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Biochemistry

बायोटिन से जुड़ी आरएनए का उपयोग करके Macromolecular परिसरों का एकल-चरण शुद्धिकरण और एक फोटो-सट linker

Published: January 3, 2019 doi: 10.3791/58697
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Integrative Program for Biological and Genome Sciences, University of North Carolina at Chapel Hill, 2Department of Biochemistry and Biophysics, University of North Carolina at Chapel Hill

Summary

आरएनए/प्रोटीन परिसरों botin का उपयोग कर शुद्ध-streptavidin रणनीति आगे शोधन और कार्यात्मक विश्लेषण के लिए एक अनुपयुक्त रूप में denaturing शर्तों के तहत समाधान के लिए eluted हैं । यहां, हम इस रणनीति का एक संशोधन है कि एक फोटो-आरएनए में सट linker और एक सज्जन यूवी-रेफरेंस कदम का इस्तेमाल, देशी और पूरी तरह कार्यात्मक आरएनए उपज/

Abstract

कई वर्षों के लिए, असाधारण मजबूत और तेजी से बायोटिन और streptavidin के बीच बातचीत का गठन सफलतापूर्वक जैविक रूप से महत्वपूर्ण आरएनए के आंशिक शुद्धि के लिए उपयोग किया गया है/ हालांकि, यह रणनीति एक प्रमुख नुकसान से ग्रस्त है कि अपने व्यापक उपयोग सीमा: बायोटिन/streptavidin बातचीत denaturing शर्तों के तहत ही तोड़ा जा सकता है कि eluted परिसरों की अखंडता को भी बाधित है, इसलिए precluding उनके बाद में कार्यात्मक विश्लेषण और/या अंय तरीकों से आगे शोधन । इसके अलावा, eluted नमूने अक्सर streptavidin मोतियों के साथ विशेष रूप से संबद्ध है कि पृष्ठभूमि प्रोटीन के साथ प्रदूषित कर रहे हैं, चांदी धुंधला और जन स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा शुद्ध परिसरों के विश्लेषण उलझी । इन सीमाओं को दूर करने के लिए, हम बायोटिन/streptavidin रणनीति है जिसमें बायोटिन एक आरएनए सब्सट्रेट करने के लिए एक तस्वीर के माध्यम से संलग्न है के एक संस्करण विकसित-सट linker और परिसरों streptavidin मोतियों पर मैटीरियल चुनिंदा एक में हल करने के लिए eluted हैं लंबी लहर यूवी द्वारा देशी फार्म, मोतियों पर पृष्ठभूमि प्रोटीन जा. छोटे शाही सेना के बंधन सब्सट्रेट एक पूरक oligonucleotide द्वारा दो समूहों के साथ प्रदान किया जा सकता है, जबकि अब आरएनए सब्सट्रेट, आरएनए के 5 ' अंत करने के लिए संलग्न फोटो-सट लिंकर covalently और बायोटिन के साथ रासायनिक संश्लेषित किया जा सकता है । यूवी रेफरेंस विधि के इन दो वेरिएंट U7 snRNP-निर्भर प्रसंस्करण परिसरों कि 3 ' अंत में हिस्टोन पूर्व mRNAs सट और वे दोनों दूसरे पहले से विकसित शुद्धि तरीकों के लिए अनुकूल तुलना करने के लिए साबित कर दिया के शोधन के लिए परीक्षण किया गया । यूवी eluted नमूने U7 snRNP कि प्रमुख प्रोटीन संदूषण और जन स्पेक्ट्रोमेट्री और कार्यात्मक परख द्वारा प्रत्यक्ष विश्लेषण के लिए उपयुक्त से मुक्त किया गया था की आसानी से पता लगाने की मात्रा में निहित । वर्णित विधि आसानी से अन्य आरएनए बाध्यकारी परिसरों की शुद्धि के लिए अनुकूलित किया जा सकता है और डीएनए विशिष्ट प्रोटीन और macromolecular परिसरों को शुद्ध करने के लिए एकल और डबल असहाय डीएनए बंधन साइटों के साथ संयोजन के रूप में इस्तेमाल किया.

Introduction

eukaryotes में, आरएनए पोलीमरेज़ द्वितीय जनित mRNA पुरोगामी (pre-mRNAs) mRNA में प्रोटीन संश्लेषण के लिए पूरी तरह कार्यात्मक कोशिका द्रव्य टेम्पलेट्स बनने से पहले नाभिक में कई परिपक्वता घटनाओं से गुजरना । इन घटनाओं में से एक 3 ' अंत प्रसंस्करण है । पूर्व mRNAs, 3 ' अंत प्रसंस्करण के विशाल बहुमत के लिए polyadenylation के साथ मिलकर दरार शामिल है । यह दो कदम प्रतिक्रिया एक अपेक्षाकृत प्रचुर मात्रा में 15 से अधिक प्रोटीन1से मिलकर जटिल द्वारा catalyzed है । पशु प्रतिकृति-निर्भर हिस्टोन पूर्व mRNAs एक अलग तंत्र जिसमें महत्वपूर्ण भूमिका U7 snRNP, एक कम बहुतायत के U7 snRNA से मिलकर जटिल द्वारा खेला जाता है द्वारा 3 ' अंत में संसाधित कर रहे है ~ ६० न्यूक्लियोटाइड और एकाधिक प्रोटीन2,3 . हिस्टोन प्री-mRNA में एक विशिष्ट अनुक्रम के साथ U7 snRNA आधार जोड़े और U7 snRNP catalyzes की उपइकाईयों में से एक, एक पाली (एक) पूंछ के बिना परिपक्व हिस्टोन mRNA पैदा करने वाली । 3 ' हिस्टोन पूर्व mRNA के अंत प्रसंस्करण भी स्टेम लूप बाध्यकारी प्रोटीन की आवश्यकता है (SLBP), जो एक संरक्षित स्टेम-पाश बांध दरार साइट के ऊपर स्थित है और सब्सट्रेट2,3करने के लिए U7 snRNP की भर्ती को बढ़ाता है । U7 snRNP के व्यक्तिगत घटकों की पहचान करने के उद्देश्य से अध्ययन पशु कोशिकाओं में U7 snRNP की कम एकाग्रता और अलग कर देना करने के लिए जटिल की प्रवृत्ति के कारण चुनौतीपूर्ण हो गया है या उपयोग करने का एक परिणाम के रूप में शुद्धि के दौरान आंशिक प्रोटियोलिसिस से गुजरना हल्के डिटर्जेंट4,5,6, उच्च नमक बहाकर और/या एकाधिक क्रोमेटोग्राफिक कदम7,8,9।

हाल ही में, U7-निर्भर प्रसंस्करण मशीनरी, हिस्टोन पूर्व की एक छोटी टुकड़ा या तो 3 ' या 5 ' पर बायोटिन युक्त mRNA की संरचना का निर्धारण करने के लिए एक परमाणु निकालने के साथ मशीन था और इकट्ठे परिसरों streptavidin पर कब्जा कर लिया गया लेपित agarose मोती५,६,१०. बायोटिन और streptavidin के बीच असाधारण मजबूत बातचीत के कारण, प्रोटीन streptavidin मोतियों पर मैटीरियल एसडीएस में उबलते द्वारा denaturing शर्तों के तहत eluted और चांदी धुंधला और मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा विश्लेषण किया गया । हालांकि इस सरल दृष्टिकोण U7 snRNP के घटकों के एक नंबर की पहचान की, यह अपेक्षाकृत कच्चे तेल के नमूनों की उपज, अक्सर पृष्ठभूमि प्रोटीन की एक बड़ी संख्या के साथ दूषित विशेष रूप से streptavidin मोती के लिए बाध्य, संभवतः के कुछ घटकों मास्किंग प्रसंस्करण मशीनरी और चांदी सना हुआ जैल5,6,10पर उनके पता लगाने को रोकने के । महत्वपूर्ण बात, इस दृष्टिकोण भी अलग सामग्री और इसके अतिरिक्त तरीकों से एकरूपता के लिए इसके आगे शुद्धि के साथ किसी भी कार्यात्मक अध्ययन precluded ।

संशोधनों के एक नंबर समय पर प्रस्तावित करने के लिए बायोटिन की वस्तुतः अपरिवर्तनीय प्रकृति का पता/streptavidin बातचीत कर रहे थे, उनमें से ज्यादातर के साथ या तो बातचीत को कमजोर करने के लिए या में एक रासायनिक वि हाथ प्रदान करने के लिए डिज़ाइन किया जा रहा बायोटिन युक्त रिएजेंट11,12. इन सभी संशोधनों के नकारात्मक पक्ष यह था कि वे काफी विधि की क्षमता को कम करने और/या अक्सर रेफरेंस कदम के दौरान गैर शारीरिक स्थितियों की आवश्यकता है, या तो अखंडता या शुद्ध प्रोटीन की गतिविधि को ख़तरे में डालना ।

यहां, हम एक अलग दृष्टिकोण का वर्णन करने के लिए बायोटिन की अंतर्निहित समस्या को हल करने के लिए streptavidin रणनीति आरएनए सब्सट्रेट जिसमें बायोटिन एक फोटो के माध्यम से 5 ' अंत करने के लिए संलग्न covalently है-सट 1-(2-nitrophenyl) एथिल moiety है कि लंबी लहर यूवी13,14के प्रति संवेदनशील । हम Drosophila और स्तनधारी परमाणु अर्क15से सीमित U7-निर्भर प्रसंस्करण मशीनरी की शुद्धि के लिए इस दृष्टिकोण का परीक्षण किया । हिस्टोन पूर्व की एक छोटी सी मशीन के बाद बायोटिन युक्त mRNA और फोटो-एक परमाणु उद्धरण के साथ सट linker, इकट्ठे प्रसंस्करण परिसरों streptavidin मोतियों पर स्थिर हैं, अच्छी तरह से धोया और धीरे से एक देशी में समाधान के लिए जारी ~ ३६० एनएम यूवी लाइट करने के लिए जोखिम से फार्म । यूवी-रेफरेंस विधि बहुत ही कुशल, तेज और सीधी, U7 snRNP की पर्याप्त मात्रा में उपज के रूप में कम से धुंधला अभिजात्य द्वारा अपने घटकों की कल्पना करने के लिए १०० µ एल निकालने के15। यूवी eluted सामग्री पृष्ठभूमि प्रोटीन और प्रत्यक्ष जन स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण, अतिरिक्त शुद्धि कदम और एंजाइमी परख के लिए उपयुक्त से मुक्त है । एक ही विधि अंय आरएनए/प्रोटीन परिसरों कि अपेक्षाकृत कम आरएनए बाइंडिंग साइटों की आवश्यकता की शुद्धि के लिए अपनाया जा सकता है । बायोटिन और फोटो-सट linker भी एकल और दोहरे फंसे हुए डीएनए से जुड़ी covalently हो सकती है, संभावित रूप से विभिन्न डीएनए/प्रोटीन कॉम्प्लेक्स की शुद्धि के लिए यूवी-रेफरेंस विधि का विस्तार ।

covalently संलग्न बायोटिन और फोटो-सट linker युक्त आरएनए के रासायनिक संश्लेषण केवल अनुक्रम है कि ~ ६५ न्यूक्लियोटाइड से अधिक नहीं है, महंगी और अक्षम बनने के लिए काफी लंबे समय अनुक्रम के साथ व्यावहारिक है । इस समस्या को हल करने के लिए, हम भी एक वैकल्पिक दृष्टिकोण है कि बहुत लंबे समय तक आरएनए बाध्यकारी लक्ष्य के लिए उपयुक्त है विकसित की है । इस दृष्टिकोण में, किसी भी लंबाई और न्यूक्लियोटाइड अनुक्रम के आरएनए में T7 या SP6 प्रतिलेखन और annealed द्वारा इन विट्रो में उत्पन्न होता है एक छोटी पूरक oligonucleotide कि बायोटिन शामिल हैं और फोटो-' 5 अंत में सट लिंकर (ट्रांस विन्यास). परिणामी द्वैध बाद में व्यक्तिगत बाध्यकारी प्रोटीन या macromolecular परिसरों streptavidin मोतियों पर एक ही प्रोटोकॉल के लिए वर्णित के बाद शुद्ध करने के लिए प्रयोग किया जाता है, जिसमें फोटो-सट बायोटिन संलग्न covalently (सीआईएस विन्यास). इस संशोधन के साथ, फोटो-सट बायोटिन के साथ संयोजन के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है के साथ इन विट्रो उत्पन्न न्यूक्लियोटाइड के सैकड़ों युक्त टेप, आरएनए की एक विस्तृत श्रृंखला की शुद्धि के लिए यूवी-रेफरेंस विधि का विस्तार/

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Protocol

1. सब्सट्रेट तैयारी

नोट: आरएनए सब्सट्रेट से कम ~ ६५ न्यूक्लियोटाइड बायोटिन के साथ रासायनिक संश्लेषित किया जा सकता (ख) और फोटो-सट (पीसी) linker (एक साथ फोटो-सट बायोटिन या पीसीबी के रूप में संदर्भित) covalently से जुड़ी आरएनए 5 ' अंत (सीआईएस विन्यास). आरएनए काफी लंबे समय तक बाध्यकारी साइटों युक्त सब्सट्रेट T7 द्वारा इन विट्रो में उत्पन्न होने की जरूरत है (या SP6) प्रतिलेखन और बाद में एक छोटे पूरक अनुकूलक oligonucleotide युक्त पीसीबी moiety में 5 ' अंत (ट्रांस विंयास) (चित्रा 1) ।

  1. बाध्यकारी साइटों की तुलना में कम से मिलकर के लिए ~ ६५ न्यूक्लियोटाइड, एक वाणिज्यिक निर्माता (सामग्री की मेज) का उपयोग करने के लिए रासायनिक आरएनए 5 ' अंत (आंकड़ा 1a और चित्रा 2a) से जुड़ी पीसीबी covalently के साथ ब्याज की शाही सेना को संश्लेषित करने के लिए । -८० डिग्री सेल्सियस पर छोटे aliquots में वांछित एकाग्रता और दुकान को प्राप्त करने के लिए बाँझ पानी में भंग.
  2. बाध्यकारी साइटों के लिए काफी अधिक से अधिक ~ ६५ न्यूक्लियोटाइड, फार्म का एक आंशिक द्वैध इन विट्रो में ब्याज की आरएनए उत्पंन और एक पूरक अनुकूलक 5 ' अंत में पीसीबी moiety युक्त oligonucleotide (चित्रा 3ए) ।
    1. या तो एक रैखिक प्लाज्मिड डीएनए या एक उपयुक्त पीसीआर पर T7 प्रतिलेखन प्रदर्शन के लिए एक ~ 20-न्यूक्लियोटाइड मनमाना अनुक्रम द्वारा 3 ' अंत में विस्तारित ब्याज की बाध्यकारी साइट के साथ आरएनए उत्पंन करने के लिए खाके ।
    2. T7 जनित आरएनए में 3 ' विस्तार के लिए पूरक है कि एक अनुकूलक oligonucleotide रासायनिक संश्लेषित करने के लिए एक वाणिज्यिक निर्माता (सामग्री की मेज) का उपयोग करें और 5 ' अंत (चित्रा 3ए) में पीसीबी शामिल हैं.
      नोट: २ १८-एटम स्पेसर्स और 2-3 गैर-पूरक न्यूक्लियोटाइड oligonucleotide के 5 ' अंत में रखा जा सकता है के लिए बाध्य जटिल और streptavidin मोतियों के बीच संभावित steric बाधा को कम । यह भी वांछनीय है कि oligonucleotide को समान रूप से एक 2 ' O-मिथाइल समूह के साथ संशोधित करने के लिए द्वैध की ताकत को बढ़ाने और विभिंन nucleases के खिलाफ प्रतिरोध प्रदान करना है ।
    3. T7-जनित आरएनए को पीसीबी एडेप्टर oligonucleotide.
      1. आरएनए के 20 pmol और १०० pmol एडेप्टर पीसीबी oligonucleotide (1:5 दाढ़ अनुपात) एक १.५ मिलीलीटर ट्यूब में निम्नलिखित रचना के साथ बंधन बफर के १०० µ एल मिश्रण: ७५ मिमी KCl, 15 मिमी HEPES पीएच ७.९, 15% ग्लिसरॉल, 10 मिमी ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA) ।
        नोट: यह एडेप्टर oligonucleotide की एक ंयूनतम राशि है कि सबसे (यदि नहीं सभी) पूर्व mRNA सब्सट्रेट एनीलिंग प्रतिक्रिया में इस्तेमाल के साथ एक द्वैध फार्म के लिए पर्याप्त है का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है । यह आसानी से ३२पी के साथ 5 ' अंत में आरएनए सब्सट्रेट लेबलिंग द्वारा निर्धारित किया जा सकता है, एडेप्टर oligonucleotide की मात्रा में वृद्धि के साथ लेबल सब्सट्रेट एनीलिंग विभिन्न बफर स्थितियों का उपयोग कर और की अवधारण की निगरानी बाध्यकारी बफर के साथ मोतियों की कई बहाकर बाद streptavidin मोतियों पर रेडियोधर्मी संकेत ।
      2. 5 मिनट के लिए उबलते पानी में ट्यूब प्लेस ।
      3. कमरे के तापमान को ठंडा करने के लिए पानी की अनुमति दें ।

2. जटिल विधानसभा

  1. पूरक 1 एक माउस परमाणु निकालने के (या एक और विकल्प के उद्धरण) के साथ ८० mm EDTA पीएच 8 10 मिमी के अंतिम एकाग्रता के लिए विशिष्ट धातु-निर्भर nucleases है कि निकालने में मौजूद हैं ब्लॉक करने के लिए.
    नोट: यह बफ़र बाइंडिंग बफ़र में (चरण 1.2.3.1 देखें) के रूप में एक ही संरचना करने के लिए निकालने में का समायोजन करने में परिणाम होगा । EDTA इन विट्रो हिस्टोन पूर्व mRNAs के प्रसंस्करण में प्रभावित नहीं करता है, लेकिन शुद्ध प्रोटीन या प्रोटीन परिसरों कि एक मैग्नीशियम पर निर्भर तरीके से इकट्ठा करने में हानिकारक हो सकता है । इन मामलों में EDTA से बचना चाहिए ।
  2. आरएनए के 5-10 pmol जोड़ें सीआईएस में पीसीबी moiety के साथ टैग (चरण १.१ देखें) या ट्रांस (देखें चरण 1.2.3.3) 10 मिमी EDTA युक्त निकालने की 1 मिलीलीटर के लिए ।
    नोट: आरएनए की राशि का परीक्षण प्रयोगों की एक श्रृंखला में सावधानीपूर्वक मूल्यांकन करने की आवश्यकता है. एक सीमित जटिल शायद उल्टा की शुद्धि के लिए बहुत अधिक आरएनए सब्सट्रेट का उपयोग, काफी विशिष्ट प्रोटीन की उपज पर कोई प्रभाव होने के बिना विशिष्ट आरएनए बंधन प्रोटीन की पृष्ठभूमि में वृद्धि.
  3. बर्फ पर 5 मिनट के लिए निकालने के साथ आरएनए सब्सट्रेट, कभी-कभार नमूना मिश्रण ।
    नोट: दोनों समय और गर्मी की आवश्यकता के तापमान empirically स्थापित करने के लिए और काफी भिंन हो सकते हैं, आरएनए के विशिष्ट प्रकृति पर निर्भर करता है/
  4. १०,००० एक्स जी में 10 मिनट के लिए एक पूर्व ठंडा microcentrifuge में मशीन मिश्रण स्पिन किसी भी संभावित हाला को दूर करने के लिए और ध्यान से गोली स्थानांतरित करने से परहेज supernatant इकट्ठा ।

3. Streptavidin मोतियों पर आरएनए/प्रोटीन परिसरों का स्थिरीकरण ।

  1. स्थानांतरण ~ १०० µ एल के streptavidin agarose मनका निलंबन एक वाणिज्यिक आपूर्तिकर्ता (सामग्री तालिका) से एक १.५ एमएल ट्यूब करने के लिए और बाध्यकारी बफर के साथ मात्रा बढ़ाने के लिए (७५ मिमी KCl, 15 मिमी HEPES पीएच ७.९, 15% ग्लिसरॉल, 10 मिमी EDTA).
    नोट: यह बफ़र एनीलिंग मिश्रण में और जटिल असेंबली (चरण २.१) के लिए उपयोग किया गया निकालने में एक ही संरचना होनी चाहिए ।
  2. 25 x जी में 2-3 मिनट के लिए कताई द्वारा ट्यूब के तल पर मोतियों को इकट्ठा करने और supernatant महाप्राण ।
  3. दोहराएं एक ही धोने/कताई प्रक्रिया 2-3 बार के लिए बाध्यकारी बफर के साथ मोतियों equilibrate ।
    नोट: इस कदम के अंत में, मोतियों की गोली की एक मात्रा होना चाहिए ~ 30 µ l
  4. equilibrated streptavidin agarose मोतियों पर इकट्ठे जटिल (कदम २.४) युक्त supernatant लोड ।
  5. आरएनए और मोतियों पर बंधे परिसरों को स्थिर करने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे घुमाएँ ।
  6. 25 x जी में 2-3 मिनट के लिए कताई द्वारा ट्यूब के तल पर मोती ले लीजिए ।
    नोट: यदि वे कोणीय रोटर्स में ट्यूब की ओर का पालन करने के लिए करते हैं मोतियों की पर्याप्त हानि से बचने के लिए रोटर बाहर एक स्विंग का उपयोग करें ।
  7. महाप्राण supernatant और मोतियों की माला दो बार बाइंडिंग बफर के 1 मिलीलीटर के साथ कुल्ला, एक ही केंद्रापसारक शर्तों का उपयोग कर ।
  8. बाइंडिंग बफ़र की 1 मिलीलीटर जोड़ें और 4 ° c पर नमूना 1 h घुमाएं ।
    नोट: इस कदम को छोटा किया जा सकता है यदि जटिल सब्सट्रेट पर गठित अलग कर देना के लिए जाता है ।
  9. 25 एक्स जी में 2-3 मिनट के लिए मोती नीचे स्पिन, बफर के 1 मिलीलीटर जोड़ने और एक नई ट्यूब के लिए निलंबन स्थानांतरण ।
  10. एक अतिरिक्त 1 ज या कम के लिए घुमाएँ, अगर परिसर स्थिर नहीं है, 25 x जी में 2-3 मिनट के लिए नीचे स्पिन और एक ५०० µ एल ट्यूब में मोतियों का हस्तांतरण २०० µ l बाइंडिंग बफ़र की ।

4. यूवी-रेफरेंस ।

  1. पूर्ण प्रतिभा तक पहुंचने से पहले 5-10 मिनट के लिए ३६५ एनएम यूवी प्रकाश उत्सर्जक एक उच्च तीव्रता यूवी लैंप पर बारी ।
    नोट: यह विकिरण के शुरू में यूवी उत्सर्जन की अधिकतम ऊर्जा को प्राप्त करने के लिए आवश्यक है ।
  2. एक पेट्री डिश के नीचे भरें (१०० mm x 15 mm) कसकर पैक बर्फ के साथ और यह है पकवान ढक्कन पर ढेर ।
  3. थोडक्यात परिसर युक्त ट्यूब को संक्षेप में भंवर, यह क्षैतिज बर्फ पर जगह और पूर्व गर्म दीपक के साथ कवर, यह सुनिश्चित करना है कि नमूना बल्ब की सतह के 2-3 सेमी की दूरी के भीतर स्थित है ।
    नोट: दूरी बहुत बड़ी है, तो नमूना बल्ब के करीब लाने के लिए अतिरिक्त पेट्री व्यंजन या अन्य उपयुक्त वस्तुओं का उपयोग करें ।
  4. 30 मिनट की कुल के लिए विकीर्ण, अक्सर पलटना और यूवी को निलंबन की वर्दी जोखिम सुनिश्चित करने के लिए और overheating को रोकने के लिए ट्यूब भंवर ।
    नोट: अतिरिक्त कूलिंग प्रदान करने के लिए, यूवी-रेफरेंस स्टेप को ठंडे कमरे में ले जाया जा सकता है । अत्यधिक बर्फ पिघलने के मामले में ताजा बर्फ के साथ एक पेट्री डिश के लिए स्विच ।
  5. 25 x जी में 2-3 मिनट के लिए मोतियों को नीचे स्पिन और supernatant इकट्ठा ।
  6. फिर से एक ही शर्तों का उपयोग कर supernatant स्पिन और supernatant इकट्ठा ।
    नोट: अवशिष्ट मोतियों को स्थानांतरित करने से बचने के लिए तल पर supernatant की एक छोटी राशि छोड़ दें ।

5. चांदी धुंधला द्वारा नमूना विश्लेषण मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा पीछा किया ।

  1. एसडीएस/polyacrylamide जेल ट्रो का प्रयोग यूवी eluted supernatant के एक अंश को अलग करने के लिए और यूवी रेफरेंस के बाद मोतियों पर छोड़ी गई सामग्री का एक ही अंश है ।
    नोट: विश्लेषण यूवी-रेफरेंस से पहले नमूने से वापस ले लिया मोतियों की एक aliquot भी शामिल हो सकता है ।
  2. एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध चांदी धुंधला किट का उपयोग कर अलग प्रोटीन युक्त जेल दाग ।
  3. यूवी-eluted supernatant और उन मोतियों पर छोड़ दिया यूवी विकिरण के बाद उन में मौजूद प्रोटीन की तीव्रता की तुलना करके यूवी रेफरेंस की दक्षता का मूल्यांकन करें ।
  4. उत्पाद के प्रोटीन बैंड ब्याज और जन स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा अपनी पहचान निर्धारित मानक प्रोटोकॉल का उपयोग कर10,15।

6. जन स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा यूवी-eluted नमूना का वैश्विक विश्लेषण ।

  1. सीधे जन स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा यूवी eluted supernatant के एक अंश का विश्लेषण करने के लिए एक निष्पक्ष तरीके से शुद्ध सामग्री के पूरे proteome निर्धारित करते हैं ।
    नोट: यह trypsin के साथ शुद्ध नमूनों के समाधान उपचार के द्वारा किया जा सकता है मानक मास स्पेक्ट्रोमेट्री प्रोटोकॉल के बाद उत्पन्न पेप्टाइड्स की पहचान निर्धारित करने के लिए10,15.

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Representative Results

यूवी रेफरेंस विधि दो रासायनिक संश्लेषित आरएनए सब्सट्रेट covalently के साथ परीक्षण किया गया था 5 ' अंत करने के लिए पीसीबी moiety (सीआईएस विन्यास): पीसीबी-SL (चित्रा 1) और पीसीबी-dH3/5m RNAs (चित्रा 2). 31-न्यूक्लियोटाइड pcB-SL आरएनए एक स्टेम-पाश संरचना एक 5 न्यूक्लियोटाइड एकल पूंछ से पीछा किया और इसके अनुक्रम परिपक्व हिस्टोन mRNA के 3 ' अंत करने के लिए समान है (यानी, हिस्टोन mRNA द्वारा U7 पूर्व के दरार के बाद snRNP). यह अद्वितीय अनुक्रम स्तनधारी cytoplasmic अंश: SLBP और 3 ' hExo16,17,18में मौजूद दो प्रोटीन के लिए एक ज्ञात बाइंडिंग साइट है । pcB-dH3/5m एक ६३-न्यूक्लियोटाइड अंश है Drosophila H3 हिस्टोन pre-mRNA और इसके अलावा में स्टेम लूप एक अनुक्रम है कि बांध Drosophila U7 snRNP (चित्रा 2) शामिल हैं ।

dH3 Ext (१२५ न्यूक्लियोटाइड) अब आरएनए सब्सट्रेट है कि T7 प्रतिलेखन द्वारा उत्पन्न किया जा सकता है और बायोटिन और एक तस्वीर के लिए एनीलिंग द्वारा ट्रांस में पीसीबी/22mer, एक रासायनिक संश्लेषित अनुकूलक oligonucleotide के साथ प्रदान की जा सकती का एक उदाहरण है ( ट्रांस विंयास) । पीसीबी/22mer 5 ' अंत में दो समूहों में शामिल है और 22 2 ' O-मिथाइल-modifed न्यूक्लियोटाइड (चित्रा 3ए) के होते हैं । 19 न्यूक्लियोटाइड के 3 ' अंत में पीसीबी/22mer ( चित्र३ ए में अनुक्रम में रेखांकित) dH3 Ext पूर्व mRNA के पिछले 19 न्यूक्लियोटाइड के पूरक हैं. इस पूर्व mRNA के अलावा अब जा रहा है काफी सिंथेटिक पीसीबी से अलग नहीं है-dH3/5m, एक ही दो प्रमुख प्रसंस्करण संकेतों से युक्त: स्टेम लूप और U7-बाध्यकारी साइट ।

पीसीबी-SL आरएनए एक cytoplasmic माउस मायलोमा कोशिकाओं से प्राप्त अंश के 1 ज के लिए ultracentrifugation (१००,००० एक्स जी द्वारा तैयार S100 निकालने के 1 मिलीलीटर के साथ मशीन था और यूवी-रेफरेंस के प्रभाव और दक्षता पहले चांदी धुंधला द्वारा विश्लेषण किया गया । यूवी-रेफरेंस (फिगर 1b, लेन 1) से पहले streptavidin मोतियों पर कई प्रोटीन पाए गए । लंबी लहर यूवी के साथ विकिरण supernatant (चित्रा 1b, लेन 3) के लिए इन प्रोटीन के केवल कुछ जारी, मोतियों पर एक गैर विशिष्ट पृष्ठभूमि छोड़ने (आंकड़ा 1b, लेन 2), इसलिए यूवी-रेफरेंस कदम के महत्व पर बल । प्रमुख यूवी eluted प्रोटीन जन स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा 3 ' hExo और SLBP के रूप में की पहचान की, SLBP पूर्ण लंबाई प्रोटीन (FL) और छोटे गिरावट उत्पादों (डीपी) के एक नंबर के द्वारा प्रतिनिधित्व किया जा रहा है के साथ थे । अन्य प्रोटीन की छोटी मात्रा, विभिन्न आरएनए बाइंडिंग प्रोटीन (RBPs) के रूप में पहचान की, भी चुनिंदा यूवी विकिरण द्वारा समाधान के लिए जारी किए गए (आंकड़ा 1b, लेन 3).

pcb-dH3/5m पूर्व mRNA (चित्रा 2) या dH3 Ext पूर्व mRNA annealed पीसीबी/22mer (चित्रा 3) Drosophila केसी कोशिकाओं से एक परमाणु निकालने के 1 मिलीलीटर के साथ मशीन थे प्रसंस्करण परिसरों20,21फार्म । बेहतर है कि प्रत्येक हिस्टोन पूर्व mRNA को बांध प्रोटीन की विशिष्टता का मूल्यांकन करने के लिए, एक नकारात्मक नियंत्रण समानांतर में परमाणु निकालने के लिए दो प्रतियोगियों को जोड़ने के द्वारा तैयार किया गया था: SL आरएनए कि sequesters SLBP, और एक छोटी antisense oligonucleotide कि आधार जोड़े के साथ U7 snRNA और पूर्व mRNA पर अपनी साइट के साथ U7 snRNP की बातचीत को रोकता है ।

यूवी-रेफरेंस के स्टेप मैटीरियल pcB-dH3/5m प्री-mRNA केवल supernatant (चित्रा 2 बी, लेन 1) के लिए प्रोटीन की एक छोटी सी संख्या के एक चयनात्मक रिलीज के परिणामस्वरूप, गैर विशेष मोती पर शेष प्रोटीन की एक तीव्र पृष्ठभूमि के साथ (चित्रा बी 3 , लेन 3) । इन प्रोटीन, एक लेबल मैं, U7 snRNP15के घटकों के रूप में जन स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा की पहचान की गई । नमूना भी आंशिक रूप से नीचा SLBP कि 10 केडीए में स्थानांतरित करता है और केवल उच्च एकाग्रता एसडीएस/polyacrylamide जैल पर दिखाई जा सकती है निहित । इन सभी प्रोटीन की उपस्थिति में पता नहीं था कि दो प्रसंस्करण प्रतियोगियों U7 snRNP के हिस्टोन पूर्व mRNA के लिए बाध्यकारी (चित्रा 2 बी, लेन २) ।

Drosophila U7 snRNP के एक ही घटक एक स्थिर dH3 Ext पूर्व mRNA और पीसीबी/22mer (चित्रा 3 बी, लेन 1) से मिलकर द्वैध के यूवी विकिरण द्वारा समाधान के लिए जारी किए गए । इस नमूने इसके अतिरिक्त एक dH3 Ext पूर्व mRNA के साथ एक द्वैध फार्म करने के लिए अतिरिक्त में इस्तेमाल किया पीसीबी/22mer oligonucleotide के साथ बातचीत की है कि कई शाही सेना बाध्यकारी प्रोटीन निहित । U7 snRNP के उपइकाई के विपरीत में, इन दूषित प्रोटीन, साथ ही सभी पृष्ठभूमि प्रोटीन है कि मोतियों पर बनी हुई है, प्रसंस्करण प्रतियोगियों की उपस्थिति में बने (आंकड़ा 3 बी, लेन 1 और 2 की तुलना में, और गलियों और 4) ।

यूवी-supernatant युक्त प्रसंस्करण परिसरों और एक नकारात्मक नियंत्रण से यूवी-supernatant के एक ही अंश का एक छोटा सा अंश (दो प्रतियोगी oligonucleotides की उपस्थिति में तैयार है और इसलिए प्रसंस्करण परिसरों की कमी) सीधे हो सकता है eluted प्रोटीन की एक पूर्व जुदाई के बिना जन स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा जेल ट्रो15द्वारा विश्लेषण किया । यह विधि सभी eluted प्रोटीन का पता लगाने में बहुत संवेदनशील है उनके आकार और बहुतायत की परवाह किए बिना और नकारात्मक नमूने के साथ संयोजन के रूप में प्रोटीन की एक पूरी और निष्पक्ष सूची है कि विशेष रूप से हिस्टोन पूर्व mRNA के साथ संबद्ध 3 ' अंत आचरण प्रदान करता है प्रसंस्करण प्रतिक्रिया ।

Figure 1
चित्रा 1: माउस cytoplasmic प्रोटीन के शोधन पीसीबी के लिए बाध्य-SL आरएनए । (क) रासायनिक संश्लेषित पीसीबी-SL आरएनए (31-न्यूक्लियोटाइड) का एक चित्र । बायोटिन (Biot) 5 ' अंत में एक तस्वीर के बाद है-सट moiety (पीसी) लंबी लहर यूवी (३६६ एनएम) के प्रति संवेदनशील, २ १८ एटम स्पेसर और 31 न्यूक्लियोटाइड है कि संरक्षित स्टेम पाश संरचना फार्म ' 3 परिपक्व हिस्टोन mRNAs के अंत में पाया । (ख) पीसीबी-SL आरएनए माउस मायलोमा कोशिकाओं से S100 cytoplasmic निकालने के साथ मशीन था । आरएनए और बंधे प्रोटीन streptavidin मोतियों पर शुद्ध, बड़े पैमाने पर धोया, यूवी eluted और चांदी धुंधला (लेन 3) द्वारा विश्लेषण किया गया । प्रोटीन्स को यूवी रेफरेंस से पहले streptavidin मोतियों पर मैटीरियल दिया जाता है और यूवी रेफरेंस के बाद मोतियों पर छोड़ा जाता है, जो क्रमशः फि ल्म 1 और 2 में दिखाए जाते हैं । प्रोटीन आकार मार्करों की स्थिति (केडीए में) बाईं ओर संकेत दिया है.

Figure 2
चित्रा 2: पीसीबी पर इकट्ठे Drosophila प्रसंस्करण परिसरों की शुद्धि-dH3/5m pre-mRNA । (a) रासायनिक संश्लेषित Drosophila-विशिष्ट पीसीबी-dH3/5m pre-mRNA (६३-न्यूक्लियोटाइड) का एक आरेख । बायोटिन (Biot) 5 ' अंत में एक तस्वीर के बाद है-सट moiety (पीसी), २ १८-एटम स्पेसर और ६३ न्यूक्लियोटाइड कि दो अनुक्रम तत्व आवश्यक प्रसंस्करण शामिल: स्टेम लूप संरचना और U7-बाध्यकारी साइट । दो तत्वों के बीच स्थित प्रमुख दरार साइट के आसपास पांच न्यूक्लियोटाइड एक 2 ' O-मिथाइल समूह के साथ जटिल विधानसभा (पार लाइनों) के दौरान U7 snRNP द्वारा दरार ब्लॉक करने के लिए संशोधित कर रहे हैं । (ख) पीसीबी-dH3/5m एक Drosophila परमाणु निकालने के साथ मशीन था प्रसंस्करण परिसर को इकट्ठा । नकारात्मक नियंत्रण में, परमाणु निकालने के लिए दो प्रसंस्करण प्रतियोगियों SLBP और U7 snRNP के बंधन ब्लॉक करने के लिए हिस्टोन पूर्व mRNA शामिल हैं । इकट्ठे परिसरों streptavidin मोतियों पर मैटीरियल, बड़े पैमाने पर धोया और लंबी लहर यूवी के लिए नमूने के जोखिम से समाधान के लिए जारी किया गया । यूवी-eluted सामग्री (यूवी-sups) और मोतियों के निम्न यूवी-रेफरेंस (यूवी-मोतियों) के समान अंशों को चांदी के दाग से विश्लेषित किया गया. प्रोटीन आकार मार्करों की स्थिति (केडीए में) और streptavidin (एसए) सही करने के लिए संकेत दिया है.

Figure 3
चित्रा 3: dH3 Ext पर इकट्ठे Drosophila प्रसंस्करण परिसरों की शुद्धि पूर्व- ट्रांसमें फोटो-सट समूह से जुड़ी mRNA । (क) एनीलिंग T7 द्वारा उत्पन्न dH3 ext द्वैध का एक आरेख-उत्पन्न dH3 ext पूर्व mRNA और रासायनिक संश्लेषित पीसीबी/22mer oligonucleotide निम्नलिखित अनुक्रम के साथ: 5 ' Biot/पीसी/18S/18S/mAmGmUmAmGmCmUmUmAmCmAmCmUmCmGmAmGmCmCmUmAmC/ oligonucleotide में, बायोटिन (Biot) 5 ' अंत में रखा गया है और फोटो-सट (पीसी) linker द्वारा पीछा किया जाता है । पिछले 19 न्यूक्लियोटाइड (ऊपर अनुक्रम में रेखांकित) ' 3 विस्तार के पूरक है dH3 Ext पूर्व में जोड़ा-mRNA । 2 ' O-मिथाइल संशोधनों की उपस्थिति (चित्रा में संकेत नहीं) दो प्रयोजनों के कार्य करता है: यह निकालने nucleases के खिलाफ oligonucleotide स्थिर और dH3 Ext पूर्व mRNA के साथ गठित द्वैध की ताकत बढ़ जाती है । (ख) dH3 Ext द्वैध एक Drosophila सी परमाणु निकालने के साथ या तो अभाव में या प्रसंस्करण प्रतियोगियों की उपस्थिति में, streptavidin मोतियों पर मैटीरियल, बड़े पैमाने पर धोया और यूवी eluted बाध्य प्रोटीन के साथ मशीन था । यूवी-eluted सामग्री के एक ही अंश (यूवी-sups, गलियाँ 1 और 2) और मोतियों के बाद यूवी-रेफरेंस (यूवी-मोतियों, फि ल्म 3 और 4) चांदी के दाग का विश्लेषण किया गया । प्रसंस्करण परिसरों के विशिष्ट componenst (उन है कि प्रतियोगियों प्रसंस्करण द्वारा समाप्त कर रहे हैं) के लिए एक एफ पत्र के साथ संकेत दिया जाता है । प्रमुख गैर विशिष्ट आरएनए बंधन प्रोटीन (उन है कि यूवी-eluted लेकिन दो प्रसंस्करण प्रतियोगियों की उपस्थिति में बनी रहती है) तारों के साथ संकेत दिया जाता है । प्रोटीन आकार मार्करों की स्थिति (केडीए में) सही करने के लिए संकेत दिया है. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

यहां वर्णित विधि सीधी है और इसके अलावा एक फोटो-सट linker और यूवी-रेफरेंस स्टेप में आमतौर पर इस्तेमाल किए जाने वाले तरीकों से अलग नहीं होती है जो बायोटिन और streptavidin के बीच बेहद मजबूत बातचीत का लाभ उठाते हैं । यूवी-रेफरेंस कदम बहुत कुशल है, आम तौर पर streptavidin मोतियों से ७५% से अधिक स्थिर आरएनए और जुड़े प्रोटीन को रिहा, प्रोटीन की एक उच्च पृष्ठभूमि है कि गैर विशेष रूप से मोतियों को बांध पीछे छोड़कर । इस पृष्ठभूमि को नष्ट करने से, यूवी रेफरेंस कदम उल्लेखनीय शुद्ध नमूनों चांदी धुंधला, जन स्पेक्ट्रोमेट्री और कार्यात्मक परख द्वारा प्रत्यक्ष विश्लेषण के लिए उपयुक्त पैदावार ।

एक अपेक्षाकृत कुछ और सरल चरणों को शामिल करने का एक परिणाम के रूप में, यूवी-रेफरेंस विधि अत्यधिक reproducible है, चांदी के दाग के लिए U7 snRNP की पर्याप्त मात्रा उपलब्ध कराने के रूप में माउस और Drosophila परमाणु अर्क15के रूप में कम से १०० µ एल । विधि एक MS2 बंधन साइट और एक MS2-MBP फ्यूजन के माध्यम से amylose मोतियों पर संबंधित परिसरों के साथ टैगिंग आरएनए सब्सट्रेट सहित, आरएनए/प्रोटीन परिसरों को शुद्ध करने के लिए इस्तेमाल किया अन्य प्रयोगात्मक रणनीतियों के लिए एक आकर्षक विकल्प है प्रोटीन. MS2 रणनीति है, जबकि अपेक्षाकृत प्रचुर मात्रा में spliceosomes और विहित 3 ' अंत प्रसंस्करण परिसर22,23, अलग करने में सफल U7 snRNP युक्त प्रसंस्करण परिसरों की पर्याप्त मात्रा में उपज में विफल (ZD, अप्रकाशित परिणाम), जो लगभग १०० बार कम प्रमुख U1 spliceosomal snRNP से पशु कोशिकाओं में केंद्रित है ।

प्रोटोकॉल के कई पहलुओं के लिए विभिंन व्यक्तिगत अनुसंधान लक्ष्यों को पूरा करने और अंय आरएनए के साथ इष्टतम परिणामों का उत्पादन करने के लिए संशोधित करने की आवश्यकता/ सबसे पहले, यह इस जटिल है कि निकालने में मौजूद है की राशि के साथ जटिल विधानसभा के लिए इस्तेमाल किया आरएनए सब्सट्रेट की राशि से मेल करने के लिए महत्वपूर्ण है । जटिल U7 snRNP सहित सीमित करने के लिए, बहुत अधिक सब्सट्रेट का उपयोग कर उल्टा है, केवल यूवी-supernatant में गैर विशिष्ट आरएनए-बाइंडिंग प्रोटीन की पृष्ठभूमि में वृद्धि. दूसरा, यह भी लंबाई और गर्मी के तापमान को अनुकूलित करने के लिए जटिल की जोरदार विधानसभा को बढ़ावा देने के लिए महत्वपूर्ण है, एक ही समय में अपनी संभावित प्रोटियोलिसिस या अत्यधिक आरएनए गिरावट के कारण पृथक्करण पर रोक ।

U7-निर्भर प्रसंस्करण परिसरों और समान आरएनए/प्रोटीन कॉंप्लेक्स के साथ काम करने में एक महत्वपूर्ण मुश्किल है कि एंजाइमी गतिविधियों ले जा रहा है कि पूरी तरह से इकट्ठे होने के बाद वे catalysis का एक परिणाम के रूप में अलग कर देना हो सकता है । हिस्टोन पूर्व mRNAs के क्लीवेज भी कम तापमान पर तेजी से होता है, काफी शुद्ध प्रसंस्करण परिसरों की उपज को कम करने. इस अवांछनीय प्रभाव को रोकने के लिए, प्रमुख दरार साइट और पीसीबी में चार पास न्यूक्लियोटाइड-dH3/5m पूर्व mRNA 2 ' O-मिथाइल समूहों (5m)10के साथ रासायनिक संश्लेषण के दौरान संशोधित किया गया । इस पूर्व mRNA लगभग पूरी तरह से U7 snRNP द्वारा दरार के लिए प्रतिरोधी है और पता लगाने वाला जटिल व्यवधान के कारण के बिना ६० मिनट के लिए कमरे के तापमान पर एक परमाणु निकालने के साथ किया जा सकता है । T7-उत्पंन dH3 Ext annealed को पीसीबी/22mer इन संशोधनों और एक परमाणु निकालने के साथ इसकी मशीन की कमी है बर्फ पर 5 मिनट या कम करने के लिए catalysis सीमा के लिए किया जाता है । पीसीबी-SL आरएनए परिपक्व हिस्टोन mRNA के 3 ' अंत होता है और cytoplasmic निष्कर्षों में किसी भी अलावा प्रसंस्करण से गुजरना नहीं है. 3 ' hExo, जो मैग्नीशियम पर निर्भर है 3 '-5 ' exonuclease vivo24,25 में सिंगल कतरा टेल के 2-3 न्यूक्लियोटाइड को हटाने में सक्षम है लेकिन इन विट्रो में इसकी गतिविधि16EDTA की उपस्थिति से हिचकती है । नतीजतन, पीसीबी-SL आरएनए किसी भी प्रतिकूल प्रभाव के बिना एक विस्तारित समय के लिए कमरे के तापमान पर cytoplasmic निष्कर्षों में किया जा सकता है, हालांकि आम तौर पर बर्फ पर एक छोटी सी मशीन SLBP और 3 ' hExo के साथ आरएनए के एक त्रिगुट परिसर बनाने के लिए पर्याप्त है.

यूवी-रेफरेंस विधि के दो वैकल्पिक वेरिएंट में, बायोटिन के साथ आरएनए सब्सट्रेट का उपयोग करना और सीआईएस में फोटो-सट लिंकर (covalently आरएनए के 5 ' अंत से जुड़ी) समग्र रूप से सरल है और अपेक्षाकृत शुद्ध नमूनों की पैदावार है । इस दृष्टिकोण की एक महत्वपूर्ण सीमा यह है कि दो समूहों आरएनए के लिए संलग्न covalently जा सकता है सब्सट्रेट से अधिक नहीं ~ ६५ न्यूक्लियोटाइड. अब आरएनए बंधन लक्ष्य एक अनुकूलक oligonucleotide के माध्यम से ट्रांस में पीसीबी moiety से जुड़ा जा सकता है । हालांकि, इस प्रकिया के उच्च पृष्ठभूमि का उत्पादन हो सकता है गैर-विशिष्ट प्रोटीन जो एडेप्टर oligonucleotide के अतिरिक्त बाइंड करने के लिए करते हैं । यह इसलिए प्रयोग में प्रयुक्त सभी पूर्व mRNA सब्सट्रेट बांध करने के लिए पर्याप्त oligonucleotide के केवल एक न्यूनतम दाढ़ अधिक का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है.

इस क्रम, लंबाई और अनुकूली oligonucleotides की रासायनिक प्रकृति आरएनए सब्सट्रेट में पूरक अनुक्रम के साथ जोड़ी आधार करने के लिए उनकी क्षमता में सुधार करने के लिए अलग किया जा सकता है, जबकि गैर विशिष्ट आरएनए बाइंडिंग प्रोटीन के साथ बातचीत करने की क्षमता को कम करने. अंत में, लंबे समय तक पूर्व mRNA के साथ द्वैधित सब्सट्रेट oligonucleotides जटिल गठन के लिए इस्तेमाल किया जा रहा करने से पहले streptavidin मोतियों पर मैटीरियल किया जा सकता है । इस पूर्व चयन दृष्टिकोण का एक लाभ यह है कि यह नमूना आरएनए अणुओं है कि oligonucleotide को एनएन करने में विफल से समाप्त । इन अणुओं को एक सामांय निकालने में एक जटिल में इकट्ठा करने की क्षमता बनाए रखने, लेकिन streptavidin मोती बांध में असमर्थ हैं, आंशिक रूप से शुद्धि की उपज को कम करने ।

एकल-असहाय आरएनए सब्सट्रेट पर इकट्ठे किए गए परिसरों को शुद्ध करने के अलावा, एक समान तरीके से यूवी-रेफरेंस पद्धति को प्रोटीन या प्रोटीन कॉम्प्लेक्स को शुद्ध करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है जो एकल और दोहरे-असहाय डीएनए दृश्यों को बांधते हैं ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है

Acknowledgments

हम अपने काम के लिए उनके योगदान के लिए हमारे सहकर्मियों और सहयोगियों को धंयवाद । इस अध्ययन NIH अनुदान जीएम २९८३२ द्वारा समर्थित किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Streptavidin-Agarose Sigma S1638-5ML
High-intensity, long-wave UV lamp Cole-Parmer UX-97600-00
Replacement bulb Cole-Parmer UX-97600-19 100 Watts Mercury H44GS-100M bulb emitting 366 nm UV light (Sylvania)
RNAs and oligonucleotides containing biotin and photo-cleavable linker in cis Dharmacon (Lafayette, CO) or Integrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA) Requst a quote in Dharmacon
Beckman GH 3.8 swing bucket rotor Beckman
RiboMAX Large Scale RNA Production Systems (T7 polymerase) Promega P1300
RiboMAX Large Scale RNA Production Systems (SP6 polymerase) Promega P1280
Pierce Silver Stain Kit ThermoFisher Scientific 24612

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References

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जैव रसायन अंक १४३ अपनत्व शुद्धि आरएनए/प्रोटीन कॉम्प्लेक्स बायोटिन streptavidin फोटो-सट linker यूवी-रेफरेंस U7 snRNP 3 ' end processing
बायोटिन से जुड़ी आरएनए का उपयोग करके Macromolecular परिसरों का एकल-चरण शुद्धिकरण और एक फोटो-सट linker
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Skrajna, A., Yang, X. C., Dominski, Z. Single-step Purification of Macromolecular Complexes Using RNA Attached to Biotin and a Photo-cleavable Linker. J. Vis. Exp. (143), e58697, doi:10.3791/58697 (2019).

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