Summary
In dit artikel tonen we live beeldvorming van individuele wormen met een aangepaste microfluidic apparaat. In het apparaat, zijn meerdere wormen individueel beperkt om te scheiden van de kamers, waardoor multiplexed longitudinale toezicht van verschillende biologische processen.
Abstract
In het laatste decennium, microfluidic technieken zijn toegepast om te bestuderen van kleine dieren, met inbegrip van de nematode Caenorhabditis elegans, en zijn nuttig als een handige levende imaging platform bieden mogelijkheden voor een nauwkeurige besturing van gebleken experimentele omstandigheden in real time. In dit artikel tonen we live beeldvorming van individuele wormen, WormSpa, een apparaat van de eerder uitgegeven aangepaste microfluidic in dienst. In het apparaat, zijn meerdere wormen individueel beperkt om te scheiden van de kamers, waardoor multiplexed longitudinale toezicht van verschillende biologische processen. Ter illustratie van het vermogen, wij aantonen van de principiële experimenten waarin wormen in het apparaat met pathogene bacteriën besmet waren, en de dynamiek van de expressie van genen van de immuunrespons en het leggen van eieren waren doorlopend gecontroleerd in individuele uitgevoerd dieren. Het eenvoudige ontwerp en de werking van dit apparaat maken het geschikt voor gebruikers geen ervaring heeft met microfluidic gebaseerde experimenten. Wij stellen voor dat deze aanpak nuttig voor veel onderzoekers ook geïnteresseerd in de lengterichting opmerkingen van biologische processen onder welomschreven voorwaarden zitten zal.
Introduction
Wijzigingen in de omgevingscondities kunnen leiden tot activatie van genetische programma's begeleid door inductie en onderdrukking van de expressie van specifieke genen1,2. Deze kinetische veranderingen kunnen variabele onder weefsels in dezelfde dieren en tussen verschillende dieren. Studies van dergelijke genetische programma's pleit daarom voor methoden die verlenen nauwkeurige dynamische controle van milieuomstandigheden en longitudinale beeldvorming van individuele dieren.
In de afgelopen jaren zijn microfabricated fluidic apparaten gebruikt om het bestuderen van vele aspecten van respons en gedrag bij kleine dieren, zoals wormen, vliegen, water beren en meer3,4,5,6, 7. Toepassingen omvatten bijvoorbeeld, diepe fenotypering, optogenetic opnemen van neuronale activiteit in reactie op chemische stimuli en volgen van gedrag van de motor zoals motoriek en pompen8,9,10 , 11.
Microfluidic-gebaseerde benaderingen houden veel eigenschappen die op lange termijn longitudinale beeldvorming van antwoord op het milieu signalen, met inbegrip van nauwkeurige dynamische controle van het lokale communicatie, flexibel ontwerp waarmee onderhoud van kunnen profiteren individuele dieren in de afzonderlijke kwartalen en gunstige kenmerken voor imaging. Behoud van dieren in een microfluidic kamer voor een lange tijd met een minimale negatieve impact op hun mens goed is echter een uitdaging, waarvoor bijzondere aandacht in het ontwerp van het microfluidic-apparaat alsook bij de uitvoering van het experiment.
We laten hier zien dat het gebruik van WormSpa, een microfluidic apparaat voor longitudinale beeldvorming van Caenorhabditis elegans. 5 individuele wormen zijn beperkt in de kamers. Een constante lage stroom van vloeibare en bacteriële suspensie garandeert dat wormen zijn goed gevoed en voldoende actief goede gezondheid te behouden en te verlichten stress, en de structuur van de kamers laat wormen om eieren te leggen. De eenvoud van het ontwerp en de werking van WormSpa moeten onderzoekers zonder eerdere ervaring in microfluidics te nemen van dit apparaat in hun eigen onderzoeksplannen toestaan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Het protocol hieronder gebruikt WormSpa5, een apparaat van de eerder beschreven microfluidic voor longitudinale beeldvorming van wormen. Fabricage van WormSpa (beginnend met CAD-bestanden die kunnen worden verkregen van de auteurs op aanvraag) is eenvoudig maar vereist enige deskundigheid. In de meeste gevallen kan fabricage gemakkelijk worden gedaan door een kern-faciliteit of door een commercieel bedrijf dat dergelijke diensten verleent. Wanneer het fabriceren van het apparaat, moet u opgeven dat de hoogte van de functies 50 µm is.
1. experimentele opstelling
- Monteer het microfluidic-apparaat op een omgekeerde fluorescentie Microscoop met een gemotoriseerde stadium.
- Plaats een roteerschudapparaat dicht bij de Microscoop, maar zorg ervoor dat de trillingen van de shaker heeft geen rechtstreeks invloed op de Microscoop. Bijvoorbeeld, zet de shaker op een plank vast op een muur die geen contact met de optische tabel maakt.
- Plaats een spuitpomp op de rondschudapparaat. Tape de pomp om de shaker zodat het niet terwijl het schudden schudden doet.
2. voorbereiding van het Microfluidic milieu
Opmerking: Tijdens het experiment, vier spuiten zijn verbonden met het microfluidic-apparaat via spuit buizen, zoals uiteengezet in Figuur 1. Deze stap wordt beschreven op de voorbereiding van deze spuiten. Tenzij anders vermeld, houd de injectiespuit buizen zo kort mogelijk zonder waardoor ze strak.
- De spuit van een stopcontact en een spuit buis voorbereiden. Deze spuit (S1 in Figuur 1) zal later worden aangesloten op de uitgang van het apparaat door de buis van de spuit, en gebruikt voor de tijdelijke opslag van vocht die uit het apparaat.
- Een adapter naald maken door het verwijderen van de kunststof delen van een 20 G x 1/2 inch spuit tip, alleen de naald (het metalen deel) houden. Doen door de plastic en metalen delen met een tang en trekken ze uit elkaar. Overige plastic residu op de naald kan worden verbrand uit met een bunsenbrander.
- Buig de naald volgens de geometrie van de experimentele opstelling terwijl de twee uiteinden met een tang. In het ontwerp die hier worden beschreven, is het geschiktst buigen de naald in het midden een hoek van ~ 110°.
- Steek de adapter naald halverwege in de buis. De andere helft zal later worden aangesloten op het apparaat. De spuit buis moet verenigbaar zijn met een tip van de spuit 20 G zonder een lek (bijvoorbeeld leidingen met van 0,86 mm binnendiameter en buitendiameter van 1,32 mm). De aanbevolen buislengte is ~ 50 cm.
- Sluit een spuit van 10 mL luer-lock aan de andere (open) uiteinde van de buis van de spuit via een tip van de spuit 20 G x 1/2 inch.
- Bereiden van buffer-inlaat spuiten en syringe buizen. Een van deze spuiten (S2 in Figuur 1) wordt gebruikt als een reservoir voor de vloeistof die in het apparaat en het bepalen van de tekstdoorloop injectie gaat. De andere spuit (S3 in Figuur 1) is vereist voor buffer uitwisseling, zoals uitgelegd in stap 3.2.
- Een 10 mL spuit voor luer-lock (S2) rechtstreeks verbinden met een 3-weg klep en een ander spuit (S3) verbinden met de dezelfde klep via een spuit-buis (Figuur 1): S3 sluit aan op de buis via een tip van de spuit en de buis verbinden met de klep via een ander uiteinde van de spuit.
Opmerking: De volgorde waarin deze materialen zijn verbonden maakt niet uit. - De resterende haven van de 3-wegkraan verbinden met een spuit-buis. Bereiden van een andere adapter naald zoals in stap 2.1.2, en steek de naald halverwege in het andere (open) uiteinde van de buis van de spuit.
- Het ventiel zo ingesteld dat de buis van de spuit in stap 2.2.2 en S2 zijn aangesloten terwijl S3 is gesloten (Figuur 1).
- Een 10 mL spuit voor luer-lock (S2) rechtstreeks verbinden met een 3-weg klep en een ander spuit (S3) verbinden met de dezelfde klep via een spuit-buis (Figuur 1): S3 sluit aan op de buis via een tip van de spuit en de buis verbinden met de klep via een ander uiteinde van de spuit.
- Een worm-inlaat spuit en een spuit buis voorbereiden. Deze spuit (S4 in Figuur 1) wordt gebruikt voor het laden van wormen in het apparaat.
- Een lange spuit buis verbinden met een injectiespuit luer-lock 10 mL (S4). Bepalen van de lengte van deze buis van het volume van de vloeistof die wordt gebruikt voor het laden; 100 cm buis ondersteunt bijvoorbeeld meer dan 2 mL vloeistof (Zie ook stap 4.2).
- Bereiden van een andere adapter naald zoals in stap 2.1.2, en sluit een helft van de naald naar het andere (open) uiteinde van de buis van de spuit.
- Spoel alle spuiten en buis met S-medium12 tweemaal. Vul de spuiten en de buizen met S-medium, verzorgen alle luchtbellen te verwijderen.
