Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Enkelt-trins rensning af makromolekylære komplekser ved hjælp af RNA knyttet til Biotin og et foto-cleavable Linker

Published: January 3, 2019 doi: 10.3791/58697
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Integrative Program for Biological and Genome Sciences, University of North Carolina at Chapel Hill, 2Department of Biochemistry and Biophysics, University of North Carolina at Chapel Hill

Summary

RNA/protein komplekser renset ved hjælp af botin-streptavidin strategi er elueret løsning på denaturering betingelser i en form, der er uegnet til yderligere rensning og funktionelle analyse. Her, beskriver vi en ændring af denne strategi, der udnytter en foto-cleavable linker i RNA og en blid UV-eluering skridt, fremstilling af indfødte og fuldt funktionel RNA/protein komplekser.

Abstract

I mange år, er usædvanlig stærk og hurtigt dannet samspillet mellem biotin og streptavidin med succes udnyttet til delvis rensning af biologisk vigtige RNA/protein komplekser. Men denne strategi lider af en væsentlig ulempe, der begrænser dens bredere udnyttelse: biotin/streptavidin interaktion kan brydes kun under denatureringen betingelser, der også forstyrre integriteten af de eluted komplekser, dermed udelukker deres efterfølgende funktionalanalyse og/eller yderligere rensning af andre metoder. Derudover er eluted prøverne ofte forurenet med de baggrund proteiner, som nonspecifically forbinder med streptavidin perler, komplicerer analysen af de oprensede komplekser af sølv farvning og massespektrometri. For at overvinde disse begrænsninger, udviklede vi en variant af biotin/streptavidin strategi, biotin er knyttet til en RNA-substratet via en foto-cleavable linker og komplekser immobiliseret på streptavidin perler er selektivt elueres til løsning i en Native form af langbølge UV, forlader baggrund proteiner på perlerne. Kortere RNA bindende underlag kan syntetiseres kemisk med biotin og den foto-cleavable linker kovalent knyttet til 5'-enden af RNA, mens længere RNA substrater kan være forsynet med de to grupper af en supplerende oligonukleotid. Disse to varianter af UV-eluering metode blev testet for rensning af U7 snRNP-afhængige behandling-komplekser, der kløver Histon pre-mRNAs på 3'-enden, og de begge vist sig at sammenligne positivt med andre tidligere udviklet rensning metoder. De UV-elueres prøver indeholdt let påviselige mængder af U7 snRNP, der var fri for store protein forureninger og egnet til direkte analyse af massespektrometri og funktionelle assays. Den beskrevne metode kan let tilpasses til rensning af andre RNA bindende komplekser og bruges sammen med enkelt - og dobbelt-strenget DNA bindingssteder til at rense DNA-specifikke proteiner og makromolekylære komplekser.

Introduction

I eukaryoter gennemgå RNA polymerase II-genereret mRNA prækursorer (pre-mRNAs) flere modning begivenheder i kernen før han bliver fuldt funktionel mRNA skabeloner til proteinsyntesen i cytoplasmaet. En af disse begivenheder er 3' enden behandling. For langt de fleste præ-mRNAs omfatter 3' enden behandlingen kavalergang koblet til polyadenylation. Denne to-trins reaktion katalyseret af et forholdsvis rigelig kompleks bestående af mere end 15 proteiner1. Animalske replikation-afhængige Histon pre-mRNAs behandles i 3'-slutningen af en anden mekanisme, hvor hovedrollen spilles af U7 snRNP, en lav overflod kompleks bestående af U7 snRNA ~ 60 nukleotider og flere proteiner2,3 . U7 snRNA basepar med en bestemt sekvens i Histon pre-mRNA og en af underenheder af U7 snRNP katalyserer spaltning reaktion, genererer modne Histon mRNA uden en poly(A) hale. 3' enden behandling af Histon pre-mRNA kræver også Stem-Loop bindende Protein (SLBP), som binder en bevaret stem-loop beliggende opstrøms af webstedet kavalergang og øger rekrutteringen af U7 snRNP til substratet2,3. Undersøgelser med henblik på at identificere individuelle komponenter af U7-snRNP har været udfordrende på grund af den lave koncentration af U7 snRNP i animalske celler og tendens af komplekset adskille eller gennemgå delvis proteolyse under rensningen brugt milde rengøringsmidler4,5,6, høje salt vasker og/eller flere kromatografiske trin7,8,9.

For nylig, til at bestemme sammensætningen af U7-afhængige behandling maskiner, en kort fragment af Histon pre-mRNA indeholdende biotin på enten 3' eller 5' blev udruget med en nuklear ekstrakt og de forsamlede komplekser blev fanget på streptavidin-belagt Agarosen perler5,6,10. På grund af usædvanlig stærk samspillet mellem biotin og streptavidin, blev proteiner immobiliseret på streptavidin perler elueret under denatureringen betingelser ved kogning i SDS og analyseret af sølv farvning og massespektrometri. Mens denne enkle strategi identificeret en række komponenter af U7 snRNP, givet det forholdsvis rå prøver, ofte kontamineret med et stort antal baggrund proteiner nonspecifically bundet til streptavidin perler, potentielt maskering nogle komponenter i forarbejdningsmaskiner og forhindre deres opdagelse på sølv farvede geler5,6,10. Vigtigst, udelukket denne tilgang også enhver funktionelle studier med isolerede materialet og dets yderligere rensning til homogenitet yderligere metoder.

En række ændringer blev foreslået over tid til at løse den næsten irreversible karakter af biotin/streptavidin interaktion med de fleste af dem er designet til at enten svækker interaktionen eller levere en kemisk cleavable spacer arm i den Biotin-indeholdende reagenser11,12. Ulempen ved alle disse ændringer var, at de betydeligt reducere effektiviteten af den metode og/eller ofte kræves ikke-fysiologiske tilstande under trinnet eluering, forringe enten integritet eller aktivitet af de rensede proteiner.

Her, vi beskriver en anderledes tilgang for at løse den iboende problem af biotin/streptavidin strategi ved hjælp af RNA substrater som biotin er kovalent knyttet til 5' ende via en foto-cleavable 1-(2-nitrophenylfosfat) ethanol gruppe, der er følsomme over for længe bølge UV13,14. Vi har testet denne metode til rensning af begrænsende U7-afhængige behandling maskiner fra Drosophila og pattedyr nukleare ekstrakter15. Efter en kort inkubation af Histon pre-mRNA indeholdende biotin og den foto-cleavable linker med en nuklear ekstrakt, samlet behandling komplekser er immobiliseret på streptavidin perler, grundigt vasket og forsigtigt frigivet til løsning i en indfødt form af udsættelse for ~ 360 nm UV lys. UV-eluering metode er meget effektiv, hurtig og enkel, giver tilstrækkelige mængder af U7 snRNP at visualisere dets komponenter af splint farvning fra så lidt som 100 µL af ekstrakt15. UV-elueres materialet er gratis baggrund proteiner og egnet til direkte massespektrometri analyse, yderligere rensning trin og enzymatiske assays. Samme metode kan vedtages til rensning af andre RNA/protein komplekser, der kræver relativt korte RNA bindingssteder. Biotin og den foto-cleavable linker kan også være kovalent knyttet til enkelt - og dobbelt-strenget DNA, potentielt udvide UV-eluering metode til rensning af forskellige DNA/protein komplekser.

Kemisk syntese af RNA substrater indeholdende kovalent knyttet biotin og den foto-cleavable linker er praktiske kun med de sekvenser, der ikke overstiger ~ 65 nukleotider, bliver dyre og ineffektive for betydeligt længere sekvenser. For at løse dette problem, udviklet vi også en alternativ tilgang, der er egnet til meget længere RNA bindende mål. I denne tilgang, RNA af enhver længde og nucleotide sequence er genereret i vitro af T7 eller SP6 transskription og udglødet til en kort supplerende oligonukleotid der indeholder biotin og den foto-cleavable linker på 5'-enden (trans konfiguration). Den resulterende duplex efterfølgende bruges til at rense individuelle bindende proteiner eller makromolekylære komplekser på streptavidin perler efter samme protokol beskrevet for RNA substrater som indeholder foto-cleavable biotin knyttet kovalent (cis konfiguration). Med denne ændring, kan den foto-cleavable biotin bruges sammen med in vitro- genereret udskrifter som indeholder hundredvis af nukleotider, udvide UV-eluering metoden til rensning af en bred vifte af RNA/protein.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. underlaget forberedelse

Bemærk: RNA substrater kortere end ~ 65 nukleotider kan syntetiseres kemisk med biotin (B) og foto-cleavable (pc) linker (sammen kaldet foto-cleavable biotin eller pcB) kovalent knyttet til RNA 5' ende (cis konfiguration). RNA substrater indeholdende betydeligt længere bindingssteder skal være genereret i vitro af T7 (eller SP6) transskription og efterfølgende udglødet til en kort supplerende adapter oligonukleotid indeholdende pcB gruppe på 5'-enden (trans konfiguration) (figur 1).

  1. For bindingssteder bestående af færre end ~ 65 nukleotider, bruge en kommerciel producent (Table of Materials) til kemisk syntetisere RNA af interesse med pcB kovalent knyttet til RNA 5' enden (figur 1A og figur 2A). Opløses i sterilt vand til at opnå ønskede koncentration og opbevares i små alikvoter ved-80 ° C.
  2. Bindingssteder betydeligt genereret længere end ~ 65 nukleotider, form en delvis duplex af en in vitro- RNA interesse og en supplerende adapter oligonukleotid indeholdende pcB gruppe på 5'-enden (figur 3A).
    1. Udføre T7 transskription på enten en lineariseret plasmid DNA eller en passende PCR-skabelon til at generere RNA med bindingssted interesse udvides på 3'-enden af en vilkårlig ~ 20-nucleotidsekvensen.
    2. Brug en kommerciel producent (Table of Materials) til kemisk syntetisere en adapter oligonukleotid, der supplerer 3' forlængelsen i den T7-genereret RNA og indeholder pcB på 5'-enden (figur 3A).
      Bemærk: To 18-atom spacere og 2-3 ikke-supplerende nukleotider kan placeres i 5' slutningen af oligonukleotid at reducere potentielle sterisk hindring mellem bundne kompleks og streptavidin perler. Det er også ønskeligt, at oligonukleotid ensartet modificeret med en 2' O-methyl gruppe at øge styrken af duplex og yde modstand mod forskellige nukleaser.
    3. Anneal T7-genereret RNA til pcB adapter oligonukleotid.
      1. Mix 20 pmol af RNA og 100 pmol af adapter pcB oligonukleotid (1:5 molære forhold) i en 1,5 mL rør indeholdende 100 µL af binding buffer med følgende sammensætning: 75 mM KCl, 15 mM HEPES pH 7,9, 15% glycerol, 10 mM ethylendiamintetra syre (EDTA).
        Bemærk: Det er vigtigt at bruge en minimal mængde af adapter oligonukleotid, der er tilstrækkelig til at danne en duplex med de fleste (hvis ikke alle) pre-mRNA substrat anvendes i den udglødning reaktion. Dette kunne bekvemt bestemmes ved mærkning RNA-substratet i 5' slutningen med 32P, udglødning mærket bærematerialet med stigende mængder adapter oligonukleotid ved brug af forskellige buffer betingelser og overvåge opretholdelsen af den radioaktive signal på streptavidin perler efter flere vask af perler med binding buffer.
      2. Glasset anbringes i kogende vand i 5 min.
      3. Så vandet kan køle ned til stuetemperatur.

2. komplekse forsamling

  1. Supplement 1 mL af en mus nukleare ekstrakt (eller en anden ekstrakt af valg) med 80 mM EDTA pH 8 til en slutkoncentration på 10 mM til at blokere uspecifik metal-afhængige nukleaser, der er til stede i ekstraktet.
    Bemærk: Dette vil resultere i justere buffer i uddrag til den samme sammensætning som i bindende buffer (Se trin 1.2.3.1). EDTA påvirker ikke in vitro- behandling af Histon pre-mRNAs men kan være skadeligt i rensning af proteiner eller proteinkomplekser, der samles i en magnesium-afhængige måde. I disse tilfælde, bør EDTA undgås.
  2. Tilføj 5-10 pmol af RNA-substratet markeret med pcB gruppe i SNG (Se trin 1.1) eller trans (Se trin 1.2.3.3) til 1 mL af ekstraktet indeholdende 10 mM EDTA.
    Bemærk: Mængden af RNA skal evalueres omhyggeligt i en serie af retssag eksperimenter. Bruger for meget RNA-substratet til rensning af et begrænsende kompleks måske kontraproduktivt, markant stigende baggrund af uspecifik RNA-bindende proteiner uden at have nogen effekt på udbyttet af specifikke proteiner.
  3. Inkuber RNA-substratet med ekstrakt i 5 min på is, lejlighedsvis blanding prøven.
    Bemærk: Både tid og temperatur af inkubation skal være etableret empirisk og kan variere betydeligt, afhængig af den specifikke karakter af RNA/protein kompleks.
  4. Spin inkubation blandingen i en pre afkølede microcentrifuge i 10 min på 10.000 x g til at fjerne enhver potentiel bundfald og omhyggeligt indsamle supernatanten at undgå overførsel af toerstoffet.

3. immobilisering af RNA/protein komplekser på Streptavidin perler.

  1. Overføre ~ 100 µL af streptavidin Agarosen perle suspension fra en kommerciel leverandør (Table of Materials) til en 1,5 mL tube og øge volumen med binding buffer (75 mM KCl, 15 mM HEPES pH 7,9, 15% glycerol, 10 mM EDTA).
    Bemærk: Denne buffer bør have den samme sammensætning som i den udglødning blanding og ekstrakt bruges til komplekse Forsamling (trin 2.1).
  2. Indsamle perler i bunden af røret ved spinning for 2-3 min på 25 x g og Opsug supernatanten.
  3. Gentag den samme vask/spinning procedure 2 - 3 gange til Reagensglasset perler med binding buffer.
    Bemærk: I slutningen af dette skridt, pellet af perlerne bør have et volumen på ~ 30 µL.
  4. Indlæse supernatanten indeholdende samlet komplekset (trin 2.4) over afbalancerede streptavidin Agarosen perler.
  5. Rotere 1 h ved 4 ° C til at immobilisere RNA og de bundne komplekser på perlerne.
  6. Indsamle perler i bunden af røret ved spinning for 2-3 min på 25 x g.
    Bemærk: Brug et sving ud rotor for at undgå betydelige tab af perlerne, hvis de har tendens til at holde sig til siden af røret i kantede rotorer.
  7. Opsug supernatanten og skyl perler to gange med 1 mL af den bindende buffer, bruger de samme centrifugeringsbetingelserne.
  8. Der tilsættes 1 mL af binding buffer og rotere prøve 1 h ved 4 ° C.
    Bemærk: Dette trin kan forkortes, hvis komplekset dannet på bærematerialet tendens til at adskille.
  9. Spin ned perler i 2-3 min. på 25 x g, tilsættes 1 mL af bufferen og overføre suspension til et nyt rør.
  10. Rotere for en yderligere 1 h eller kortere, hvis komplekset ikke er stabil, spin ned for 2-3 min på 25 x g og overføre perlerne til et 500 µL rør i 200 µL af binding buffer.

4. UV-eluering.

  1. Drej på en høj intensitet UV-lampe afgiver 365 nm UV-lys for 5-10 min før de når fuld glans.
    Bemærk: Dette er afgørende for at opnå maksimal energi af UV emission fra starten af bestråling.
  2. Fylde op i bunden af en petriskål (100 mm x 15 mm) med tætpakkede is og stak det over fadets låg.
  3. Kort vortex rør indeholdende immobiliseret komplekset, placere det vandret på is og dække med den pre varmede lampe, at sikre, at prøven er beliggende inden for 2-3 cm af overfladen af pæren afstand.
    Bemærk: Hvis afstanden er for stor, bruge ekstra petriskåle eller andre egnede objekter for at bringe prøven tættere til pæren.
  4. Bestråle for i alt 30 min, ofte invertere og vortexing tube at sikre ensartet eksponering af udsættelse for UV- og for at forhindre overophedning.
    Bemærk: For at give ekstra køling, UV-eluering trin kan foretages i et koldt rum. Skifte til en petriskål med frisk is i tilfælde af overdreven isen smelter.
  5. Spin ned perler i 2-3 min. på 25 x g og indsamle supernatanten.
  6. Re-spin supernatanten ved hjælp af de samme betingelser og indsamle supernatanten.
    Bemærk: Lad en lille mængde af supernatanten i bunden for at undgå at overføre resterende perler.

5. analysen af sølvfarvning efterfulgt af massespektrometri.

  1. Brug SDS/polyacrylamid gelelektroforese at adskille en brøkdel af UV-elueres supernatanten og de samme brøkdel af materialet tilbage på perlerne efter UV eluering.
    Bemærk: Analysen kan også indeholde en alikvot af perler trukket tilbage fra prøven, før UV-eluering.
  2. Pletten gel indeholder adskilt proteiner ved hjælp af en kommercielt tilgængelig sølvfarvning kit.
  3. At evaluere effektiviteten af UV-eluering ved at sammenligne intensiteten af proteiner i UV-elueres supernatanten og dem tilbage på perlerne efter UV-bestråling.
  4. Punktafgifter protein bands af interesse og bestemme deres identitet ved massespektrometri bruger standardprotokoller10,15.

6. globale analyse af UV-elueres prøven ved massespektrometri.

  1. Direkte analysere en brøkdel af UV-elueres supernatanten ved massespektrometri til at bestemme det hele proteomet oprenset materiale på en saglig måde.
    Bemærk: Dette kan gøres ved-løsning behandling af renset prøverne med trypsin efterfulgt af standard massespektrometri protokoller til at fastslå identiteten på Generer peptider10,15.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Metoden UV-eluering blev testet med to kemisk syntetiseret RNA substrater kovalent fastgjort på 5' enden at pcB gruppe (cis konfiguration): pcB-SL (figur 1) og pcB-dH3/5 m RNA'er (figur 2). 31-nukleotid pcB-SL RNA indeholder en stem-loop-struktur, efterfulgt af en 5-nukleotid enkelt strandede hale og dens sekvens er identisk til 3'-enden af modne Histon mRNA (dvs., efter kløvningen af Histon pre-mRNA af U7 snRNP). Denne unikke sekvens er en kendt bindingssted for to proteiner til stede i pattedyr cytoplasmatisk fraktion: SLBP og 3' hExo16,17,18. pcB-dH3 / 5m er en 63-nukleotid fragment af Drosophila H3 Histon pre-mRNA og stem-loop indeholder en sekvens, der binder Drosophila U7 snRNP (figur 2).

dH3 Ext (125 nukleotider) er et eksempel på længere RNA substrater, der kan genereres af T7 transskription og forsynet med biotin og et foto-cleavable spacer i trans ved annealing at pcB/22mer, en kemisk syntetiseret adapter oligonukleotid ( Trans konfiguration). pcB/22mer indeholder de to grupper på 5'-enden og består af 22 2' O-methyl-modificerede nukleotider (figur 3A). 19 nukleotider i 3'-slutningen af pcB/22mer(underlined in the sequence in Figure 3A) er komplementær til de sidste 19 nukleotider af dH3 Ext pre-mRNA. Denne pre-mRNA ud over at være længere adskiller sig ikke væsentligt fra de syntetiske pcB-dH3 / 5m, der indeholder de samme to centrale behandling signaler: stem-loop og U7-bindingssted.

pcB-SL RNA blev inkuberet med 1 mL S100 ekstrakt udarbejdet af ultracentrifugering (100.000 x g i 1 h) i cytoplasmatisk brøken fremstillet af musen myelomatose celler19 og virkningen og effektiviteten af UV-eluering blev først analyseres af sølv farvning. En række proteiner der blev fundet streptavidin perler før UV-eluering (figur 1B, lane 1). Bestråling med langbølge UV udgivet kun nogle af disse proteiner til supernatanten (figur 1B, lane 3), forlader en uspecifik baggrund på perler (figur 1B, lane 2), derfor understreger vigtigheden af UV-eluering trin. Store UV-elueres proteiner blev identificeret ved massespektrometri som 3' hExo og SLBP, med SLBP at være repræsenteret af fuld længde protein (FL) og en række kortere nedbrydningsprodukter (DP). Mindre mængder af andre proteiner, identificeret som forskellige RNA-bindende proteiner (RBPs), blev også selektivt frigivet til løsning af UV-bestråling (figur 1B, lane 3).

pcB-dH3 / 5m pre-mRNA (figur 2) eller dH3 Ext pre-mRNA udglødet til pcB/22mer (figur 3) blev inkuberet med 1 mL af en nuklear ekstrakt fra Drosophila Kc celler til at danne forarbejdning komplekser20,21. For at bedre vurdere specificiteten af proteiner, der bindes til hver Histon pre-mRNA, en negativ kontrol blev udarbejdet sideløbende ved at tilføje to konkurrenter til den nukleare uddrag: SL RNA, der sequesters SLBP, og en kort antisense oligonukleotid, at basere par med U7 snRNA og forhindrer samspillet mellem U7 snRNP med sin hjemmeside på pre-mRNA.

Trinnet UV-eluering af de immobiliserede pcB-dH3 / 5m pre-mRNA resulterede i en selektiv frigivelse af kun et lille antal proteiner til supernatanten (figur 2B, lane 1), med en intens baggrund af ikke-specifikke proteiner resterende på perler (figur 2B , lane 3). Disse proteiner markeret med A-I, blev identificeret af massespektrometri som komponenter af U7 snRNP15. Stikprøven indeholdt også delvist nedbrudte SLBP, der trækker på 10 kDa og kan kun ses på højere koncentration SDS/polyacrylamid geler. Alle disse proteiner blev ikke fundet i nærværelse af de to forarbejdning konkurrenter, der blokerer for bindingen af U7 snRNP til Histon pre-mRNA (figur 2B, lane 2).

De samme komponenter i Drosophila U7 snRNP blev frigivet til løsning af UV-bestråling af et immobiliseret duplex bestående af dH3 Ext pre-mRNA og pcB/22mer (figur 3B, lane 1). Denne prøve indeholdt desuden flere RNA-bindende proteiner, der kommunikerede med pcB/22mer oligonukleotid anvendes i overskud til at danne en duplex med dH3 Ext pre-mRNA. I modsætning til underenheder af U7 snRNP, disse kontaminerende proteiner, samt alle de baggrund proteiner, der forblev på perler, fortsatte tilstedeværelse af forarbejdning konkurrenter (figur 3B, sammenligne baner 1 og 2, og banerne 3 og 4).

En lille brøkdel af UV-supernatanten indeholdende forarbejdning komplekser og den samme brøkdel af UV-supernatanten fra en negativ kontrol (forberedt i nærværelse af to konkurrent oligonukleotider og dermed mangler forarbejdning komplekser) kan være direkte analyseret af massespektrometri uden en forudgående separation af de eluted proteiner af gel elektroforese15. Denne metode er meget følsom til at opdage alle eluted proteiner uanset deres størrelse og tæthed og sammenholdt med den negative prøve giver en komplet og upartiske liste af proteiner, der specifikt knytter med Histon pre-mRNA at gennemføre 3' enden behandling reaktion.

Figure 1
Figur 1: rensning af musen cytoplasmatiske protein bundet til pcB-SL RNA. (A) A diagram af kemisk syntetiseret pcB-SL RNA (31-nukleotider). Biotin (Biot) i 5'-slutningen er efterfulgt af en foto-cleavable gruppe (pc), som er følsomme over for længe bølge UV (366 nm), to 18 atom spacere og 31 nukleotider, der udgør den bevarede stem-loop struktur findes i 3'-slutningen af modne Histon mRNAs. (B) pcB-SL RNA blev inkuberet med S100 cytoplasmatisk ekstrakt fra mus myelomatose celler. RNA og bundne proteiner var renset på streptavidin perler, grundigt vasket UV elueret og analyseret af sølvfarvning (lane 3). Proteiner immobiliseret på streptavidin perler før UV eluering og efterladt på perlerne efter UV eluering er vist i spor 1 og 2, henholdsvis. Placeringen af protein størrelse markører (i kDa) er angivet til venstre.

Figure 2
Figur 2: Rensning af Drosophila forarbejdning komplekser samlet på pcB-dH3/5 m pre-mRNA. (A) et diagram af kemisk syntetiseret Drosophila-specifikke pcB-dH3/5 m pre-mRNA (63-nukleotider). Biotin (Biot) i 5'-slutningen er efterfulgt af en foto-cleavable gruppe (pc), to 18-atom spacere og 63 nukleotider, der indeholder to sekvens elementer væsentlige forarbejdning: stem-loop struktur og U7-bindingssted. Fem nukleotider omkring store spaltning stedet ligger mellem de to elementer er modificeret med en 2' O-methyl gruppe for at blokere kløvningen af U7 snRNP under komplekse Forsamling (krydsede linjer). (B) pcB-dH3/5 m blev inkuberet med en Drosophila nukleare ekstrakt at samle behandlingen komplekser. I den negative kontrol indeholder den nukleare ekstrakt to forarbejdning konkurrenter til at blokere bindingen af SLBP og U7 snRNP til Histon pre-mRNA. De forsamlede komplekser blev immobiliseret på streptavidin perler, grundigt vasket og frigivet til løsning af eksponering af prøven til langbølge UV. De samme brøkdele af UV-elueres materiale (UV-sups) og perler efter UV-eluering (UV-perler) blev analyseret af sølv farvning. Placeringen af protein størrelse markører (i kDa) og streptavidin (SA) er angivet til højre.

Figure 3
Figur 3: Rensning af Drosophila forarbejdning komplekser samlet på dH3 Ext pre-mRNA knyttet til den foto-cleavable gruppe i trans. (A) A diagram af dH3 Ext duplex genereret ved annealing T7-genereret dH3 Ext pre-mRNA og kemisk syntetiseret pcB/22mer oligonukleotid med følgende sekvens: 5' Biot/pc/18S/18S/mAmGmUmAmGmCmUmUmAmCmAmCmUmCmGmAmGmCmCmUmAmC. I oligonukleotid, biotin (Biot) er placeret i 5' slutningen og efterfølges af foto-cleavable (pc) linker. De sidste 19 nukleotider (understreget i rækkefølge ovenfor) er komplementære til den 3' udvidelse tilføjet til dH3 Ext pre-mRNA. Tilstedeværelsen af 2' O-methyl ændringer (ikke angivet i figur) tjener to formål: den stabiliserer oligonukleotid mod ekstrakt nukleaser og øger styrken af duplex dannet med dH3 Ext pre-mRNA. (B) dH3 Ext duplex blev inkuberet med en Drosophila Kc nukleare uddrag i fravær eller tilstedeværelse af forarbejdning konkurrenter, immobiliseret på streptavidin perler, grundigt vasket og UV-elueres sammen med de bundne proteiner. De samme brøkdele af UV-elueres materiale (UV-sups, baner 1 og 2) og perler efter UV-eluering (UV-perler, baner 3 og 4) blev analyseret af sølv farvning. Specifikke componenst for forarbejdning komplekser, (dem, der elimineres ved behandling af konkurrenter) er angivet med A til F bogstaver. Store ikke-specifikke RNA-bindende proteiner (dem der er UV-elueres men vedvarer i nærværelse af de to forarbejdning konkurrenter) er angivet med stjerner. Placeringen af protein størrelse markører (i kDa) er angivet til højre. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Metoden beskrevet her er ligetil og udover indarbejde en foto-cleavable linker og UV-eluering trin adskiller sig ikke fra de almindeligt anvendte metoder, som drager fordel af de ekstremt stærke interaktion mellem biotin og streptavidin. UV-eluering trin er meget effektiv, typisk frigive mere end 75% af de immobiliserede RNA og proteiner fra streptavidin perler, efterlod en stor baggrund af proteiner, der ikke specifikt binder til perlerne er forbundet. Ved at fjerne denne baggrund, giver UV-eluering trin bemærkelsesværdigt rene prøver egnet til direkte analyse af sølv farvning, massespektrometri og funktionelle assays.

Der involverer en relativt få og enkle trin, UV-eluering metode er meget reproducerbar, giver tilstrækkelige mængder af U7 snRNP sølv farvning fra så lidt som 100 µL af mus og Drosophila nukleare ekstrakter15. Metoden er et attraktivt alternativ til andre eksperimentelle strategier tidligere har brugt til at rense RNA/protein komplekser, herunder tagging RNA substrater med en MS2 bindingssted og immobilisere tilhørende komplekser på amylose perler via en MS2-MBP fusion protein. MS2 strategi, mens vellykket i isolation forholdsvis rigelig spliceosomes og kanoniske 3' enden forarbejdning komplekser22,23, undladt at give tilstrækkelig mængder af forarbejdning komplekser indeholdende U7 snRNP (ZD, upubliceret resultater), som er ca 100 gange mindre koncentreret i animalske celler end den store U1 spliceosomal snRNP.

Mange aspekter af protokollen skal ændres til at opfylde forskellige individuelle forskningsmål og til at producere optimale resultater med andre RNA/protein komplekser. For det første er det vigtigt at matche størrelsen af RNA-substratet bruges til kompleks samling med den mængde af dette kompleks, der findes i uddrag. For at begrænse komplekser, herunder U7 snRNP, er bruger for meget substrat kontraproduktivt, kun stigende på baggrund af ikke-specifik RNA-bindende proteiner i UV-supernatanten. Anden, det er også vigtigt at optimere længden og temperatur til inkubation at fremme energisk forsamling af kompleks, forhindrer samtidig sin dissociation på grund af potentielle proteolyse eller overdreven RNA nedbrydning.

En nøgle difficultly i arbejder med U7-afhængige behandling komplekser og lignende RNA/protein komplekser, der bærer enzymaktiviteter er, at de efter at være fuldt samlet kan tage afstand som følge af katalyse. Spaltning af Histon pre-mRNAs opstår hurtigt selv ved lave temperaturer, hvilket reducerer udbyttet af renset forarbejdning komplekser. For at forhindre denne uønskede virkning, blev webstedet store spaltning og fire nærliggende nukleotider i pcB-dH3 / 5m pre-mRNA ændret under kemisk syntese med 2' O-methyl grupper (5m)10. Denne pre-mRNA er næsten fuldstændig resistent over for spaltning af U7 snRNP og kan sættes i varmeskab med en nuklear ekstrakt ved stuetemperatur i 60 min uden at forårsage påviselige komplekse forstyrrelser. T7-genereret dH3 Ext udglødet til pcB/22mer mangler disse ændringer og dens inkubering med en nuklear ekstrakt udføres på is i 5 min eller kortere at begrænse katalyse. pcB-SL RNA indeholder modne 3' enden af Histon mRNA og i cytoplasmatisk ekstrakter ikke undergår enhver tilsætning behandling. 3' hExo, som er magnesium-afhængige 3' - 5' exonuclease er i stand til at fjerne 2-3 nucleotider enkelt strandede hale i vivo24,25 men in vitro- dens aktivitet er hæmmet af tilstedeværelsen af EDTA16. Som et resultat, kan pcB-SL RNA være inkuberes i cytoplasmatisk ekstrakter ved stuetemperatur i længere tid uden nogen form for bivirkninger, selv om en kort inkubation på is er normalt tilstrækkelig til at danne en ternær kompleks af RNA med SLBP og 3' hExo.

Af de to alternative varianter af UV-eluering metode, ved hjælp af RNA substrater med biotin og den foto-cleavable linker i SNG (kovalent knyttet til 5'-enden af RNA) er samlet enklere og udbytter forholdsvis ren prøver. En vigtig begrænsning af denne tilgang er, at de to grupper kan være kovalent knyttet til RNA substrater ikke overstiger ~ 65 nukleotider. Længere RNA bindende mål kan være knyttet til pcB-gruppe i trans via en adapter oligonukleotid. Men denne tilgang kan producere højere baggrund af ikke-specifikke proteiner, der har tendens til at binde overskydende af adapter oligonukleotid. Det er derfor vigtigt at bruge kun en minimal kindtand overskud af oligonukleotid tilstrækkeligt til at binde alle de pre-mRNA substrat anvendes i forsøget.

Den rækkefølge, længde og kemisk karakter af adapter oligonukleotider kan varieres for at forbedre deres evne til at basere par med de komplementære sekvenser i RNA substrater, samtidig med at reducere deres evne til at interagere med uspecifikke RNA-bindende proteiner. Endelig, længere pre-mRNA substrater dupleks med adapter oligonukleotider kan være immobiliseret på streptavidin perler før bruges til kompleks dannelse. En fordel ved denne operatørvalg tilgang er, at det fjerner fra prøven RNA molekyler, der mislykkedes at anneal til oligonukleotid. Disse molekyler beholder en normal evne til at samle til et kompleks i uddrag, men er i stand til at binde streptavidin perler, delvist reducere udbyttet af rensning.

Ud over rensende komplekser samlet på enkeltstrenget RNA substrater, kan UV-eluering metode på en lignende måde bruges til at rense proteiner eller proteinkomplekser, der binder enkelt - og dobbelt-strenget DNA-sekvenser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at videregive

Acknowledgments

Vi takker vores kolleger og samarbejdspartnere for deres bidrag til vores arbejde. Denne undersøgelse blev støttet af NIH give GM 29832.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Streptavidin-Agarose Sigma S1638-5ML
High-intensity, long-wave UV lamp Cole-Parmer UX-97600-00
Replacement bulb Cole-Parmer UX-97600-19 100 Watts Mercury H44GS-100M bulb emitting 366 nm UV light (Sylvania)
RNAs and oligonucleotides containing biotin and photo-cleavable linker in cis Dharmacon (Lafayette, CO) or Integrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA) Requst a quote in Dharmacon
Beckman GH 3.8 swing bucket rotor Beckman
RiboMAX Large Scale RNA Production Systems (T7 polymerase) Promega P1300
RiboMAX Large Scale RNA Production Systems (SP6 polymerase) Promega P1280
Pierce Silver Stain Kit ThermoFisher Scientific 24612

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mandel, C. R., Bai, Y., Tong, L. Protein factors in pre-mRNA 3'-end processing. Cellular and Molecular Life Sciences. 65 (7-8), 1099-1122 (2008).
  2. Dominski, Z., Carpousis, A. J., Clouet-d'Orval, B. Emergence of the beta-CASP ribonucleases: highly conserved and ubiquitous metallo-enzymes involved in messenger RNA maturation and degradation. Biochimica et Biophysica Acta. 1829 (6-7), 532-551 (2013).
  3. Dominski, Z., Marzluff, W. F. Formation of the 3' end of histone mRNA: getting closer to the end. Gene. 396 (2), 373-390 (2007).
  4. Yang, X. C., Torres, M. P., Marzluff, W. F., Dominski, Z. Three Proteins of the U7-Specific Sm Ring Function as the Molecular Ruler To Determine the Site of 3 '-End Processing in Mammalian Histone Pre-mRNA. Molecular and Cellular Biology. 29 (15), 4045-4056 (2009).
  5. Sabath, I., et al. 3 '-End processing of histone pre-mRNAs in Drosophila: U7 snRNP is associated with FLASH and polyadenylation factors. RNA. 19 (12), 1726-1744 (2013).
  6. Skrajna, A., et al. U7 snRNP is recruited to histone pre-mRNA in a FLASH-dependent manner by two separate regions of the stem-loop binding protein. RNA. 23 (6), 938-951 (2017).
  7. Smith, H. O., et al. Two-step affinity purification of U7 small nuclear ribonucleoprotein particles using complementary biotinylated 2'- O-methyl oligoribonucleotides. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 88, 9784-9788 (1991).
  8. Pillai, R. S., et al. Unique Sm core structure of U7 snRNPs: assembly by a specialized SMN complex and the role of a new component, Lsm11, in histone RNA processing. Genes and Development. 17 (18), 2321-2333 (2003).
  9. Pillai, R. S., Will, C. L., Luhrmann, R., Schumperli, D., Muller, B. Purified U7 snRNPs lack the Sm proteins D1 and D2 but contain Lsm10, a new 14 kDa Sm D1-like protein. EMBO Journal. 20 (19), 5470-5479 (2001).
  10. Yang, X. C., et al. A Complex Containing the CPSF73 Endonuclease and Other Polyadenylation Factors Associates with U7 snRNP and Is Recruited to Histone Pre-mRNA for 3 '-End Processing. Molecular and Cellular Biology. 33 (1), 28-37 (2013).
  11. Shimkus, M., Levy, J., Herman, T. A chemically cleavable biotinylated nucleotide: usefulness in the recovery of protein-DNA complexes from avidin affinity columns. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (9), 2593-2597 (1985).
  12. Hirsch, J. D., et al. Easily reversible desthiobiotin binding to streptavidin, avidin, and other biotin-binding proteins: uses for protein labeling, detection, and isolation. Analytical Biochemistry. 308 (2), 343-357 (2002).
  13. Olejnik, J., Krzymanska-Olejnik, E., Rothschild, K. J. Photocleavable biotin phosphoramidite for 5'-end-labeling, affinity purification and phosphorylation of synthetic oligonucleotides. Nucleic Acids Research. 24 (2), 361-366 (1996).
  14. Olejnik, J., Krzymanska-Olejnik, E., Rothschild, K. J. Photocleavable affinity tags for isolation and detection of biomolecules. Methods in Enzymology. 291, 135-154 (1998).
  15. Skrajna, A., Yang, X. C., Dadlez, M., Marzluff, W. F., Dominski, Z. Protein composition of catalytically active U7-dependent processing complexes assembled on histone pre-mRNA containing biotin and a photo-cleavable linker. Nucleic Acids Research. 46 (9), 4752-4770 (2018).
  16. Dominski, Z., Yang, X. C., Kaygun, H., Dadlez, M., Marzluff, W. F. A 3 ' exonuclease that specifically interacts with the 3 ' end of histone mRNA. Molecular Cell. 12 (2), 295-305 (2003).
  17. Yang, X. C., Purdy, M., Marzluff, W. F., Dominski, Z. Characterization of 3'hExo, a 3' exonuclease specifically interacting with the 3' end of histone mRNA. Journal of Biological Chemistry. 281 (41), 30447-30454 (2006).
  18. Tan, D., Marzluff, W. F., Dominski, Z., Tong, L. Structure of histone mRNA stem-loop, human stem-loop binding protein, and 3'hExo ternary complex. Science. 339 (6117), 318-321 (2013).
  19. Mayeda, A., Krainer, A. R. Preparation of HeLa cell nuclear and cytosolic S100 extracts for in vitro splicing. Methods in Molecular Biology. 118, 309-314 (1999).
  20. Dominski, Z., et al. 3' end processing of Drosophila histone pre-mRNAs: Requirement for phosphorylated dSLBP and co-evolution of the histone pre-mRNA processing system. Molecular and Cellular Biology. 22, 6648-6660 (2002).
  21. Dominski, Z., Yan, X. C., Purdy, M., Marzluff, W. F. Differences and similarities between Drosophila and mammalian 3 ' end processing of histone pre-mRNAs. Rna-a Publication of the Rna Society. 11 (12), 1835-1847 (2005).
  22. Jurica, M. S., Licklider, L. J., Gygi, S. R., Grigorieff, N., Moore, M. J. Purification and characterization of native spliceosomes suitable for three-dimensional structural analysis. RNA. 8 (4), 426-439 (2002).
  23. Shi, Y., et al. Molecular architecture of the human pre-mRNA 3' processing complex. Molecular Cell. 33 (3), 365-376 (2009).
  24. Thomas, M. F., L'Etoile, N. D., Ansel, K. M. Eri1: a conserved enzyme at the crossroads of multiple RNA-processing pathways. Trends in Genetics. 30 (7), 298-307 (2014).
  25. Lackey, P. E., Welch, J. D., Marzluff, W. F. TUT7 catalyzes the uridylation of the 3' end for rapid degradation of histone mRNA. RNA. 22 (11), 1673-1688 (2016).

Tags

Biokemi spørgsmålet 143 affinitet rensning RNA/protein komplekser biotin streptavidin foto-cleavable linker UV-eluering U7 snRNP 3' ende behandling
Enkelt-trins rensning af makromolekylære komplekser ved hjælp af RNA knyttet til Biotin og et foto-cleavable Linker
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Skrajna, A., Yang, X. C., Dominski,… More

Skrajna, A., Yang, X. C., Dominski, Z. Single-step Purification of Macromolecular Complexes Using RNA Attached to Biotin and a Photo-cleavable Linker. J. Vis. Exp. (143), e58697, doi:10.3791/58697 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter