Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Microfluidic платформа для продольной Imaging в Caenorhabditis elegans

Published: May 2, 2018 doi: 10.3791/57348
Automatic Translation
1,2, 2,3
1Department of Physics Education, Kongju National University, 2Department of Physics, Harvard University, 3FAS Center for Systems Biology, Harvard University

Summary

В этой статье мы демонстрируем живых изображений отдельных червей, используя microfluidic пользовательского устройства. В устройстве несколько червей, индивидуально ограничиваются отдельные камеры, позволяя мультиплексированных продольной наблюдения различных биологических процессов.

Abstract

В течение последнего десятилетия microfluidic методы были применены для изучения малых животных, в том числе нематоды Caenorhabditis elegansи доказали свою полезность как удобный живой платформа отображения информации, предоставляя возможности для точного управления экспериментальных условиях в режиме реального времени. В этой статье мы демонстрируем живых изображений отдельных червей, используя WormSpa, ранее опубликованных пользовательских microfluidic устройство. В устройстве несколько червей, индивидуально ограничиваются отдельные камеры, позволяя мультиплексированных продольной наблюдения различных биологических процессов. Чтобы проиллюстрировать возможности, мы провели доказательства принцип экспериментов в которых червей были инфицированы в устройстве с патогенных бактерий, и динамики экспрессии генов иммунной реакции и откладки непрерывно контролируются в отдельных животных. Простая конструкция и эксплуатация данного устройства делают его пригодным для пользователей без предыдущего опыта с на основе microfluidic экспериментов. Мы предлагаем, что такой подход будет полезным для многих исследователей, заинтересованных в продольных наблюдения биологических процессов при четко определенных условиях.

Introduction

Изменения в условиях окружающей среды может привести к активации генетических программ сопровождается индукции и подавление экспрессии определенных генов1,2. Эти кинетическая изменения могут быть переменной среди тканей, в том же животных и между различными животными. Исследования таких генетических программ поэтому призываем методов, которые позволяют продольной томографии отдельных животных и точный динамический контроль состояния окружающей среды.

В последние годы microfabricated оптимизированных устройств были использованы для изучения многих аспектов реакции и поведения в мелких животных, в том числе червей, мух, медведи воды и более3,4,5,6, 7. Приложения включают, например, глубоко фенотипирование, optogenetic запись активности нейронов в ответ на химические стимулы и отслеживание моторного поведения локомоции и насосных8,9,10 , 11.

Подходы, основанные на microfluidic провести множество свойств, которые могли бы пользу долгосрочных продольной томографии реакции на экологические сигналы, включая точный динамический контроль местных микроокружения, гибкий дизайн, который позволяет ведение отдельных животных в отдельных помещениях и благоприятные атрибуты для изображений. Однако поддержание животных в камере microfluidic долгое время с минимальное отрицательное воздействие на их хорошо существ является проблемой, которая требует определенного ухода в дизайн microfluidic устройства, а также в выполнении эксперимента.

Здесь мы продемонстрировать использование WormSpa, microfluidic устройством для продольной томографии Caenorhabditis elegans. 5 индивидуальных червей ограничены в камерах. Постоянный низкий поток жидкости и бактериальных подвеска гарантирует, что черви являются хорошо кормят и достаточно активным, чтобы поддерживать хорошее здоровье и облегчить стресс, и структура камер позволяет червей откладывают яйца. Простота конструкции и эксплуатации WormSpa должны позволить исследователи с нет предыдущего опыта работы в микрофлюидика включения этого устройства в свои собственные исследовательские планы.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Ниже протокол использует WormSpa5, ранее описанные microfluidic устройством для продольной томографии червей. Изготовление WormSpa (начиная с CAD-файлов, которые могут быть получены от авторов по запросу) проста, но требует некоторых знаний. В большинстве случаев изготовление легко может быть сделано путем основной объект или коммерческая компания, которая предоставляет такие услуги. При изготовлении устройство, убедитесь указать, что высота функции — 50 мкм.

