Summary
РНК/белковых комплексов, очищенная с помощью Ботин стрептавидина стратегии являются этого eluted решение под денатурируя условия в форме неподобающе для дальнейшей очистки и функционального анализа. Здесь мы описываем изменения этой стратегии, которая использует фото горные компоновщика в РНК и нежный УФ элюции шаг, уступая родной и полностью функциональный РНК/белковых комплексов.
Abstract
На протяжении многих лет исключительно сильное и быстро формируется взаимодействие между биотина и стрептавидина успешно использовались для частичная очистка биологически важных РНК/белковых комплексов. Однако, эта стратегия страдает от одной основной недостаток, который ограничивает его широкого использования: биотин/стрептавидина взаимодействие может быть нарушена только при денатурации условий, которые также нарушают целостность eluted комплексов, следовательно исключающие их последующие функционального анализа и/или дальнейшей очистки другими методами. Кроме того образцы eluted часто загрязнены фон белки, связывающие nonspecifically с бисером стрептавидина, осложняет анализ комплексов очищенный Серебряный пятнать и масс-спектрометрии. Чтобы преодолеть эти ограничения, мы разработали вариант биотина/стрептавидина стратегии, в котором биотина прилагается к РНК субстрата через фото горные компоновщика и комплексы, иммобилизованных на стрептавидина бусины выборочно этого eluted решение в родной форме длинней волны УФ, оставив белки фон на бисер. Короткие РНК привязки субстратов могут быть синтезированы химически с биотина и фото горные компоновщик ковалентно прилагается к 5' концу РНК, тогда как дольше субстратов РНК могут быть предоставлены с двумя группами взаимодополняющих олигонуклеотида. Эти два варианта метода УФ элюции были протестированы для очистки U7 snRNP зависимых обработки комплексов, которые прилепится гистона пре мРНК в конце 3', и они оба оказались выгодно для других ранее развитых методов очищения. Образцы этого eluted УФ содержатся легко обнаружить количество U7 snRNP, который был свободным от крупных белковых загрязнений и подходит для прямого анализа по масс-спектрометрии и функциональных анализов. Описан метод можно легко адаптированы для очистки других комплексов связывания РНК и используется в сочетании с одно - и двуцепочечной ДНК привязки сайтов для очистки ДНК специфических белков и макромолекулярных комплексов.
Introduction
В эукариот РНК-полимераза II генерируемые мРНК прекурсоров (пре мРНК) проходят несколько событий созревания в ядре прежде чем стать полностью функциональной мРНК шаблоны для синтеза белка в цитоплазме. Одно из этих событий является 3' конца обработки. Для подавляющего большинства из пре мРНК 3' конца обработка включает расщепления в сочетании с сплайсингу. Эта реакция двухэтапный катализируемой относительно обильные комплекс состоящий из более чем 15 белки1. В конце 3' животных зависит от репликации гистона пре мРНК обрабатываются другим механизмом, в которой ключевую роль играет U7 snRNP, низкие изобилии комплекс, состоящий из U7 мяРНК ~ 60 нуклеотидов и несколько белки2,3 . U7 мяРНК низкопробных пар с определенной последовательности гистона пре мРНК и одним из подразделений U7 snRNP катализирует реакцию расщепления, генерации Зрелые гистона мРНК без poly(A) хвост. 3' конца обработка гистона пре мРНК также требует стволовых-петля привязки белка (SLBP), которая связывает сохранение стволовых петля расположен выше по течению от расщепления сайта и повышает вербовки U7 snRNP субстрат2,3. Исследования, направленные на выявление отдельных компонентов U7 snRNP были сложной из-за низкой концентрации U7 snRNP в животных клетках и тенденция комплекса отмежеваться или проходят частичное протеолиза во время очистки в результате использования мягкий моющих средств4,5,6, высокая соли моет и/или несколько хроматографического шаги7,8,9.
Недавно чтобы определить состав механизма обработки зависящих от U7, короткий фрагмент гистона пре мРНК содержащие биотин на 3 или 5' был инкубировали с ядерной экстракта и собрал комплексы были захвачены на стрептавидина покрытием агарозы бусины5,6,10. Благодаря исключительно сильное взаимодействие между биотина и стрептавидина белки, иммобилизованных на стрептавидина бусины были этого eluted под денатурации условий путем кипячения в ПБ и проанализированы Серебряные пятная и масс-спектрометрии. Хотя этот простой подход был выявлен ряд компонентов U7 snRNP, она дала относительно сырой образцы, часто загрязненные большое количество белков фон nonspecifically обязан стрептавидина бусы, потенциально маскировать некоторые компоненты Оборудование обработки и предотвращения их обнаружения на серебро витражные гели5,6,10. Важно отметить, что этот подход также исключается какие-либо функциональные исследования с изолированной материала и его дальнейшей очистки до однородности дополнительные методы.
Был предложен ряд изменений с течением времени для решения практически необратимый характер взаимодействия биотина/стрептавидина, с большинством из них разрабатывается либо ослабить взаимодействия или предоставлять химически горные распорку руку в биотин содержащих реагентов11,12. Недостаток всех этих изменений был, что они значительно снижают эффективность метод или часто требуется-физиологические условия во время шага элюции, ставит под угрозу целостность или активность очищенных белков.
Здесь мы описываем другой подход для решения проблемы присущие биотина/стрептавидина стратегии с помощью РНК субстратах, в которых биотина ковалентно прилагается к 5' конца через фото горные 1-(2-нитрофенил) этилового остаток, который чувствителен к длиной волны УФ13,14. Мы протестировали этот подход для очистки ограничения механизма обработки U7 зависящих от дрозофилы и млекопитающих ядерной извлекает15. После короткого инкубационного гистона пре мРНК содержащие биотин и фото горные компоновщик с ядерной экстракт собранный обработки комплексы иммобилизованных на стрептавидина бусы, тщательно промывают и аккуратно выпустила решение в родной форма под воздействием ~ 360 Нм УФ света. УФ элюции метод очень эффективный, быстрый и простой, давая достаточное количество U7 snRNP, чтобы визуализировать его компоненты ленты, окрашивания как 100 мкл экстракт15. Материал этого eluted УФ бесплатно фон белков и подходит для анализа прямых масс-спектрометрии, дополнительной очистки шагов и ферментативные анализов. Тот же метод может быть принят для очистки других РНК/белковых комплексов, которые требуют относительно короткий сайтов связывания РНК. Биотин и фото горные Компоновщик может быть ковалентно присоединен к одно - и двуцепочечной ДНК, потенциально расширения УФ элюции метод для очистки различных комплексов ДНК/белок.
Химический синтез РНК субстраты, содержащие ковалентно придает биотина и фото горные компоновщик практических только с последовательностей, не превышающие ~ 65 нуклеотидов, становится дорогим и неэффективным для значительно более последовательностей. Для решения этой проблемы, мы также разработали альтернативный подход, который подходит для гораздо больше РНК цели привязки. В этом подходе РНК любой длины и нуклеотидной последовательности является созданный в пробирке , транскрипции T7 или SP6 и отжигом для нескольких взаимодополняющих олигонуклеотида, содержащий биотина и фото горные компоновщика в конце 5' (транс Конфигурация). Результирующая дуплекс впоследствии используется для очистки отдельных связывания белков или макромолекулярных комплексов на стрептавидина бусы после тот же протокол, описанные для РНК субстраты, содержащие фото горные биотин, придает ковалентно (СНГ конфигурации). С этой модификации фото горные биотина может использоваться в сочетании с в пробирке создан стенограммы, содержащих сотни нуклеотидов, расширяя УФ элюции метод для очистки из широкого диапазона РНК/белков.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка основания
Примечание: Короче, чем ~ 65 нуклеотидов РНК подложки может быть синтезирован химически с фото горные (pc) компоновщик (вместе именуемые как фото горные биотина или ПХД) ковалентно придает РНК 5' конца (СНГ конфигурация) и биотин (B). Субстраты РНК, содержащие значительно больше сайтов связывания должны быть созданный в пробирке , транскрипции T7 (или SP6) и впоследствии отожженная короткий дополнительный адаптер олигонуклеотида, содержащие ПХД группу на 5' конца (транс Конфигурация) (рис. 1).
- Для привязки сайтов, состоящий из менее ~ 65 нуклеотидов, используйте коммерческих изготовителем (Таблица материалов) химически синтезирует РНК интерес с ПХД ковалентно придает РНК 5' конца (рис. 1A и 2A рисунок). Растворяют в стерильной воде для достижения желаемой концентрации и хранить в небольших аликвоты-80 ° c.
- Для сайтов связывания значительно дольше, чем ~ 65 нуклеотидов, форма частичной дуплекс в пробирке создан РНК интерес и дополнительный адаптер олигонуклеотида, содержащие ПХД группу на 5' конца (рис. 3A).
- Выполняйте транскрипции T7 на линеаризованной плазмида ДНК или соответствующий шаблон ПЦР для создания РНК с привязки сайта интересов продлен в конце 3' ~ 20-нуклеотида произвольной последовательности.
- Использование коммерческих изготовителем (Таблица материалов) для химически синтеза олигонуклеотида адаптер, который дополняет 3' расширение в RNA T7-генерируется и содержит ПХД в конце 5' (Рисунок 3А).
Примечание: Две распорки 18-атом и 2-3 номера взаимодополняющие нуклеотидов может находиться в ' конец 5 олигонуклеотида для уменьшения потенциальных их пространственной помех между связанным комплекс и стрептавидина бусины. Желательно также, что олигонуклеотида равномерно изменяется с 2' O-метил группы для повышения прочности дуплекс и оказывать сопротивление против различных nucleases. - Отжиг генерируемые T7 РНК для pcB адаптер олигонуклеотида.
- Микс 20 пмоль РНК и 100 пмоль адаптер pcB олигонуклеотида (молярное соотношение 1:5) в 1,5 мл трубки содержащей 100 мкл буфера привязки в следующем составе: 75 мм KCl, 15 мм HEPES рН 7.9, 15% глицерина, 10 мм Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА).
Примечание: Важно использовать минимальное количество олигонуклеотида адаптер, что достаточно для формирования дуплекс с большинство (если не все) пре мРНК субстрата, при отжиге реакции. Это может быть удобно определяется маркировки РНК субстрата в конце 5' с 32P, отжиг помечены субстрат с увеличением количества олигонуклеотида адаптер с помощью различные буфера, условий и контроль за сохранение радиоактивные сигнал на стрептавидина бусы после нескольких стирок бусины с буфером привязки. - Поместите трубку в кипящую воду на 5 мин.
- Дайте воде остыть до комнатной температуры.
- Микс 20 пмоль РНК и 100 пмоль адаптер pcB олигонуклеотида (молярное соотношение 1:5) в 1,5 мл трубки содержащей 100 мкл буфера привязки в следующем составе: 75 мм KCl, 15 мм HEPES рН 7.9, 15% глицерина, 10 мм Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА).
2. комплекс Ассамблеи
- Дополнение 1 мл ядерной экстракт мыши (или другого экстракт выбора) с 80 мм ЭДТА pH 8 до конечной концентрации 10 мм, чтобы блокировать неспецифические nucleases металл зависимых, которые присутствуют в экстракте.
Примечание: Это приведет к корректировке буфера в экстракте в тот же состав, что в буфере привязки (см. шаг 1.2.3.1). ЭДТА не влияет на обработку в vitro гистона пре мРНК, но может быть вредным в очистки белков или белковых комплексов, которые собирают в зависимости от магния. В этих случаях следует избегать ЭДТА. - Добавить 5-10 пмоль субстрата РНК, отмеченных группу ПХД в странах СНГ (см. шаг 1.1) или транс (см. шаг 1.2.3.3) по 1 мл экстракт, содержащий 10 мм ЭДТА.
Примечание: Количество РНК должна тщательно оцениваться в серии Пробные эксперименты. Использование слишком много РНК субстрат для очистки ограничивающим комплекс может быть контрпродуктивным, значительно увеличивая на фоне неспецифического связывания белков РНК не имея никакого влияния на урожайность специфических белков. - Инкубируйте РНК субстрат с экстрактом за 5 минут на льду, иногда смешивая образца.
Примечание: Оба времени и температуры инкубации должны быть созданы эмпирически и может значительно отличаться, в зависимости от конкретного характера комплекса РНК/белков. - Спина в инкубации смесь в предварительно охлажденным microcentrifuge 10 мин на 10000 x g для удаления любых потенциальных осадков и тщательно собирать супернатанта избегая передачи гранулы.
3. Иммобилизация РНК/белковых комплексов на стрептавидина бусины.
- Передать 1,5 мл ~ 100 мкл стрептавидина агарозы бусины подвеска от коммерческого поставщика (Таблица материалов) и увеличить объем с буфером привязки (75 мм KCl, 15 мм HEPES рН 7.9, 15% глицерина, 10 мм ЭДТА).
Примечание: Этот буфер должен иметь тот же состав, что в смеси для отжига и экстракт используется для сложных Ассамблеи (шаг 2.1). - Собирать шарики в нижней части трубки, спиннинг для 2-3 мин на 25 x g и удалить супернатант.
- Повторите ту же процедуру Стиральная/спиннинг 2 - 3 раза чтобы сбалансировать бусины с буфером привязки.
Примечание: В конце этого шага, Пелле бисер должен иметь объем ~ 30 мкл. - Загрузите супернатанта, содержащий собранный комплекс (шаг 2.4) более уравновешенной стрептавидина агарозы бусины.
- Поворот 1 ч при 4 ° C для иммобилизации РНК и привязанных комплексов на бисер.
- Собирайте шарики в нижней части трубки, спиннинг для 2-3 мин на 25 x g.
Примечание: Используйте качели из ротора избежать существенные потери бисера, если они склонны придерживаться на стороне трубки в угловых роторов. - Аспирационная супернатант и промойте бусины дважды с 1 мл привязки буфера, используя те же условия центрифугирования.
- Добавьте 1 mL привязки буфера и вращать образец 1 ч при 4 ° C.
Примечание: Этот шаг может быть сокращен, если комплекс сформирован на подложке, как правило, разъединять. - Спин вниз Бусины для 2-3 мин на 25 x g, добавляют 1 мл буфера и передать новой трубки подвеска.
- Поворот для дополнительного 1 h или короче, если комплекс не является стабильным, уменьшается на 2-3 мин на 25 x g и передать трубку 500 мкл в 200 мкл буфера привязки бисер.
4. УФ элюции.
- Включите высокой интенсивности УФ-лампа излучает 365 Нм УФ свет для 5-10 мин до достижения полной яркости.
Примечание: Это необходимо для достижения максимальной энергии УФ излучения в начале облучения. - Заполните вверх в нижней части Петри (100 x 15 мм) с плотно упакованных льда и укладывают на блюдо крышкой.
- Кратко вихревых труб, содержащих иммобилизованные комплекс, место его горизонтально на льду и крышка с подогретым лампа, обеспечивая, что образец расположен на расстоянии 2-3 см поверхности колбы.
Примечание: Если расстояние является слишком большим, используйте дополнительные Петри или другие подходящие объекты довести образца ближе к колбе. - Облучение в общей сложности 30 мин, часто переворачивать и vortexing трубка для обеспечения единообразного облучения УФ подвески и предотвращения перегрева.
Примечание: Чтобы обеспечить дополнительное охлаждение, УФ элюции шаг может осуществляться в холодной комнате. Переключитесь на Петри блюдо со свежими льда в случае чрезмерного льда таяние. - Спин вниз Бусины для 2-3 мин на 25 x g и собирать супернатант.
- Повторно спина супернатанта, используя те же условия и собирать супернатант.
Примечание: Оставьте небольшое количество супернатант внизу, чтобы избежать переноса остаточного бусины.
5. Пример анализа Серебряные пятная следуют масс-спектрометрии.
- Электрофорез геля SDS/Полиакриламида использования отделить часть этого eluted УФ супернатант и же часть материала на бусы, после УФ элюции.
Примечание: Анализ может также включать Алиготе выведены из образца до УФ элюции бусины. - Пятно гель, содержащий разлученных белки, использование коммерчески доступных Серебряный пятнать комплект.
- Оцените эффективность УФ-элюции путем сравнения интенсивности белков, присутствующих в надосадке этого eluted УФ и тех, кто остался на бусы, после УФ облучения.
- Акцизный белка полосы интерес и определить их удостоверения по масс-спектрометрии с помощью стандартных протоколов10,15.
6. Глобальный анализ этого eluted УФ образца по масс-спектрометрии.
- Непосредственно анализировать часть этого eluted УФ супернатант масс-спектрометрии для определения всего протеома очищенный материал в непредвзято.
Примечание: Это может осуществляться-решение лечения образцов очищенной трипсином, следуют стандартные масс-спектрометрии протоколы для определения формирования пептиды10,15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
УФ элюции метод был протестирован с двумя химически синтезированных РНК субстратов ковалентно придает в конце 5' группу ПХД (СНГ конфигурация): pcB-SL (рис. 1) и ПХД dH3/5 м РНК (рис. 2). PcB-SL 31-нуклеотидов РНК содержит стволовые циклической структуры, следуют один мель хвост 5-нуклеотидов и ее последовательности идентичен 3' конца зрелых гистона мРНК (т.е., после расщепления гистона пре мРНК, U7 snRNP). Эта уникальная последовательность является известный привязки сайта для двух белков присутствующих в млекопитающих фракции цитоплазматических: SLBP и 3' hExo16,17,18. pcB-dH3 / 5m 63-нуклеотида фрагмент гистонов H3 Drosophila пре мРНК и помимо стебель петля содержит последовательность, которая связывает дрозофилы U7 snRNP (рис. 2).
dH3 Ext (125 нуклеотидов) является примером больше субстратов РНК, которые могут быть порожденных транскрипции T7 и отжига для ПХД/22mer, химически синтезированных адаптер олигонуклеотида ( , предоставило биотина и фото горные прокладку в транс Транс конфигурации). pcB/22mer содержит две группы в конце 5' и состоит из 22 2' O-метил доработанную нуклеотидов (рис. 3A). 19 нуклеотидов в конце 3' pcB 22mer(underlined in the sequence in Figure 3A) дополняют последних 19 нуклеотидов dH3 Ext пре мРНК. Это пре мРНК, помимо того, что более существенно не отличаются от синтетических pcB-dH3/5 м, содержащий то же два ключевых обработки сигналов: стебель петля и U7-привязки сайта.
pcB-SL РНК была инкубировали с 1 мл экстракт С100, подготовленный ultracentrifugation (100000 x g за 1 ч) цитоплазматической фракции, полученные из клеток миеломы мыши19 и эффект и эффективность УФ-элюции впервые были проанализированы Серебряный пятнать. Количество белков были обнаружены на стрептавидина бисер перед УФ элюции (рис. 1B, переулок 1). Излучения с длиной волны УФ выпустила лишь некоторые из этих белков в надосадке (рис. 1B, Лейн 3), оставляя фоне неспецифического на четках (рис. 1B, переулок 2), следовательно, подчеркивая важность УФ элюции шаг. Масс-спектрометрия 3' hExo и SLBP, с SLBP представлена полная длина белка (FL) и ряд короче продуктов разложения (DP) были определены основные белки этого eluted УФ. Небольшие количества других белков, определены как различные белки, связывающие РНК (ОДП), были также выборочно освобождены решение УФ облучения (рис. 1B, Лейн 3).
pcB-dH3 / 5m пре мРНК (рис. 2) или dH3 Ext пре мРНК отжигом для ПХД/22mer (рис. 3) инкубировали с 1 мл ядерной выписки из дрозофилы Kc клетки к форме обработки комплексов20,21. Чтобы лучше оценить специфичность белков, которые привязаны к каждому гистона пре мРНК, отрицательный контроль был подготовлен параллельно путем добавления двух конкурентов ядерной экстракт: SL РНК, которая поглощает SLBP и короткие антисмысловых олигонуклеотидов, что базовая пар с U7 мяРНК и предотвращает взаимодействие U7 snRNP с его сайтом на пре мРНК.
УФ элюции шаг иммобилизованных pcB-dH3 / 5m пре мРНК привели к выборочной выпуск только небольшое количество белков в надосадке (Рисунок 2B, переулок 1), с интенсивным фон неспецифических белков, оставшиеся на четках (Рисунок 2B , пер. 3). Эти белки, помечены А-я, в качестве компонентов U7 snRNP15были определены по масс-спектрометрии. Образец также содержит частично деградировавших SLBP, который переносит на 10 кДа и может быть только видимым на более высокой концентрации, которую SDS/полиакриламидные гели. Все эти белки не были обнаружены в присутствии двух обработки конкурентов, которые блокируют привязки U7 snRNP к гистона пре мРНК (Рисунок 2B, переулок д. 2).
Те же компоненты дрозофилы U7 snRNP были освобождены решение УФ облучения иммобилизованных дуплекс, состоящий из dH3 Ext пре мРНК и ПХД/22mer (рисунок 3B, переулок 1). В этом примере дополнительно содержится несколько РНК связывания белков, которые взаимодействовали с ПХД/22mer олигонуклеотида используемых в избытке сформировать дуплекс с dH3 Ext пре мРНК. В отличие от подразделений U7 snRNP, эти загрязняясь протеины, а так все фон белки, которые остались на бусы, сохраняется при наличии конкурентов обработки (рис. 3Б, сравнить дорожки 1 и 2 и майнах 3 и 4).
Небольшая часть УФ супернатант содержащие обработки комплексов и же часть УФ супернатант от отрицательного контроля (подготовлен в присутствии двух конкурента олигонуклеотиды и следовательно не хватает комплексов обработки) может быть непосредственно проанализированы масс-спектрометрия без предварительного разделения белков eluted путем электрофореза геля15. Этот метод очень чувствительные для обнаружения всех eluted белки, независимо от их размера и изобилия и в сочетании с отрицательным образец предоставляет полную и объективную список белков, которые конкретно связаны с гистонов пре мРНК проводить 3' конца обработки реакции.
Рисунок 1: Очистка цитоплазматических белков мыши привязан к ПХД SL РНК. (A) A схема химически синтезированных pcB-SL РНК (31-нуклеотидов). Биотин (Biot) в конце 5' следуют фото горные остаток (pc), чувствительных к длиной волны УФ (366 Нм), два 18 атом распорки и 31 нуклеотидов, которые формируют сохранение стволовых циклической структуры, нашли в конце мРНК зрелых гистона 3'. (B) pcB-SL РНК была инкубировали с С100 цитоплазматических выписку из клеток миеломы мыши. РНК и белков привязанных были очищенная на стрептавидина бусы, тщательно промывают, УФ этого eluted и проанализированы Серебряный пятнать (пер. 3). Белки иммобилизованных на стрептавидина бисер перед элюции УФ и оставил на бисер, после УФ элюции указаны в строках 1 и 2, соответственно. Слева указывается положение маркеры размера протеина (в кДа).
Рисунок 2: Очистка дрозофилы обработки комплексов собрал на pcB-dH3/5 m пре мРНК. (A) схема химически синтезированных дрозофилы-конкретных pcB-dH3/5 m пре мРНК (63-нуклеотидов). Биотин (Biot) в конце 5' следуют фото горные группу (pc), два 18-атом распорки и 63 нуклеотидов, которые содержат основные обработки две последовательности элементов: стебель циклической структуры и U7-привязки сайта. Пяти нуклеотидов вокруг основных расщепления сайт, расположенный между двумя элементами изменяются с 2' O-метильной группы блокировать расщепления по U7 snRNP во время сложных Ассамблеи (пересекли линии). (B) pcB-dH3/5 m был инкубировали с ядерной экстракта дрозофилы собрать комплексов обработки. В элементе негативных ядерных экстракт содержит две обработки конкурентов, чтобы блокировать привязки SLBP и U7 snRNP к гистона пре мРНК. Собрал комплексы были иммобилизованных на стрептавидина бусы, широко промывают и выпустила решение под воздействием образца длинней волны УФ. Же фракции материала этого eluted ультрафиолетового (УФ sups) и бусы, после УФ элюции (УФ бусы) были проанализированы Серебряный пятнать. Справа указывается положение маркеры размера протеина (в кДа) и стрептавидина (SA).
Рисунок 3: Очистка дрозофилы обработки комплексов собрались на dH3 Ext пре мРНК прилагается к группе Фото горные в транс. A (A) диаграмма dH3 Ext дуплекс, порожденных отжига T7-генерируется dH3 Ext пре мРНК и химически синтезированных ПХД/22mer олигонуклеотида с следующую последовательность: 5' Биот/pc/18/18/mAmGmUmAmGmCmUmUmAmCmAmCmUmCmGmAmGmCmCmUmAmC. В олигонуклеотида биотин (Biot) помещается в конце 5' и сопровождается компоновщика фото горные (pc). Последние 19 нуклеотидов (подчеркнул в последовательности выше) являются дополнением к 3' расширение, добавленное к dH3 Ext пре мРНК. Наличие 2' O-метил изменения (не показано на рисунке) служит двум целям: он стабилизирует олигонуклеотида против экстракт nucleases и увеличивает прочность дуплекс, с dH3 Ext пре мРНК. (B) dH3, которую Ext дуплекс был инкубировали с дрозофилы Kc ядерной экстракт в отсутствие или присутствии обработки конкурентов, иммобилизованных на стрептавидина бусы, широко промывают и УФ-этого eluted наряду с привязанного белков. Же фракции материала этого eluted ультрафиолетового (УФ sups, дорожки 1 и 2) и бусы, после УФ элюции (УФ бусы, майнах 3 и 4) были проанализированы Серебряный пятнать. Конкретные componenst комплексов обработки (те, которые устраняются путем обработки конкурентов) указаны с A до F письма. Основные белки привязки неспецифической РНК (те, которые этого eluted УФ, но сохраняются при наличии двух конкурентов обработки) обозначаются звездочками. Справа указывается положение маркеры размера протеина (в кДа). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Метод, описанный здесь является простой и помимо включения фото горные компоновщика и УФ элюции шаг не отличаются от используемых методов, которые принимают преимущество чрезвычайно сильное взаимодействие между биотина и стрептавидина. УФ элюции шаг является очень эффективным, обычно выпускает более чем 75% иммобилизованных РНК и связанных белков из бисера стрептавидина, оставив высокий фон белков, которые неспецифически связывают с бисером. Устраняя этот фон, УФ элюции шаг дает удивительно чистые образцы подходит для прямого анализа Серебряный пятнать, масс-спектрометрия и функциональных анализов.
В результате с участием сравнительно мало и простых шагов, метод УФ элюции весьма воспроизводима, обеспечивая достаточное количество U7 snRNP для Серебряный пятнать от как 100 мкл мыши и дрозофилы ядерной извлекает15. Этот метод является привлекательной альтернативой для других экспериментальных стратегий, ранее используемый для очистки РНК/белковых комплексов, включая пометки РНК субстратов с сайтом связывания MS2 и иммобилизирующие связанных комплексов на бусины амилоза через MS2-MBP фьюжн белка. MS2 стратегии, хотя успешный в изоляции относительно обильные spliceosomes и канонические 3' конца обработки комплексы22,23, не дают достаточного количества перерабатывающих комплексов, содержащие U7 snRNP (ZD, неопубликованные результаты), которая примерно в 100 раз меньше сконцентрированы в животных клеток, чем крупные U1 spliceosomal snRNP.
Многие аспекты протокола должны быть изменены для удовлетворения различных отдельных научно-исследовательских целей и производить оптимальные результаты с другими РНК/белковых комплексов. Во-первых важно соответствовать количество субстрата РНК, используются для сложных Ассамблеи с суммой этого комплекса, который существует в экстракте. Для ограничения комплексов, включая U7 snRNP, используя слишком много субстрата является контрпродуктивным, только увеличивая фон неспецифической RNA-связывая протеинов в УФ супернатант. Во-вторых важно также оптимизировать длину и температура инкубации содействовать энергичные Ассамблеи комплекса, в то же время предотвращая его диссоциации вследствие чрезмерной деградации РНК или потенциальных протеолиза.
Ключ трудно в работе с U7-зависимых обработки комплексы и аналогичных РНК/белковых комплексов, которые несут ферментативную деятельность является, что после полностью собирают они могут отделить результате катализа. Расщепление гистона пре-мРНК происходит быстро даже при низких температурах, значительно снижая урожайность очищенного обработки комплексов. Чтобы предотвратить этот нежелательный эффект, на сайте расщепления основных и четырех близлежащих нуклеотидов в pcB-dH3 / 5m пре мРНК были изменены во время химического синтеза с 2' O-метил-группы (5 м)10. Это пре мРНК почти полностью устойчивы к расщепления по U7 snRNP и может инкубировали с ядерной экстракта при комнатной температуре 60 мин не вызывая обнаружению сложные нарушения. T7-генерируется dH3, которую Ext отжигом для ПХД/22mer не хватает эти изменения и его инкубации с ядерной экстракт осуществляется на льду для 5 минут или меньше ограничивать катализа. pcB-SL РНК содержит Зрелые 3' концу гистона мРНК и цитоплазматических экстрактов не проходят какой-либо обработки сложения. 3' hExo, который является магний-зависимых от 3' - 5' при exonuclease способен удалять 2-3 нуклеотидов единого мель хвост в естественных условиях24,25 но в vitro который свою деятельность ингибируется наличием ЭДТА16. В результате pcB-SL РНК может инкубировали в цитоплазматических выдержки при комнатной температуре на длительное время без каких-либо побочных эффектов, хотя обычно короткий инкубационный на льду для тройных комплекс РНК с SLBP и 3' hExo достаточно.
Из двух альтернативных вариантов метода УФ элюции субстраты РНК с помощью биотина и фото горные компоновщика в СНГ (ковалентно прилагается к 5' концу РНК) в целом проще и дает относительно чистые образцы. Важное ограничение этого подхода является, что две группы можно ковалентно придается субстратов РНК, не превышающий ~ 65 нуклеотидов. Больше цели привязки РНК может быть присоединен к группу ПХД в транс через адаптер олигонуклеотида. Однако этот подход может производить выше фона неспецифических белков, которые склонны связывать избыток олигонуклеотида адаптер. Поэтому важно использовать только минимальный Молярная избыток олигонуклеотида, достаточно, чтобы связать все пре мРНК субстрата, используемые в эксперименте.
Последовательность, длину и химической природы олигонуклеотиды адаптер может быть изменено для повышения их способности строить пара с дополнительных последовательностей в РНК субстратов, при одновременном снижении их способность взаимодействовать с неспецифическими РНК связывания белков. Наконец больше пре мРНК субстратов дублированный с олигонуклеотиды адаптер может иммобилизованных на стрептавидина бусы до используется для формирования сложных. Одним из преимуществ этого подхода предварительного отбора является, что она устраняет из образца молекулы РНК, которые не обжигают олигонуклеотида. Эти молекулы сохраняют нормальное возможность собрать в комплекс в экстракте, но невозможно подшить стрептавидина бусы, частично снижение урожайности очистки.
Помимо очистки комплексы, собрал на одноцепочечной РНК субстратов, метод УФ элюции аналогичным образом может использоваться для очистки белков или белковых комплексов, которые связывают и двойной одноцепочечной ДНК последовательности.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать
Acknowledgments
Мы благодарим наших коллег и партнеров за их вклад в нашу работу. Это исследование было поддержано NIH Грант GM 29832.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Streptavidin-Agarose | Sigma | S1638-5ML | |
| High-intensity, long-wave UV lamp | Cole-Parmer | UX-97600-00 | |
| Replacement bulb | Cole-Parmer | UX-97600-19 | 100 Watts Mercury H44GS-100M bulb emitting 366 nm UV light (Sylvania) |
| RNAs and oligonucleotides containing biotin and photo-cleavable linker in cis | Dharmacon (Lafayette, CO) or Integrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA) | Requst a quote in Dharmacon | |
| Beckman GH 3.8 swing bucket rotor | Beckman | ||
| RiboMAX Large Scale RNA Production Systems (T7 polymerase) | Promega | P1300 | |
| RiboMAX Large Scale RNA Production Systems (SP6 polymerase) | Promega | P1280 | |
| Pierce Silver Stain Kit | ThermoFisher Scientific | 24612 |
References
- Mandel, C. R., Bai, Y., Tong, L.
- Dominski, Z., Carpousis, A. J., Clouet-d'Orval, B. Emergence of the beta-CASP ribonucleases: highly conserved and ubiquitous metallo-enzymes involved in messenger RNA maturation and degradation. Biochimica et Biophysica Acta. 1829 (6-7), 532-551 (2013).
- Dominski, Z., Marzluff, W. F. Formation of the 3' end of histone mRNA: getting closer to the end. Gene. 396 (2), 373-390 (2007).
- Yang, X. C., Torres, M. P., Marzluff, W. F., Dominski, Z. Three Proteins of the U7-Specific Sm Ring Function as the Molecular Ruler To Determine the Site of 3 '-End Processing in Mammalian Histone Pre-mRNA. Molecular and Cellular Biology. 29 (15), 4045-4056 (2009).
- Sabath, I., et al. 3 '-End processing of histone pre-mRNAs in Drosophila: U7 snRNP is associated with FLASH and polyadenylation factors. RNA. 19 (12), 1726-1744 (2013).
- Skrajna, A., et al. U7 snRNP is recruited to histone pre-mRNA in a FLASH-dependent manner by two separate regions of the stem-loop binding protein. RNA. 23 (6), 938-951 (2017).
- Smith, H. O., et al. Two-step affinity purification of U7 small nuclear ribonucleoprotein particles using complementary biotinylated 2'- O-methyl oligoribonucleotides. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 88, 9784-9788 (1991).
- Pillai, R. S., et al. Unique Sm core structure of U7 snRNPs: assembly by a specialized SMN complex and the role of a new component, Lsm11, in histone RNA processing. Genes and Development. 17 (18), 2321-2333 (2003).
- Pillai, R. S., Will, C. L., Luhrmann, R., Schumperli, D., Muller, B. Purified U7 snRNPs lack the Sm proteins D1 and D2 but contain Lsm10, a new 14 kDa Sm D1-like protein. EMBO Journal. 20 (19), 5470-5479 (2001).
- Yang, X. C., et al. A Complex Containing the CPSF73 Endonuclease and Other Polyadenylation Factors Associates with U7 snRNP and Is Recruited to Histone Pre-mRNA for 3 '-End Processing. Molecular and Cellular Biology. 33 (1), 28-37 (2013).
- Shimkus, M., Levy, J., Herman, T. A chemically cleavable biotinylated nucleotide: usefulness in the recovery of protein-DNA complexes from avidin affinity columns. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (9), 2593-2597 (1985).
- Hirsch, J. D., et al. Easily reversible desthiobiotin binding to streptavidin, avidin, and other biotin-binding proteins: uses for protein labeling, detection, and isolation. Analytical Biochemistry. 308 (2), 343-357 (2002).
- Olejnik, J., Krzymanska-Olejnik, E., Rothschild, K. J. Photocleavable biotin phosphoramidite for 5'-end-labeling, affinity purification and phosphorylation of synthetic oligonucleotides. Nucleic Acids Research. 24 (2), 361-366 (1996).
- Olejnik, J., Krzymanska-Olejnik, E., Rothschild, K. J. Photocleavable affinity tags for isolation and detection of biomolecules. Methods in Enzymology. 291, 135-154 (1998).
- Skrajna, A., Yang, X. C., Dadlez, M., Marzluff, W. F., Dominski, Z. Protein composition of catalytically active U7-dependent processing complexes assembled on histone pre-mRNA containing biotin and a photo-cleavable linker. Nucleic Acids Research. 46 (9), 4752-4770 (2018).
- Dominski, Z., Yang, X. C., Kaygun, H., Dadlez, M., Marzluff, W. F. A 3 ' exonuclease that specifically interacts with the 3 ' end of histone mRNA. Molecular Cell. 12 (2), 295-305 (2003).
- Yang, X. C., Purdy, M., Marzluff, W. F., Dominski, Z. Characterization of 3'hExo, a 3' exonuclease specifically interacting with the 3' end of histone mRNA. Journal of Biological Chemistry. 281 (41), 30447-30454 (2006).
- Tan, D., Marzluff, W. F., Dominski, Z., Tong, L. Structure of histone mRNA stem-loop, human stem-loop binding protein, and 3'hExo ternary complex. Science. 339 (6117), 318-321 (2013).
- Mayeda, A., Krainer, A. R. Preparation of HeLa cell nuclear and cytosolic S100 extracts for in vitro splicing. Methods in Molecular Biology. 118, 309-314 (1999).
- Dominski, Z., et al. 3' end processing of Drosophila histone pre-mRNAs: Requirement for phosphorylated dSLBP and co-evolution of the histone pre-mRNA processing system. Molecular and Cellular Biology. 22, 6648-6660 (2002).
- Dominski, Z., Yan, X. C., Purdy, M., Marzluff, W. F. Differences and similarities between Drosophila and mammalian 3 ' end processing of histone pre-mRNAs. Rna-a Publication of the Rna Society. 11 (12), 1835-1847 (2005).
- Jurica, M. S., Licklider, L. J., Gygi, S. R., Grigorieff, N., Moore, M. J. Purification and characterization of native spliceosomes suitable for three-dimensional structural analysis. RNA. 8 (4), 426-439 (2002).
- Shi, Y., et al. Molecular architecture of the human pre-mRNA 3' processing complex. Molecular Cell. 33 (3), 365-376 (2009).
- Thomas, M. F., L'Etoile, N. D., Ansel, K. M. Eri1: a conserved enzyme at the crossroads of multiple RNA-processing pathways. Trends in Genetics. 30 (7), 298-307 (2014).
- Lackey, P. E., Welch, J. D., Marzluff, W. F. TUT7 catalyzes the uridylation of the 3' end for rapid degradation of histone mRNA. RNA. 22 (11), 1673-1688 (2016).
