mekanik pompa denetleyicisi arabellek sabit akı cihazın içine korur sırada deneme görüntülerin otomatik kaydı oluşur. Önemlisi, uydurma bir WormSpa cihazın herhangi bir fazla standart yumuşak litografi Protokolü gerektirmez ve kendi tasarım ve işletme kadar basittir havacilik Hayır önceki deneyim ile araştırmacılar için bile. Çeşitli yukarıda açıklanan avantaj ve nispeten basit hazırlık adımları ile bu yaklaşım tam kontrollü şartlar altında canlı solucanlar boyuna ölçümü düşünüyorsanız olanlar için yararlı olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Bu araştırma hibe PHY-1205494 aracılığıyla Ulusal Bilim Vakfı ve MCB-1413134 (EL) ve Ulusal Araştırma Vakfı Kore grant 2017R1D1A1B03035671 tarafından desteklenmiştir (KSL).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| WormSpa | N/A | N/A | The CAD file for WormSpa is available from the Levine lab. |
| Compound Microscope | Zeiss | AxioObserver Z1 | An inverted fluorescence microscope with a motorized stage |
| Syringe Pump | New Era Pump Systems | NE-501 | |
| Tubing | SCI Scientific Commodities Inc. | BB31695-PE/5 | 0.034” (0.86 mm) I.D. x 0.052” (1.32 mm) O.D |
| Syringe Tip | CMLsupply | 901-20-050 | 20 Gauge x 1/2” blunt tip stainless steel canula |
| Syringe Filter | PALL | 4650 | Acrodisc 32 mm Syringe Filter with 5 um Supor Membrane |
| Syringe | Qosina | C3307 | 10 mL Male Luer Lock Syringe |
| 3 Way Valve | ColeParmer | FF-30600-23 | Large-bore 3-way, male-lock, stopcocks, 10/pack, Non-sterile |
| Dowel Pin | McMaster-Carr | 90145A317 | 18-8 Stainless Steel Dowel Pins (1/32" Dia. x 1/2" Lg.) |
| Low Binding Microcentrifuge Tube | Corning | CL S3206 | 0.65 mL low binding snap cap microcentrifuge tube |
References
- Lopez-Maury, L., Marguerat, S., Bahler, J. Tuning gene expression to changing environments: from rapid responses to evolutionary adaptation. Nat Rev Genet. 9 (8), 583-593 (2008).
- de Nadal, E., Ammerer, G., Posas, F. Controlling gene expression in response to stress. Nat Rev Genet. 12 (12), 833-845 (2011).
- Hulme, S. E., Shevkoplyas, S. S., Samuel, A. Microfluidics: Streamlining discovery in worm biology. Nat Methods. 5 (7), 589-590 (2008).
- San-Miguel, A., Lu, H. Microfluidics as a tool for C. elegans research. WormBook. , (2013).
- Kopito, R. B., Levine, E. Durable spatiotemporal surveillance of Caenorhabditis elegans response to environmental cues. Lab Chip. 14 (4), 764-770 (2014).
- Mishra, B., et al. Using microfluidics chips for live imaging and study of injury Responses in Drosophila larvae. J Vis Exp. (84), e50998 (2014).
- Grisi, M., et al. NMR spectroscopy of single sub-nL ova with inductive ultra-compact single-chip probes. Sci Rep. 7, 44670 (2017).
- Crane, M. M., Chung, K., Stirman, J., Lu, H. Microfluidics-enabled phenotyping, imaging, and screening of multicellular organisms. Lab Chip. 10 (12), 1509-1517 (2010).
- Leifer, A. M., Fang-Yen, C., Gershow, M., Alkema, M. J., Samuel, A. D. T. Optogenetic manipulation of neural activity in freely moving Caenorhabditis elegans. Nat Meth. 8 (2), 147-152 (2011).
- Lee, K. S., Lee, L. E., Levine, E. HandKAchip - Hands-free killing assay on a chip. Sci Rep. 6, 35862 (2016).
- Lee, K. S., et al. Serotonin-dependent kinetics of feeding bursts underlie a graded response to food availability in C. elegans. Nat Commun. 8, 14221 (2017).
- Stiernagle, T.
- NE-1000 Series of Programmable Syringe Pumps. , New Era Pump Systems Inc. (2017).
- Tan, M. W., Mahajan-Miklos, S., Ausubel, F. M. Killing of Caenorhabditis elegans by Pseudomonas aeruginosa used to model mammalian bacterial pathogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (2), 715-720 (1999).
- Kim, D. H., et al. A conserved p38 MAP kinase pathway in Caenorhabditis elegans innate immunity. Science. 297 (5581), 623-626 (2002).
- Troemel, E. R., et al. p38 MAPK regulates expression of immune response genes and contributes to longevity in C. elegans. PLoS Genet. 2 (11), 183 (2006).
- Estes, K. A., Dunbar, T. L., Powell, J. R., Ausubel, F. M., Troemel, E. R. bZIP transcription factor zip-2 mediates an early response to Pseudomonas aeruginosa infection in Caenorhabditis elegans. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (5), 2153-2158 (2010).
- Byerly, L., Cassada, R. C., Russell, R. L. The life cycle of the nematode Caenorhabditis elegans: I. Wild-type growth and reproduction. Dev Biol. 51 (1), 23-33 (1976).
- Chalancon, G., et al. Interplay between gene expression noise and regulatory network architecture. Trends Genet. 28 (5), 221-232 (2012).
- Sanchez, A., Choubey, S., Kondev, J.
- Norman, T. M., Lord, N. D., Paulsson, J., Losick, R. Stochastic Switching of Cell Fate in Microbes. Annu Rev Microbiol. 69, 381-403 (2015).
- Gardner, T. S., di Bernardo, D., Lorenz, D., Collins, J. J. Inferring genetic networks and identifying compound mode of action via expression profiling. Science. 301 (5629), 102-105 (2003).
- Samuelson, A. V., Carr, C. E., Ruvkun, G. Gene activities that mediate increased life span of C. elegans insulin-like signaling mutants. Genes Dev. 21 (22), 2976-2994 (2007).
- Edwards, C. B., Copes, N., Brito, A. G., Canfield, J., Bradshaw, P. C. Malate and Fumarate Extend Lifespan in Caenorhabditis elegans. PLoS ONE. 8 (3), 58345 (2013).
- Riddle, D. L., Blumenthal, T., Meyer, B. J., Priess, J. R. C. elegans II. Riddle, D. L., Blumenthal, T., Meyer, B. J., Priess, J. R. , (1997).
- Churgin, M. A., et al. Longitudinal imaging of Caenorhabditis elegans in a microfabricated device reveals variation in behavioral decline during aging. eLife. 6, 26652 (2017).
- Scholz, M., Lynch, D. J., Lee, K. S., Levine, E., Biron, D. A scalable method for automatically measuring pharyngeal pumping in C. elegans. J Neurosci Methods. 274, 172-178 (2016).
- Scholz, M., Dinner, A. R., Levine, E., Biron, D. Stochastic feeding dynamics arise from the need for information and energy. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (35), 9261-9266 (2017).