1. Экспериментальная установка

  1. Смонтируйте устройство microfluidic на Перевернутый флуоресценции микроскоп с моторизованного столика.
  2. Место орбитальный шейкер недалеко от Микроскоп, но убедитесь, что вибрации от шейкер непосредственно не затрагивают Микроскоп. Например положите шейкер на полке на стене, что делает никаких контактов с таблицей оптических.
  3. Место шприцевый насос на орбитальный шейкер. Лента насоса в шейкер, таким образом, чтобы он не трясти при встряхивании.

2. Подготовка Microfluidic окружающей среды

Примечание: Во время эксперимента, четыре шприцы подключены к устройству microfluidic через шприц-тюбиков, как указано на рисунке 1. Этот шаг описывается подготовка этих шприцы. Если не указано иное, держите как можно более коротким шприц-тюбиков без их тугой.

  1. Подготовки шприц розетки и трубку от шприца. Этот шприц (S1 на рис. 1) будет позже подключен к розетке устройства через трубку от шприца и используется для временного хранения жидкости выходит из устройства.
    1. Сделайте иглы адаптер, удалив пластиковые части кончика шприца 20 G x 1/2 дюйма, сохраняя только иглы (металлические части). Сделать это, удерживая пластиковых и металлических деталей с помощью плоскогубцев и потянув их друг от друга. Оставшиеся пластиковые остатка на иглу можно сгореть с помощью горелки Бунзена.
    2. Согните иглы по геометрии экспериментальной установки удерживая ее два концы плоскогубцами. В конструкции, описанные здесь изгиб иглы в его середине угол ~ 110° является наиболее удобным.
    3. Подключите адаптер иглы половину пути в трубу. Другая половина позднее быть подключен к устройству. Шприц трубка должна быть совместима с кончик шприца 20 G без утечки (например, трубопровод с внутренним диаметром 0.86 мм и наружным диаметром 1.32 мм). Рекомендуется трубки длиной ~ 50 см.
    4. Подключите шприц 10 мл luer-lock в другой (открытый) конец шприца трубки через кончик шприца 20 G x 1/2 дюйма.
  2. Подготовка буфера входе шприцы и шприц трубы. Один из этих шприцы (S2 на рис. 1) используется как резервуар для жидкости, которая идет в устройство и управлять потоком инъекции. Другие шприц (S3 на рис. 1) требуется для буфера обмена, как описано в шаге 3.2.
    1. Подключите шприц 10 мл luer-lock (S2) непосредственно к 3-ходового клапана а другой шприц (S3) к же клапан через трубку от шприца (рис. 1): Подключите S3 на трубу через кончик шприца, а трубка к клапану через другой наконечник шприца.
      Примечание: Порядок, в котором соединены эти материалы не имеет значения.
    2. Подключите трубку от шприца в оставшихся порт 3-ходового клапана. Подготовить еще один адаптер иглу как шаг 2.1.2 и вставьте иглу на полпути в другой (открытый) конец трубку от шприца.
    3. Установите клапан, таким образом, что трубку от шприца в шаге 2.2.2 и S2 связаны в то время как S3 закрыт (рис. 1).
  3. Подготовки шприц червь входе и трубку от шприца. Этот шприц (S4 на рис. 1) используется для загрузки червей в устройство.
    1. Соединить трубки длиной шприц шприц 10 мл luer-lock (S4). Определить длину этой трубки от объема жидкости, которая будет использоваться для загрузки; Например, 100 см трубка поддерживает более 2 мл жидкости (см. также, шаг 4.2).
    2. Подготовить еще один адаптер иглу как шаг 2.1.2 и подключите один половине к другой (открытый) конец шприца трубки иглы.
  4. Промойте все шприцы и труб с S-средний12 дважды. Заполните шприцы и трубы с S-средний, заботясь, чтобы удалить все пузырьки воздуха.
  5. Подключите отводной трубки шприц к розетке устройства.
    1. Подключите адаптер иглы в конце трубки шприц на выходе порт.
    2. Внедрить небольшой объем S-средний через выход заполнить устройство, пока немного S-средний приходит из входного буфера и входе червя.
  6. Подключите в буфер-шприц трубку к буфер впускное отверстие устройства, во время подключения червь вход с PIN-код (из нержавеющей стали штифт диаметром 1/32 дюйма).
  7. Inject постоянного потока буфера в устройство. Загрузить S2 буфера входе шприца насоса шприца13и установить насос, таким образом, что средний в S2 непрерывно вводят в устройство со скоростью потока 3 мкл/мин.