- Sluit de stopcontact spuit buis aan op de wandcontactdoos van het apparaat.
- Sluit de adapter naald aan het einde van de buis van de spuit op de outlet-poort.
- Het injecteren van een kleine hoeveelheid van de S-medium via het stopcontact te vullen van het apparaat, totdat een beetje S-medium uit zowel de inlaat van de buffer en de inlaat van de worm komt.
- De buffer-inlaat spuit buis verbinden met de buffer-inlaat poort van het apparaat, terwijl het inpluggen van de worm-inlaat met een pincode (Paspen roestvrij staal met een diameter van 1/32 inch).
- Het injecteren van een constante stroom van buffer in het apparaat. Laden van de buffer-inlaat spuit S2 op een spuit pomp13, en de pomp zo ingesteld dat het medium in S2 voortdurend wordt geïnjecteerd in het apparaat op een debiet van 3 µL/min.
3. veilig laden van bacteriën in het Microfluidic-apparaat
- Escherichia coli OP50 geschorst in S-medium12voor te bereiden.
- Na een standaardprotocol, een kolf van 250 mL met 50 mL LB en een één kolonie beënten, en na een nacht bebroeden bij 37 ° C.
- De overnachting cultuur bij 4000 omwentelingen per minuut gedurende 10 minuten centrifugeren en resuspendeer de pellet in 30 mL S-medium.
- Filtreer de suspensie door een filter van de spuit 5 µm. Meten van de bacteriële concentratie door de optische dichtheid bij 600 nm (OD600), en de concentratie op een OD600 van 3 aan te passen. Deze hoge dichtheid is vereist voor de wormen goed gevoed te houden.
- De buffer in het apparaat met de ophanging van de OP50 uit te wisselen.
- Een schone injectiespuit (S5) gevuld met de schorsing van de OP50 voor te bereiden. Houd de injectiespuit verticaal en kraan het meerdere malen voor het verzamelen van alle de luchtbellen aan de bovenkant.
- Schakel van de 3-weg klep van de buffer-inlaat spuiten om te sluiten van de verbinding met het apparaat, en sluit de twee spuiten, S2 en S3. S2 losraken van de spuitpomp.
- S2 Verbreek het ventiel en S5 verbinden met de klep. Alle lucht verzameld aan de bovenkant van de S5 naar S3 via het ventiel tot een klein beetje van de buffer van de OP50 in S3 gaat uitduwen. Daarbij, door ervoor te zorgen dat er geen luchtbel in de S5 of de klep blijft.
- Zet de 3-wegkraan terug naar de oorspronkelijke positie te sluiten de verbinding tussen de S3 en S5 en S5 verbinden met het apparaat. S5 op de spuitpomp laden. Zet de roteerschudapparaat die in het bezit van de pomp. Zet de schudden snelheid naar circa 200 rpm.
- Instellen van het debiet worden 100 µL/min. De tijd die nodig is voor de nieuwe buffer om te komen tot de wormen in het apparaat is afhankelijk van de lengte van de buffer-inlaat spuit buis (ongeveer 5 minuten met de slang die hierboven beschreven). Een hoger debiet kan worden ingezet als een snellere uitwisseling van de buffer vereist is.
- Zodra de OP50 buffer in het apparaat verspreidt, stelt u het stroomtarief terug naar 3 µL/min.
4. veilig laden van wormen in het Microfluidic-apparaat
- Bereiden van een kleine laag bindende microcentrifuge buis (650 µL) en vul deze met 100 µL van schorsing van de OP50. Transfer rond 20-30 leeftijd-gesynchroniseerde jonge volwassen wormen (46 uur na L1 larvale arrestatie bij 25 ° C) uit een agarplaat NGM (nematode groeimedium) aan de buis door het plukken ze één voor één met een worm kiezen. Leeftijd-synchronisatie kan gebeuren na een standaardprotocol12.
- Vul de worm-inlaat spuit en spuit buis (S4 in Figuur 1) met de schorsing van de OP50. Injecteren ~ 500 µL van de vloeistof in de buis microcentrifuge met wormen. Trekken de vering met wormen in de worm-inlaat spuit buis. Zorg ervoor dat de buis van de spuit lang genoeg is (> 1 m) en dat de getekende wormen in de spuit buis blijven en niet helemaal naar de spuit S4 maken.
- S4 verbinden met de worm-inlaat. Alle de wormen in de worm-inlaat spuit buis injecteren in het microfluidic-apparaat. Haal de S4 en de spuit buis. Sluit de worm-inlaat met een pincode.
- Losraken van de buffer-inlaat spuit S2 uit de mechanische pomp ( Figuur 1) en S1 en S2 te duwen van alle de wormen in afzonderlijke kanalen handmatig kan instellen. Op S2 te drukken verplaatst, wormen in de kanalen, terwijl S1 indrukken in omgekeerde richting verplaatsen zal. Zodra een kanaal wordt geladen, zal de worm in elk kanaal de toetreding van andere wormen blokkeren.
- Laat wormen aanpassen aan de nieuwe omgeving voor 2-3 uur.
5. het opzetten van een Imaging-Protocol
- Vind alle wormen die zich zich veilig in het apparaat bevinden, en een imaging positie instellen voor elk van hen in de afbeelding acquisitie software waarmee uw Microscoop. Merk op dat in sommige gevallen (bijvoorbeeld wanneer hogere vergroting is gewenst of bij het gebruik van camera's met een kleinere sensor CCD) meerdere beeldvorming posities zijn vereist voor elk kanaal.
Opmerking: Terwijl dit kan handmatig worden gedaan, kunnen sommige softwarepakketten overname laden een tekstbestand waarin de posities waar afbeeldingen moeten worden genomen. Aangezien deze posities regelmatig in WormSpa bevolen worden, kan een gebruiker een klein script (bijvoorbeeld in Python of commerciële software) waarmee automatisch een dergelijke lijst schrijven. Het precieze formaat van dit script zou afhangen van de bestandsindeling verwacht door de acquisitie software (zie een voorbeeld aanvullende materiaal 1). - Stel de vereiste frequentie voor time-lapse imaging. Beeldvorming van immuun gene reactie op besmetting gebeurt bijvoorbeeld met een frequentie van 10 minuten per frame. Zorg ervoor dat alle nodige kanalen (bijvoorbeeld helder-veld en de fluorescentie GFP) worden verworven op elk punt van de tijd.
6. host reactie op Pseudomonas-infectie
Opmerking: Deze stap is specifiek voor het bestuderen van de gastheer-pathogeen interacties. Anderzijds kan een voorbereiding van een buffer waarin andere milieu signalen van belang (biotische en abiotische stressoren, drugs, signalering van moleculen, enz.).
- Pseudomonas aeruginosa PA14 geschorst in SK-medium14voor te bereiden.
- Inoculeer een kolf van 250 mL met 50 mL LB en een één kolonie, en na een nacht bebroeden bij 37 ° C.
- Inoculeer nog een kolf van 250 mL met 50 mL LB en een aliquoot deel van de cultuur, en na een nacht bebroeden bij 37 ° C.
- De overnachting cultuur bij 4000 omwentelingen per minuut gedurende 10 minuten centrifugeren en resuspendeer de pellet in 10 mL voor SK-medium. Meten van de bacteriële concentratie en aanpassen van de concentratie op de OD600 = 4.
- Spoel de suspensie over in een maatkolf van schoon en Incubeer bij 37 ° C gedurende 24 uur en bij 25 ° C gedurende 24 uur terwijl het schudden. Deze stap bootst de plaat-incubatie stap in de standaard assay14doden.
- Filtreer de suspensie door een filter van de spuit 5 µm. Dit is om te voorkomen dat bacteriële aggregaten verstopping van het apparaat.
- De schorsing van de OP50 in het apparaat wordt vervangen door de opschorting van de PA14, volgens dezelfde procedure als in stap 3.2. Houden imaging voor 10 uur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Leeftijd-gesynchroniseerde jonge volwassen wormen (46 uur post L1 larvale arrestatie bij 25 ° C)12 werden geladen in het apparaat, zoals beschreven in het protocol. De wormen waren individueel gevestigd in afzonderlijke kanalen, waardoor longitudinale meting van dieren reactie op het pathogene agens oplevert. Als het experiment succesvol is, blijven de meeste wormen in hun kanalen voor de duur van het experiment. In dit geval, worden beelden van individuele wormen genomen gewoon door het plaatsen van hun kanaal in de beeldvorming weg, het vermijden van de noodzaak om actief het dier te zoeken. Figuur 2 A toont de beelden van de heldere-veld van een enkele vertegenwoordiger worm in de loop van 10 uur in het apparaat. Terwijl wormen zijn beperkt in hun kanalen, ze kunnen bewegen up - en "downstream", en kunnen vrij hun hoofden draaien. Dit is essentieel om te garanderen dat het apparaat zelf niet leiden stress tot of schadelijk voor de dieren.
Wij gecontroleerd reactie van wormen voor bacteriële infectie door P. aeruginosa, één van de best bestudeerde bacteriële pathogenen van C. elegans. Het is ook een opportunistische menselijke pathogenen die infectie bij cystic fibrosis en immuungecompromitteerde patiënten veroorzaakt. Het voeden van wormen met bepaalde stammen van P. aeruginosa, zoals de klinische PA14, leidt tot dodelijke intestinale infectie isoleren, en de Virulentiefactoren die betrokken zijn bij dit proces ook bij de infectie van zoogdieren hosts betrokken zijn. 14 , 15
Om te onderzoeken het patroon van de wijzigingen in genexpressie tijdens bacteriële infectie, kunnen fluorescerende verslaggevers worden toegepast. Onder de vele genen die dynamische reactie op de infectie worden weergegeven, gecontroleerd we de transcriptionele reactie van irg-1 (infectie reactie gen 1), door imaging GFP fluorescentie van transgene wormen uiting van irg-1::GFP (AU0133 [agIs17 () pirg-1::GFP; pmyo-2::mCherry)], verkregen uit de Ausubel lab). IRG-1 heet sterk veroorzaakt in de darm van geïnfecteerde dieren in de vroege fase van infectie door P. aeruginosa PA14. 16 , 17 Figuur 2 B toont tijd lapse beelden van een representatieve worm (hetzelfde dier zoals in Figuur 2). Elk fluorescentie beeld werd genomen onmiddellijk na de corresponderende afbeelding helder-veld. In de eerste 5 uur post infectie, GFP fluorescentie verhoogt slechts licht in het midden lichaam en de staart. Vervolgens wordt een aanzienlijke toename van de fluorescentie waargenomen, vanaf het midden lichaam. De totale fluorescentie in elke worm wordt getekend in Figuur 2C als functie van tijd post infectie. Deze gegevens illustreren niet alleen de eerder beschreven inductie van irg-1 na PA14 infectie, maar ook de variabiliteit van de worm-naar-worm bij de timing en de mate van inductie.
Het ontwerp van het WormSpa microfluidic apparaat omvat filters die de gelegde door elke afzonderlijke worm5eieren te verzamelen. Zodra de eieren uitkomen, worden de larven L1 gewassen door de filter en in de outlet-buis. Hierdoor konden wij handmatig controleren de kinetiek van ei-leggen van individuele wormen tijdens bacteriële infectie. De tijd lapse beelden van de eieren gelegd door de dezelfde worm zoals in Figuur 2 zijn weergegeven in Figuur 3A. Deze beelden werden genomen gelijk na de bijbehorende beelden van de heldere-veld in Figuur 2. Het cumulatieve aantal eieren gelegd door elke worm wordt weergegeven als een functie van tijd post-infectie in Figuur 3, onderB, en de gemiddelde en de standaarddeviatie over de gehele bevolking zijn afgebeeld in Figuur 3C. Het vastleggen van deze gegevens de variabiliteit van de dier-aan-dier, alsmede de daling van de eerder beschreven in het ei-leggen als infectie voortschrijdt. In tegenstelling, in niet-geïnfecteerde dieren ei leggen van tarief niet tot het dalen doet post pieken bij ~ 54 uur L1 bij 25 ° C5,18.
Figuur 1: Experimental schema van live beeldvorming van wormen in een microfluidic apparaat. Wormen worden geladen in het apparaat via de inlaat van de worm, en vervolgens in aparte kanalen zijn geduwd. Bacteriële suspensie wordt geïnjecteerd in het apparaat van de inlaat van de buffer door een mechanische pomp die is gemonteerd op een roteerschudapparaat. De buffer wordt afgesloten via de uitgang-poort van het apparaat. Vier spuiten (S1, S2/S5, S3 en S4) worden gebruikt om het toestel bedienen. De rode onderbroken lijnen zijn spuit buizen verbinden spuiten en het apparaat. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: vertegenwoordiger gen expressie kinetiek. Tijd lapse beelden van een representatieve worm genomen door Bright-veld (A) en (B) GFP fluorescentie microscopie. De meest linkse beelden werden genomen net voordat het pathogene agens geïntroduceerd, terwijl de meest rechtse beelden werden genomen 10 uur na besmetting door PA14. Het tijdsinterval tussen de afbeeldingen is 1 uur. (C) het tijdsverloop van totaal irg-1:: GFP fluorescentie in individuele wormen. Elke rij komt overeen met een enkel dier. Rijen gesorteerd in aflopende volgorde van gemiddelde fluorescentie. Intensiteit van de fluorescentie is gekleurd en de kleurenschaal wordt weergegeven aan de rechterkant. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: vertegenwoordiger ei leggen kinetiek. (A) Time lapse beelden van het aantal eieren gelegd door de dezelfde worm weergegeven in Figuur 2A en B. De meest linkse beelden werden genomen net voordat het pathogene agens geïntroduceerd, terwijl de meest rechtse beelden werden genomen 10 uur na besmetting door PA14. Het tijdsinterval tussen de afbeeldingen is 1 uur. (B) het tijdsverloop van cumulatieve aantal eieren in individuele wormen. Elke rij komt overeen met een enkel dier. Rijen gesorteerd in aflopende volgorde van het totale aantal per worm gelegde eieren. Het aantal eieren is gekleurd en de kleurenschaal wordt weergegeven aan de rechterkant. (C) het gemiddeld aantal eieren gelegd per worm als een functie van de tijd. Het grijze gebied geeft aan ± één standaarddeviatie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Aanvullende materiaal 1: een voorbeeldscript waarmee een tekstbestand met de beeldvorming posities voor alle kanalen in WormSpa apparaat. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Microfluidic tools bieden veelvoudige voordeel halen uit het bestuderen van wormen. Beeldvorming in een PDMS biedt apparaat hogere grafische kwaliteit ten opzichte van een standaard NGM agarplaat. Meerdere afbeeldingen kunnen afkomstig zijn uit een enkele worm, in tegenstelling tot de traditionele methoden waarin dieren zijn geplukt uit de plaat en gemonteerd op een microscoopglaasje voor imaging. Daarnaast kan de communicatie waarin wormen zich bevinden worden gehouden, constante of gemoduleerde zoals gewenst, toelaat nauwkeurige toewijzing tussen de samenstelling van het milieu en de reactie van de dieren.
We laten hier zien het uitvoeren van een longitudinaal meting van host reactie op bacteriële infectie door imaging de reactie van meerdere individuele wormen aan de opportunistische pathogenen P. aeruginosa PA14 met behulp van een aangepaste microfluidic apparaat (WormSpa). Zowel lichte-veld en fluorescentie beelden werden genomen op meerdere keren zonder storing veroorzaakt het lopende experiment. In het bijzonder, waren de kinetiek van de ei-leggen en de irg-1 genexpressie gesondeerd elke 10 minuten, een aanzienlijke stijging van de temporele resolutie over traditionele methoden14,15.
In dit apparaat, kunnen longitudinale metingen van meerdere wormen worden uitgevoerd door de opgeslagen locatie van elke worm te allen tijde herzien. Dit werd aangetoond in de figuren 2C en 3B, waar we het kwantificeren van de irg-1:: GFP fluorescentie en de eieren gelegd door individuele wormen. Deze cijfers laten zien dat wormen brede waaier van kinetische profielen weergeven. Als eerder is laten zien in eencellige studies19,20,21, kan deze individualiteit worden gebruikt om te begrijpen van het ontwerp van genetische circuits, evenals de correlatie tussen verschillende trajecten19, 22.
Voor succesvolle experimenten is het cruciaal voor het snel laden van wormen in het microfluidic-apparaat. Terwijl wormen op agar oppervlak kruipen, ze de neiging om thrash in vloeibare omgeving, en dit probleem induceert een genetische programma waarin AMP geactiveerd proteïne kinases betrokken23,24 zijn. Om deze ongewenste verstoring te minimaliseren, is het belangrijk om wormen in hun afzonderlijke kamers snel, zoals de microstructuren in de zaal en de doordringbaarheid voor lucht voor PDMS bieden wormen met een omgeving die vast oppervlak imiteert. 5 hoewel hogere druk uit te oefenen sneller laden wormen helpt, teveel Drukbehandeling van het apparaat kan induceren mechanische belasting op de wormen. Wormen die ernstig gestresst doen niet feed of leggen eieren, wat resulteert in een duidelijk waarneembare bagging fenotype25. Na het laden, worden wormen gevoed E. coli OP50 voor 2-3 uur, zodat de wormen aan te passen aan de omgeving van de microfluidic en het verstrekken van de onderzoeker een kans om de dieren te observeren en negeren die werden beschadigd.
De grootte en spatiëring van microstructuren in elke kamer zijn geoptimaliseerd voor de wormen gekweekt voor 46 uur van L1 arrestatie bij 25 ° C. De structuren kunnen worden opgeschaald naar het bestuderen van oudere wormen of verminderde te onderzoeken L4 larven die kleiner zijn. Wormen zijn echter niet kundig voor met succes molt in de zaal, uitschakeling van de studie van post embryonale ontwikkeling in dit apparaat. Voor dergelijke toepassingen, kunnen de methoden zoals WorMotel26 worden overwogen. Aangezien wormen zijn beperkt, maar niet in WormSpa worden geïmmobiliseerd, hangt een succesvolle duurzame experiment of de dieren in de zaal blijven. Wij vinden dat dit uitdagend voor beginnende larven, voor mannelijke volwassenen, en voor sommige hermafrodiete mutanten zijn kan.
In plaats van de inlaat van een interne buffer (in het midden van de top, Figuur 1), kunnen de twee ondersteboven ballon-vormige inhammen tegelijkertijd worden gebruikt. De twee spuiten vullen met verschillende buffers, kan een stoffelijk gestructureerde omgevingen genereren door te drukken op verschillende spuiten op ander moment. Bijvoorbeeld, hierdoor studie van aanpassing aan de veranderende omgeving. 27 , 28
Zoals hierboven vermeld, kan het apparaat van de microfluidic zoals hier beschreven voor een breed scala aan andere toepassingen worden gebruikt. Het gaat hierbij bestuderen van reacties op andere milieu signalen. Dergelijke reacties eventueel wijzigingen in genexpressie en ei leggen van gedrag, zoals hier wordt geïllustreerd maar ook veranderingen in de stofwisseling en vet (bijvoorbeeld door middel van vet door Nile rode kleuring) accumulatie neuronale fysiologie en signalering (bijvoorbeeld door calcium beeldvorming en optogenetic verstoringen), veranderingen in het gedrag van de motor zoals pompen, ontlasting en hoofd verkeer (via geautomatiseerde kwantitatieve beeldvorming van time-lapse sequenties), en meer.
Ten slotte, deze aanpak is grotendeels geautomatiseerd en vermindert de arbeid die nodig is voor lange experimenten over vele uren, zelfs dagen. Zodra de locaties van individuele wormen worden opgeslagen in de data-acquisitie software, bestaat het experiment uit automatische opname van beelden, terwijl de mechanische pomp controller de constante stroom van buffer in het apparaat onderhoudt. Belangrijker, fabricage van een WormSpa apparaat vereist geen elk meer dan de standaard zacht litho-protocol, en het ontwerp en de werking zijn eenvoudig genoeg zelfs aan onderzoekers zonder eerdere ervaring in microfluidics. Met de verschillende voordelen die hierboven besproken en relatief eenvoudige voorbereiding stappen, kan deze aanpak worden nuttig zijn voor degenen die longitudinale meting van levende wormen onder precies gecontroleerde omstandigheden overwegen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd gesteund door de National Science Foundation via subsidies PHY-1205494 en MCB-1413134 (EL) en door de nationale onderzoek Stichting van Korea subsidie 2017R1D1A1B03035671 (KSL).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| WormSpa | N/A | N/A | The CAD file for WormSpa is available from the Levine lab. |
| Compound Microscope | Zeiss | AxioObserver Z1 | An inverted fluorescence microscope with a motorized stage |
| Syringe Pump | New Era Pump Systems | NE-501 | |
| Tubing | SCI Scientific Commodities Inc. | BB31695-PE/5 | 0.034” (0.86 mm) I.D. x 0.052” (1.32 mm) O.D |
| Syringe Tip | CMLsupply | 901-20-050 | 20 Gauge x 1/2” blunt tip stainless steel canula |
| Syringe Filter | PALL | 4650 | Acrodisc 32 mm Syringe Filter with 5 um Supor Membrane |
| Syringe | Qosina | C3307 | 10 mL Male Luer Lock Syringe |
| 3 Way Valve | ColeParmer | FF-30600-23 | Large-bore 3-way, male-lock, stopcocks, 10/pack, Non-sterile |
| Dowel Pin | McMaster-Carr | 90145A317 | 18-8 Stainless Steel Dowel Pins (1/32" Dia. x 1/2" Lg.) |
| Low Binding Microcentrifuge Tube | Corning | CL S3206 | 0.65 mL low binding snap cap microcentrifuge tube |
References
- Lopez-Maury, L., Marguerat, S., Bahler, J. Tuning gene expression to changing environments: from rapid responses to evolutionary adaptation. Nat Rev Genet. 9 (8), 583-593 (2008).
- de Nadal, E., Ammerer, G., Posas, F. Controlling gene expression in response to stress. Nat Rev Genet. 12 (12), 833-845 (2011).
- Hulme, S. E., Shevkoplyas, S. S., Samuel, A. Microfluidics: Streamlining discovery in worm biology. Nat Methods. 5 (7), 589-590 (2008).
- San-Miguel, A., Lu, H. Microfluidics as a tool for C. elegans research. WormBook. , (2013).
- Kopito, R. B., Levine, E. Durable spatiotemporal surveillance of Caenorhabditis elegans response to environmental cues. Lab Chip. 14 (4), 764-770 (2014).
- Mishra, B., et al. Using microfluidics chips for live imaging and study of injury Responses in Drosophila larvae. J Vis Exp. (84), e50998 (2014).
- Grisi, M., et al. NMR spectroscopy of single sub-nL ova with inductive ultra-compact single-chip probes. Sci Rep. 7, 44670 (2017).
- Crane, M. M., Chung, K., Stirman, J., Lu, H. Microfluidics-enabled phenotyping, imaging, and screening of multicellular organisms. Lab Chip. 10 (12), 1509-1517 (2010).
- Leifer, A. M., Fang-Yen, C., Gershow, M., Alkema, M. J., Samuel, A. D. T. Optogenetic manipulation of neural activity in freely moving Caenorhabditis elegans. Nat Meth. 8 (2), 147-152 (2011).
- Lee, K. S., Lee, L. E., Levine, E. HandKAchip - Hands-free killing assay on a chip. Sci Rep. 6, 35862 (2016).
- Lee, K. S., et al. Serotonin-dependent kinetics of feeding bursts underlie a graded response to food availability in C. elegans. Nat Commun. 8, 14221 (2017).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , (2006).
- NE-1000 Series of Programmable Syringe Pumps. , New Era Pump Systems Inc. (2017).
- Tan, M. W., Mahajan-Miklos, S., Ausubel, F. M. Killing of Caenorhabditis elegans by Pseudomonas aeruginosa used to model mammalian bacterial pathogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (2), 715-720 (1999).
- Kim, D. H., et al. A conserved p38 MAP kinase pathway in Caenorhabditis elegans innate immunity. Science. 297 (5581), 623-626 (2002).
- Troemel, E. R., et al. p38 MAPK regulates expression of immune response genes and contributes to longevity in C. elegans. PLoS Genet. 2 (11), 183 (2006).
- Estes, K. A., Dunbar, T. L., Powell, J. R., Ausubel, F. M., Troemel, E. R. bZIP transcription factor zip-2 mediates an early response to Pseudomonas aeruginosa infection in Caenorhabditis elegans. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (5), 2153-2158 (2010).
- Byerly, L., Cassada, R. C., Russell, R. L. The life cycle of the nematode Caenorhabditis elegans: I. Wild-type growth and reproduction. Dev Biol. 51 (1), 23-33 (1976).
- Chalancon, G., et al. Interplay between gene expression noise and regulatory network architecture. Trends Genet. 28 (5), 221-232 (2012).
- Sanchez, A., Choubey, S., Kondev, J. Regulation of noise in gene expression. Annu Rev Biophys. 42, 469-491 (2013).
- Norman, T. M., Lord, N. D., Paulsson, J., Losick, R. Stochastic Switching of Cell Fate in Microbes. Annu Rev Microbiol. 69, 381-403 (2015).
- Gardner, T. S., di Bernardo, D., Lorenz, D., Collins, J. J. Inferring genetic networks and identifying compound mode of action via expression profiling. Science. 301 (5629), 102-105 (2003).
- Samuelson, A. V., Carr, C. E., Ruvkun, G. Gene activities that mediate increased life span of C. elegans insulin-like signaling mutants. Genes Dev. 21 (22), 2976-2994 (2007).
- Edwards, C. B., Copes, N., Brito, A. G., Canfield, J., Bradshaw, P. C. Malate and Fumarate Extend Lifespan in Caenorhabditis elegans. PLoS ONE. 8 (3), 58345 (2013).
- Riddle, D. L., Blumenthal, T., Meyer, B. J., Priess, J. R. C. elegans II. Riddle, D. L., Blumenthal, T., Meyer, B. J., Priess, J. R. , (1997).
- Churgin, M. A., et al. Longitudinal imaging of Caenorhabditis elegans in a microfabricated device reveals variation in behavioral decline during aging. eLife. 6, 26652 (2017).
- Scholz, M., Lynch, D. J., Lee, K. S., Levine, E., Biron, D. A scalable method for automatically measuring pharyngeal pumping in C. elegans. J Neurosci Methods. 274, 172-178 (2016).
- Scholz, M., Dinner, A. R., Levine, E., Biron, D. Stochastic feeding dynamics arise from the need for information and energy. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (35), 9261-9266 (2017).
