Summary
Vi presenterer en mus tibial distraksjon osteogenesis modell utviklet ved hjelp av en skreddersydd distractor. Bruk av en mus som en analyse mål er fordelaktig for fremme forskning.
Abstract
Distraksjon osteogenesis (DO) er en kirurgisk prosedyre som innebærer skjelettlidelser vev gjenfødelse uten cellen transplantasjon. Modell består av følgende tre faser: ventetid fasen etter osteotomi og plasseringen av den eksterne distractor; distraksjon-fase der atskilt bein endene er gradvis og kontinuerlig distrahert; og konsolideringsfasen. Denne skreddersydde distractor brukes for gjøre består av to ufullstendig akryl harpiks ringer og en utvidelse skruen. Prosessen ble startet ved å lage en mold med silikon inntrykk materiale og deretter opprette den skreddersydd distractor. Dental harpiks ble helles i forskalingen laget av silikon inntrykk materiale, og det kunne danner for å opprette ufullstendig harpiks ringene kreves for skreddersydd distractor. Disse ringene ble løst med en utvidelse skruen med gjennomsiktig harpiks. Den skreddersydde distractor opprettet via denne tilnærmingen var festet til tibia mus. Tibia ble løst til enheten med ett par 25 G nåler proximally, ett par 27 G nåler distally, og akryl harpiks. Etter en ventetid periode på 5 dager initiert distraksjon frekvensen av 0.2 mm/12 h. Forlengelsen ble fortsatt for 8 dager, noe som resulterer i en total avstand på 3,2 mm. Mus ble ofret 4 uker etter distraksjon. Bein formasjon distraksjon gapet ble bekreftet med både røntgen og histology.
Introduction
Distraksjon osteogenesis (DO) er en etablert behandlingsmetode for en rekke skjelettlidelser lidelser, som lem lengde avvik, bein feil og lem misdannelser1. Denne unike behandling strategi er basert på "spenning-stress prinsippet" foreslått av Ilizarov. Metoden krever flere dager for ventetid, flere uker før aktiv distraksjon og flere måneder for konsolidering til modne benet er dannet2.
De lokale hypoxic forholdene på grunn av blokkering av blod flyte3,4 og mekanisk stimulering5,6 er spesielt viktig i helbredelsesprosessen do. Hypoksi-indusert angiogenese bærer oksygen, næringsstoffer, løselig faktorer og celler nødvendig for reparasjon av vev lokalt gjennom blodstrømmen. Mekanisk stimulering forlengelsen operasjonen fører biologiske reaksjoner som differensiering av mesenchymal stamceller, bein formasjon, forkalkninger og remodeling. Seriell gjøre behandling gjør det mulig for ikke bare vanskelig vev, men også myke vev, inkludert nerver, muskler, blodårer og hudvevet, uten stilk cellen transplantasjon. Derfor anses gjør modell å være en utmerket modell for å analysere fornyelse av ulike vev.
Kaniner og hundene er de mest brukte dyr i grunnleggende forskning for gjøre; Det er imidlertid noen analyseverktøy tilgjengelig for disse dyrene. Bruk av en mus gjør modell muliggjør en mer detaljert analyse. Det er spesielt egnet for eksperimenter med knockout mus. Men når du bruker en mus som en eksperimentell dyr, skal en utvidelse enhet opprettes. Her utviklet vi presenterer en mus tibial modell med en skreddersydd distractor opprettet ved hjelp av en tannlege laboratorium verktøyet og teknikk, som har blitt brukt i en tidligere studie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimentene ble utført i henhold til protokoller godkjent av Animal Care og bruk komiteen i institusjon våre. Sterilisere alle instrumenter før prosedyren.
1. utarbeidelse av en form for å lage skreddersydde Distractor
- Gjøre to ufullstendig ringer (ytre diameter 20 mm; indre diameter, 10 mm), som er en del av distractor, med ett papirark parafinvoks (145 mm x 74 mm) bruker en Evans voks carver.
- Gjør 4 av de samme. Bruk en voks slikkepott oppvarmet med en gass-brenner. Stable de fire gullringer til en tykkelse på 5 mm. gi rom for utvidelse skruen og nål, 8 x 2 mm og 5 x 2 mm henholdsvis med Evans voks carver (tall 1A, 1B).
- Embed voks mønstre i silikon inntrykk materialet og lage en mold for harpiks ringene (figur 1C).
- Etter herding silikon inntrykk materiale (ca 5 min ved romtemperatur), fjerne voks mønstre.
2. produksjon av skreddersydde Distractor
- Bruke vaselin tynt og jevnt på silikon mold. Bland 3 g av polymerisasjon dental harpiks og umiddelbart hell den i silikon mold. Angi for 5 min ved romtemperatur (RT).
- Fjerne polymerized harpiks ringen fra formen og poleres karbid og en tannlege micromotor fjerne burr (ca 1 min). To harpiks ringer kreves for hver skreddersydd distractor.
- Gjenta denne fremgangsmåten for å opprette det nødvendige antallet harpiks ringene (figur 1D).
- La et gap på ca 2 mm fikse harpiks ringene med verktøyet voks og sikre utsiden av ekspansjon skruen helt med gjennomsiktig harpiks. Angi harpiks i 5 min på RT. Når polymerisasjon er fullført, kan du fjerne ekspansjon skruen bryteren (figur 1E).
3. kirurgisk protokollen
- Bruk 8 uke gammel mannlig mus.
- Indusere anestesi med en intraperitoneal injeksjon medetomidine hydroklorid 0,3 mg/g, midazolam ved 4 mg/kg og butorphanol tartrate 5 mg/kg av kroppsvekt.
- Nøye barbere Desinfiser det kirurgiske området med 10% joden løsning og deretter administrere 0,5% lidokain hydroklorid på høyre nedre lem.
- Gjøre en langsgående huden snitt (ca 15 mm i lengde) til høyre nederst på bena med nei 15 skalpell. Rett ut separate underliggende musklene, ta vare ikke for å fjerne alle periosteum. Nærmer utenfra for å enkelt nå fibula. Klippe fibula med saks.
- Forstå ankelen med smale tynn sterilt tang, og bruk en steril nål 27 G for å lage hull i benet cirka 5 mm fra hælen. Nålen skal trenge gjennom huden, bein, og huden i den rekkefølgen. Når nålen trenger, klippe tips og rot med en nipper slik at nålen er ca 15 mm.
- Gjør et hull i samme måte, ca 2-3 mm proksimale. Hold rundt ankelen og passerer to 25 G pinner under kneet på samme måte. Etter nålene trenge, kuttet tips og røtter med en nipper (figur 1F).
- Plass den skreddersydd distractor slik at det er parallelt med filtypen retning. Fastsette nåler og enhet med nok polymerisasjon dental harpiks å fylle sporene av enheten. Venter polymerisasjon å fullføre (ca 5 min) (figur 1G).
- Pass på at du ikke skader omkringliggende vev. Klipp opp midt i diaphysis av tibia bruker en svært tynn klippe plate mens du bruker en saltvannsoppløsning (1-2 mL).
- Lukke såret med en 4-0 nylon Sutur.
- Gi subcutaneous injeksjoner av buprenorfin (0,1 mg/kg) for analgesi umiddelbart etter operasjonen. Fortsette buprenorfin hver 12 h gjennom postoperativ dag 7 og så nødvendig etterpå.
4. distraksjon protokollen
Merk: Det er ulike rapporter på ventetid periode og distraksjon rente, men her representant protokoller vises.
- Etter en ventetid periode på 5 dager, starte distraksjon frekvensen av 0.2 mm/12 h. Bruke PIN-koden knyttet til rask ekspansjon skruen forlengelsen. Bevege nålen i retning av den gule pilen knyttet til filtypen skruen (figur 1E).
- Anestesi er ikke nødvendig under filtype. Hold halen med lillefingeren og palm, og fikse forlengelsen enheten med pekefingeren og tommelen.
- Utføre forlengelsen (0.2 mm for 1/4 slå). Fortsette forlengelse for 8 dager, som vil resultere i en samlet avstand på 3,2 mm.
5. analyse
- Røntgen analyse: etter gjennomføringen av forlengelsen, evaluere bein gjenfødelse med beregnede tomografi under narkose ved hjelp av 2.0% isoflurane.
Merk: Hvis oppmerksomhet har blitt tatt med hensyn til plasseringen av filtypen enheten, er det mulig å vurdere den med enkel røntgenfotograferingen selv med enheten vedlagt. - Histologiske analyse: fjerne apparatet forsiktig for ikke å forårsake et brudd distraksjon område under prøvetaking. Fastsette prøven i 10% nøytral bufrede formalin 24 h ved romtemperatur. Avkalke Morses løsning (10% natrium citrat, 20% maursyre) natten på 4 ° C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tallene 1A og 1B presenterer parafinvoks ufullstendige ringer (ytre diameter, 20 mm indre diameter, 10 mm; tykkelse, 5 mm). To voks mønstre var innebygd i silikon inntrykk materiale, og en form for harpiks ringene (figur 1C) ble dannet. Polymerized resin ble umiddelbart strømmet inn i denne formen, og harpiks ringer ble innhentet (figur 1D). En skreddersydd distractor ble opprettet ved å kombinere to harpiks ringer og en utvidelse skruen (figur 1E). Figur 2 A presenterer typisk røntgenfotograferingen funn på 4 uker etter distraksjon i modellen. Nyopprettede bein ble observert på webområdet distraksjon. Figur 2B presenterer hematoxylin og eosin fargeresultatene. En nylig dannet bein bro ble observert og nydannede benet kan lett skilles fra innfødte benet. Det var ingen intraoperativ brudd eller postoperativ infeksjon i 5 musene som brukes i dette eksperimentet.
Figur 1 : Skreddersydd distractor. (A, B) Omtrentlig ringen er som følger: ytre diameter, 20 mm; Indre diameter, 10 mm; tykkelse, 5 mm. Mellomrom for ekspansjon skruen (hvitt pilhode) og p (svart pilspiss) er sikret. (C) voks mønster innebygd i silikon inntrykk materialet. (D) fullført harpiks ringer. (E) to harpiks ringer og utvidelse skruen er sikret med harpiks. (F) fire nåler settes inn i den proksimale og distale metaphysis av tibia. (G) distraksjon enheten plasseres i musen lem. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Radiologiske og histologiske funn. (A) Radiologically, nylig dannet bein er observert 4 uker etter distraksjon. (B) histologisk, gapet er fylt med nydannede bein (skala bar = 500 µm). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Når en stor dyr som en eksperimentell modell, en ferdige utvidelse enhet kan brukes, og det er lett å få god fiksering og vurdere forlengelsen operasjonen selv og hvor forlengelsen. Men når en mus brukes som en eksperimentell modell, er det nødvendig å utvikle noen eller alle av utstyret. Isefuku et al. og Tay et al. laget enheten og opprettet en mus modell7,8. Carvahjo et al. vedtatt en metode som involverer fiksering av ferdige utvidelse enhet (spore distractor: KLS Martin) med en ligatur wire9. Vi kan også lage en mus gjør modell eksisterende produkter for forlengelse enheter og utarbeide en fiksering metode. Denne tilnærmingen vil gjøre det enkelt å produsere forlengelsen enheten utføre utvidelse og vurdere hvor utvidelse. Videre forventes det at en tibial Segmentinformasjon feil modell kan opprettes ved hjelp av samme enhet. Dessuten lengden på feilen kan justeres i trinn på 0.2 mm, og dermed enheten anses å være allsidig.
I slikt eksperiment er det teknisk vanskelig å tråd nålen gjennom tibia. Spesielt diameteren på den distale del av tibia er liten, og noen opplæring er nødvendig for å passere to pinner. Hvis nok bein ikke er kjent, er det nødvendig å kontrollere om god fiksering hentes. For å få god fiksering, kan det være bedre å passere nålene i vinkel og med en gapet så stort som mulig mellom pinner7,8. I tillegg som frekvensen av healing og histology under healing vil endres i henhold til osteotomi, er det nødvendig å utføre prosedyren på en bestemt måte.
Størrelsen på det eksperimentelle dyr kan betraktes som en begrensende faktor for dette eksperimentet. Det er ingen problemer når musen er stor; men hvis det er for lite, kan kirurgi selv ikke være mulig. Tidligere vi brukte 4-uke-gamle mus og var i stand til å utføre eksperimenter uten noen problemer10. Med hensyn til evalueringsperioden, kan forlengelse enheter installeres uten problemer før 42 dager etter skjæring benet. Som ytterligere observasjoner ikke ble gjort, er ytterligere forskning imidlertid nødvendig i fremtiden. Forekomsten av komplikasjoner kan være et problem når fremme eksperimenter. Brudd under operasjonen kan oppstå i ca 1 av 30 mus. Tilsvarende kan postoperativ sår infeksjon oppstå i ca 1 av 30 mus.
I konklusjonen, presenterte vi en mus tibial gjøre modell utviklet ved hjelp av en skreddersydd distractor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne takke Ms. Makiko Kato for å gi oppmuntring til å fullføre denne studien. Vi takker også divisjon av forsøksdyr og medisinsk forskning Engineering, Nagoya University Graduate School of Medicine, for boliger av mus.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraffin wax | YAMAHACHI DENTAL MFG. CO. | - | For preparation a mold for resin rings |
| Labocone putty | GC Corporation | - | For preparation a mold for resin rings |
| Utility wax | GC Corporation | - | For preparation a mold for resin rings |
| Expansion screw | Ortho Dentaurum | 600-301-30 | Component of custom-made distractor |
| Unifast III | GC Corporation | - | Immediate polymerization resin Component of custom-made distractor |
| Ortho Crystal | NISSIN | - | Transparent resin Component of custom-made distractor |
| 25 G needle | TERUMO | NN-2516R | For custom-made distractor |
| 27 G needle | TERUMO | NN-2719S | For custom-made distractor |
| ICR mouse | Chubu Kagaku Shizai Corporation | - | Experimental animal |
| Somnopentyl | Kyoritsu Seiyaku | - | Pentobarbital sodium salt |
| Isoflurane | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 099-06571 | Isoflurane inhalation solution |
References
- Watson, J. T. Distraction osteogenesis. The Journal of the American Academy of Orthopaedic Surgeons. 14, 168-174 (2006).
- Ilizarov, G. A. The tension-stress effect on the genesis and growth of tissues: Part II. The influence of the rate and frequency of distraction. Clinical Orthopaedics and Related Research. 239, 263-285 (1989).
- Wan, C., et al. Activation of the hypoxia-inducible factor-1 alpha pathway accelerates bone regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (2), 686-691 (2008).
- Fujio, M., et al. Stromal cell-derived factor-1 enhances distraction osteogenesis-mediated skeletal tissue regeneration through the recruitment of endothelial precursors. Bone. 49 (4), 693-700 (2011).
- Tong, L., et al. Focal adhesion kinase expression during mandibular distraction osteogenesis: evidence for mechanotransduction. Plastic and reconstructive surgery. 111 (1), 211-222 (2003).
- Rhee, S. T., El-Bassiony, L., Buchman, S. R. Extracellular signal- related kinase and bone morphogenetic protein expression during distraction osteogenesis of the mandible: in vivo evidence of mechanotransduction mechanism for differentiation and osteogenesis by mesenchymal precursor cells. Plastic and reconstructive surgery. 117 (7), 2243-2249 (2006).
- Isefuku, S., Joyner, C. J., Simpson, A. H. A murine model of distraction osteogenesis. Bone. 27 (5), 661-665 (2000).
- Tay, B. K., Le, A. X., Gould, S. E., Helms, J. A. Histochemical and molecular analyses of distraction osteogenesis in a mouse model. Journal of Orthopaedic Research. 16 (5), 636-642 (1998).
- Carvalho, R. S., et al. The role of angiogenesis in a murine tibial model of distraction osteogenesis. Bone. 34 (5), 849-861 (2004).
- Osawa, Y., et al. Activated FGFR3 promotes bone formation via accelerating endochondral ossification in mouse model of distraction osteogenesis. Bone. 105, 42-49 (2017).