3. Загрузка бактерий в Microfluidic устройства

  1. Подготовка ОР50 Escherichia coli , приостановлено в S-средний12.
    1. После стандартного протокола прививать 250 мл флакон с 50 мл LB и единую колонию и Инкубируйте на ночь на 37 ° C.
    2. Центрифуга ночь культуры при 4000 об/мин в течение 10 минут и Ресуспензируйте гранулы в 30 мл S-средний.
    3. Через шприц фильтр 5 мкм фильтр подвеска. Измерить бактериальных концентратов, ее оптическая плотность 600 Нм (OD600) и регулировка концентрации ОД600 3. Это высокая плотность требуется держать червей хорошо кормят.
  2. Обмен буфера в устройство с ОР50 подвеской.
    1. Подготовки шприц чистый (S5), заполнены с ОР50 подвеской. Возьмите шприц вертикально и коснитесь его несколько раз, чтобы собрать все пузырьки воздуха в верхней.
    2. Поверните клапан 3-полосная буфера входе шприцев закрыть подключение к устройству и подключить два шприцы, S2 и S3. Освободите S2 от шприцевой насос.
    3. Отключите S2 от клапана и подключите S5 на клапан. Вытолкнуть весь воздух, собранных на верхней части S5 S3 через клапан до тех пор, пока немного ОР50 буфера переходит в S3. Поступая таким образом, убедитесь, что нет пузырьков воздуха остается в S5 или клапан.
    4. Включение 3-ходовой клапан обратно в исходное положение, чтобы закрыть соединение между S3 и S5 и подключить к устройству S5. Загрузите S5 шприцевой насос. Включите орбитальный шейкер, который держит насос. Установите пожимая скорость около 200 об/мин.
    5. Установите скорость потока быть 100 мкл/мин. Время, необходимое для нового буфера приехать червей в устройстве зависит от длины буфера-шприц трубку (около 5 минут с трубки, описанной выше). Выше скорость потока может использоваться, если требуется быстрее буфера обмена.
    6. Как только буфер ОР50 распространяется по всему устройство, установите скорость потока обратно в 3 мкл/мин.

4. Загрузка червей в Microfluidic устройства

  1. Подготовить небольшой низкий привязки microcentrifuge трубки (650 мкл) и заполнить его с 100 мкл суспензии ОР50. Перевод около 20-30 синхронизированы возраст молодых взрослых червей (46 часов после L1 личиночной арест при 25 ° C) из плиты агара NGM (нематоды роста среднего) на трубу, выбирая их по одному с червь выбрать. Возраст синхронизации может быть сделано после стандартного протокола12.
  2. Заполните червь входе шприц и шприц трубки (S4 на рис. 1) с ОР50 подвеской. Inject ~ 500 мкл жидкости в пробки microcentrifuge с червями. Нарисуйте подвеска с червями в шприц-трубку червя. Убедитесь, что трубка шприц достаточно долго (> 1 м) и Рисованные червей остаться в трубку от шприца и не сделать всю дорогу до шприца S4.
  3. Подсоедините S4 червь входу. Внедрить все черви в шприц-трубку червя в microfluidic устройство. Отключите S4 и трубку от шприца. Подключите червь вход с PIN-код.
  4. Разъединение буфера входе шприц S2 от механического насоса ( рис. 1) и вручную управлять S1 и S2, чтобы подтолкнуть все черви в отдельные каналы. Нажатие S2 будет двигаться червей в каналы, при нажатии S1 будет переместить их в обратном направлении. После загрузки канала, червь в каждом канале будет блокировать запись других червей.
  5. Пусть черви приспособиться к новой среде для 2-3 часа.

