Summary
الجيش الملكي النيبالي/البروتين المجمعات تنقيته باستخدام استراتيجية ستريبتافيدين botin هي التيد للحل في ظل الظروف يشوه بشكل غير مناسب لمزيد من التنقية والتحليل الوظيفي. وهنا يصف لنا تعديل هذه الاستراتيجية التي تستخدم رابط صورة كليفابل في الجيش الملكي النيبالي، وخطوة شطف الأشعة فوق البنفسجية لطيف، تسفر عن مجمعات الجيش الملكي النيبالي/البروتين الأصلي وتعمل بكامل طاقتها.
Abstract
لسنوات عديدة، استخدمت بنجاح قوية على نحو استثنائي وشكلت سرعة تفاعل البيوتين وستريبتافيدين لتنقية جزئية هامة بيولوجيا الحمض النووي الريبي/البروتين المجمعات. إلا أن هذه الاستراتيجية تعاني من عيب رئيسي واحد يحد من استخدامها الأوسع: تفاعل البيوتين/ستريبتافيدين يمكن كسرها إلا بمعرفة الظروف التي تعطل أيضا سلامة مجمعات الوتيد، ومن ثم تحول دون بهم تحليل وظيفي اللاحقة و/أو تنقية كذلك بطرق أخرى. وباﻹضافة إلى ذلك، العينات التيد غالباً ملوثة بالبروتينات الأساسية التي تربط نونسبيسيفيكالي بالخرز streptavidin، تعقيد تحليل المجمعات المنقي تلطيخ الفضة والطيف الكتلي. للتغلب على هذه القيود، قمنا بتطوير البديل من البيوتين/ستريبتافيدين الاستراتيجية التي يتم إرفاق البيوتين الركيزة الحمض النووي الريبي عن طريق رابط صورة كليفابل ومجمعات معطلة على الخرز streptavidin هي التيد بشكل انتقائي للحل في النموذج الأصلي بموجة طويلة الأشعة فوق البنفسجية، تاركاً البروتينات الخلفية في الخرز. يمكن توليفها أقصر من ركائز ربط الحمض النووي الريبي كيميائيا مع البيوتين ورابط الصورة كليفابل تساهمي يعلق على نهاية 5 ' من الجيش الملكي النيبالي، بينما أطول الحمض النووي الريبي ركائز يمكن أن تقدمها مع الفريقين اليغنوكليوتيد تكميلية. تم اختبار هذه نوعين مختلفين من الأسلوب شطف الأشعة فوق البنفسجية لتنقية U7 سنرنب-تعتمد على تجهيز المجمعات أن تنشق هيستون قبل-مرناس في نهاية 3 ' وكلاهما أثبت إيجابية مقارنة بأخرى قبل وضع أساليب تنقية. عينات التيد الأشعة فوق البنفسجية الواردة مبالغ سنرنب U7 التي كانت خالية من الملوثات الرئيسية البروتين ومناسبة للتحليل المباشر من الطيف الكتلي والاختبارات الوظيفية سهولة الاكتشاف. يمكن تكييفها لتنقية مجمعات ربط الحمض النووي الريبي الأخرى الأسلوب الذي وصف بسهولة واستخدامها بالاقتران مع مواقع مفرد، ومزدوج تقطعت الحمض النووي ملزم لتنقية البروتينات الخاصة بالحمض النووي ومجمعات الجزيئات.
Introduction
في حقيقيات النوى، يخضع السلائف مرناً ولدت الثاني بوليميريز الحمض النووي الريبي (قبل-مرناس) عدة أحداث نضج في النواة قبل أن تصبح قوالب مرناً تعمل بكامل طاقتها تخليق البروتين في السيتوبلازم. واحد من هذه الأحداث نهاية تجهيز 3 '. للغالبية العظمى من قبل-مرناس، تتضمن 3 ' المعالجة نهاية الانقسام بالإضافة إلى بوليادينيليشن. هذا رد فعل خطوتين هو تحفزها وفيرة نسبيا معقدة تتألف من أكثر من 15 البروتينات1. معالجة ما قبل الحيوانية المعتمدة على النسخ المتماثل هيستون-مرناس في نهاية 3 ' بواسطة إليه مختلفة التي الدور الرئيسي الذي تؤديه سنرنب U7، وفرة منخفضة معقدة تتألف من سنرنا U7 ~ 60 النيوكليوتيدات والبروتينات متعددة2،3 . زوج قاعدي سنرنا U7 مع تسلسل معين في هيستون قبل-مرناً وواحدة من الوحدات فرعية سنرنب U7 يحفز رد فعل الانقسام، وتوليد هيستون الناضجة ذيل مرناً دون poly(A). هيستون-مرناً قبل نهاية تجهيز 3 ' يتطلب أيضا حلقة الجذعية ملزمة البروتين (سلبب)، الذي يربط حلقة جذعية مصانة يقع المنبع لموقع الانقسام ويعزز تجنيد سنرنب U7 إلى الركيزة2،3. الدراسات الرامية إلى تحديد المكونات الفردية سنرنب U7 كانت صعبة بسبب تركيز منخفض من سنرنب U7 في الخلايا الحيوانية، واتجاه المجمع ننأى أو الخضوع proteolysis الجزئي أثناء تنقية نتيجة استخدام المنظفات خفيفة4،،من56ويغسل الملح عالية و/أو متعددة الخطوات الكروماتوغرافي7،،من89.
لتحديد تكوين الآلية U7-تعتمد على المعالجة، وكان المحتضنة جزء قصير من هستون مرناً قبل المحتوية على البيوتين في 3 أو 5 ' مع خلاصة نووية مؤخرا، وتم القبض على مجمعات المجتمعون في المغلفة ستريبتافيدين [اغروس] الخرز5،،من610. بسبب تفاعل قوية على نحو استثنائي بين البيوتين و streptavidin، الوتيد تحت يشوه الظروف من الغليان في الحزب الديمقراطي الصربي بروتينات معطلة على الخرز ستريبتافيدين وتحليلها بواسطة تلطيخ الفضة والطيف الكتلي. بينما هذا النهج بسيطة حددت عددا من عناصر سنرنب U7، أسفرت عن عينات بدائية نسبيا، وغالباً ما تكون ملوثة بعدد كبير من البروتينات الخلفية نونسبيسيفيكالي ملزمة بالخرز ستريبتافيدين، يحتمل أن إخفاء بعض عناصر إليه معالجة ومنع الكشف عنها على الفضة الملون الهلام5،،من610. الأهم من ذلك، يمنع هذا النهج أيضا أي الدراسات الفنية مع المواد المعزولة وفي تنقية إضافية إلى التجانس بطرق إضافية.
واقترح عددا من التعديلات على مر الزمن لمعالجة الطبيعة تقريبا لا رجعة فيه تفاعل البيوتين/streptavidin، مع معظمهم ويجري تصميم أما يضعف التفاعل أو تقديم ذراع مباعدة كيميائيا كليفابل في المحتوية على البيوتين الكواشف11،12. وكان الجانب السلبي لجميع هذه التعديلات أنها تقلل إلى حد كبير كفاءة الأسلوب و/أو الشروط غير الفسيولوجية المطلوبة غالباً أثناء الخطوة شطف، يعرض للخطر سلامة أو نشاط البروتينات المنقاة.
وهنا يصف لنا مقاربة مختلفة لحل المشكلة الكامنة استراتيجية البيوتين/ستريبتافيدين باستخدام الحمض النووي الريبي نهاية ركائز التي أرفقت البيوتين تساهمي إلى 5 ' عبر ' 1 صور--كليفابل-(2-نيتروفينيل) moiety إيثيل هو حساسة للأشعة فوق البنفسجية13،14موجه طويلة. وقمنا باختبار هذا النهج لتنقية إليه تجهيز U7-تعتمد على الحد من المورفولوجية والثدييات النووية مقتطفات15. معطلة في الخرز streptavidin عقب حضانة قصيرة من هستون مرناً قبل المحتوية على البيوتين ورابط صور كليافابلي مع خلاصة نووية، مجمعات المعالجة المجمعة وغسلها جيدا وصدر برفق للحل في مسقط النموذج قبل التعرض للضوء ~ 360 نانومتر الأشعة فوق البنفسجية. أسلوب الأشعة فوق البنفسجية-شطف جداً فعالة وسريعة وواضحة، مما أسفر عن كميات كافية من سنرنب U7 تصور مكوناته بالشظية تلطيخ من قدر ضئيل من 100 ميليلتر من استخراج15. المواد التيد الأشعة فوق البنفسجية خال من البروتينات أساسية ومناسبة لتحليل الطيف الكتلي المباشر وخطوات تنقية إضافية وفحوصات الانزيمية. قد اعتمدت نفس الأسلوب لتطهير المجمعات الحمض النووي الريبي/البروتين الأخرى التي تتطلب مواقع ربط الحمض النووي الريبي قصيرة نسبيا. البيوتين ورابط الصورة كليافابلي يمكن أيضا تساهمي إرفاق إلى واحد-ومزدوجة-الذين تقطعت بهم السبل الحمض النووي، واحتمال توسيع نطاق الأسلوب شطف الأشعة فوق البنفسجية لتنقية مختلف الحمض النووي/البروتين المجمعات.
التوليف الكيميائي للحمض النووي الريبي الركازات المحتوية على تساهمي تعلق البيوتين ورابط الصورة كليفابل العملي فقط مع تسلسل التي لا تتجاوز النيوكليوتيدات ~ 65، أصبحت مكلفة وغير فعالة لتسلسل أطول بشكل ملحوظ. ولمعالجة هذه المشكلة، وضعنا أيضا نهج بديل مناسب لأهداف ملزمة الحمض النووي الريبي أطول بكثير. في هذا النهج، والجيش الملكي النيبالي من أي طول والنوكليوتيدات تسلسل الذي تم إنشاؤه في المختبر بالنسخ T7 أو SP6 وتعتيق إلى اليغنوكليوتيد تكميلية قصيرة التي تحتوي على البيوتين ورابط الصورة كليفابل في 5 ' نهاية (ترانس التكوين). مزدوج الناتجة بعد ذلك، تستخدم لتنقية البروتينات الربط الفردي أو مجمعات الجزيئات في الخرز streptavidin بعد البروتوكول نفسه وصف لركائز الجيش الملكي النيبالي المحتوية على البيوتين كليفابل الصور المرفقة تساهمي (رابطة الدول المستقلة التكوين). مع هذا التعديل، يمكن استخدام البيوتين صور كليفابل بالاقتران مع في المختبر التي تم إنشاؤها بالنصوص التي تحتوي على مئات النيوكليوتيدات، توسيع نطاق الأسلوب شطف الأشعة فوق البنفسجية للتنقية لنطاق واسع من الجيش الملكي النيبالي/البروتين.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-إعداد الركيزة
ملاحظة: ركائز رنا أقصر من النيوكليوتيدات ~ 65 يمكن توليفها كيميائيا مع البيوتين (ب) ورابط الصورة كليفابل (pc) (المشار إليها معا البيوتين صور كليفابل أو ثنائي الفينيل متعدد الكلور) تساهمي يعلق على الحمض النووي الريبي 5 ' نهاية (تكوينرابطة الدول المستقلة ). بحاجة لأن يتم إنشاؤه في المختبر بالنسخ T7 (أو SP6) ركائز الجيش الملكي النيبالي الذي يحتوي على مواقع الربط أطول بشكل ملحوظ وتعتيق في وقت لاحق إلى اليغنوكليوتيد قصيرة محول تكميلية المحتوية على ثنائي الفينيل متعدد الكلور moiety في نهاية 5 ' (عبر التكوين) (الشكل 1).
- لمواقع الربط التي تتكون من أقل من 65 ~ النيوكليوتيدات، استخدام منتج تجاري (جدول المواد) كيميائيا توليف الحمض النووي الريبي للفائدة مع ثنائي الفينيل متعدد الكلور تساهمي يعلق على الحمض النووي الريبي 5 ' نهاية (الشكل 1A و 2A الشكل). تذوب في الماء المعقم لتحقيق التركيز المطلوب وتخزينها في مختبرين الصغيرة في-80 درجة مئوية.
- لمواقع الربط إلى حد كبير أطول من النيوكليوتيدات ~ 65، النموذج الاتجاه جزئي في المختبر إنشاء الجيش الملكي النيبالي للفائدة واليغنوكليوتيد محول تكميلية التي تحتوي على مجموعة ثنائي الفينيل متعدد الكلور في 5 ' نهاية (الشكل 3A).
- إجراء النسخ T7 الحمض النووي بلازميد خطية أو قالب PCR مناسبة لإنشاء الجيش الملكي النيبالي مع الموقع ملزم للفائدة التي قدمتها في نهاية 3 ' ~ 20-النوكليوتيدات تسلسل تعسفي.
- استخدام منتج تجاري (جدول المواد) لتوليف كيميائيا محول اليغنوكليوتيد مكمل للملحق 3 'في الجيش الملكي النيبالي المولدة بواسطة T7 ويحتوي على ثنائي الفينيل متعدد الكلور في 5' نهاية (الشكل 3A).
ملاحظة: يمكن وضع هما 18-ذرة الفواصل والنيوكليوتيدات غير مكملة 2-3 في 5 ' نهاية اليغنوكليوتيد للحد من إعاقة الفراغية المحتملة بين مجمع منضم والخرز ستريبتافيدين. من المستحسن أيضا أن اليغنوكليوتيد يتم تعديل شكل موحد مع 2 ' س-ميثيل مجموعة لتعزيز قوة مزدوج وتوفير المقاومة ضد nucleases مختلف. - يصلب الجيش الملكي النيبالي المولدة بواسطة T7 إلى اليغنوكليوتيد محول ثنائي الفينيل متعدد الكلور.
- بمول ميكس 20 من الجيش الملكي النيبالي و pmol 100 من اليغنوكليوتيد ثنائي الفينيل متعدد الكلور محول (1:5 نسبة المولى) 1.5 مل أنبوب ميليلتر 100 تحتوي على ربط المخزن المؤقت على النحو التالي: 75 ملم بوكل، 15 ملم حبيس الأس الهيدروجيني 7.9، والغليسيرول 15%، حمض الإيثيلين 10 ملم (يدتا).
ملاحظة: من المهم استخدام الحد أدنى من اليغنوكليوتيد محول غير كافية لتشكيل ازدواج مع معظم (أن لم يكن كلها) الركيزة مرناً قبل استخدامها في رد فعل انلينغ. هذا يمكن أن مريح تحددها وسم الركازة الجيش الملكي النيبالي في نهاية 5 ' مع 32ف، الصلب الركيزة المسمى مع زيادة كميات من اليغنوكليوتيد محول باستخدام مختلف المخزن المؤقت الشروط ورصد الاحتفاظ إشارة المشعة على الخرز streptavidin بعد يغسل العديد من الخرز مع المخزن المؤقت ملزم. - ضع الأنبوبة في الماء المغلي لمدة 5 دقائق.
- السماح للمياه ليبرد لدرجة حرارة الغرفة.
- بمول ميكس 20 من الجيش الملكي النيبالي و pmol 100 من اليغنوكليوتيد ثنائي الفينيل متعدد الكلور محول (1:5 نسبة المولى) 1.5 مل أنبوب ميليلتر 100 تحتوي على ربط المخزن المؤقت على النحو التالي: 75 ملم بوكل، 15 ملم حبيس الأس الهيدروجيني 7.9، والغليسيرول 15%، حمض الإيثيلين 10 ملم (يدتا).
2-مجمع الجمعية
- الملحق 1 مل خلاصة نووية ماوس (أو استخراج آخر الاختيار) مع 80 مم يدتا درجة الحموضة 8 إلى تركيز نهائي 10 مم لحظر غير محدد نوكليسيس تعتمد على المعادن التي تكون موجودة في النص المقتبس.
ملاحظة: هذا سيؤدي إلى ضبط المخزن المؤقت في الاستخراج لتكوين نفسه كالتي في المخزن المؤقت للربط (راجع الخطوة 1.2.3.1). لا تؤثر على المعالجة في المختبر من قبل هيستون-مرناس يدتا بل قد تكون ضارة في تنقية البروتينات أو البروتين المجمعات التي تجمع بطريقة تعتمد على المغنيسيوم. وفي هذه الحالات، ينبغي تجنب يدتا. - إضافة 5-10 بمول من الجيش الملكي النيبالي الركيزة المعلمة مع مجموعة ثنائي الفينيل متعدد الكلور في رابطة الدول المستقلة (انظر الخطوة 1-1) أو عبر (راجع الخطوة 1.2.3.3) إلى 1 مل استخراج تحتوي على 10 مم يدتا.
ملاحظة: كمية الحمض النووي الريبي يحتاج إلى تقييم بعناية في سلسلة من التجارب للمحاكمة. استخدام الكثير من الركازة الحمض النووي الريبي لتنقية معقدة تحد ربما يأتي بنتائج عكسية، زاد الخلفية للجيش الملكي النيبالي غير محدد ملزم البروتينات دون أي تأثير على إنتاج بروتينات معينة. - احتضان الركيزة الجيش الملكي النيبالي باستخراج لمدة 5 دقائق في الجليد، وأحيانا خلط العينة.
ملاحظة: كل من الوقت ودرجة الحرارة الحضانة بحاجة إلى إنشاء تجريبيا وقد تتباين تباينا كبيرا، تبعاً للطبيعة المحددة لمجمع الجيش الملكي النيبالي/البروتين. - تدور الخليط حضانة في ميكروسينتريفوجي قبل يبرد لمدة 10 دقيقة في 10,000 ز x إزالة أي رواسب المحتملين، وجمع بعناية طافية تجنب نقل بيليه.
3-التثبيت من الحمض النووي الريبي/البروتين المجمعات على "الخرز ستريبتافيدين".
- نقل ~ 100 ميليلتر streptavidin [اغروس] تعليق حبة من مورد تجاري (جدول المواد) إلى أنبوب 1.5 مل وزيادة حجم المخزن المؤقت ملزم (75 ملم بوكل، 15 ملم حبيس الأس الهيدروجيني 7.9، والغليسيرول 15 في المائة، 10 مم يدتا).
ملاحظة: يجب أن يكون هذا المخزن المؤقت نفس تكوين في الخليط انلينغ واستخراج المستخدمة للجمعية المعقدة (الخطوة 2، 1). - جمع الخرز في الجزء السفلي من الأنبوب بالغزل لمدة 2-3 دقيقة في 25 x ز ونضح المادة طافية.
- كرر نفس الإجراء الغسيل/الغزل 2-3 مرات حجته الخرز مع المخزن المؤقت ملزم.
ملاحظة: في نهاية هذه الخطوة، بيليه الخرز ينبغي أن يكون حجم ~ 30 ميليلتر. - تحميل المادة طافية تحتوي على مجمع المجمعة (2.4 خطوة) على الخرز [اغروس] streptavidin متوازن.
- قم بتدوير ح 1 في 4 درجات مئوية شل الجيش الملكي النيبالي ومجمعات منضم في الخرز.
- جمع الخرز في الجزء السفلي من الأنبوب بالغزل لمدة 2-3 دقيقة في 25 x ز.
ملاحظة: استخدم سوينغ بالدوار لتجنب خسارة كبيرة من الخرز إذا أنها تميل إلى التمسك بجانب الأنبوب في دوار الزاوي. - نضح المادة طافية وشطف الخرز مرتين مع 1 مل من المخزن المؤقت ملزم، باستخدام نفس شروط الطرد المركزي.
- أضف 1 مل من المخزن المؤقت ملزم وتدوير العينة ح 1 في 4 درجات مئوية.
ملاحظة: هذه الخطوة يمكن اختصارها إذا المجمع شكلت الركيزة يميل إلى الانسحاب. - تدور أسفل الخرز لمدة 2-3 دقيقة في 25 x ز وإضافة 1 مل من المخزن المؤقت ونقل التعليق إلى أنبوب جديد.
- تدوير ح 1 إضافية أو أقصر، إذا كان المجمع غير مستقر وتدور إلى أسفل لمدة 2-3 دقيقة في ز 25 x ونقل الخرز إلى أنبوب 500 ميليلتر في 200 ميليلتر من المخزن المؤقت ملزم.
4-الأشعة فوق البنفسجية-شطف.
- قم بتشغيل كثافة عالية مصباح الأشعة فوق البنفسجية التي تنبعث منها 365 نيوتن متر فوق البنفسجية لمدة 5-10 دقائق قبل أن تصل إلى تألق كامل.
ملاحظة: وهذا ضروري لتحقيق الطاقة القصوى لانبعاث الأشعة فوق البنفسجية في البداية التشعيع. - ملء الجزء السفلي من صحن بتري (100 ملم × 15 ملم) مع الجليد محكم معبأة وكومة من خلال غطاء للطبق.
- باختصار دوامة الأنبوب الذي يحتوي على المجمع المعطل تداولها، وضعه أفقياً على الجليد والغطاء مع مصباح المعالجون مسبقاً، ضمان أن العينة يقع ضمن مسافة 2-3 سم سطح المصباح.
ملاحظة: إذا كانت المسافة كبيرة جداً، استخدام أطباق بيتري إضافية أو كائنات أخرى مناسبة لإحضار العينة أقرب إلى اللمبة. - تشعيع لمدة 30 دقيقة، وكثيراً ما عكس وفورتيكسينج على أنبوب لضمان التعرض موحدة من التعليق للأشعة فوق البنفسجية ومنع الانهاك.
ملاحظة: لتوفير مزيد من البرودة، خطوة شطف الأشعة فوق البنفسجية يمكن أن تتم في غرفة باردة. قم بالتبديل إلى طبق بتري مع الجليد الطازجة في حالة ذوبان الجليد المفرط. - وتدور أسفل الخرز لمدة 2-3 دقيقة في 25 x ز جمع المادة طافية.
- إعادة تدور المادة طافية باستخدام نفس الشروط وجمع المادة طافية.
ملاحظة: ترك كمية صغيرة من المادة طافية في الجزء السفلي لتجنب نقل حبات المتبقية.
5-نموذج تحليل الفضة تلطيخ تليها الكتلي.
- استخدام مخزونات النشر الاستراتيجي/polyacrylamide هلام التفريد لفصل جزء من المادة طافية الوتيد الأشعة فوق البنفسجية والكسر نفس المواد التي تركت في الخرز بعد شطف الأشعة فوق البنفسجية.
ملاحظة: قد تتضمن أيضا التحليل قاسمة الخرز سحبت من العينة قبل شطف الأشعة فوق البنفسجية. - وصمة عار جل يحتوي على فصل البروتينات باستخدام فضة متاحة تجارياً تلطيخ طقم.
- تقييم كفاءة الأشعة فوق البنفسجية-شطف بمقارنة الكثافة البروتينات موجودة في المادة طافية التيد الأشعة فوق البنفسجية، وتلك التي تركت على الخرز بعد إشعاع الأشعة فوق البنفسجية.
- المكوس عصابات البروتين الفائدة وتحديد هوياتهم باستخدام البروتوكولات القياسية10،15الطيف الكتلي.
6-العالمية من تحليل عينة التيد الأشعة فوق البنفسجية من الطيف الكتلي.
- مباشرة تحليل جزء صغير من المادة طافية التيد الأشعة فوق البنفسجية من الطيف الكتلي لتحديد البروتين الكامل للمواد النقية بطريقة غير متحيزة.
ملاحظة: يمكن أن يتم ذلك قبل العلاج بحل من العينات النقية مع التربسين تليها البروتوكولات القياسية الطيف الكتلي تحديد الهوية لتوليد الببتيدات10،15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تم اختبار طريقة الأشعة فوق البنفسجية-شطف مع اثنين من ركائز الجيش الملكي النيبالي مركباً كيميائيا يعلق تساهمي في النهاية 5 ' لمجموعة ثنائي الفينيل متعدد الكلور (تكوينرابطة الدول المستقلة ): ثنائي الفينيل متعدد الكلور-SL (الشكل 1) وثنائي الفينيل متعدد الكلور-dH3/5 م الكشف (الشكل 2). 31-النوكليوتيدات ثنائي الفينيل متعدد الكلور-SL الرنا تحتوي على بنية جذعية-حلقة متبوعاً بذيل 5-النوكليوتيدات الذين تقطعت بهم السبل وحيدة ولها تسلسل متطابقة إلى 3 ' نهاية هيستون الناضجة مرناً (أي.، بعد انشقاق من قبل هيستون-مرناً من سنرنب U7). هذا التسلسل الفريد موقع ربط معروفة لاثنين من البروتينات الموجودة في الكسر هيولى الثدييات: سلبب و 3 ' hExo16،،من1718. ثنائي الفينيل متعدد الكلور-dH3/5 م شظية 63-النوكليوتيدات المورفولوجية H3 هيستون قبل-مرناً والإضافة إلى الجذعية-الحلقة يحتوي على تسلسل الذي يربط بين سنرنب U7 المورفولوجية (الشكل 2).
dH3 تحويله (125 النيوكليوتيدات) هو مثال على ركائز الجيش الملكي النيبالي الأطول التي يمكن إنشاؤها بواسطة T7 النسخ وقدمتها مع البيوتين وفاصل صور كليفابل في ترانس الصلب لثنائي الفينيل متعدد الكلور/22mer، اليغنوكليوتيد محول مركباً كيميائيا ( ترانس التكوين). ثنائي الفينيل متعدد الكلور/22mer يحتوي على هاتين المجموعتين في نهاية 5 '، ويتألف من 22 2' س-الميثيل-موديفيد النيوكليوتيدات (الشكل 3A). ومكملة النيوكليوتيدات 19 آخر من dH3 تحويله قبل-مرناً النيوكليوتيدات 19 في نهاية 3 ' ثنائي الفينيل متعدد الكلور/22mer(underlined in the sequence in Figure 3A). لا يختلف هذا قبل مرناً، إلى جانب كونها أطول كثيرا من الاصطناعية ثنائي الفينيل متعدد الكلور-dH3/5 م، والتي تحتوي على نفس رئيسيين معالجة الإشارات: حلقة الجذعية وموقع U7-ملزمة.
ثنائي الفينيل متعدد الكلور-SL الجيش الملكي النيبالي كان المحتضنة مع 1 مل استخراج S100 أعده تنبيذ فائق (100,000 x ز ح 1) الكسر هيولى التي تم الحصول عليها من خلايا الورم النخاعي الماوس19 والتأثير وفعالية الأشعة فوق البنفسجية-شطف حللت أولاً بتلوين الفضة. تم اكتشاف عدد من البروتينات على الخرز streptavidin قبل شطف الأشعة فوق البنفسجية (الشكل 1B، لين 1). التشعيع مع موجه الأشعة فوق البنفسجية طويلة الإفراج عن بعض هذه البروتينات فقط للمادة طافية (الشكل 1B، لين 3)، ترك خلفية غير محدد على الخرز (الشكل 1B، لين 2)، ومن ثم التأكيد على أهمية خطوة شطف الأشعة فوق البنفسجية. وحددت البروتينات الرئيسية التيد الأشعة فوق البنفسجية الكتلي 3 ' hExo وسلبب، مع سلبب حيث يمثل طول كامل البروتين (فلوريدا) وعدد من منتجات التحلل أقصر (DP). وأفرج أيضا بشكل انتقائي كميات أصغر من البروتينات الأخرى، اعتبرت مختلف البروتينات ربط الحمض النووي الريبي (الممارسات التجارية التقييدية)، إلى الحل باشعاع الأشعة فوق البنفسجية (الشكل 1B، لين 3).
ثنائي الفينيل متعدد الكلور-dH3/5 م قبل-مرناً (الشكل 2) أو تحويله dH3 قبل-مرناً تعتيق لثنائي الفينيل متعدد الكلور/22mer (الشكل 3) كانت المحتضنة مع 1 مل خلاصة النووية من المورفولوجية كيه سي الخلايا على شكل تجهيز المجمعات20،21. لتقييم أفضل خصوصية البروتينات التي تربط كل من قبل-مرناً هستون، أعد عنصر سلبي بالتوازي بإضافة اثنين من المنافسين للنووي استخراج: SL الجيش النيبالي الملكي التي تعزل سلبب، واليغنوكليوتيد العقاقير قصيرة قاعدة أزواج مع سنرنا U7 ويمنع تفاعل سنرنب U7 مع موقعها في مرحلة ما قبل-مرناً.
الخطوة الأشعة فوق البنفسجية-شطف من ثنائي الفينيل متعدد الكلور-dH3/5 م المعطل تداولها قبل-مرناً أسفرت عن الإفراج عن عدد قليل فقط من البروتينات انتقائي للمادة طافية (الشكل 2B، لين 1)، مع خلفية مكثفة من البروتينات غير محددة المتبقية على الخرز (الشكل 2B ، لين 3). هذه البروتينات، المسمى A-الأول، حددت الكتلي كمكونات لل سنرنب U715. نموذج يتضمن أيضا جزئيا المتدهورة سلبب التي ترتحل في كاتشين 10 وفقط يمكن أن يكون مرئياً على أعلى تركيز الحزب الديمقراطي الصربي/polyacrylamide والهلام. تم الكشف عن جميع هذه البروتينات لا حضور اثنين من المنافسين تجهيز أن كتلة ملزمة سنرنب U7 إلى مرناً قبل هستون (الشكل 2B، لين 2).
وأفرجت إشعاع الأشعة فوق البنفسجية من الوجهين المعطل تداولها تتألف من dH3 تحويله قبل-مرناً وثنائي الفينيل متعدد الكلور/22mer (الشكل 3B، لين 1) نفس مكونات سنرنب U7 المورفولوجية للحل. بالإضافة إلى ذلك يتضمن هذه العينة متعددة من البروتينات ربط الحمض النووي الريبي التي تفاعلت مع اليغنوكليوتيد 22mer/ثنائي الفينيل متعدد الكلور المستخدمة في الزائدة لتشكيل ازدواج مع dH3 تحويله قبل-مرناً. على عكس الوحدات الفرعية U7 سنرنب، وهذه البروتينات تلويث، فضلا عن جميع البروتينات الأساسية التي ظلت على الخرز، استمر حضور المنافسين تجهيز (الشكل 3B، قارن بين الممرات 1 و 2، والممرات 3 و 4).
يمكن أن يكون جزء صغير من المجمعات التجهيز التي تحتوي على الأشعة فوق البنفسجية-المادة طافية والكسر نفسه من الأشعة فوق البنفسجية-المادة طافية من عنصر تحكم سلبية (إعداد حضور النوكليوتيد منافس اثنين ومن ثم تفتقر إلى تجهيز المجمعات) مباشرة تحليل بواسطة الكتلي دون فصل مسبقة للبروتينات التيد هلام التفريد15. هذا الأسلوب هو حساسة للغاية في الكشف عن جميع البروتينات التيد بغض النظر عن حجمها ووفرة وبالاقتران مع العينة سلبية ويقدم قائمة كاملة وغير منحازة من البروتينات التي تربط على وجه التحديد مع هستون-مرناً قبل إجراء 3 ' نهاية تجهيز رد فعل.
رقم 1: تنقية البروتينات هيولى الماوس ملزمة لثنائي الفينيل متعدد الكلور-SL الرنا. (أ) بالرسم التخطيطي لثنائي الفينيل متعدد الكلور مركباً كيميائيا-SL الحمض النووي الريبي (31-النيوكليوتيدات). البيوتين (بيو) في نهاية 5 'تبعتها مجموعة صور كليفابل (pc) حساسة الأشعة فوق البنفسجية موجه طويلة (366 نيوتن متر)، الفواصل ذرة هما 18 و 31 النيوكليوتيدات التي تشكل هيكل حلقة الجذعية المصانة وجدت في نهاية 3' مرناس هيستون الناضجة. (ب) ثنائي الفينيل متعدد الكلور-SL الجيش الملكي النيبالي كان المحتضنة مع استخراج هيولى S100 من خلايا الورم النخاعي الماوس. تم تنقية الجيش الملكي النيبالي، والبروتينات المنضم على الخرز streptavidin، على نطاق واسع غسلها، الأشعة فوق البنفسجية التيد وتحليلها بواسطة الفضة تلطيخ (لين 3). البروتينات معطلة على الخرز streptavidin قبل شطف الأشعة فوق البنفسجية وترك على الخرز بعد شطف الأشعة فوق البنفسجية ويبين في حارات 1 و 2، على التوالي. وضع علامات حجم البروتين (في كاتشين) يشار إلى اليسار.
الشكل 2: تنقية مجمعات تجهيز المورفولوجية المجتمعون بشأن ثنائي الفينيل متعدد الكلور-dH3/5 م قبل-مرناً. (أ) رسم تخطيطي لتصنيعه كيميائيا المورفولوجية-خاصة ثنائي الفينيل متعدد الكلور-dH3/5 م قبل مرناً (63-النيوكليوتيدات). البيوتين (بيو) في نهاية 5 ' متبوعاً مجموعة صور--كليافابلي (pc) وهما 18-ذرة الفواصل 63 النيوكليوتيدات التي تحتوي على تسلسل هما العناصر الأساسية تجهيز: هيكل حلقة الجذعية وموقع U7-ملزمة. يتم تعديل النيوكليوتيدات الخمسة المحيطة بموقع الانقسام الرئيسية الواقعة بين هذين العنصرين مع 2 ' س-ميثيل المجموعة كتلة الانقسام قبل سنرنب U7 خلال الجمعية المعقدة (تجاوزت الخطوط). (ب) ثنائي الفينيل متعدد الكلور-dH3/5 م كان المحتضنة مع خلاصة نووية المورفولوجية لتجميع تجهيز المجمعات. في عنصر التحكم السلبي، استخراج النووية يحتوي على اثنين من المنافسين التجهيز لحظر ملزم سنرنب سلبب و U7 إلى ما قبل هيستون-مرناً. المجمعات المجمعة كانت معطلة على الخرز streptavidin وعلى نطاق واسع غسلها ونشرته تعرض العينة إلى الطويلة موجه الأشعة فوق البنفسجية إلى الحل. تم تحليل الكسور نفس المواد الوتيد الأشعة فوق البنفسجية (الأشعة فوق البنفسجية-sups) والخرز بعد شطف-الأشعة فوق البنفسجية (الأشعة فوق البنفسجية-الخرز) تلطيخ الفضة. تتم الإشارة إلى الموقف من علامات حجم البروتين (في كاتشين) وستريبتافيدين (SA) بالحق.
الشكل 3: تنقية مجمعات تجهيز المورفولوجية تجميعها على dH3 تحويله من قبل-مرناً، المرفقة بمجموعة صور كليفابل في ترانس. A (أ) مخطط مزدوج Ext dH3 المتولدة عن الصلب dH3 المولدة بواسطة T7 تحويله قبل-مرناً واليغنوكليوتيد مركباً كيميائيا ثنائي الفينيل متعدد الكلور/22mer بالتسلسل التالي: 5 ' بيو/pc/18S/18S/مامجمومامجمكمومومامكمامكمومكمجمامجمكمكمومامك. في اليغنوكليوتيد، البيوتين (بيو) يوضع في نهاية 5 '، وتبعتها رابط الصورة كليفابل (pc). النيوكليوتيدات آخر 19 (أكد في التسلسل أعلاه) مكملة للملحق 3 ' إضافة إلى dH3 تحويله قبل-مرناً. وجود 2 ' التعديلات س-ميثيل (لا المبينة في الشكل) يخدم غرضين: تستقر اليغنوكليوتيد ضد nucleases استخراج ويزيد من قوة مزدوج شكلت مع dH3 تحويله قبل-مرناً. (ب) dH3 Ext المزدوجة كان المحتضنة مع المورفولوجية كيه سي النووية استخراج في الغياب أو حضور تجهيز المنافسين، معطلة في الخرز streptavidin، التيد الأشعة فوق البنفسجية جنبا إلى جنب مع البروتينات منضم وغسلها على نطاق واسع. تم تحليل الكسور نفس المواد التيد الأشعة فوق البنفسجية (الأشعة فوق البنفسجية-sups، الممرات 1 و 2) والخرز بعد شطف-الأشعة فوق البنفسجية (الأشعة فوق البنفسجية-الخرز، الممرات 3 و 4) تلطيخ الفضة. وترد كومبونينست محددة من تجهيز المجمعات (تلك التي يتم حلها بواسطة تجهيز المنافسين) مع (أ) برسائل و. الرئيسية غير محدد الحمض النووي الريبي البروتينات ملزمة (تلك التي التيد الأشعة فوق البنفسجية ولكن استمرار حضور اثنين من المنافسين التجهيز) يشار إليها بعلامات نجمية. تتم الإشارة إلى وضع علامات حجم البروتين (في كاتشين) إلى اليمين. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الأسلوب الموصوفة هنا واضحة وإلى جانب إدراج رابط صورة كليفابل والأشعة فوق البنفسجية-شطف والخطوة لا تختلف عن الأساليب شيوعاً التي تستفيد من تفاعل قوي جداً بين البيوتين وستريبتافيدين. الخطوة الأشعة فوق البنفسجية-شطف فعال جداً، عادة الإفراج عن أكثر من 75% من الجيش الملكي النيبالي المعطل تداولها والمرتبطة البروتينات من الخرز streptavidin، تاركة وراءها خلفية عالية من البروتينات التي تربط الخرز غير على وجه التحديد. بالقضاء على هذه الخلفية، غلة الخطوة الأشعة فوق البنفسجية-شطف عينات نقية ملحوظ مناسبة للتحليل المباشر تلطيخ الفضة والطيف الكتلي والاختبارات الوظيفية.
نتيجة تنطوي على خطوات قليلة وبسيطة نسبيا، الأسلوب الأشعة فوق البنفسجية-شطف استنساخه عالية، توفير كميات كافية من سنرنب U7 لتلطيخ الفضية من قدر ضئيل من 100 ميليلتر من الماوس و المورفولوجية النووية مقتطفات15. الأسلوب بديل جذاب لاستراتيجيات تجريبية أخرى كانت تستخدم لتنقية الحمض النووي الريبي/البروتين المجمعات، بما في ذلك وضع علامات على ركائز الجيش الملكي النيبالي بموقع ربط MS2 وشل المجمعات المنتسبة على الخرز اميلوز عبر انصهار MS2 MBP البروتين. الاستراتيجية MS2، بينما نجحت في عزل spliceosomes وفيرة نسبيا والمتعارف عليه 3 ' نهاية تجهيز المجمعات22،23، لم تؤد إلى كميات كافية من تجهيز المجمعات التي تحتوي على سنرنب U7 (ZD، غير منشورة النتائج)، وهو ما يقارب 100 مرة أقل تتركز في الخلايا الحيوانية من سنرنب سبليسيوسومال U1 الرئيسية.
العديد من جوانب البروتوكول تحتاج إلى تعديل لتحقيق مختلف الأهداف البحثية الفردية وتحقيق نتائج مثلى مع الحمض النووي الريبي/البروتين المجمعات الأخرى. أولاً، من المهم لتطابق كمية الحمض النووي الريبي الركازة المستخدمة للتجميع المعقدة مع الكمية من هذا التعقيد الموجود في الاستخراج. للحد من المجمعات، بما في ذلك سنرنب U7، يأتي بنتائج عكسية، سوى زيادة الخلفية غير محددة ملزمة الحمض النووي الريبي البروتينات في الأشعة فوق البنفسجية-المادة طافية استخدام الكثير الركازة. ثانيا، من المهم أيضا تحسين الطول ودرجة حرارة الحضانة تعزيز الجمعية قوية من المجمع، وتمنع في نفس الوقت الانفصال بسبب proteolysis المحتملة أو إفراط الجيش الملكي النيبالي تدهور.
مفتاح صعوبة في العمل مع U7-تعتمد على تجهيز المجمعات ومجمعات الجيش الملكي النيبالي/البروتين المماثلة التي تحمل الأنشطة الانزيمية أنه بعد ويجري تجميع تماما أنهم قد ننأى بنتيجة الحفز. الانقسام من قبل-مرناس هيستون يحدث بسرعة حتى في درجات الحرارة المنخفضة، يقلل عائد مجمعات تجهيز المنقي. لمنع حدوث هذا الأثر غير المرغوب فيه، تم تعديل الموقع انشقاق رئيسي وأربعة النيوكليوتيدات القريبة في ثنائي الفينيل متعدد الكلور-dH3/5 م قبل-مرناً أثناء التوليف الكيميائي مع 2 ' س-ميثيل المجموعات (م 5)10. هذا ما قبل-مرناً تماما تقريبا مقاومة للانقسام قبل سنرنب U7 ويمكن المحتضنة مع خلاصة نووية في درجة حرارة الغرفة لمدة 60 دقيقة دون التسبب في اضطراب معقدة قابلة للاكتشاف. DH3 المولدة بواسطة T7 Ext تعتيق لثنائي الفينيل متعدد الكلور/22mer يفتقر إلى هذه التعديلات ويضطلع به الحضانة مع خلاصة نووية على الجليد لمدة 5 دقائق أو أقل للحد من الحفز. تحتوي على ثنائي الفينيل متعدد الكلور-SL الحمض النووي الريبي ناضجة 3 ' نهاية هيستون مرناً وفي مقتطفات هيولى لا تخضع لأي معالجة بالإضافة. 3 'hExo، وتعتمد على المغنيسيوم 3'-5 ' [ااكسونوكلس] قادر على إزالة النيوكليوتيدات 2-3 من ذيل واحد الذين تقطعت بهم السبل في فيفو24،25 لكن في المختبر تثبيط نشاطها بسبب وجود يدتا16. نتيجة لذلك يمكن المحتضنة ثنائي الفينيل متعدد الكلور-SL الجيش الملكي النيبالي في مقتطفات هيولى في درجة حرارة الغرفة لفترة طويلة دون أي آثار سلبية، على الرغم من أن عادة حضانة قصيرة على الجليد كاف لتشكيل مجمع ثلاثي من الجيش الملكي النيبالي مع hExo سلبب و 3 '.
من الخيارين بديلة لأسلوب الأشعة فوق البنفسجية-شطف، استخدام ركائز الجيش الملكي النيبالي مع البيوتين ورابط الصورة كليافابلي في رابطة الدول المستقلة (تساهمي المرفقة إلى نهاية 5 ' الحمض النووي الريبي) عموما هو أبسط وغلة عينات نقية نسبيا. قيداً هاما لهذا النهج أن الفريقين يمكن إرفاق تساهمي للجيش الملكي النيبالي ركائز لا تتجاوز النيوكليوتيدات ~ 65. يمكن إرفاق أطول أهدافا ملزمة في الجيش الملكي النيبالي لمجموعة ثنائي الفينيل متعدد الكلور في ترانس عبر اليغنوكليوتيد محول. ومع ذلك، قد ينتج هذا النهج الخلفية أعلى من البروتينات غير المحددة التي تميل إلى ربط الزائدة من اليغنوكليوتيد محول. ولذلك من المهم استخدام فقط من فائض مولى الحد أدنى من اليغنوكليوتيد كافية لربط جميع مرناً قبل الركازة المستخدمة في التجربة.
يمكن أن تختلف طبيعة التسلسل، والطول والكيميائية النوكليوتيد محول لتحسين قدرتهم على قاعدة زوج مع تسلسل تكميلية في ركائز الجيش الملكي النيبالي، مع الحد من قدرتها على التفاعل مع الحمض النووي الريبي غير محددة ملزمة البروتينات. أخيرا، يمكن المعطل تداولها أطول ركائز مرناً قبل duplexed مع محول النوكليوتيد على الخرز streptavidin قبل المستخدمة لتشكيل معقدة. ميزة واحدة لهذا النهج الاختيار المسبق هو أن تزيل من جزيئات الحمض النووي الريبي عينة أن لم يصلب اليغنوكليوتيد. الاحتفاظ قدرة عادية لتجميع إلى مجمع في الاستخراج هذه الجزيئات لكن غير قادر على ربط الخرز streptavidin، الحد جزئيا من العائد لتنقية.
بالإضافة إلى تنقية مجمعات تجميعها على ركائز الحمض النووي الريبي المفرد-الذين تقطعت بهم السبل، يمكن استخدام الأسلوب الأشعة فوق البنفسجية-شطف بطريقة مماثلة لتنقية البروتين المجمعات التي تربط مفرد، ومزدوج تقطعت تسلسل الحمض النووي أو البروتينات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب لا تمت بصلة إلى الكشف عن
Acknowledgments
ونحن نشكر زملائنا والمتعاونين على مساهمتهم لعملنا. أيد هذه الدراسة المعاهد الوطنية للصحة منح جنرال موتورز 29832.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Streptavidin-Agarose | Sigma | S1638-5ML | |
| High-intensity, long-wave UV lamp | Cole-Parmer | UX-97600-00 | |
| Replacement bulb | Cole-Parmer | UX-97600-19 | 100 Watts Mercury H44GS-100M bulb emitting 366 nm UV light (Sylvania) |
| RNAs and oligonucleotides containing biotin and photo-cleavable linker in cis | Dharmacon (Lafayette, CO) or Integrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA) | Requst a quote in Dharmacon | |
| Beckman GH 3.8 swing bucket rotor | Beckman | ||
| RiboMAX Large Scale RNA Production Systems (T7 polymerase) | Promega | P1300 | |
| RiboMAX Large Scale RNA Production Systems (SP6 polymerase) | Promega | P1280 | |
| Pierce Silver Stain Kit | ThermoFisher Scientific | 24612 |
References
- Mandel, C. R., Bai, Y., Tong, L.
- Dominski, Z., Carpousis, A. J., Clouet-d'Orval, B. Emergence of the beta-CASP ribonucleases: highly conserved and ubiquitous metallo-enzymes involved in messenger RNA maturation and degradation. Biochimica et Biophysica Acta. 1829 (6-7), 532-551 (2013).
- Dominski, Z., Marzluff, W. F. Formation of the 3' end of histone mRNA: getting closer to the end. Gene. 396 (2), 373-390 (2007).
- Yang, X. C., Torres, M. P., Marzluff, W. F., Dominski, Z. Three Proteins of the U7-Specific Sm Ring Function as the Molecular Ruler To Determine the Site of 3 '-End Processing in Mammalian Histone Pre-mRNA. Molecular and Cellular Biology. 29 (15), 4045-4056 (2009).
- Sabath, I., et al. 3 '-End processing of histone pre-mRNAs in Drosophila: U7 snRNP is associated with FLASH and polyadenylation factors. RNA. 19 (12), 1726-1744 (2013).
- Skrajna, A., et al. U7 snRNP is recruited to histone pre-mRNA in a FLASH-dependent manner by two separate regions of the stem-loop binding protein. RNA. 23 (6), 938-951 (2017).
- Smith, H. O., et al. Two-step affinity purification of U7 small nuclear ribonucleoprotein particles using complementary biotinylated 2'- O-methyl oligoribonucleotides. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 88, 9784-9788 (1991).
- Pillai, R. S., et al. Unique Sm core structure of U7 snRNPs: assembly by a specialized SMN complex and the role of a new component, Lsm11, in histone RNA processing. Genes and Development. 17 (18), 2321-2333 (2003).
- Pillai, R. S., Will, C. L., Luhrmann, R., Schumperli, D., Muller, B. Purified U7 snRNPs lack the Sm proteins D1 and D2 but contain Lsm10, a new 14 kDa Sm D1-like protein. EMBO Journal. 20 (19), 5470-5479 (2001).
- Yang, X. C., et al. A Complex Containing the CPSF73 Endonuclease and Other Polyadenylation Factors Associates with U7 snRNP and Is Recruited to Histone Pre-mRNA for 3 '-End Processing. Molecular and Cellular Biology. 33 (1), 28-37 (2013).
- Shimkus, M., Levy, J., Herman, T. A chemically cleavable biotinylated nucleotide: usefulness in the recovery of protein-DNA complexes from avidin affinity columns. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (9), 2593-2597 (1985).
- Hirsch, J. D., et al. Easily reversible desthiobiotin binding to streptavidin, avidin, and other biotin-binding proteins: uses for protein labeling, detection, and isolation. Analytical Biochemistry. 308 (2), 343-357 (2002).
- Olejnik, J., Krzymanska-Olejnik, E., Rothschild, K. J. Photocleavable biotin phosphoramidite for 5'-end-labeling, affinity purification and phosphorylation of synthetic oligonucleotides. Nucleic Acids Research. 24 (2), 361-366 (1996).
- Olejnik, J., Krzymanska-Olejnik, E., Rothschild, K. J. Photocleavable affinity tags for isolation and detection of biomolecules. Methods in Enzymology. 291, 135-154 (1998).
- Skrajna, A., Yang, X. C., Dadlez, M., Marzluff, W. F., Dominski, Z. Protein composition of catalytically active U7-dependent processing complexes assembled on histone pre-mRNA containing biotin and a photo-cleavable linker. Nucleic Acids Research. 46 (9), 4752-4770 (2018).
- Dominski, Z., Yang, X. C., Kaygun, H., Dadlez, M., Marzluff, W. F. A 3 ' exonuclease that specifically interacts with the 3 ' end of histone mRNA. Molecular Cell. 12 (2), 295-305 (2003).
- Yang, X. C., Purdy, M., Marzluff, W. F., Dominski, Z. Characterization of 3'hExo, a 3' exonuclease specifically interacting with the 3' end of histone mRNA. Journal of Biological Chemistry. 281 (41), 30447-30454 (2006).
- Tan, D., Marzluff, W. F., Dominski, Z., Tong, L. Structure of histone mRNA stem-loop, human stem-loop binding protein, and 3'hExo ternary complex. Science. 339 (6117), 318-321 (2013).
- Mayeda, A., Krainer, A. R. Preparation of HeLa cell nuclear and cytosolic S100 extracts for in vitro splicing. Methods in Molecular Biology. 118, 309-314 (1999).
- Dominski, Z., et al. 3' end processing of Drosophila histone pre-mRNAs: Requirement for phosphorylated dSLBP and co-evolution of the histone pre-mRNA processing system. Molecular and Cellular Biology. 22, 6648-6660 (2002).
- Dominski, Z., Yan, X. C., Purdy, M., Marzluff, W. F. Differences and similarities between Drosophila and mammalian 3 ' end processing of histone pre-mRNAs. Rna-a Publication of the Rna Society. 11 (12), 1835-1847 (2005).
- Jurica, M. S., Licklider, L. J., Gygi, S. R., Grigorieff, N., Moore, M. J. Purification and characterization of native spliceosomes suitable for three-dimensional structural analysis. RNA. 8 (4), 426-439 (2002).
- Shi, Y., et al. Molecular architecture of the human pre-mRNA 3' processing complex. Molecular Cell. 33 (3), 365-376 (2009).
- Thomas, M. F., L'Etoile, N. D., Ansel, K. M. Eri1: a conserved enzyme at the crossroads of multiple RNA-processing pathways. Trends in Genetics. 30 (7), 298-307 (2014).
- Lackey, P. E., Welch, J. D., Marzluff, W. F. TUT7 catalyzes the uridylation of the 3' end for rapid degradation of histone mRNA. RNA. 22 (11), 1673-1688 (2016).