5. Настройка протокола изображений

  1. Найти все черви, которые надежно расположены в устройстве и набор изображений позицию для каждого из них в приобретение изображений программное обеспечение, которое контролирует ваш Микроскоп. Обратите внимание, что в некоторых случаях (например когда требуется увеличение, или при использовании камеры с ПЗС сенсор меньшего размера) для каждого канала требуются несколько изображений позиции.
    Примечание: Хотя это может быть сделано вручную, некоторые приобретение пакетов программного обеспечения можно загрузить текстовый файл, который содержит список позиций, где изображения должны быть приняты. Поскольку эти позиции отсортированы регулярно в WormSpa, пользователь может написать небольшой скрипт (например, Python или коммерческого программного обеспечения), который автоматически создает такой список. Точный формат этого сценария будет зависеть предусмотрено приобретение программного обеспечения (см. пример в дополнительный материал 1) формат файла.
  2. Установите необходимую частоту покадровой съемки. Например изображения генов иммунной реакции на инфекции осуществляется с частотой 10 минут каждого кадра. Убедитесь, что все необходимые каналы (например ярко поле и флуоресценции GFP) приобретаются в каждый момент времени.

6. принимающие ответ синегнойной инфекции

Примечание: Этот шаг специфичен для изучения взаимодействия хост патогена. Кроме того можно подготовить буфер, содержащий другие экологические сигналы интереса (биотических и абиотических факторов стресса, наркотики, сигнальные молекулы, и т.д.).

  1. Подготовка PA14 Pseudomonas aeruginosa , приостановлено в SK-средний14.
    1. 250 мл флакон с 50 мл LB и единую колонию прививок и Инкубируйте на ночь на 37 ° C.
    2. Прививок еще 250 мл флакон с 50 мл фунтов и Алиготе культуры и Инкубируйте на ночь на 37 ° C.
    3. Центрифуга ночь культуры при 4000 об/мин в течение 10 минут и Ресуспензируйте гранулы в 10 мл SK-средний. Измерить бактериальных концентратов и регулировка концентрации ОД600 = 4.
    4. Передать чистую колбу подвеска и инкубировать при 37 ° C в течение 24 часов и при 25 ° C для еще 24 часов при встряхивании. Этот шаг имитирует пластины инкубации шаг в стандарте убийство пробирного14.
    5. Через шприц фильтр 5 мкм фильтр подвеска. Это необходимо для предотвращения бактериального агрегатов от засорения устройство.
  2. Замените PA14 подвеска, следуя той же процедуре, как и в шаге 3.2 ОР50 подвеска в устройстве. Сохранять изображения на 10 часов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Возраст синхронизированы молодых взрослых червей (46 часов пост личиночной арест L1 при 25 ° C)12 были загружены в устройство, как описано в протоколе. Черви индивидуально были расположены в отдельных каналов, позволяя продольной измерение реакции животных на возбудителя. Когда успешный эксперимент, большинство червей остаются в их каналах в течение всего эксперимента. В этом случае просто, поместив их канал в визуализации пути, избегая необходимости активно найти животное принимаются изображения отдельных червей. Рисунок 2 Показывает, А светлые области изображения одного представителя червя в течение 10 часов в устройстве. Пока черви ограничены в пределах их каналов, они могут двигаться вверх и вниз по течению и могут свободно повернуть голову. Это очень важно, чтобы гарантировать, что само устройство не вызвать стресс или вреда животным.

Мы за ответ червей к бактериальной инфекции, P. aeruginosa, один из наиболее изученных патогенные нематоды Caenorhabditis elegans. Это также оппортунистических человека возбудителя, который вызывает инфекции в кистозный фиброз и пациентов с ослабленным иммунитетом. Питание червей с конкретных штаммов P. aeruginosa, такие, как клинических изолировать PA14, приводит к смертельным кишечной инфекции, и также факторы вирулентности, вовлеченных в этот процесс вовлечены в инфекции млекопитающих хостов. 14 , 15

Для изучения шаблон изменения в экспрессии генов при бактериальной инфекции, могут быть использованы люминесцентные репортеры. Среди многих генов, которые отображать динамический ответ на инфекции, мы контролируется transcriptional ответ irg-1 (инфекции ответ ген 1), визуализации GFP флуоресценции от трансгенных червей, выражая irg-1::GFP (AU0133 [agIs17 () Пано 1::GFP; pmyo-2::mCherry)], полученные от Ausubel лаборатории). IRG-1 , как известно, быть сильно индуцированных в кишечнике зараженных животных на ранней стадии инфекции P. aeruginosa PA14. 16 , 17 Рисунок 2 B показывает изображения промежуток времени представитель червя (то же самое животное, как показано на рисунке 2A). Каждое изображение флуоресценции было принято сразу после соответствующего светлые области изображения. В первый пост инфекции 5 часов, лишь слегка увеличивает GFP флуоресценции в середине тела и хвоста. Затем наблюдается существенное увеличение флуоресценции, начиная от середины тела. Общая флуоресценции в каждом червь строится в Рисунок 2C как функцию времени пост инфекции. Эти данные показывают не только ранее описанных индукции irg-1 при PA14 инфекции, но и червь червь изменчивости в сроках и масштабах индукции.

Дизайн устройства microfluidic WormSpa включает в себя фильтры, которые собирают яиц на каждый отдельным червя5. Когда яйца люк, личинки L1 отмываются через фильтр и в отводной трубки. Это позволило нам следить за вручную яйцекладка кинетика отдельных червей бактериальной инфекции. Изображения промежуток времени яиц же червь, как показано на рисунке 2 показаны на рисунке 3A. Эти изображения были взяты справа после соответствующего светлые области изображения в Рисунок 2A. Совокупное количество яиц каждый червь показано как функция времени пост инфекции в рисунке 3B, и среднее и стандартное отклонение над все население показаны на рис. 3C. Эти данные захватить изменчивости животных и животных, а также описано ранее снижение яйценоскости как инфекция прогрессирует. В отличие от неинфицированных животных, которые яйцекладка ставка не снижаться до тех пор, пока он пиков в ~ 54 ч пост L1 при 25 ° C5,18.

Figure 1
Рисунок 1: экспериментальная схема живых изображений червей в устройстве microfluidic. Черви загружаются в устройство через впускной червяи впоследствии помещаются в отдельные каналы. Бактериальные подвеска впрыскивается в устройство из входного буфера механический насос, установленный на орбитальный шейкер. Буфер выходит через выход порта устройства. Четыре шприцы (S1, S2/S5, S3 и S4) используются для управления устройством. Красные пунктирные линии, соединяющей шприцы и устройство шприц-тюбиков. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2: представитель ген выражение кинетики. Время перерыва образы представитель червя, принятые микроскопии флуоресцирования GFP Брайт поля (A) и (B) . Левого изображения были взяты непосредственно перед патогена была введена, тогда как правого изображения были взяты 10 часов после инфекции, PA14. Временной интервал между изображениями составляет 1 час. (C) время курс всего irg-1:: GFP флуоресценции в отдельных червей. Каждая строка соответствует одиночного животного. Строки были отсортированы в порядке убывания средней флуоресценции. Интенсивность флуоресценции цветом и цветовой шкале показано справа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3: представитель яйцекладка кинетики. (A) время перерыва изображения количество яиц же червь, показано на рисунке 2A и B. Левого изображения были взяты непосредственно перед патогена была введена, тогда как правого изображения были взяты 10 часов после инфекции, PA14. Временной интервал между изображениями составляет 1 час. (B) время курс совокупное количество яиц в отдельных червей. Каждая строка соответствует одиночного животного. Строки были отсортированы в убывающем порядке общего числа яиц на червя. Количество яиц, цветом и цветовой шкале показано справа. (C) среднее количество яиц заложил на червя как функцию от времени. Серая зона указывает одно стандартное отклонение ±. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Supplementary Material 1
Дополнительный материал 1: пример сценария, который создает текстовый файл, содержащий изображения позиции для всех каналов в WormSpa устройстве. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Microfluidic инструменты обеспечивают многочисленные преимущества в изучении червей. Изображений в PDMS устройство обеспечивает более высокое качество изображения по сравнению с стандартной плиты агар NGM. Несколько изображений могут быть взяты из одного червя, в отличие от традиционных методов, в которых животные взял от плиты и монтируется на микроскопа для изображений. Кроме того микроокружение, в котором проживают черви могут храниться постоянной или модулированные по желанию, позволяя точное сопоставление состава окружающей среды и ответ животных.

Здесь мы продемонстрировали, как для выполнения продольной измерения принимающей ответ бактериальной инфекции путем визуализации ответа несколько отдельных червей для оппортунистических патогенов P. aeruginosa PA14 с помощью пользовательских microfluidic устройства (WormSpa). Ярко поле и флуоресценции изображения были взяты в несколько раз без нарушается текущего эксперимента. В частности кинетика яйцекладки и экспрессии генов irg-1 были зондируемой каждые 10 минут, значительное увеличение временного разрешения более традиционные методы14,15.

В этом устройстве продольные размеры несколько червей могут выполняться путем пересмотра сохраненное местоположение каждого червя в любой момент времени. Это было продемонстрировано в рисунках 2C и 3B, где мы количественно irg-1:: GFP флуоресценции и яйца, установленных отдельными червей. Эти цифры показывают, что черви отображать широкий спектр кинетическая профилей. Как показано ранее на одноклеточного исследованиях19,20,21это индивидуальность может использоваться для понимания дизайн генетических цепей, а также взаимосвязь между различных путей19, 22.

Для успешных экспериментов имеет решающее значение для загрузки червей в устройство microfluidic быстро. В то время как черви обхода на поверхности агара, они, как правило, трэш в жидкой среде, и это поведение вызывает генетические программы, в котором участвуют23,24AMP активации протеинкиназы. Чтобы свести к минимуму этот нежелательных возмущений, важно поставить червей в их отдельных камер быстро, как микроструктур в камере и воздухопроницаемость PDMS обеспечивают червей с окружающей средой, которая имитирует твердой поверхности. 5 хотя выше давления помогает загрузке червей быстрее, слишком много давления устройство может побудить механических напряжений на червей. Черви, которые резко подчеркнули делать не корма или заложить яйца, приводит в фенотипе четко наблюдаемых мешки25. После загрузки, черви кормят E. coli ОР50 для 2-3 часа, позволяя червей, чтобы приспособиться к окружающей среде microfluidic и обеспечивая исследователь возможность наблюдать за животными и отбросить те, которые были повреждены.

Размер и расстояние микроструктур в каждой камере оптимизированы для червей, выросли на 46 часов от ареста L1 при 25 ° C. Структуры могут быть масштабируются для изучения старых червей или сокращены для изучения L4 личинки, которые меньше по размеру. Однако черви не способны успешно линьки в камере, исключающие изучения постэмбрионального развития в это устройство. Для таких приложений могут рассматриваться такие методы, как WorMotel26 . Так как черви ограничен, но не иммобилизованные в WormSpa, успешный эксперимент прочный зависит ли животные остаются в камере. Мы находим, что это может быть сложным для ранней стадии личинки, для взрослых мужчин и для некоторых Гермафродит мутантов.

Вместо использования одного буфера входного (в центре верхней, рис. 1), два отверстия вверх ногами шар образный могут использоваться одновременно. Заполнение двух шприцы с различные буферы, одно может генерировать височно структурированных сред, нажав на различных шприцы в разное время. Это, например, позволяет исследование адаптации к изменяющейся среде. 27 , 28

Как упоминалось выше, устройство microfluidic, описанные здесь может использоваться для широкого круга других приложений. К ним относятся, изучая ответы на другие экологические сигналы. Такие ответы могут включать в себя изменения в экспрессии генов и яйцекладка поведения, о чем свидетельствует здесь, но также изменения в метаболизм и жира накопления (например через жира, пятнать Красного Нил), нейронных физиология и сигнализации (например , кальция optogenetic и изображения возмущения), изменения в моторное поведение, например накачки, дефекации и руководитель движения (через автоматизированный количественных изображений покадровой последовательности) и многое другое.

Наконец, этот подход во многом автоматизирована и уменьшает труда, необходимые для длительного экспериментов в течение многих часов, даже дней. После расположения отдельных червей, сохраняются в программное обеспечение получения данных, эксперимент состоит из автоматической записи изображений, а механический насос контроллер поддерживает постоянный поток буфера в устройство. Главное, изготовление WormSpa устройство не требует любой протокол более чем стандартная мягкая литографии, и его дизайн и операции являются достаточно простыми даже для исследователей с нет предыдущего опыта работы в микрофлюидика. С различные преимущества, рассмотренных выше и относительно простой подготовительных шагов этот подход может быть полезно для тех, кто рассматривает продольной измерение живут черви точно контролируемых условиях.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgments

Это исследование было поддержано национального научного фонда через гранты PHY-1205494 и MCB-1413134 (EL) и Национальный исследовательский фонд Кореи Грант 2017R1D1A1B03035671 (KSL).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
WormSpa N/A N/A The CAD file for WormSpa is available from the Levine lab.
Compound Microscope Zeiss AxioObserver Z1 An inverted fluorescence microscope with a motorized stage
Syringe Pump New Era Pump Systems NE-501
Tubing SCI Scientific Commodities Inc. BB31695-PE/5 0.034” (0.86 mm) I.D. x 0.052” (1.32 mm) O.D
Syringe Tip CMLsupply 901-20-050 20 Gauge x 1/2” blunt tip stainless steel canula
Syringe Filter PALL 4650 Acrodisc 32 mm Syringe Filter with 5 um Supor Membrane
Syringe Qosina C3307 10 mL Male Luer Lock Syringe
3 Way Valve ColeParmer FF-30600-23 Large-bore 3-way, male-lock, stopcocks, 10/pack, Non-sterile
Dowel Pin McMaster-Carr 90145A317 18-8 Stainless Steel Dowel Pins (1/32" Dia. x 1/2" Lg.)
Low Binding Microcentrifuge Tube Corning CL S3206 0.65 mL low binding snap cap microcentrifuge tube

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lopez-Maury, L., Marguerat, S., Bahler, J. Tuning gene expression to changing environments: from rapid responses to evolutionary adaptation. Nat Rev Genet. 9 (8), 583-593 (2008).
  2. de Nadal, E., Ammerer, G., Posas, F. Controlling gene expression in response to stress. Nat Rev Genet. 12 (12), 833-845 (2011).
  3. Hulme, S. E., Shevkoplyas, S. S., Samuel, A. Microfluidics: Streamlining discovery in worm biology. Nat Methods. 5 (7), 589-590 (2008).
  4. San-Miguel, A., Lu, H. Microfluidics as a tool for C. elegans research. WormBook. , (2013).
  5. Kopito, R. B., Levine, E. Durable spatiotemporal surveillance of Caenorhabditis elegans response to environmental cues. Lab Chip. 14 (4), 764-770 (2014).
  6. Mishra, B., et al. Using microfluidics chips for live imaging and study of injury Responses in Drosophila larvae. J Vis Exp. (84), e50998 (2014).
  7. Grisi, M., et al. NMR spectroscopy of single sub-nL ova with inductive ultra-compact single-chip probes. Sci Rep. 7, 44670 (2017).
  8. Crane, M. M., Chung, K., Stirman, J., Lu, H. Microfluidics-enabled phenotyping, imaging, and screening of multicellular organisms. Lab Chip. 10 (12), 1509-1517 (2010).
  9. Leifer, A. M., Fang-Yen, C., Gershow, M., Alkema, M. J., Samuel, A. D. T. Optogenetic manipulation of neural activity in freely moving Caenorhabditis elegans. Nat Meth. 8 (2), 147-152 (2011).
  10. Lee, K. S., Lee, L. E., Levine, E. HandKAchip - Hands-free killing assay on a chip. Sci Rep. 6, 35862 (2016).
  11. Lee, K. S., et al. Serotonin-dependent kinetics of feeding bursts underlie a graded response to food availability in C. elegans. Nat Commun. 8, 14221 (2017).
  12. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , (2006).
  13. NE-1000 Series of Programmable Syringe Pumps. , New Era Pump Systems Inc. (2017).
  14. Tan, M. W., Mahajan-Miklos, S., Ausubel, F. M. Killing of Caenorhabditis elegans by Pseudomonas aeruginosa used to model mammalian bacterial pathogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (2), 715-720 (1999).
  15. Kim, D. H., et al. A conserved p38 MAP kinase pathway in Caenorhabditis elegans innate immunity. Science. 297 (5581), 623-626 (2002).
  16. Troemel, E. R., et al. p38 MAPK regulates expression of immune response genes and contributes to longevity in C. elegans. PLoS Genet. 2 (11), 183 (2006).
  17. Estes, K. A., Dunbar, T. L., Powell, J. R., Ausubel, F. M., Troemel, E. R. bZIP transcription factor zip-2 mediates an early response to Pseudomonas aeruginosa infection in Caenorhabditis elegans. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (5), 2153-2158 (2010).
  18. Byerly, L., Cassada, R. C., Russell, R. L. The life cycle of the nematode Caenorhabditis elegans: I. Wild-type growth and reproduction. Dev Biol. 51 (1), 23-33 (1976).
  19. Chalancon, G., et al. Interplay between gene expression noise and regulatory network architecture. Trends Genet. 28 (5), 221-232 (2012).
  20. Sanchez, A., Choubey, S., Kondev, J. Regulation of noise in gene expression. Annu Rev Biophys. 42, 469-491 (2013).
  21. Norman, T. M., Lord, N. D., Paulsson, J., Losick, R. Stochastic Switching of Cell Fate in Microbes. Annu Rev Microbiol. 69, 381-403 (2015).
  22. Gardner, T. S., di Bernardo, D., Lorenz, D., Collins, J. J. Inferring genetic networks and identifying compound mode of action via expression profiling. Science. 301 (5629), 102-105 (2003).
  23. Samuelson, A. V., Carr, C. E., Ruvkun, G. Gene activities that mediate increased life span of C. elegans insulin-like signaling mutants. Genes Dev. 21 (22), 2976-2994 (2007).
  24. Edwards, C. B., Copes, N., Brito, A. G., Canfield, J., Bradshaw, P. C. Malate and Fumarate Extend Lifespan in Caenorhabditis elegans. PLoS ONE. 8 (3), 58345 (2013).
  25. Riddle, D. L., Blumenthal, T., Meyer, B. J., Priess, J. R. C. elegans II. Riddle, D. L., Blumenthal, T., Meyer, B. J., Priess, J. R. , (1997).
  26. Churgin, M. A., et al. Longitudinal imaging of Caenorhabditis elegans in a microfabricated device reveals variation in behavioral decline during aging. eLife. 6, 26652 (2017).
  27. Scholz, M., Lynch, D. J., Lee, K. S., Levine, E., Biron, D. A scalable method for automatically measuring pharyngeal pumping in C. elegans. J Neurosci Methods. 274, 172-178 (2016).
  28. Scholz, M., Dinner, A. R., Levine, E., Biron, D. Stochastic feeding dynamics arise from the need for information and energy. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (35), 9261-9266 (2017).

Tags

Биоинженерия выпуск 135 C. elegans микрофлюидика продольные измерения экологического контроля иммунный ответ яиц
Microfluidic платформа для продольной Imaging в <em>Caenorhabditis elegans</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lee, K. S., Levine, E. A… More

Lee, K. S., Levine, E. A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (135), e57348, doi:10.3791/57348 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter